WO2019157691A1 - 一种重组嵌合抗原受体基因及其应用 - Google Patents
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Definitions
- the T lymphocytes of the invention are autologous T lymphocytes.
Abstract
本发明提供了一种重组嵌合抗原受体(CAR)基因、包含其的载体、CAR-T细胞及其应用，所述重组CAR基因包含编码如下部分的核酸序列：CD30抗体的抗原结合部分，跨膜部分以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区；还提供了使用本发明所述CAR-T细胞治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的方法。
Description
本发明属于肿瘤治疗领域，具体涉及一种重组嵌合抗原受体(CAR)基因及其载体和其在治疗肿瘤特别是CD30阳性肿瘤中的应用。
霍奇金淋巴瘤(HL)是淋巴瘤的一种独特类型，为青年人中最常见的恶性肿瘤之一。据流行病学调查霍奇金淋巴瘤在世界各地的发病情况差异较大，在欧美国家多发，占淋巴瘤的45％左右，居淋巴瘤之首位，而中国和日本发病率较低。经典型霍奇金淋巴瘤的RS细胞CD30抗原表达阳性，是识别RS细胞的重要免疫标志。
间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)，即是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一种独立类型，由德国病理学家Stein等于1985年应用Ki-1(CD30)抗体识别，被命名为间变性大细胞淋巴瘤。在临床上ALCL被分为原发性(系统性和皮肤)及继发性(由其他淋巴瘤转化而来)两种，约占全部NHL的2％-7％。
CAR-T，全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞。嵌合抗原受体(CAR)由胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。CAR-T细胞治疗技术是指通过将上述CAR结构在体外进行基因重组得到重组质粒，再在体外将其导入到患者的T细胞内，从而获得能够表达上述嵌合抗原受体的CAR-T细胞，然后经过纯化和体外大规模扩增后，再将上述CAR-T细胞输回患者体内行使杀灭肿瘤细胞的功能。
CAR-T能将T细胞的生理功能和在非MHC限制性方式下识别表面抗原的能力结合起来。这些受体不依赖抗原加工就能识别完整的膜蛋白。CAR-T细胞疗法通过外源基因转导技术，把识别肿瘤相关特异性抗原的单链抗体片段(scFv)和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，经回输患者体内后大量扩增，能够以非MHC限制性的模式表现出较强的抗肿瘤作用。然而，CAR的问题是信号通过胞质内scFv-TCRζ单一链结构域时不能完全复制多链的TCR信号复合体。因此，本领域需要开发能够增加T细胞功能和增殖的CAR基因。
发明内容
本发明提供了一种重组CAR基因，使用该重组CAR基因及含有该重组CAR基因的载体转染T淋巴细胞的效率高，且经转染后的阳性T淋巴细胞具有较好的增殖能力。本发明利用CD30抗体抗原结合部分构建的重组CAR表达于T细胞表面，可特异性地杀伤CD30阳性的肿瘤细胞。本发明所述重组CAR基因对CD30阳性肿瘤特异性高，促使CAR-T特异性杀伤例如霍奇金淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤。
在一个方面，本发明提供了一种分离的重组核酸(CAR重组基因)，其编码包含如下部分的多肽：CD30抗体的抗原结合部分，跨膜部分，以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区，其中所述重组核酸任选还包含编码信号肽的核苷酸序列。
在一个方面，本发明提供了一种CAR融合蛋白，其包括：CD30抗体的抗原结合部分，跨膜部分，以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。
在一个方面，本发明提供了一种重组T淋巴细胞，其具有包括如下部分的融合多肽：CD30抗体的抗原结合部分，跨膜部分，以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患者的霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的方法，包括给患者施用一种重组T淋巴细胞，其具有包括如下部分的融合多肽：CD30抗体的抗原结合部分，跨膜部分，以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。
图1为淋巴细胞体外扩增结果图。
图2为感染原代T细胞的流式细胞结果图，显示感染效率约为64.7％。
图3为慢病毒感染原代培养的T细胞的结果图，左图为免疫荧光图，右图为明场图。感染效率约60％。
图4为CART-30scFv质粒载体图谱。
图5为pLent-EF1a质粒载体图谱。
图6为pLent-EF1a-Nluc-P2A-Puro-CMV-CD30慢病毒质粒图谱。
图7为患者回输CART细胞后CD8阳性T细胞/CD4阳性T细胞比例示意图，其中最高时CD8/CD4比例约为11。
虽然在此示出并描述了本发明的各个实施方案和各方面，但是本领域技术人员显然了解这些实施方案和各个方面只是举例说明本发明。本领域技术人员在不偏离本发明精神的范围内可以进行多种变化、改变和替代。应理解本文所述的本发明的实施方案的各种替代选择可用于本发明的实施中。
除非另有说明或者上下文明显，本文所用的缩写具有其在化学和生物学领域内的常规含义，本文示例陈述的化学结构和化学式应根据化学领域已知的化合价的标准规则加以理解。
