JPH04504110A - 癌関連ハプトグロビン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 癌関連ハプトグロビン この研究は国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　 Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金により支援された。米国政府はこの発明に一定の権 利を保持する。

及咀ｑ汰癒北野 本発明は新生物組織から発現されるが大部分の正常組織からは発現されないヒト 蛋白質の分野に関する。

発朋Ω菫量 通常のヒト・ハプトグロビンは十分に研究されている；それらは４０年以上前に 発見され、それらの役割はヘモグロビンの血漿輸送であると考えられている。

ハプトグロビンの合成は主として肝臓で起こるが、いくつかの場合にはリンパ球 培養物と脳がハプトグロビンを合成すると報告された。

すべてのハプトグロビンは２種類のポリペプチド鎖、ベータ鎖とアルファ鎖、を 含んでいる。ベータ鎖はすべてのハプトグロビンにおいてほとんど同じであるが 、アルファ鎖は３つの型で存在している。２つのアルファ鏡型（Ｈｐｌ’および Ｈｐｌつは５４位のアミノ酸残基が１個相違するだけである。３つ目の型（Ｈｐ Ｚ）は他の２つのアルファ鎖のどちらよりも長く、明らかにアルファ鎖が部分的 に重複する不等乗換え（ｕｎｅｑｕａｌ　ｃｒｏｓｓｉｎｇ　ｏｖｅｒ）によっ て生じたものである。

１９８５年に、Ｍａｅｄａ　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ、　ｖｏｌ、２６０ ．　ｐ、６６９８−６７０９、この文献は特別にここに引用される）は通常のハ プトグロビン遺伝子座から２．２ｋｂ下流に位置するＤＮＡの領域を開示した。

このＤＮＡ配列は、この遺伝子座が理論蛋白質（そのアルファ鎖とベータ鎖は通 常のハプトグロビンと相違するが、高度に相同である）をコードする完全な遺伝 子を含むことを示した。Ｍａｅｄａはこの遺伝子座を“ハプトグロビン関連”と して旦２工と名付けた。数人の研究者はこの遺伝子の発現を検出するのに失敗し た。（Ｏｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ｖｏｌ、 ４７゜ｐ−５１２０−５１２６，１９８７；　Ｍａｅｄａ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　 ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　ｖｏｌ、２U０．　ｐ・ ６ ６９８−６７０９．１９８５；およびＢｅｎ５ｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　Ｅ ＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　ｖｏｌ、４．　ｐ、１１９（２６K １９８５）。

及呉二厘力 本発明の目的は、ｈｐｒ遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列を有 しかつｈｐｒ遺伝子産物に存在してハプトグロビンｌまたは２に存在しないエピ トープと免疫反応性である抗体の哺乳動物による生産を刺激する能力を有するポ リペプチドの実質的に純粋な調製物を提供することである。

本発明の他の目的は、Ｈｐｒ蛋白質と免疫反応性であってノ）ブトグロビンｌま たは２とは免疫反応性でない抗体の調製物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ＨｐｌおよびＨｐＺから実質的に精製されるＨｐｒ 蛋白質の調製物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ヒト細胞からＨｐｒ調製物を生産する方法を提供す ることである。

本発明の別の目的は、乳癌の予後を判定するためのキットおよび方法を提供する ことである。

本発明の他の目的は、固形腫瘍を有する患者の予後を判定する方法を提供するこ とである。

本発明の他の目的は、生物学的液体中のＨｐｒ蛋白質を検定する方法を提供する ことである。

本発明の他の目的は、患者の腫瘍細胞の増殖を検出する方法を提供することであ る。

これらの目的と本発明の他の目的は以下に記載する実施態様により実現される。

一実施態様において、ｈｐｒ遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列 を有するポリペプチドの実質的に純粋な調製物が提供される。このポリペプチド 調製物を哺乳動物に投与すると、それはｈｐｒ遺伝子産物に存在してノ＼ブトグ ロビン１または２に存在しないエビドーグと免疫反応性である抗体の生産を刺激 する。

本発明の他の実施態様では、Ｈｐｒ蛋白質と免疫反応性であってハプトグロビン ｌまたは２とは免疫反応性でない抗体の調製物が提供される。

本発明のさらに他の実施態様では、ＨｐｌおよびＨｐ２から実質的に精製される Ｈｐｒ蛋白質の調製物が提供される。

本発明の別の実施態様では、Ｈｐｒ調製物を生産する方法が提供される。ヒト乳 癌細胞はＨｐｒに存在してＨｐｌやＨｐ２に存在しないエピトープと反応する抗 体との免疫反応性について試験される。免疫反応性の乳癌細胞を培養し、この培 養細胞からＨｐｒを含む細胞質画分を回収する。別の実施態様では、ヒト脱落膜 または胎盤組織が集められる。Ｈｐｒ調製物を得るために、この脱落膜または胎 盤組織からＨｐｒ蛋白質を含む細胞質画分を回収する。

さらに別の実施態様では、乳癌の予後を判定するためのキットが提供される。

このキットはＨｐｒ蛋白質に存在してハプトグロビンｌまたは２に存在しないエ ピトープと免疫反応性である抗体の調製物、およびこの抗体を検出するための手 段を含んでいる。また、固形腫瘍の経過を判定する方法も提供され、この場合は 組織学的切片をＨｐｒ蛋白質と免疫反応性であってハプトグロビンｌまたは２と は免疫反応性でない抗体の調製物と接触させる。切州への抗体結合を測定する。

本発明の他の実施態様では、生物学的液体中のＨｐｒを検定する方法が提供され る。Ｈｐｒに存在してＨｐｌやＨｐ２に存在しないエピトープと免疫反応性の抗 体を担体に結合させ、次にこの担体と未知量のＨｐｒを含む生物学的液体とを抗 体−抗原複合体が安定して形成される条件下に接触させる。その後、担体はＨｐ ｒとエピトープを共有するがＨｐｌやＨｐ２とは共有しないポリペプチドと、抗 体−抗原複合体が安定して形成される条件下で接触させる。このポリペプチドは また、担体に結合されたポリペプチドの量が検出可能な成分を検出・定量するこ とにより定量化できるように、検出可能な成分を保有する。生物学的液体を担体 と接触させないで、この担体へのポリペプチドの１００％結合を測定する対照実 験も行われる。生物学的液体の存在下で観測された結合低下の量が生物学的液体 中のＨｐｒの量に関係づけられる。

本発明のさらに別の実施態様では、患者の腫瘍細胞の増殖を検出する方法が提供 される。腫瘍保持患者から生物学的液体を採取する。この液体中のＨｐｒの量を 定量化する。液体中に存在するＨｐｒの量は、検出できるａｍをもたない患者か ら集めた対照液体中のＨｐｒの量と比較する。腫瘍保持患者の液体中のＨｐｒの 量の増加は腫瘍細胞の増殖を示す。これらと他の実施態様は本発明の詳細な説明 において以下で述べることにする。

ハプトグロビンと違って、肝臓ではＨｐｒの合成が発見されていないという事実 にもかかわらず、本発明はＨｐｒを含む４種類の異なる供給源を提供する。ヒト 乳癌細胞、ヒト脱落膜、ヒト胎盤、およびヒト妊娠血清はすべてＨｐｒ特異的抗 体と特異的に交差反応する物質を含むことが見いだされた。さらに、Ｈｐｒは腫 瘍の侵入および初期転移の傾向を予告するための、ヒト固形腫瘍の特に有用な診 断マーカーであることが判明した。

盈里史！車１塁屋 図」は、Ｈｐｒ蛋白質の漸進的精製を示す。抗ＰＡＰＰ−Ａと反応性の血漿蛋白 質の段階的クロマトグラフィー精製のポリアクリルアミドゲル電気泳動および対 応するウェスタンプロットを示す。

図２は、勾配アニオン交換クロマトグラフィーによる免疫反応性重鎮および軽鎖 のポリアクリルアミドゲル電気泳動分離を示す。

図３は、（１）遺伝子配列から推定されたＨｐｒ蛋白質：（２）ハプトグロビン ｌ：および（３）ハプトグロビン２：の配列を示し、それぞれは妊娠血清から単 離した蛋白質のＮ末端ベータ鎖配列と整合しである。