在一个方面，本发明提供了一种分离的重组核酸(CAR重组基因)，其编码包含如下部分的多肽：
CD30抗体的抗原结合部分，
跨膜部分，以及
以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区，
其中所述重组核酸任选还包含编码信号肽的核苷酸序列。
在一个方面，本发明提供了一种CAR融合蛋白，其包括：
CD30抗体的抗原结合部分，
跨膜部分，以及
以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。
术语“分离的”当用于核酸或蛋白质时，是指所述核酸或者蛋白质基本上不含其在天然状态下结合的其它细胞组分。其可以是例如均质状态，并且可以是干燥的或者在水溶液中。
本文所用术语“重组”当用于指代细胞、核酸、蛋白质或载体时，是指所述细胞、核酸、蛋白质或载体已被修饰或者是实验室方法的结果。因此，例如，重组蛋白质包括由实验室方法产生的蛋白质。重组蛋白质可以包括未在天然(非重组)形式的蛋白质中发现的氨基酸，或者可以包括已被修饰例如被标记的氨基酸残基。
本文所用术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸及其单链或双链形式聚合物，及其互补序列。术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”是指核苷酸线性序列。术语“核苷酸”典型地是指多核苷酸的单一单位，即单体。核苷酸可以是核糖核苷酸、 脱氧核糖核苷酸或者其修饰的版本。本文的核苷酸序列的例子包括单链和双链DNA，单链和双链RNA(包括siRNA)，及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂交分子。本文所用核酸也指具有与天然发生的核酸相同的基本化学结构的核酸。这种类似物具有修饰的糖和/或修饰的环取代基，但是保持与天然发生的核酸相同的基本化学结构。核酸模拟物是指具有不同于核酸的一般化学结构的结构但是以类似于天然发生的核酸的方式起作用的化合物。这种类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸，和肽-核酸(PNA)。
本文中术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基聚合物。所述术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基是相应天然发生的氨基酸的人工化学模拟物，所述术语还适用于天然发生的氨基酸聚合物和非天然发生的氨基酸聚合物。术语“氨基酸”是指天然发生的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和以类似于天然发生的氨基酸的方式起作用的氨基酸模拟物。天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及被后来修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然发生的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸通常化学结构的结构但是以类似于天然发生的氨基酸的方式起作用的化合物。在本文中氨基酸可以通过已知的三字母符号代表，或者通过IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission推荐的单字母符号代表。类似地核苷酸可以用通常接受的单字母符号代表。
CD30是位于激活的淋巴细胞上的一种膜蛋白受体，属于肿瘤坏死因子家族成员，为霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤的肿瘤标志物。TRAF2和TRAF5与CD30结合之后能够激活细胞内核因子-κB分子通路，从而导致细胞的增殖和凋亡异常，引发肿瘤。
本文所用术语“抗体”是指特异性结合和识别抗原的包含来自免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其部分。公认的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε和μ恒定区基因，以及免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为α，γ，δ，ε或μ，其限定免疫球蛋白类别，分别为IgA，IgG，IgD，IgE和IgM。典型地，抗体的抗原结合区在决定结合的特异性和亲和性方面起显著作用。在一些实施方案中，抗体或抗体片段可以衍生自不同生物体，包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、骆驼等。
天然抗体分子含有两个相同多肽链对，每对具有一个轻链和一个重链。每个轻链 和重链由两个区域组成：参与结合靶抗原的可变(“V”)区，及与免疫系统的其它组分相互作用的恒定(“C”)区。轻链和重链可变区在3维空间中一起形成结合抗原(例如细胞表面上的受体)的可变区。在每个轻链或重链可变区内，有3个互补决定区(CDR)。抗体可变结构域中的这六个CDR(3个来自轻链，3个来自重链)在3维空间中折叠形成实际的抗体结合位点。CDR的位置和长度已被Kabat，E.et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services，1983，1987精确限定。未包含在CDR中的可变区部分称为构架(FR)，其形成CDR的环境。
在本发明中，抗原结合部分具有本领域技术人员通常已知的含义，是指能够特异性结合靶抗原的部分。例如，抗体的“抗原结合部分”可以通过重组DNA技术或者通过酶或化学切割完整的抗体而产生，包括Fab、Fab′、F(ab′)
2、Fv和单链抗体(scFv)。抗体或其片段其制备及使用是熟知的并且公开在例如Harlow，E.and Lane，D.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1999。
“特异性结合”当指抗体时，是指确定抗原存在的结合反应，通常是在抗原和其它生物制品的异质群体中。因此，在所指定的测定条件下，抗体结合于特定抗原是背景的至少两倍，更典型地是背景的10-100倍以上。在这种条件下与抗体的特异性结合典型需要根据其对于一特定抗原的特异性而选择的抗体。例如，可以选择多克隆抗体以获得仅特异性与选择的抗原免疫反应而不与其它物质免疫反应的抗体亚集。这一选择可以通过去除与其它分子交叉反应的抗体而实现。可以使用各种免疫测定形式来选择特异性与特定抗原免疫反应的抗体，例如ELISA(参见例如Harlow&Lane，Using Antibodies，A Laboratory Manual(1998)，其描述了可以用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件)。
在一个实施方案中，本发明所述的CD30抗体抗原结合部分选自抗原结合片段Fab、Fab’和F(ab’)
2、Fv或单链抗体(scFv)。
在一个实施方案中，所述CD30抗体的重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列以及轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
已知胃蛋白酶消化完整抗体产生F(ab)’
2，其是Fab二聚体，Fab本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)’
2可以在温和条件下还原以打破铰链区的二硫键，由此将F(ab)’
2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体基本上是具有部分铰链区的抗原结合部 分(参见Fundamental Immunology(Paul ed.，3d ed.1993)。尽管各种抗体片段是基于完整抗体的消化而限定，但是本领域技术人员理解这种片段可以经化学从头合成或者用重组DNA方法学从头合成。因此，本文所用术语抗原结合部分包括由修饰完整抗体产生的抗体片段或者用重组DNA方法学从头合成的抗体片段(例如单链Fv)或者用噬菌体展示文库鉴别的抗体片段(参见例如McCafferty et al.，Nature 348：552-554(1990))。
单链可变片段(scFv)典型地是免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)经10到大约25个氨基酸的短接头肽连接的融合蛋白。接头通常富含甘氨酸以具有柔性，及具有丝氨酸或苏氨酸以具有溶解性。接头可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或者与之相反。连接VH与VL的接头可以是本领域已知的任何合适接头，例如(GGGS)
n，其中n是1至10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9。
在一个实施方案中，本发明所述CD30抗体的抗原结合部分是单链抗体(scFv)，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)以任意顺序直接或通过接头连接，从N至C端例如是：VH-VL、VL-VH、VH-接头-VL或VL-接头-VH。
在一个实施方案中，本发明所述CD30抗体的抗原结合部分选自scF
V，例如包含或由SEQ ID NO：3或31组成。
在本发明中，术语“跨膜部分”和“跨膜区”可互换使用，具有本领域技术人员通常已知的含义，指跨膜蛋白中连接蛋白的胞外区和胞内区的部分，其跨越细胞膜，例如通常为α-螺旋结构，约20～25个氨基酸残基。构成蛋白质跨膜部分的氨基酸大部分是疏水性氨基酸。本文所述的跨膜部分能够将本文及其实施方案中提供的重组CAR基因编码的蛋白质锚定在生物学膜(例如T细胞的细胞膜)中。能够锚定本文及其实施方案中提供的重组CAR基因编码的蛋白质的任何跨膜结构域均包括在本发明中。
在一个实施方案中，可用于本发明CAR重组基因或CAR融合蛋白的跨膜部分选自CD分子的跨膜部分，例如选自CD30分子的跨膜部分、CD8分子的跨膜部分、CD28分子的跨膜部分、41BB分子的跨膜部分和CD3zeta分子的跨膜部分。
在一个实施方案中，本发明CAR重组基因或CAR融合蛋白的跨膜部分是CD8分子的跨膜部分。本文提供的术语″CD分子跨膜部分″包括任何重组或天然发生形式的CD分子跨膜结构域，或者保持CD分子跨膜结构域活性(例如与CD分子跨膜结构域相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)的变体或同系物。在一些方面，所述变体或同系物与天然发生的CD分子跨膜结构域多肽相 比在全序列或部分序列(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)范围内具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列相同性。
在一个实施方案中，CD8跨膜结构域是包含SEQ ID NO：4的蛋白质、其同系物或功能片段。在一个实施方案中，所述CD8分子的跨膜部分包含或由SEQ ID NO：4或5所示的氨基酸序列组成，所述编码CD8分子的跨膜部分的核酸序列例如包含或由SEQ ID NO：10或11组成。
在一个实施方案中，本发明所述跨膜部分(例如CD8跨膜结构域)与所述CD30抗体抗原结合部分的C端(例如重链可变区或轻链可变区的C端)连接。
在本发明中，术语“胞浆部分”和“胞浆功能区”可互换使用，包括能够提供应答抗原与本文实施方案中提供的抗原结合部分的结合的初级信号传导的氨基酸序列，导致表达CAR基因的T细胞的活化和/或增殖(细胞分裂)。
本发明所述CAR重组基因或CAR融合蛋白的胞浆部分包含CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。