図４は、ハプトグロビンｌ、ハプトグロビン２および精製した妊娠関連ハプトグ ロビン（Ｈｐｒ）のポリアクリルアミドゲル電気泳動分離、並びに抗ハプトグロ ビンおよび抗ＰＡＰＰ−Ａとの対応するイムノプロットを示す。

図５は、ハプトグロビン１１ハプトグロビン関連蛋白質（Ｈｐｒ）、ハプトグロ ビン２、およびハプトグロビンの混合物のハプトグロビンアルファ鎖のトリプシ ンペプチド地図を示す。

図６は、ハプトグロビンｌとハプトグロビン関連蛋白質のポリアクリルアミドゲ ル電気泳動を示す。パネルＢ−Ｅは同一蛋白質と種々の抗体調製物とのイムノプ ロットである。

図７のパネルＡは、合成ペプチド（その配列はｈｐｒ遺伝子に対応する）に対し て誘導された抗体を用いたヒト乳癌細胞の免疫組織化学的染色を示す。パネルＢ は同一の実験を示すが、ただし抗体は妊娠血清からの精製Ｈｐｒとブレインキュ ベートした。パネルＣは抗ＣＥＡによる染色を示し、抗ＣＥＡ染色はＨｐｒとの ブレインキュベーションにより阻止されなかった（パネルＤ）。

図８は、癌関連ハプトグロビン染色と乳癌の再発との相関関係を示す。

図９は、ｈｐｒ遺伝子の配列に従って合成したペプチドに対して誘導された抗体 による乳癌細胞系列の染色を示す。

図１０は、ｈｐｒ遺伝子からの推定配列に従って合成したペプチドに対して誘導 された抗体による脱落膜の染色を示す。

図１１は、ｈｐｒ遺伝子からの推定配列に従って合成したペプチドに対して誘導 された抗体によるヒト脱落膜中の反応性蛋白質のウェスタンプロット分析を示す 。

及盟り翌胆鼠朦里 これまで検出されなかったＨｐｒ蛋白質がいろいろなヒト細胞および組織に存在 しうるということは本発明の発見である。これらにはヒト乳癌組織、ヒト脱落膜 および胎盤、妊娠女性からの血清、および培養したヒト乳癌細胞系列が含まれる 。妊娠血清からのＨｐｒ蛋白質はＨｐｌとＨｐ２を実質的に含まないように物理 化学的方法を使って精製された。ヌクレオチド配列から推定されたＨｐｒ蛋白質 はハプトグロビンｌおよび２と非常に類似しているが、アルファ鎖のＮ末端に多 くのアミノ酸の相違が集中している。

次のアミノ酸配列をもつ合成ポリペプチドがつくられた：このポリペプチドはＭ ａｅｄａにより同定されたＨｐｒ遺伝子のヌクレオチド配列から推定された３４ 個のＮ末端アミノ酸にほぼ一致している。このペプチドはＨｐｒ’Ｍ伝子産物に 存在してハプトグロビン■または２に存在しないエピトープと免疫反応性である 抗体の哺乳動物による生産を刺激することができる。これらの抗体はヒト組織で のＨｐｒ発現を確実に検出するためばかりでなく、当分野でよく知られたイムノ アフィニティー技法を使ってＨｐｒを精製するためにも使用される。

ｈｐｒ遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド の実質的に純粋な調製物は、当分野で知られた技法のどれかを使ってつくること ができる。例えば、Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ。

ｖｏｌ、８５．　ｐ、２１４９−２１５４．１９６８）が使用される。実質的に 純粋とは、その調製物がハプトグロビン１および２をほとんど完全に含まないこ とを意味する。推定Ｈｐｒ蛋白質の３４個のＮ末端アミノ酸に一致する配列が使 用されたが、他のポリペプチドも同様に使用できる。他のポリペプチドはより長 くてもより短くてもよく、またＨｐｒに存在してＨｐｌやＨｐ２に存在しないエ ピトープを変えることのない保存的アミノ酸の変更を含んでいてもよい。ポリペ プチドはＨｐｒ、ハプトグロビンｌおよびハプトグロビン２のアミノ酸配列を比 較して、最大量の相違を有する配列の領域を利用することによってデザインされ る。Ｈｐｒ配列はＭａｅｄａ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ 　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　ｖｏｌ、２６０．　ｐ−６６９８−６７０９，１９８ ５の文献■■ 得られ、ハプトグロビン１および２の配列はナショナル・バイオメディカル・リ サーチ・ファウンデーションのデータベース、並びにＫｕｒｏｓｋｙ、　Ｐｒｏ ｃｅｅｄｌｎｓＯｒａ　Ｎａｔｉｏｎａｌ＾ｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃ ｅｓ　ＵＳＡ、　ｖｏｌ、７７、　ｐ、３３８ｇ−３３９２，１９８０；　Ｂｌ ≠モ求@ｅｔ ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、２１８．　ｐ、７３６−７４１．１９６８ ；　Ｂｌａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏ浮窒獅≠戟@ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｖｏｌ、４８．　ｐ、１２３−１３２．１９７０ ；およびＢｌａｃｋ　ａｔ　ａｌ、、　ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｖｏｌ、４８．　ｐ、１３３−１４６．１９７ ０から得られる。ポリペプチドは、それらがＨｐｒに存在してＨｐｌやＨｐ２に 存在しないエピトープと免疫反応性の抗体を生産すべく哺乳動物を刺激すること ができるかどうか調べるために試験される。抗体生産を刺激するように哺乳動物 を免疫する方法は当分野でよく知られている。また、既知抗原に対する抗体の免 疫反応性を試験する方法も周知である。

本発明の実質的に純粋なポリペプチド調製物はＨｐｒ蛋白質に特異的な抗体をア フィニティー精製するために使用される。さらに、本発明のポリペプチド調製物 はこの調製物で哺乳動物を免疫して哺乳動物による抗体生産を刺激するために使 用される。通常、この種の免疫法はキーホール・リンベット・ヘモシアニンのよ うな大きい免疫原物質へのポリペプチドの結合を使用するだろう。アフィニティ ー精製の場合には、ポリペプチドをアガロースビーズのような不活性マトリック スに結合させる。このような結合技術は当分野でよく知られている。ポリペプチ ド調製物はさらに抗体調製物中のＨｐｒ特異的抗体を定量するために使用される 。このような場合、合成ペプチドは通常ウシ血清アルブミンのような大きい不活 性の蛋白様物質に結合されるだろう。このような物質にポリペプチドを結合させ る技術も当分野でよく知られている。

上で述べたように、Ｈｐｒ蛋白質と免疫反応性であるがハプトグロビンｌまたは ２とは免疫反応性でないという点でＨｐｒ蛋白質に対して特異的である抗体は本 発明の合成ポリペプチドを使ってつくることができる。抗体を生産させるための ウサギ、マウス、ヤギなどの哺乳動物の免疫法は当分野でよく知られている。

この種のポリクローナル抗体調製物は、本発明の合成ポリペプチドを用いるイム ノアフィニティー技法により部分精製することができる。このような精製法は当 分野でよく知られている。また、Ｈｐｒエピトープに特異的で、／曳ブトグロビ ンｌまたは２と交差反応しないモノクローナル抗体も誘導することができる。一 般に、ラットやマウスを本発明の合成ポリペプチド（またはＨｐｒ蛋白質）で免 疫し、その後これらの動物を犠牲にして、ミエローマ細胞との融合のために牌細 胞を回収する。ハイブリッド細胞は当分野で知られた技法、例えば２つの表現型 （各母細胞から１つ）の補足を含む選別法、に従って選別される。各ノ・イブリ ッド細胞の抗体生産は個々にスクリーニングされる。Ｈｐｒのエピトープに結合 するがＨｐｌやＨｐｌのエピトープには結合しない抗体はＨｐｒまたはこれらの エピトープを発現する他の蛋白質と結合することができる。