CD137分子是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员，是除CD28/B7之外的另一重要的介导T细胞活化的共刺激分子。主要分布在活化的CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞和NK细胞表面。CD137分子的胞浆功能区含有5个氨基酸的保守序列，可介导T细胞活化的第二信号。本发明所述CD137分子的胞浆功能区是指能够介导T细胞活化的CD137分子胞浆区的全部或一部分。优选地，所述CD137分子的胞浆功能区包含或由SEQ ID NO：6所示的氨基酸组成，所述编码CD137分子的胞浆功能区的核酸序列例如SEQ ID NO：12所示。
CD3zeta分子是一种T细胞刺激因子，也是T细胞共受体复合物的成员之一。CD3胞质段含三个ITAM，可引发T细胞的分裂和细胞因子的释放。本发明所述CD3zeta分子的胞浆功能区是指包含所述3个ITAM并可引发T细胞分裂和细胞因子释放的CD3zeta分子胞浆区的全部或一部分。优选地，所述CD3zeta分子的胞浆功能区包含或由SEQ ID NO：7所示的氨基酸组成，所述编码CD3zeta分子的胞浆功能区的核酸序列例如SEQ ID NO：13所示。
在本发明CAR重组基因或CAR融合蛋白中，CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区可以任意顺序连接，例如CD137胞浆功能区-CD3zeta胞浆功能区；或CD3zeta胞浆功能区-CD137胞浆功能区。
在一个实施方案中，在本发明CAR重组基因或CAR融合蛋白中所述胞浆功能区 从N至C端以CD137胞浆功能区-CD3zeta胞浆功能区的顺序连接。
在一个实施方案中，本发明分离的重组核酸从5′到3′方向编码：CD30抗体的抗原结合部分(例如scFv)、跨膜部分和胞浆部分。
在一个实施方案中，本发明所述重组CAR基因从5’至3’方向编码以如下顺序连接的部分：
CD30抗体的scFV-跨膜部分(例如CD8跨膜结构域)-CD137胞浆功能区-CD3zeta胞浆功能区，任选在CD30抗体的scFV和跨膜部分之间存在间隔子区。
在一个实施方案中，本发明CAR重组基因包含编码位于CD30抗体的抗原结合部分和跨膜部分之间的间隔子区的核苷酸序列，所述间隔子区可以用于纯化或其他目的。
本文所述的“间隔子区”是连接抗原结合部分与跨膜部分的多肽。在一些实施方案中，间隔子区连接重链恒定区与跨膜部分。在一些实施方案中，间隔子区包括Fc区，例如IgG Fc，如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。间隔子区的例子包括不限于免疫球蛋白分子或其片段(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)和包括影响Fc受体结合的突变的免疫球蛋白分子或其片段(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在一些实施方案中，间隔子区是IgG(例如IgG4)的片段，其中所述片段包括CH2结构域的缺失。
间隔子区可以是肽接头。在一些实施方案中，间隔子区是丝氨酸-甘氨酸接头。在一些实施方案中，间隔子区具有序列GGSG(SEQ ID NO：14)。在一些实施方案中，间隔子区具有序列GSGSGSGS(SEQ ID NO：15)。在一些实施方案中，间隔子区至少4个氨基酸长。在一些实施方案中，间隔子区是大约4个氨基酸长。在一些实施方案中，间隔子区是4到250个氨基酸长。间隔子区可以包括能够延长本文提供的蛋白质的体内(例如血浆)半衰期的残基。在一些实施方案中，间隔子区是10个氨基酸长。在一些实施方案中，间隔子区是GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：16)。在一些实施方案中，本发明CAR重组基因不包括编码间隔子区的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的分离的重组核酸包括编码接头结构域的接头序列，所述接头结构域位于跨膜部分和胞内结构域之间，例如GGCGG(SEQ ID NO：17)或GGG。
术语“信号肽”在本文中是指其在本领域中的通常含义，是指具有大约5-30个氨基酸的肽。信号肽存在于新合成的组成分泌途径的一部分的蛋白质的N末端。分泌途径的蛋白质包括但不限于位于一些细胞器(内质网、高尔基体或内体)内部的蛋白质，从细胞分泌的蛋白质或者插入到细胞膜中的蛋白质。在一个实施方案中，所示信号肽 例如是MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：18)。
在一个实施方案中，本发明所述分离的重组核酸从5′到3′末端编码：信号肽、重链可变区序列、任选存在的接头序列、轻链可变区序列、间隔子序列、跨膜部分序列、肽接头序列和胞浆区序列。
在一个实施方案中，本发明所述的融合蛋白从N到C端包括：CD30抗体的抗原结合部分、间隔子序列、跨膜部分序列、肽接头序列和胞浆区序列。
在一个实施方案中，本发明所述的融合蛋白从N到C端包括：CD30抗体的ScFv、间隔子序列、跨膜部分序列、肽接头序列和胞浆区序列。
在一个实施方案中，本发明所述的融合蛋白从N到C端包括：(i)任选存在的信号肽、(ii)SEQ ID NO：2所示的序列、(iii)任选存在的接头、(iv)SEQ ID NO：1所示的序列、(v)跨膜部分序列和(vi)胞浆区序列。
在一个实施方案中，本发明所述的融合蛋白从N到C端包括：(i)任选存在的信号肽、(ii)SEQ ID NO：3所示的序列、(iii)跨膜部分序列和(iv)胞浆区序列。
在一个实施方案中，本发明所述重组CAR基因的核苷酸序列包含或由SEQ ID NO：20或21组成。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含或由SEQ ID NO：19或22所示的氨基酸序列组成。
在另一方面，本发明还提供本发明所述的CAR重组基因编码的融合多肽。