Ｈｐｒ遺伝子産物に存在するがＨｐｌやＨｐｌに存在しないエピトープと免疫反 応性である抗体をスクリーニングするために、−組の簡単な試験が行われる。

実質的に純粋なＨｐｒｔｌ製物か、またはウソ血清アルブミンのような大きい成 分に結合させた本発明のポリペプチド調製物を使って、Ｈｐｒとの免疫反応性に ついて抗体を試験する。希望する特異的抗体はこれらの試験のいずれか一方また は両方において陽性であるべきである。また、抗体はＨｐｌおよびＨｐｌとの免 疫反応性についても試験される。Ｈｐｒに対する絶対特異性を有する希望の抗体 は両方のこのような試験において陰性であるべきである。さらにｓ　Ｈｐ　ｌお よびＨｐｌと比べてＨｐｒに対して相対特異性を有する抗体もこの一組の試験を 使って検出することかでさる。すなわち、ＨｐｌやＨｐｌとよりもＨｐｒと一層 強く反応するいくつかのモノクローナル抗体が存在しうる。Ｈｐｒに対して相対 的特異性を有するこれらの抗体もまた有用である。これらを使う手段は以下で述 べることにする。

Ｈｐｒと反応性であるがＨｐｌやＨｐｌとは反応性でない単一特異的ポリクロー ナル抗体を精製するためのイムノアフィニティー技法が採用される。上でモノク ローナル抗体に関して記載した試験の場合と同じ結合特性が用いられる。すなわ ち、Ｈｐｒと免疫反応性の抗体は陽性として選別され、一方ＨｐｌやＨｐｌと免 疫反応性のものは希望する抗体調製物から除かれるだろう。

ＨｐｌおよびＨｐｌと比べてＨｐｒに対して相対または優先特異性を示す抗体は 、免疫反応性の検定条件を変えることにより絶対特異性にすることができる。

変更しうる検定媒体の条件には、制限するものではないが、イオン強度：界面活 性剤の濃度：尿素、グアニジン、カリウムチオシアネートのようなカオトロピッ ク剤の濃度；およびｐＨが含まれる。これらの条件の変更は抗体−抗原結合に寄 与するいろいろな結合力の不安定化へ導く。それぞれの条件を変える試薬の滴定 は、相対的または優先的に特異性の抗体がＨｐｒと免疫反応するがＨｐｌやＨｐ ｌとは反応しない一組の条件の決定を可能にする。不安定化試薬の濃度を変える ための適肖な範囲は簡単に決定することができる。例えば、イオン強度を変える ために、塩化カリウムは約０．０５Ｍから２Ｍまで滴定される。イオンまたは非 イオン界面活性剤は約０．０５％から２％まで滴定される。カオトロピック剤は 約０．５Ｍから８Ｍまで滴定される。ｐＨ範囲は約２からＩＯまで滴定される。

このような条件はＨｐｒと免疫反応性のモノクローナル抗体をスクリーニングす るためと、いろいろな生物学的供給源中のＨｐｒを検定するための両方において 有用である。種々の不安定化試薬の上記滴定方法はまた、反応の特異性を高める ために他の抗体−抗原対と共に使用することができる。

本発明者らは４種類の異なるヒト細胞型の中にＨｐｒを見いだした。このうち３ 種類の細胞型は、生化学的研究並びに生理学的条件下でのＨｐｒの生物学的作用 を調べる研究のためのＨｐｒ量の生産に実際に使用することができる。１つの特 に有用な供給源はヒト乳癌細胞系列であり、これはメリーランド州ロックビルの アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できる。１つのこのよ うな細胞系列はＭＤＡ−ＭＢ−２３１と呼ばれ、エストロゲンレセプターネガテ ィブ細胞系列である。Ｈｐｒエピトープはこの種の乳癌細胞系列の約５０％の細 胞質に検出された。これらの細胞系列は、例えば上記の３４アミ人酸ポリペプチ ドと免疫反応性の抗体の使用により、容易に同定することができる。

Ｈｐｒ調製物をつくる１つの手段は、Ｈｐｒ蛋白質を生産するヒト乳癌細胞を当 分野でよく知られた培養条件下で培養することである。その後細胞を回収し、細 胞膜を破壊して細胞リゼイトを得る。核および膜画分を除くと、Ｈｐｒを含む細 胞質画分が得られる。分画遠心のような、細胞画分の分離手段は当分野で周知で ある。

Ｈｐｒ蛋白質の他の供給源はヒト脱落膜組織と胎盤であることが見いだされた。

このような組織は異なる源から集めることができ、当分野の公知技法に従ってホ モジナイズされる。その後、ホモジナイズした細胞の細胞膜を溶解すると、Ｈｐ ｒ蛋白質を含む細胞質画分が得られる。また、妊娠女性からの血清も回収可能な 量のＨｐｒを含むことが分かった。同様に、乳癌の組繊学的切片もＨｐｒ蛋白質 を含むが、これはＨｐｒの精製を可能にする量および方法で得るためには困難な 組織源である。

いったんＨｐｒを含む細胞質画分が得られると、Ｈｐｒの精製は蛋白質精製分野 でよく知られた技法を使って達成される。例えば、いろいろなタイプのクロマト グラフィーが使用できる。特に有用なカラムにはシバクロンＦ３ＧＡセファロー スカラム、ＤＥＡＥセルロースカラム、アニオン交換カラム、およびゲル透過カ ラムが含まれる。

Ｈｐｒはまたイムノアフィニティー技法を使って精製される。ここでＨｐｒエピ トープに特異的な抗体が提供されるので、Ｈｐｒ蛋白質は多数の蛋白質の混合物 からポジティブに選別できる。この蛋白質を精製するために本発明の抗体を使用 すると、Ｈｐｒに最も類似した蛋白質、すなわちハプトグロビン１および２、か らの良好な分離が可能となる。もちろん、他の精製法も当分野で知られており、 Ｈｐｒを精製するために使用される。

本発明に従って得られたＨｐｒ調製物は実質的に純粋であり、たぶん均質である 。この結論はポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分離された蛋白質の視覚 化に基づいており、この場合Ｈｐ２は検出されない。一般に、実質的に純粋な調 製物はＨｐｌとＨｐｌを含まず、存在するハプトグロビン型蛋白質の７５％より 多くがＨｐｒ蛋白賀であるだろう。より好ましくは、この調製物はハプトグロビ ン型蛋白質の９０％より多くをＨｐｒとして含むだろう。

本発明の抗体は乳癌組織ばかりでなく、例えば肺癌組織、尿生殖器腫瘍組織およ び胃腸腫瘍組織のような他の固形腫瘍にあるＨｐｒエピトープを検出するために 使用される。乳癌組織にＨｐｒエピトープが存在することは悪化する予後と関係 のあることが分かった：それは、乳癌組織がＨｐｒネガティブであるものと比べ て、その癌が恐らく初期に再発して転移することを示す。Ｈｐｒエピトープが存 在する乳癌組織は次の３つの点に特徴がある：免疫反応性が浸潤する乳癌に存在 する：顆粒細胞質免疫反応性が核染色なしで観察される；およびその染色が不均 質である、すなわち細胞ごとにまたは領域ごとに変わりやすい。

組織切片への抗体結合は当分野で知られた検出手段、例えば放射性標識または染 色、により検出することができる。特に有用な染色はペルオキシダーゼ、過酸化 水素、およびアミノエチルカルバゾールのような発色原物質を使用する。ペルオ キシダーゼ（多数の供給源から入手できる公知の酵素）は抗Ｈｐｒ抗体に結合さ せるか、または１以上の抗体を介してそれと複合体を形成させる。例えば、ヤギ 抗ペルオキシダーゼ抗体とヤギ抗Ｈｐｒ抗体は抗ヤギＩｇＧを介して複合体を形 成させることができる。このような技術は当分野でよく知られている。その他の 発色原物質および酵素も使用される。抗体の放射性標識付けも切片への抗体結合 を検出するために使用される。標識抗体は抗Ｈｐｒまたは抗Ｈｐｒ抗体と免疫反 応性の第二抗体でありうる。この場合も、この種の技術は広く知られている。

乳癌患者のＨｐｒを検出する技術そのものは本発明にとって限定的ではない。免 疫組織化学は本発明の好適な方法であるが、それを使わない生化学的または免疫 学的技法も現在使用することができる。