在另一方面，本发明还提供包含本发明所述CAR重组基因的载体。所述的载体包括表达载体、质粒、慢病毒、逆转录病毒载体等。如本文所用，“表达载体”是重组或者合成产生的核酸构建体，其具有一系列指定核酸元件，所述核酸元件允许特定核酸在宿主细胞中转录，例如，表达载体除了编码要表达的核酸序列以外还可包括衍生自与用于表达的宿主相容的复制和控制序列以及赋予转染的细胞可选择表型的选择标记。本发明CAR重组基因可以被掺入质粒、病毒例如慢病毒或逆转录病毒载体中。本发明的载体可以是慢病毒质粒载体，如pLent-EF1a，也可以是慢病毒载体，如山东维真生物科技有限公司的LT88001载体。
在另一方面，本发明提供了一种制备重组T淋巴细胞的方法，包括将T淋巴细胞用本发明所述的CAR重组基因或包含其的重组载体、或本发明所述的CAR融合蛋白转化。
术语“转化”是指将核酸分子或蛋白质导入细胞的方法。使用非病毒或基于病毒的方法将核酸导入细胞。核酸分子可以是编码完整蛋白质或其功能部分的基因序列。 非病毒转化方法包括不使用病毒DNA或病毒颗粒作为将核酸分子导入细胞的输送系统的任何合适方法。举例的非病毒转化方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、核染、超声处理、通过热休克转染、磁转染和电穿孔。在一些实施方案中，核酸分子根据本领域公知的标准程序用电穿孔导入细胞中。对于基于病毒的转化方法，在本文所述方法中可以使用任何有用的病毒载体。病毒载体的例子包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体。在一些实施方案中，核酸分子根据本领域公知的标准程序用逆转录病毒载体导入细胞中。用载体转化细胞的方法是本领域熟知的，例如可参见Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))所述。术语“转化”还指将蛋白质从外部环境导入细胞中。典型地，蛋白质转化依赖于能穿过细胞膜的肽或蛋白质附着于感兴趣的蛋白质。参见例如Ford et al.(2001)Gene Therapy 8：1-4 and Prochiantz(2007)Nat.Methods 4：119-20。
在一个实施方案中，转化的T淋巴细胞在体外扩增至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天。培养扩增T淋巴细胞的方法为本领域技术人员所熟知，例如参见
Human T-Activator CD3/CD28(Cat.Nos：11131D，11132D和11161D，Life Technologies AS，Norway)。
在另一方面，本发明提供了一种T淋巴细胞，其具有本发明所述的CAR融合蛋白，例如在细胞膜上。
在一个实施方案，所述T淋巴细胞可以用本发明制备重组T淋巴细胞的方法的获得，即用本发明所述的CAR重组基因或包含所述CAR重组基因的载体、本发明所述的CAR融合蛋白转化T淋巴细胞，以及任选在体外扩增，如前所述。
在另一方面，本发明提供了一种治疗对象中CD30阳性肿瘤例如霍奇金淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤的方法，包括给需要其的对象施用治疗有效量的本发明提供的重组T淋巴细胞。
本文所用的术语“治疗”指缓解肿瘤的至少一种症状。该术语包括向对象给药和/或应用一种或多种本文所述重组基因、载体或T细胞和/或包括其的药物以提供肿瘤的管理或治疗。用于本公开目的的“治疗”可以但不必须提供治愈；而是指，“治疗”可以是病症的管理形式。如本文所用，“治疗”患有肿瘤的对象是指对象的肿瘤部分或完全消除，或者在治疗后保持稳定不再进展。治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防是指防止潜在肿瘤发生和/或防止肿瘤恶化或肿瘤的进展，防止肿瘤发生包括减轻或消 除导致肿瘤发生的一或多种风险因子；因为通常不能确定肿瘤否从未发生，因此防止还包括降低发生或患有肿瘤的风险。当本文用于处理有害的增殖细胞(包括癌)时，“治疗”包括部分或完全破坏所述有害的增殖细胞，但对正常细胞的破坏影响最小。
本文所述“患者”或者“有需要的对象”是指患有或者易于患有可以通过给予本文提供的组合物或药物组合物治疗的疾病或病症的生物体。非限制性例子包括人、其它哺乳动物例如牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛、鹿，及其它非哺乳动物。在一些实施方案中，患者或对象是人。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指至少足以在对象中产生治疗作用的剂量配制品中的药剂、化合物、材料的量。精确量取决于治疗目的，并且可以由本领域技术人员使用已知技术确定(参见例如Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3，1992)；Lloyd，The Art，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar，Dosage Calculations(1999)；and Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Edition，2003，Gennaro，Ed.，Lippincott，Williams&Wilkins)。
如本文所用，术语“施用”是指通过任何合适途径给予，包括例如静脉内、小动脉内、心室内和淋巴组织内等。
在一些实施方案中，所述方法包括给患者多次施用所述T淋巴细胞。施用的剂量和间隔时间使得CART细胞在体内持续存在并杀伤肿瘤细胞，而且输注后的细胞因子风暴表现轻微。
在一些实施方案中，所述方法包括给患者施用2次、3次、4次或更多次所述T淋巴细胞，其中每次施用可以间隔合适的时间，例如7-60天，如约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40或约50天。