Ｈｐｒは当分野で知られた蛋白質検出手段のいずれかを使って血清、血漿、浸出 液、腹水、尿、脳を髄液、および卵巣由来の体液のような生物学的液体において 定量化される。好適な方法は免疫学的検出手段を利用する。これらにはラジオイ ムノアッセイ、酵素免疫ｇｋｆ検定法、補体結合法、比濁分析検定法、免疫拡散 法または免疫電気泳動検定法が含まれる。血漿は当分野で知られているように使 用前に抗凝血されるべきである。細胞成分と脂質は、例えば遠心により、この液 体から取り除くべきである。尿のような希薄液体の場合は、例えば限外濾過や塩 析により、蛋白質を濃縮すべきである。

液体サンプル中のＨｐｒを検出および／または定量するための特に好適な方法は 競合検定を利用する。Ｈｐｒに存在するがＨｐｌとＨｐ２には存在しないエピト ープと免疫反応性の抗体は、当分野で知られた技法を使って、ポリスチレン製マ イクロタイター皿やニトロセルロースペーパーのような担体に結合させる。その 後、担体は分析すべき液体の存在下に抗体−抗原複合体が安定して形成される条 件下でインキュベートする。液体中の過剰の未結合成分を取り除き、抗体−抗原 複合体が担体上に保持されるようにその担体を洗浄する。次に、Ｈｐｒに存在す るがＨｐｌやＨｐ２には存在しないエピトープを含むポリペプチドの一定量をこ の担体と共にインキュベートする。ポリペプチドは担体に結合させたＨｐｒと免 疫反応性の抗体に結合する。このポリペプチドは、当分野でよく知られた手段に より、ビオチン、ベルオキシダーゼまたは放射性標識のような検出可能な成分に 結合させておく。過剰の未結合ポリペプチドを除き、担体を上記のように洗浄す る。担体に結合された検出可能な成分を定量する。Ｈｐｒとポリペプチドは同じ 抗体結合部位について競合するので、液体中のＨｐｒは担体へのポリペプチド結 合の減少により定量することができる。この検定に使用した抗体はＨｐｒと免疫 反応性であるが、ＨｐｌやＨｐ２とは免疫反応性でない。これとはｆｆｌ＋に、 相対的に特異性の抗体をＨｐｌおよびＨｐ２との免疫反応性を不安定にする条件 下で使用してもよい。また、Ｈｐｒのエピトープと免疫反応性であるがＨｐｌや Ｈｐ２のエピトープとは免疫反応性でない抗体種を含むポリクローナル抗体も使 用できる。

この検定法は特にＨｐｒ系について記載しであるが、生物学的液体中の他の蛋白 質被分析体を定量するためにも使用される。すなわち、蛋白質被分析体とエピト ープを共有する標識ポリペプチドを使って、この被分析体を定量することが可能 である。特異性はこのポリペプチドによって検定に付与されるので、単一特異性 抗体を必要としない。

患者由来の血液または生物学的液体中のＨｐｒの高レベルは、乳癌ばかりでなく 他の固形腫瘍の増殖や恐らく転移と関連がある。他の腫瘍には肺癌、尿生殖器腫 瘍および胃腸腫瘍が含まれる。Ｈｐｒの高レベルの決定は検出しうる固形腫瘍を もたない患者と比べて行われるつこれは同一患者であっても、異なる患者であっ てもよい。例えば、最初のサンプルを固形腫瘍の外科的切餓直後に採取する。

その後、腫瘍の再発および／または腫瘍細胞の増殖をモニターするために後続の サンプルを採取する。さらに、生物学的液体中のＨｐｒの検定は、悪性腫瘍の診 断ををする患者において腫瘍性と非腫瘍性の液体蓄積を区別するために使用され る。

以下の実施例は本発明を制限するものではなく、使用できる特定の実施態様を提 供するにすぎない。

！攬男土 本実施例は、ヒト妊娠血漿からのＨｐｒ蛋白質の単離・精製および２つのサブユ ニットの分離を示す。

第三トリメスター妊娠からの母親の血漿は処分されたＥＤＴＡ抗凝固全血サンプ ルから得られた。この血漿は使用するまで一７０°Ｃで貯蔵した。

妊娠関連血漿プロティンＡ　（Ｐ　Ａ　Ｐ　Ｐ　−Ａ）　（Ｄａｋｏ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ、５ａｎｔａＢａｒｂａｒａ、　Ｃａ、）に対するウサギ抗血 清の全１５０画分と反応性の蛋白質は、連続クロマトクラフィ一工程により精製 した。この精製は２８０ｎｍでのクロマトグラフィー流出液の光学密度、クーマ ／−染色されたＬａｅｍｍｌ　ｉゲルを用いる画分の分析、およびウェスタンブ ロッティングにより監視した。最初に、８０ｍ１の血漿を、５０ｍＭリン酸ナト リウム（ｐＨ６，８）で平衡化したンバクロンブルーＦ３Ｇ−Ａセファロース（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに４″Ｃで装填した。すべての検出可能な免疫反応 性物質を含む通り抜は画分は１ｍＭのＮａＮ、を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム （ｐＨ６，８）に対して４６Ｃで透析し、同一緩衝液で平衡化したＤＥ−５２Ｄ ＥＡＥ−セルロース（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）の２．５ｘｌ Ｏｃｍカラムに加えた。免疫反応性物質は出発緩衝液中００．２ＭＮａＣ１で溶 出した。溶出物は０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭベーターメルカプトエタノール 、および１ｍＭ　ＮａＮ、を含む２０ｍＭｈリスーＨＣｌ　（ｐＨ８，５）に対 して４６Ｃで透析し、その後同一緩衝液で平衡化したファーストフローＱ−セフ ァロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、）の２． ５ｘ６０ｃｍカラムに装填した。このカラムは１５０ｍＭ−５００ｍＭ　ＮａＣ １の５００ｍ１直線勾配を使ってＩ　ＯＯｍ　Ｉ　／　ｈ　ｒの流速で４６Ｃに て溶出した。免疫反応性の蛋白種は０゜２５−０．２８Ｍ　ＮａＣ１の範囲で溶 出された。免疫反応性蛋白質を含む画分はプールし、１ｍＭベーターメルカプト エタノールおよび１ｍＭ　ＮａＮ、を含む２００ｍＭトリス−アセテート（ｐＨ ７，５）に対して４°Ｃで透析し、その後５ｘ９０ｃｍセファロースＣＬ　−４ Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに加えた。

図１には、ポリ特異性抗ＰＡＰＰ−Ａ　（Ｄａｋｏ）により認識された主な免疫 反応性バンドの精製を要約しである。この図面はクーマン−染色した１０−１５ ％Ｌａｅｍｍｌｉゲル（Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ、２２７．　ｐ、６８０−６８５ ．１９７０）および対応するウェスタンプロットを示す。ウェスタンブロッティ ングは本質的に公表された方法に従って行った。Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏｉ ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、蛋白質は０．４５ｕニトロセ／Ｌ、Ｏ−ス シート（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）に９５ｍＭグリ／ン、■ ：１５ｍＭトリス、０．１％　ＮａＤｏｄＳＯ，、および２０％メタノール中で ４０Ｖ、２５０−３００ｍＡ、４°Ｃで６時間移行させた。ポンプ−５染色で移 行効率を評価した後、このメンプランは３％ウシ血清アルブミンでブロックし、 その後抗ＰＡＰＰ−Ａ抗体と２時間、次に１２ｓ■で標識したプロティンＡと１ 時間インキュベートした（Ｇｅｒｓｂｏｎｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌｙｔ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　ｖｏｌ、１３１．　ｐ、１−１５、１９８３）。各工 程後の洗浄はｌ　（ｎ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｎ　ｓを含むトリス−塩水中で行った。

連続クロマトグラフィ一工程はンバクロンブルーＦ３ＧＡセファロースによるア ルブミンと他の蛋白種の除去（レーンａ）　、ＤＥＡＥセルロースカラムからの 溶出（レーンｂ）、ファースト７０−Ｑセフアロースアニオン交換カラムからの 勾配溶出（レーンｃ）、およびセファロースＣＬ−４Ｂによるゲル透過クロマト グラフィー（レーンｄ）を含んでいた。面白いことには、ゲル濾過は免疫反応性 蛋白質を弱反応性２０ｋＤａ種と同時溶出する４０ｋＤａ種、弱免疫反応性１６ −５ｋＤａ種と同時溶出する４０ｋＤａバンド、および最後に、重複するが別の ピークとして、強免疫反応性１６．５ｋＤａバンドと同時溶出する４０ｋＤａ種 から成る３つの連続して溶出する蛋白種に不完全に分割した。

変性条件下で個々の免疫ズ応性鎖を分離するためＩ；、免疫反応性蛋白質を含む 画分はプールし、２０ｍＭトリス−ＭＣＩ、６Ｍ尿素、１０ｍＭベーターメルカ プトエタノール（２５°ＣでｐＨ８，５）に対して透析した（透析は４°Ｃで行 ったが、ｐＨは指定温度で８．５となるように調節した）。最終精製工程は５ｘ ５０　ｍｍ　Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５１５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを備えた ＷａｔｅｒｓシステムによるＨＰＬＣを利用した。サンプルはトリス−尿素−メ ルカプトエタノール出発緩衝液で注入し、ｌＱｍｌの２ｍｌ／分でのインクラチ ック溶出後、０．５ＭＮａＣ１を含む出発緩衝液の最終条件に１５分にわたる３ ０ｍ１のＩ線勾配を適用した。

ＨＰＬＣを使用するＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５１５での勾配アニオン交換クロマトグ ラフィーによる免疫反応性重鎖および軽鎖の分離を示すクーマン−ブルー染色し たｌＯ％Ｌａｅｍｍ　ｌ　ｉゲルを図２に示しである。レーンａは１００μｇの 精製した免疫反応性蛋白質である。レーンｂはボイドボリュームを通り抜けたア ルファ鎖を含み、一方レーンＣは０゜８５ＭＮａＣ１で溶出した免疫反応性４０ ｋＤａ鎖を含む。

４０ｋＤａ種を含む両分はプールし、０．２Ｍ　Ｎ８３ＨＣＯ３緩衝液に対して 透析した後に凍結乾燥した。

夾Ａ男λ 本実施例は、Ｈｐｒの重鎮（ベータ鎖）の２０アミノ酸領域がハプトグロビンｌ および２のベータ鎖に１００％相同であることを示す。

実施例１に従って調製した４０ｋＤａ種の凍結乾燥サンプルは０．２ＭＮＨ、Ｈ ＣＯ，に対して３回透析し、凍結乾燥し、その後ＨＰＬＣ級の水から３回凍結乾 燥した。気相シーフェンシング（アミノ酸配列分析）を実施した。完全な蛋白鎖 のサンプルは一般にＬＯ豐ｒｙ検定で測定して１００μｇの蛋白質から成ってい た（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｏ、、　ｖｏｉ、１９３．　ｐ、２６５−２７ ５．１９５１）　、ペプチドのサンプルは一般に７−クニンサーで定量して０． ５−２ナノモルから成っていた。蛋白質はオンラインフェニルチオヒダントイン （ＰＴＨ）分析を備えたアプライド・バイオシステムダ４フ０型シークエネータ ーで通常のプログラム０３ＲＰＴＨを使ってアミノ酸配列を決定した。ＰＴＨ誘 導体はアプライド・バイオシステム２００ｘ２１ｍｍＣ−１８カラムでの逆相Ｈ ＰＬＣにより分離した。

Ｎ末端のアミノ酸配列分析は図３に示した２０残基をもたらした。ナショナル・ バイオメディカル・リサーチ・７アウンデーシ１ンの蛋白質配列データベースお よびＤＦＡＳＴＰ整合プログラムを使うことにより′％　３種類の蛋白質の配列 は２０アミノ酸領域にわたって１００％相同を示した：ヒトハプトグロビン１の ベータ鎖：ヒトハプトグロビン２のベータ鎖；およびｌ＼ブトグロビン関連蛋白 質前駆体の推定ベータ鎖。

衷裏勇１ 本実施例は、実施例１に従って妊娠血清から単離したＩ・ブトグロビンがその１ ５．５ｋＤａ鎖に８いてＨｐｌおよびＨｐ２と相違することを示す。

アミノ酸配列分析は妊娠血漿蛋白質をハプトグロビン（Ｈｐ）遺伝子７アミリー に明確に位置づけたが、全蛋白種のベータ鎖のＮ末端配列が同一であるので、こ れ以上明確な指定はなされないであろう。回４は、精製Ｈｐｌおよび２標品、妊 娠血清から精製したハプトグロビン、ウサギ抗ハグトグロビンおよび抗ＰＡＰＰ −Ａを用いて行った免疫学的分析の結果を示す。パネルＡはＨｐ１％Ｈｐ２、お よび妊娠血清から精製したハプトグロビンの１０−１５％クーマン−染色Ｌａｅ ｍｍｌ　ｉゲルを示す（それぞれレーンａ−Ｃ）。パネルＢは抗ハプトグロビン 、１：５０．との対応するイムノプロットであり；パネルＣは抗ＰＡＰＰ−Ａ、 ｉ：５０．とのイムノプロットである。

抗ハプトグロビンはすべての４０ｋＤａベータ鎖およびＨｐｌとＨｐ２のアルフ ァ鎖と強く反応する：精製蛋白質を含むレーンＣからの１６．５ｋＤａバンドは ほんの弱く反応する。対照的に、抗ＰＡＰＰ−Ａは４０ｋＤａベータ鎖を強く標 識するが、Ｈｐ２アルファ鎖とは弱く反応し、そしてＨｐｌアルファ鎖とはほん のわずかに反応するだけである。レーンＣの精製蛋白質からの１６．５ｋＤａバ ンドはそのクーマシー染色と比較して不釣合いに強烈であり、特にレーンａに示 したＨｐｌアルファ鎖の不釣合いに弱い相対免疫反応性と比べたとき強烈である 。従って、妊娠血清から単離したアルファ鎖は、ＨｐｌまたはＨｐ２アルファ鎖 に存在しない抗ＰＡＰＰ−Ａにより認識されるエピトープを含み、免疫学的に別 個のものである。

里菖男Ａ 本実施例は、Ｈｐｒのアルファ鎖とＨｐｌおよびＨｐ２のアルファ鎖の間には配 列の相違が存在することを示す。さらに、この相違は妊娠血清からのハプトグロ ビンをｈｐｒ遺伝子産物であると指定することと一致する。

ペプチドマツピングはＥｌｄｅｒの技法を用いて行った（Ｓｐｅｉｃｈｅｒ、　 ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　ｖｏｉ、７７、　 ｐ、５６７３−５６７７、１９８０；　Ｅｌｄｅｒ、　ｅｔ@ａｌ、、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　ｖｏｌ、２５２．　ｐ、６５１０−６５１５．１９ ７７）　、簡単に述べると、目的の蛋白質を含む切片をクーマン−染色ゲルから 切り出し、徹底的に放射性ヨウ素化し、そしてトリプシンで消化した。得られた 制限ペプチドはその後セルロースシートの一方向に沿って高電圧電気泳動にかけ 、続いて垂直方向に分配薄層クロマトグラフィーを上昇させた。

この技法によるペプチドマツピングはチロシン含有ペプチドのみを検出する。

発表されたアミノ酸配列を使用すると、ＨｐｌおよびＨｐ２鎖のトリズシンペプ チドの７７ミリーは、Ｈｐ２がＨｐｌの部分重複により生じたものであるから、 それぞれ類似しているだろう（図５ａおよび５ｃ）。Ｈｐｒ、ＨｐｌおよびＨｐ ２間のアミノ酸配列の主な相違はアルファ鎖にある。アルファ鎖の中で、これら の相違は特にＮ末端に集まっている。ペプチドマツピングに関連して、推定され たＨｐｒアルファ鎖配列配列用すると、Ｈｐｌから得られたものと同じトリプン ンペプチドと追加のチロシン含有ペプチドが予測されるだろう。図５ｂは精製蛋 白質アルファ鎖のペプチドマツプを示し、矢印は実験的に得られた追加のペプチ ドを強調するものである。従って、これらの結果は、妊娠血漿から精製された特 異なハプトグロビンがＨｐｒ遺伝子産物であることを示唆している。図５ｄはマ ツピング前にＨｐｌと精製蛋白質アルファ鎖を混合した混合実験である。この場 合も、追加のペプチドは存在するが、その相対強度は小さい。一方共有ペプチド はすべて共泳動する。