在一些实施方案中，每次施用的T淋巴细胞剂量为1×10
5细胞/kg体重-1×10
8细胞/kg体重，例如约5×10
5细胞/kg体重、约1×10
6细胞/kg体重、约5×10
6细胞/kg体重、约1×10
7胞/kg体重、约5×10
7细胞/kg体重。
在一些实施方案中，本发明所述T淋巴细胞是自体T淋巴细胞。
在一些实施方案中，本发明所述T淋巴细胞是异体T淋巴细胞。
在一个实施方案中，本发明所述治疗对象中CD30阳性肿瘤的方法包括如下步骤：
(i)获得对象的T淋巴细胞；
(ii)用本发明的CAR重组基因或包含所述CAR重组基因的载体转化步骤(i)的T 淋巴细胞，任选扩增转化的T淋巴细胞，例如至少7-14天，例如至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天；以及
(iii)将步骤(ii)获得的转化的、任选扩增的T淋巴细胞施用给对象，任选多次施用给患者，每次间隔例如7-30天，每次剂量例如为约1×10
6细胞/kg体重。
在另一方面，本发明提供了用于治疗CD30阳性肿瘤例如霍奇金淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤的药物或试剂盒，其包含本发明所述的CAR重组基因、本发明所述CAR融合蛋白、包含所述CAR重组基因的载体、本发明所述重组T淋巴细胞，任选包含药物可接受的载体。
“药物可接受的载体”是指有助于活性物质给予对象且对象吸收的物质，其可以包括在本发明组合物中而不引起患者的显著毒副作用。药物可接受载体的非限制性例子包括水、NaCl、生理盐水、蔗糖、葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、香味剂、盐溶液、醇、油、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸脂、羟甲基纤维素、聚乙烯比咯烷酮和着色剂等。本领域技术人员理解其它药物载体可以用于本发明。
在另一方面，本发明提供了本发明CAR重组基因、包含所述CAR重组基因的载体在制备重组T淋巴细胞中的应用。
在另一方面，本发明提供了本发明所述CAR重组基因、本发明所述CAR融合蛋白、包含本发明所述CAR重组基因的载体、或本发明所述重组T淋巴细胞在制备用于治疗CD30阳性肿瘤例如霍奇金淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤的药物或试剂盒中的应用。
在另一方面，本发明提供了本发明所述CAR重组基因、本发明所述CAR融合蛋白、包含本发明所述CAR重组基因的载体、或本发明所述重组T淋巴细胞，用于治疗CD30阳性肿瘤例如霍奇金淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤。
如本文所用，“任选存在的”或“任选”意味着随后描述的事件或情况发生或不发生，以及所述描述包括所述事件或情况发生的情况和其不发生的情况。
本发明提供的重组CAR基因，以及包含所述重组CAR基因的载体和用所述重组CAR基因或包含所述重组CAR基因的载体转化得到的T细胞对CD30阳性肿瘤的特异性高。将所述的重组CAR基因通过AsisI/NsiI双酶切连入慢病毒质粒载体pLent-EF1a中，构建CART-30scFv质粒，利用该质粒进行慢病毒包装和纯化，通过慢病毒载体技术将重组CAR基因表达于患者T细胞，所述的CAR-T细胞的转染率高， 可达到64.7％，且经转染后的阳性T细胞具有较好的增殖能力，经体外约2周扩增后，CD3阳性T细胞增加560倍。
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。
在本发明中，术语“Nluc-P2A-CD30”核苷酸序列指从5’到3’编码
Luciferase基因、P2A基因和CD30基因的核苷酸序列，其中CD30编码基因的核苷酸序列例如如SEQ ID NO：27所示，P2A编码基因的核苷酸序列例如如SEQ ID NO：28所示，
Luciferase编码基因的核苷酸序列例如如SEQ ID NO：29所示；术语“pLent-EF1a-Nluc-P2A-Puro-CMV-CD30”指插入了
Luciferase、P2A和CD30编码序列的Plent-EF1α-Puro-CMV慢病毒载体；术语“ddH
2O”指双蒸水；术语“FBS”指胎牛血清；术语“PEI”指聚乙烯亚胺。
本发明中，Plent-EF1α-Puro-CMV载体、助感染试剂ADV-HR购自维真生物科技有限公司；限制性内切酶Asis I和MluI、T4DNA连接酶购自NEB公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；发光检测仪、Nano-GloTM荧光素酶检测试剂盒，购自Promega公司；HEK293、HEK293T细胞购自ATCC；DMEM培养基购自Hyclone公司；PMD2G质粒和PSPAX2质粒购自Invitrogen公司；裂解液为
Luciferase Assay，购自Promega公司。
核苷酸序列合成委托金斯瑞生物科技有限公司完成。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例1：CART-30scFv质粒的构建
CART-30scFv质粒的获得方法：设计3个CD30抗体的scFv的编码核苷酸序列(包括CD8a信号肽编码序列(SEQ ID NO：26)和分别由SEQ ID NO：23、24和25所示的scFv片段编码序列)，并与SEQ ID NO：11、12和13所示序列连接，形成3个CAR基因：
CAR1：由SEQ ID NO：26、23、11、12和13组成；
CAR2：由SEQ ID NO：26、24、11、12和13组成；和
CAR3：由SEQ ID NO：26、25、11、12和13组成(SEQ ID NO：21)。
将重组CAR1-3基因全序列合成(金斯瑞生物科技有限公司)，通过AsisI/NsiI(NEB公司)双酶切分别连入慢病毒质粒载体pLent-EF1a(维真生物科技有限公司)中。构建的CART-30scFv质粒及pLent-EF1a的质粒图谱见图4和图5。
实施例2：T淋巴细胞转染
将实施例1构建的CART-30scFv质粒进行慢病毒包装和纯化，进而使用慢病毒载体技术(参考文献：Tumaini B，Lee DW，Lin T，Castiello L，et al.Simplified process for the production of anti-CD19-CAR engineered T cells.Cytotherapy.2013；15(11)：1406-1415)将重组CAR基因表达于T淋巴细胞，并采用流式细胞仪检测感染阳性率，结果见图2和3。慢病毒感染T淋巴细胞的转染效率约为60％。
实施例3：体外杀伤率检测
1.构建CAR-T细胞毒性指示载体：根据中国专利申请201610537806.3所述方法构建。简言之：
(1)合成编码
Luciferase、P2A和CD30的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)，并在上下游分别引入Asis I和MluI酶切位点；
(2)使用Asis I和MluI于37℃酶切Plent-EF1α-Puro-CMV载体和步骤(1)得到的
Luciferase-P2A-CD30序列，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的
Luciferase-P2A-CD30序列和Plent-EF 1α-Puro-CMV载体；
(3)将酶切的
Luciferase-P2A-CD30序列和Plent-EF1α-Puro-CMV载体于22℃连接2小时，连接产物采用化学法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到细胞毒性指示载体pLent-EF1a-Nluc-P2A-Puro-CMV-CD30。
2.体外毒性检测
获得的pLent-EF1a-Nluc-P2A-Puro-CMV-CD30慢病毒质粒图谱见图6。细胞传代之后的第二天将pLent-EF1a-Nluc-P2A-Puro-CMV-CD30质粒转染HEK293细胞系，第三天分到96孔板，10
4个细胞每孔。
将实施例2获得的每种CART-30效应细胞与pLent-EF1a-Nluc-P2A-Puro-CMV-CD30质粒转染HEK293细胞设三个浓度比例：10∶1，2∶1，和0∶1。作用时间均为18个小时，之后离心，使用荧光光度计Luminometer测量上清的nanoluc值，然后测沉淀的nanoluc值。杀伤效率根据如下公式计算：上清nanoluc值/(上清+沉淀nanoluc值)×100％。
表1：CAR-T细胞对CD30阳性细胞的杀伤效果
| 表达的CAR基因 | 杀伤率(％) |
| CAR1 | 45 |
| CAR2 | 30 |
| CAR3 | 76 |
结果显示，含有本发明重组CAR3基因的CAR-T细胞可特异性识别CD30抗原，对CD30阳性细胞具有较强的杀伤效率，达到60％以上，显示出在细胞免疫治疗肿瘤中巨大的潜力。
实施例4：转染后T淋巴细胞的体外增殖能力检测
将实施例2获得的转染CAR3重组基因的T淋巴细胞(CAR-T细胞)在体外扩增2周(
Human T-Activator CD3/CD28(Cat.Nos：11131D，11132D和11161D，Life Technologies AS，Norway))，结果见图1。从图中可见，转染13天后，T细胞扩增了560倍。
实施例5：CAR-T细胞治疗CD30阳性淋巴瘤
筛选经临床确诊为CD30阳性的霍奇金淋巴瘤志愿患者共20例。所有志愿患者的年龄≥18岁，预期寿命＞12周，经检测，肌酸酐＜2.5mg/dl，ALT/AST＜3×正常值，胆红素＜2.0mg/dl，并具有足够的静脉通路进行血浆分离置换法，且对白细胞去除术无其他禁忌症。获得了所有参与临床试验的患者的知情同意书。
志愿患者在注射CAR-T细胞之前，进行5天的化疗治疗。化疗的目的是减少淋巴球以促进CAR-T细胞的移植成活率及稳态扩展，同时也减少了肿瘤负荷。化疗方案的选择将依据患者的基础疾病及之前的治疗方法。在化疗完成后的1-2天给予CAR-T细胞进行治疗。
使用CAR-T细胞治疗的方案具体为：采集50-100ml志愿患者的外周血于肝素抗凝管中，然后进行单个核细胞的分离，将患者T细胞感染包含实施例1的CAR3重组基因的慢病毒并且在体外进行大量扩增1-2周后，得到大约2.5-5×10
9个自体T细胞，然后将得到的CAR-T细胞回输给患者体内。
首次剂量约1×10
6/kg体重CART细胞将使用分割剂量执行，第0天(10％)，第1天(30％)，第2天(60％)。如可耐受，约10-15min完成输注。受试者的生命体征和血氧饱和度会在给药前，输注完成后及其后的1h内每15min监测一次，直到这些指标稳定且正常。输注前及完成输注后20min将会各采集一份血样以确定CAR-T 的基线水平。首次输注前及每次输注后2小时需检测血钾和血尿酸值。输注后每周检测细胞因子干扰素γ，白介素2和白介素6以及QPCR定量检测CART的DNA含量。
若患者对首次剂量耐受，将于第30天和第60天进行CAR-T细胞的第二次和第三次输注。剂量均为约1×10
6/kg体重CART细胞。输注后2小时抽血检测血钾及血尿酸值。输注后每周检测细胞因子干扰素γ，白介素2和白介素6以及QPCR定量检测CART的DNA含量。
如果制成的CART细胞足够，而且患者对CART细胞有反应，表现为首次输注一个月内肿瘤明显缩小，也将进行更多次的输注，直至CART细胞使用完毕。将总剂量分割成多个1×10
6/kg体重CART细胞，采用间隔一个月的多次输注方式，使得CART细胞在体内持续存在，持续杀伤肿瘤细胞，而且主要的优势是输注后的细胞因子风暴表现非常轻微，患者可以在门诊完成输注，避免了反复住院的高额费用。