！廓工 本実施例は、妊娠血清からのハプトグロビンのアルファ鎖が推定Ｈｐｒ配列に従 って製造した合成ペプチドとエピトープを共有することを示す。

推定Ｈｐｒ遺伝子産物の３４個のＮ末端残基（Ｍａｅｄａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、ＵＳＡ、　ｖａｔ−８３，ｐ、７３９５−７３９９．１９ ８６）に対応する合成ペプチドは、アプライド・バイオシステムダ４３Ａ型ペプ チド合成機を使って、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ 、　Ｓｏｃ、、　ｖｏ１８５．　ｐ、２１４９−２１５４．１９６８）により合 成した。ヒスチジンカップリングは効率の悪いことがあるので、２８位のヒスチ ジンの代わりにリシンが保存的に使用された。

ハプトグロビンｌおよび３４−ｍａｒ合成ペプチドを結合させたビーズを使って 、２つの別個のカラムを製造した。ハプトグロビンＩ（Ｈｐｌ）とＨｐｒ合成ペ プチドは、安定したＮ−アルキルカルバメート結合をもたらす１．１−カルボニ ルジイミダゾールで誘導体化したアガロースビーズ（Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｔ　６ Ｘ、　Ｐｉｅｒｃｅ）を使って固定化した。５ｍｌのゲルは０．１Ｍホウ酸塩お よび０．１５ＭＮａｃｔ　（ｐＨ８，５）を使って室温で洗浄し、アセトンを除 いた。ホウ酸塩緩衝液で１ｍｇ／ｍｌに希釈した４ｍｇのＨｐ　ｌ　（Ｓｉｇｍ ａ）　、およびホウ酸塩緩衝液で！２．５ｍｇ／ｍｌに希釈した５０ｍｇのＨｐ ｒ合成ペプチドはそれぞれ５ｍｌのゲルに加え、撹拌しながら４″Ｃで３０時間 インキュベートした。インキュベーション後、上清をデカントし、等量の０．２ Ｍ１−リスを加えて残存する反応を停止させた。その後ゲルはトリス−塩水緩衝 液で十分に洗浄した。Ｈｐｒペプチドカラムはトリス−塩水緩衝液中の０．１％ ＮａＤＯｄ５０．　１００ｍ１で変性した。

Ｈｐｒペプチドと反応性の抗Ｈｐｒ抗体は、連続アフィニティークロマトグラフ ィ一工程によって粗製抗ＰＡＰＰ−Ａ血清から単離した。最初に、１０ｍ１トリ ス−塩水緩衝液中の粗製抗ＰＡＰＰ−Ａ抗体１００μｌはＨｐｌゲルと撹拌しな がら４°Ｃで一晩インキユベートした。次に、このゲルをトリス−塩水で十分に 洗い、通り抜は画分は５ｍｌヒドロキシアパタイトカラムを通して集めた。Ｈｐ ｌカラムと反応性の抗体は２０ｍ１の酢酸塩緩衝液（０，０５Ｍ酢酸ナトリウム 、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ３，５、室温）で溶出した。このカラムを通り抜 けた抗体は２０ｍ１の０．４Ｍリン酸ナトリウムを用いてヒドロキシアパタイト カラムから溶出した。両方の抗体を２１のトリス−塩水緩衝液に対して透析した 。

その後、Ｈｐｌカラムと非反応性の抗体は変性Ｈｐｒペプチドゲルと撹拌しなか ら４’Ｃで一晩インキユベートした。Ｉ（ｐｒペプチドと反応性の抗体は２０ｍ １の酢酸塩緩衝液で溶出し、トリス−塩水に対して透析した。これらの抗体画分 のそれぞれは、ハプトグロビンｌとハプトグロビン関連蛋白質（５Ｊｌ施例１に よる）のサブユニットを電気泳動により分離させた１Ｏ−ｉ５％勾配Ｌａｅ＋ｌ １ｍ１ｉゲルのイムノプロットを標識するために使用した。

図６のパネルＡは、左のレーンに２５ＭｇＨｐｌの、右のレーンに１００μｇハ プトグロビン関連蛋白質のクーマシー染色１０−１５％勾配Ｌａｅｍｍ　ｌ　ｉ ゲルを示す。パネルＢ−Ｅは同一蛋白質負荷のイムノプロットである。パネルＢ は非吸着抗ＰＡＰＰ−Ａ抗体、１：５０、とインキュベートした。パネルＣは固 定化Ｈｐｌに結合させた抗ＰＡＰＰ−Ａ抗体のサブセットとインキュベートした ；パネルＤは通り抜けた未反応抗体とインキュベートした。パネルＣのＨｐｌゲ ルに結合した４０ｋＤａベータ鎖に対する抗体の濃縮に注目されたいニ一方、特 異な免疫反応性アルファ鎖に対する抗体は固定化Ｈｐｌと反応せず、通り抜けた （パ不ルＤ）。パネルＥは固定化変性合５ＥＨｐｒペプチドと反応したパネルＤ の抗体のサブセットとインキュベートした。合成Ｈｐｒペプチドに結合したこれ らの抗体は妊娠関連ハプトグロビンの１６．５ｋＤａアルフア鎖とのみ反応する ことに注目されたい。これはこのハプトグロビンの特異なアルファ鎖がＨｐｒエ ピトープを含むことを立証するものである。

９例」一 本実施例は、Ｈｐｒエピトープがヒト乳癌の細胞質において同定されることを示 す。

パラフィンに埋め込んだヒト乳癌標本はＪｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ病院の病理 学部のファイルから得られた。緩衝化１０％ホルマリン固定した、パラフィンに 埋め込んだ６μ組織切片はキシレン中でバラ７４ンを致き、アルコール−水浴中 で再不和し、トリス−塩水（ｐＨ７，６）中でインキュベートし、その後３％Ｈ ｔ　Ｏｔで内因性ペルオキシダーゼ活性を１５分間ブロックした。トリス−塩水 で洗浄後、切片は１／１００に希釈した正常ブタ血清（Ｄａｋｏ）で３０分間ブ ロックし、続いて特異的抗体または非免疫血清と４７ｃで一晩インキュベートし た。トリス−塩水で洗浄後、０．５Ｍトリス緩衝液中１．／＋００のブタ抗つサ ギ免疫グロブリンＩｇｃ画分（Ｄａｋｏ）を３０分間加え、その後ペルオキシダ ーゼーウサギ抗ペルオキシダーゼ複合体（Ｄａｋｏ）を加えた。最終洗浄の後、 切片はジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）基質と６分間インキュベートし、Ｍａ ｙｅｒのへマドキンリンで対比染色し、カバーグラスでおおって試験した。

抗体は実施例５に記載した３４−ｍａｒ合成ペプチドでウサギを免疫することに よりＨｐｒに対して誘導した。免疫するために、このペプチドはキーホール・リ ンペット・ヘモンアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ ｅｉｍ）と木質的に文献に記載される通りに結合させた（Ｌｅｒｎｅｒ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、ｖｏｌ 、７８．　ｐ、３４０３−３４０７．１９８１）　。ジメチルホルムアミド中の マレミドベンゾイル−ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢ　Ｓ）　（Ｐｉｅｒ ｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）の８゜７５ｍＭ溶液８μｍはリン酸緩衝溶液 中の１４．８ｍｇのＫＬＨに加え、室温で３０分間インキュベートした。ＫＬＨ −ＭＢＳ複合体はＰｈａｒｍａｃｉａ　ＰＤ−１０カラムでのゲル濾過により未 反応ＭＢＳから分離した。１．２ｍｇのＨｐｒペプチドを直接ＫＬＨ−ＭＢＳに 加え、この混合物を室温でさらに３０分間インキュベートした。結合効率を概算 するために、未分画化３．０ｍ１反応容量の３．５μｍサンプＪしは、Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２カラムでＷａｔｅｒＳＨＰ　Ｌ　Ｃを使っ てＰＢＳにより１ｍｌ／分でクロマトグラフィーにかけ、流出物を２１４ｎｒｎ で監視した。未反応ペプチドはピーク積分法およびペプチド流れ単独の標準への 比較により定量した。この方法は４．６ペプチド／ＫＬＨ分子のおおよその置換 比をもたらした。

２匹のパスツレラ薗（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌ　Ｉａ）非感染ニューシーラント白ウ サギ（Ｄｕｔｃｈｌａｎｄ）にそれぞれ等量のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）と完全 ７０インドアジユバントから成るエマルジ「ンｌ　ｍ　ｌ中の抗原２００μｇを ０日月に接種した：接種は３−４カ所の皮下と筋肉内に分けて行った。１４日目 に、この動物は不完全７０インドアジユバント中の等量の抗原で追加免疫した。

３２日目にウサギから試験採血した：陽性ウサギからの血清を次の数カ月間にわ たって集めた。

ウシ血清アルブミンは上記のように合成Ｈｐｒペプチドで誘導体化した。酵素免 疫吸着検定法はウェルあたり２μｇのＢＳＡ−ペプチドを使い、これをウサギ血 清の希釈物に対して試験し、そしてプロティンへ−西洋ワサビペルオキシダーゼ 複合体とｏ−７二二レンジアミン基質で発色させることにより、記載通りに（Ｖ ｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、、　ｖｏｌ、 ３１．　ｐ、５０７−５２０．１９７８）行った。

抗体を精製するために、１０　ｃ　ｍ　ｘ　５　ｍ　ｍ　５ｅｌｅｅｔｉｓｐｈ ｅｒ−１０活性化トレシルカラムＨＰＬＣアフイニテイーカラム（Ｐｉｅｒｃｅ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）はＨｐｒ合成ペプチドで誘導体化した。カラムは ３０ｍ１のＰＢＳを使って２ｍ１／分の流速で洗浄し、その後４．５ｍｌのＰＢ Ｓに溶解したペプチド２７ｍｇを１ｍｌ／分の流速でカラムに通した。未反応ト レシル基はカラムに３０ｍ１の０．２Ｍ１−リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）を通 してキャップした。抗体精製のために、このカラムは３００ｍＭ　ＮａＣｌ、２ ０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）を使って室温で平衡化した。１０１０− ２Ｏの血清を０．５ｍｌ／分の流速でカラムに装填した。装填後、カラムは２８ ０ｎｍでの流出物の光学密度がゼロに戻るまで緩衝液で洗った。その後、同一緩 衝液中の６Ｍ尿素を使って抗体を溶出し、抗体含有画分は直ちにＩｍＭ　ＮａＮ ３を含むトリス−緩衝基本に対して透析した。

図７は、抗Ｈｐｒ抗体（パネル７ａ）と抗ＣＥＡ抗体（パネル７ｃ）の両方によ る原発性乳癌のイムノペルオキシダーゼ染色を示す：抗Ｈｐｒ染色の強い細胞質 陽性に注目されたい。抗Ｈｐｒ抗体を天然Ｈｐｒと４″Ｃで２時間インキュベー トすると、陽性の細胞質染色が阻止された（パネル７ｂ）。免疫吸着の特異性を 立証するために、抗癌胎児性抗［（ＣＥＡ）抗体を類似の条件下で天然Ｈｐｒと インキュベートした。細胞質ＣＥＡ陽性はこのようなＨｐｒとのプレインキュベ ーションにより阻止されなかった（パネル７ｄ）。ＨｐｌとＨｐ２の染色阻止の 失敗と合わせて、これはＨｐｒ遺伝子産物の推定アルファ鎖のＮ末端から誘導さ れたエピトープがヒト乳癌を検出しうろことを立証している。従って、Ｈｐｒ、 Ｈｐｒの修飾型、または高度に交差反応性の蛋白質がヒト乳癌細胞に存在するに ちがいない。

里真男ヱ 本実施例は、ヒト乳癌によるＨｐｒの発現と患者が病気にかかっていない時間間 隔との間に相関関係があることを示す。

６１例のヒト乳癌は癌関連ハプトグロビンの発現および抗ＰＡＰＰ−Ａ抗血清と の免疫反応性の同時評価のために入手することができた。癌関連７％ブトグロビ ン（Ｈｐｒ）の発現は、合成ペプチド（その配列は癌関連ハプトグロビン配列か ら誘導された）に対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体を使って、パラ フィン包埋林料を免疫組織化学的に染色することにより評価した。同様に、ＰＡ ＰＰ−Ａ陽性は抗ＰＡＰＰ−Ａ抗血清を用いて評価した。６１人の患者のうち、 ４０人は１期の病気（５ｃｍ未満の唖瘍、リンパ節陰性）に、そして２１人は１ １期の病気（５ｃｍ未満の腫瘍、わきのしたのリンパ節陽性）にかかつていた。

データはＢＭＤＰ統計プログラムを使って生命表フォーマットで分析した。曲線 間のを意差を判定するために、２つの統計テスト、−膜化ウイルコクンン（Ｇｅ ｎｅｒａｌｉｚｅｄ　Ｗｉｌｃｏｘｏｎ；　Ｂｒｅｓｌｏｗ）と−膜化サベージ （Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ　５ａｖａ）Ｈｅ；Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）が使用さ れた。

結果は図８に示しである。縦座標は病気にかかっていない患者の百分率を示し、 一方横座操は診断時からの時間的間隔を示す。曲線間の差は、０．０００５未満 のｐ（ウィルコクソン）および０．０００３未満のｐ（サベージ）であって、高 度に有意である。

夾藁氾 本実施例は、培養乳癌細胞がＨｐｒを発現することを示す。

新鮮なヒト乳癌をＨｐｒ蛋白質の供給源として使用することができるが、その量 は一般に少なく、入手可能性は不規則である。これらの理由のために、一連のヒ ト乳癌細胞系列をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーラン ド州ロックビル）から入手して、免疫組織化学的手法によりＨｐｒ発現について スクリーニングした。図９は１つのこのような系列、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１゜エ ストロゲンレセプターネガティブ細胞系列（Ａｙ１ｄ６ｒ５０１．　Ｊ、　５ｕ ｂＩＩＩｉｃｒｏｓｃｏｐ。

Ｃｙｔｏｌ、、　ｖｏｌ、１６．　ｐＪ７３−６９０．１９８４）でのこの方法 の結果を示す。

簡単に述べると、細胞はＩＯ％ウシ胎児血清と抗生物質を補給したＬ−１５培地 を使ってチャンバースライド上で増殖させ、パラホルムアルデヒド中で固定し、 トリトンＸ−１００を浸透させ、抗Ｈｐ　ｒ４０ｕｇ／ｍＩまたは対照と４’ｃ で一晩インキユベートし、順次ビオチニル化第二抗竺、アビジン−ペルオキシダ ーゼ、およびアミノエチル−カルバゾール−ペルオキシド基質溶液を用いて発色 させた。

左側のパネルは特異的抗体による顆粒細胞質染色を示し、右側のパネルは第一抗 体を含まない対照を示す：無関係のアフィニティー−製抗体は、この方法で無関 係の陽性第一抗体対照として使用したとき、適当に分布して染色する。従って、 これらの培養細胞がＨｐｒを生産できるということは容易に見てとれる。

！鹿！冴 本実施例は、脱落膜組織が生理学的条件下でＨｐｒを合成することを示す。

Ｈｐｒは妊娠血清から精製されるので、妊娠特異的組織が発現のために免疫組織 化学的にスクリーニングされた。新鮮な脱落膜は選択流産後に処分されるはずの 組織から入手し、ホルマリン固定した。緩衝化１０％ホルマリン固定され、バラ フインに埋め込まれた６μ組織切片はキシレン中でパラフィンを除き、アルコー ル−水浴申で再水和し、その後トリス−塩水（ｐＨ７，６）中でインキュベート し、３％Ｈ，Ｏ，を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性を１５分間ブロックした 。トリス−塩水で洗浄後、切片はｌ／１００に希釈した正常ブタ血清（Ｄａｋｏ ）で３０分間ブロックし、実施例６に記載したように製造した特異的抗体と、あ るいは対照として、非免疫血清と４″Ｃで一晩インキユベートし、順次ビオチニ ル化第二抗体、アビジン−ペルオキシダーゼ、およびアミノエチル−カルバゾー ルペルオキシド基質溶液を用いて発色させた。スライドグラスはジアミノベンジ ジン（Ｓｉｇ＋ｏａ）基質と１０分間インキュベートし、Ｍａｙｅｒのへマドキ シリン中で対比染色して試験した。