输注CAR-T细胞后的2-6月受试者将每月返回医院一次。在这些研究随访中受试者将接受：合并用药，体格检查，记录不良事件，抽血检验血液学、生化、CAR-T细胞的存活率以及PETCT检测肿瘤大小变化。
受试者输注后2年内均会进行季度评估。在这些研究随访过程中受试者将接受：合并用药，体格检查，记录不良事件，抽血检验血液学、生化、CAR-T细胞的存活率。
结果：正常人血液内调节性T细胞为CD4阳性，杀伤性T细胞为CD8阳性，CD8/CD4的比例约为1∶2，患者回输CART细胞后其CD8阳性T细胞比率显著升高，最高时CD8/CD4比例为11，图7。
评价2年内霍奇金淋巴瘤志愿患者症状缓解的情况，结果见表2。
表2：CAR-T细胞对CD30阳性霍奇金淋巴瘤的治疗效果
| 组别 | 例数 | 症状完全缓解的例数 | 完全缓解(％) |
| 霍奇金淋巴瘤 | 20 | 14 | 70.0 |
结果显示，CD30阳性霍奇金淋巴瘤志愿患者经含有本发明重组CAR3基因的CAR-T细治疗，疗效显著，症状完全缓解率高达70％。
Claims (20)
- 一种分离的重组核酸，其自5’至3’包含编码如下的核苷酸序列：CD30抗体的抗原结合部分，例如选自scFv、Fab、Fab’、Fv或F(ab’) 2，优选scFv，跨膜部分，例如选自CD30分子的跨膜部分、CD8分子的跨膜部分、CD28分子的跨膜部分、41BB分子的跨膜部分或CD3zeta分子的跨膜部分；以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区，所述重组核酸任选包含编码例如SEQ ID NO：18所示的信号肽的核苷酸序列。
- 权利要求1所述的重组核酸，其中，所述CD30抗体的重链可变区(VH)包含或由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列组成，并且所述CD30抗体的轻链可变区(VL)包含或由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成。
- 权利要求1或2所述的重组核酸，其中，所述CD30抗体的抗原结合部分包含或由SEQ ID NO：3或31所示的氨基酸序列组成。
- 权利要求1-3任一项所述的重组核酸，其中，所述跨膜部分选自CD8分子的跨膜部分，例如包含或由SEQ ID NO：4或5所示氨基酸序列组成。
- 权利要求1-4任一项所述的重组核酸，其中：CD137胞浆功能区的氨基酸序列包含或由SEQ ID NO：6组成；和/或所述CD3zeta胞浆功能区的氨基酸序列包含或由SEQ ID NO：7组成。
- 权利要求1-5任一项所述的重组核酸，其中：所述重组核酸从5’至3’方向包含或由编码如下顺序连接的部分的核苷酸序列组成：CD30抗体的抗原结合部分-跨膜部分-CD137胞浆功能区-CD3zeta胞浆功能区。
- 权利要求1-6任一所述的重组核酸，其包含或由SEQ ID NO：20或21所示的序列组成。
- 一种融合多肽，其由权利要求1-7任一项的核酸编码。
- 权利要求8的融合多肽，其包含或由SEQ ID NO：19或22所示的序列组成。
- 一种重组载体，其包含权利要求1-7任一项所述的重组核酸，任选所述载体为质粒、慢病毒或逆转录病毒。
- 一种制备重组T淋巴细胞的方法，包括将T淋巴细胞用权利要求1-7任一项所述的重组核酸、权利要求8或9的融合多肽、或权利要求10所述的重组载体转化，任选将转化的T淋巴细胞扩增至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天。
- 一种重组T淋巴细胞，其具有权利要求8或9的融合多肽，任选通过权利要求11的方法获得。
- 权利要求1-7任一项所述的重组核酸、权利要求8或9的融合多肽或权利要求10所述的重组载体在制备重组T淋巴细胞中的应用。
- 权利要求1-7任一项所述的重组核酸、权利要求8或9所述的融合多肽、权利要求10所述的重组载体、或权利要求12所述的T淋巴细胞在制备用于治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的药物或试剂盒中的应用。
- 一种用于治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的药物或试剂盒，其包含：权利要求1-7任一项所述的重组核酸、权利要求8或9所述的融合多肽、权利要求10所述的重组载体或权利要求12所述的T淋巴细胞，以及药物可接受的载体。
- 一种用于治疗患者的霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的方法，包括给患者施用权利要求12所述的T淋巴细胞。
- 权利要求16的方法，其中所述T淋巴细胞是自体T淋巴细胞或异源T淋巴细胞。
- 权利要求16或17的方法，包括给患者多次施用所述T淋巴细胞，例如2次、3次、4次或更多次，任选每次施用的T淋巴细胞剂量为1×10 5细胞/kg体重-1×10 8细胞/kg体重，例如约5×10 5细胞/kg体重、约1×10 6细胞/kg体重、约5×10 6细胞/kg体重、约1×10 7胞/kg体重或约5×10 7细胞/kg体重。
- 权利要求18的方法，其中每次施用间隔7-60天，例如约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40或约50天。
- 权利要求16-19任一项的方法，其包括如下步骤：(a)获得来自患者的T淋巴细胞；(b)用权利要求1-7任一项的重组核酸或权利要求10的载体转化所述T淋巴细胞，任选扩增转化的T淋巴细胞，例如至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天；以及(c)将转化的T淋巴细胞输送给患者，任选多次施用给患者，每次间隔例如约30天，每次剂量例如为约1×10 6细胞/kg体重。
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2018
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