脱落膜染色の結果はｒＭｌｏに示しである。左側のパネルは抗Ｈｐｒ抗体による 顕著な細胞質染色を示し、右側のパネルは第一抗体が除かれた対照を示す。他の 胎盤組織は陰性であった（データは示してない）。この実験は脱落膜が生理学的 条件下でＨｐｒを合成することを示唆している。

東遍、ｆｌｌ上 本実施例は、脱落膜により発現されたＨｐｒが妊娠血清から単離されたＨｐｒよ りも大きいポリペプチドとして合成されることを示す。

［１１１は抗Ｈｐｒが脱落膜リゼイト中の意外に重いアルファ鎖を認識すること を示す。簡単に述べると、１ｇの凍結脱落膜はＢｒｉｎｋｍａｎｎポリトロンを 使って１０ｍ１の溶解緩衝液（ｌＯｍＭトリスＨＣＩ、４’ｃでｐＨ７，５，１ ｍＭＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００，０，５ｍＭジイソプロピルフルオロホ ス７エート）中でホモジナイズした。不溶性物質は１２００ｘｇ、４’Ｃで５分 間遠心して除き、得られた上清をＬａｅｍｍｌｉ可溶化緩衝液と混合した。５０ μｍのアリコートは１０−１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけ、半 乾燥プロッティング装芳（ポリプロット、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃ ｓ）を使ってニトロセルロースに移行させた。プロットはトリス−塩水中の３％ ＢＳＡを用いて室温で２時間ブロックし、その後トリスー塩水巾の４０μｇ／ｍ １の抗Ｈｐｒと一晩インキユベートした。インキュベーション後、プロントは順 次０．０５％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで洗い、ビオチニル化ヤギ抗ウサ ギＩｇＧとインキュベートし、洗浄後アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複 合体とインキュベートし、そして洗浄後アミノエチルカルバゾール基質溶液−で インキュベートした。

プロットは脱落膜リゼイトが特異なアルファ鋼種を含むことを示す。左側のレー ンはハプトグロビン２で汚染された部分精製Ｈｐｒ調製物を示す；この実験で使 用した抗Ｈｐｒはハプトグロビン２アルフア鎖（一番上のバンド）と交差反応す るが、ハプトグロビンｌアルファ鎖とは反応しない。左側のレーンの下の方のバ ンドはＨｐｒアルファ鎖を表す。右側のレーンは脱落瞑すゼイトが約３０ｋＤａ の範囲に主要な免疫反応性のバンドを含むことを示す。

肝臓において、ハプトグロビンは加水分解切断されてアルファ鎖とベータ鎖を形 成する単一の隣接ポリペプチド鎖として合成される。このプロットと多価抗ハプ トグロビン抗体との反応は単一の４５ｋＤａ種を検出した。成熟アルファ鎖やベ ータ鎖は検出されなかった。

ａ　ｂｃ　ａｂＣａｂｃ ＡＢＣＤＥ ＦＩＧ、　７ 浄書（内容に変更なし） 駐帖−１（の日Ｉ欠 浄書（内容に１更なし） 浄書（内容に変更なし） 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　３年　７月１７日函

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．ｈｐｒ遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列を有し、ｈｐｒ遺 伝子産物に存在するがハプトグロビン１または２に存在しないエピトープと免疫 反応性である抗体の哺乳動物による生塵を刺激する能力を有する、ポリペプチド のジ質的に純粋な調製物。
2. ２．ポリペプチドはｈｐｒ蛋白質の３４個のＮ末端アミノ酸から成る、請求項１ の調製物。
3. ３．ポリペプチドはキーホール・リンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ） のヘモシアニンに結合させる、請求項１の調製物。
4. ４．Ｈｐｒ蛋白質と免疫反応性であるがハプトグロビン１または２とは免疫反応 性でない抗体の調製物。
5. ５．抗体はモノクローナル抗体である、請求項４の調製物。
6. ６．抗体はポリクローナル抗体である、請求項４の調製物。
7. ７．Ｈｐｒ蛋白質の実質的に純粋な調製物。
8. ８．Ｈｐｒ調製物を得る方法であって：Ｈｐｒ蛋白質に存在するがハプトグロビ ン１または２に存在しないエビトープと免疫反応性の抗体調製物に結合する能力 についてヒト乳癌細胞系列を試験すること； 前記調製物に結合する能力を有するヒト乳癌細胞系列を培養すること；Ｈｐｒを 含む前記細胞系列の細胞質画分からＨｐｒ蛋白質を回収すること； から成る上記方法。
9. ９．Ｈｐｒ調製物を得る方法であって：ヒト脱落膜または胎盤組織を集めること ；および前記組織からＨｐｒ蛋白質を含む細胞質画分を回収すること；から成る 上記方法。
10. １０．乳癌の予後を判定するためのキットであって；Ｈｐｒ蛋白質に存在するが ハプトグロビン１または２に存在しないエビトープと免疫反応性である第一抗体 の調製物；前記調製物の第一抗体を検出する手段；を含む上記キット。
11. １１．検出手段は： 前記調製物の第一抗体と免疫反応性の第二抗体；ペルオキシダーゼ酸素； ペルオキシダーゼと過酸化水素の存在下で色を変える発色原物質；を含む、請求 項１０のキット。
12. １２．発色原物質はアミノエチルカルバゾールである、請求項１１のキット。
13. １３．第一抗体を検出する手段は放射性標識を含む、請求項１０のキット。
14. １４．ペルオキシダーゼ酸素は前記調製物の第一抗体と免疫反応性である第二抗 体に待合させる、請求項１１のキット。
15. １５．ペルオキシダーゼ酵素は抗ペルオキシダーゼ抗体と複合体を形成させ、前 記抗ペルオキシダーゼ抗体は前記調製物の第一抗体と免疫反応性の第二抗体と免 疫反応性である、請求項１１のキット。
16. １６．固形腫瘍の予後を判定する方法であって；固形腫瘍から組織学的切片を用 意すること；前記切片をＨｐｒ蛋白質と免疫反応性であるがハプトグロビン１ま たは２とは免疫反応性でない抗体の調製物と接触させること；前記調製物の抗体 が組織学的切片に結合するかどうかを判定すること（組織学的切片への抗体の結 合は周形腫瘍の悪化する予後と関係がある）；から成る上記方法。
17. １７．固形腫瘍は乳癌である、請求項１６の方法。
18. １８．生物学的液体山のハプドグロビン関連蛋白質（Ｈｐｒ）を検定する方法で あって： （ａ）Ｈｐｒに存在するがＨｐ１またはＨｐ２に存在しないエビトープと免疫反 応性の抗体を結合させた担体を用意すること；（ｂ）前記担体と未知量のＨｐｒ を含む生物学的液体とを、抗体一抗原複合体が形成されかつ安定である条件下で 接触させること；（ｃ）前記担体と、Ｈｐｒに存在するがＨｐＩまたはＨｐ２に 存在しないエビトープを含むポリペプチドとを、抗体−抗原複合体が形成されか つ安定である条件下でさらに接触させること（ただし、前記ポリペプチドは検出 可能な成分をもっている）； （ｄ）抗体−抗原複合体によって前記担体に結合される検出可能な成分をもつポ リペプチドを検出・定量すること；（ｅ）工程（ａ）−（ｄ）で担体に結合され たポリペプチドの量（１）を工程（ｂ）を省いたときに結合されたポリペプチド の量（２）と比較すること量（２）に対する量（１）の結合低下は生物学的複体 中のＨｐｒの量に関係がある； から成る上記方法。
19. １９．抗Ｈｐｒ抗体はＨｐｒと免疫反応性であるがＨｐ１ともＨｐ２とも免疫反 応性でない、請求項１８の方法。
20. ２０．抗原−抗体複合体を形成させる東件は、抗Ｈｐｒ抗体をＨｐ１およびＨｐ ２と非反応性にする条件となるように、不安定化剤を滴定することにより決定さ れた、請求項１８の方法。
21. ２１．患者における腫瘍細胞の増殖を検出する方法であって：固形腫瘍をもつ患 者から生物学的液体を採取すること；前記液体中のＨｐｒの量を定量すること； 前記患者からの液体中のＨｐｒ量と、検出しうる固形腫瘍をもたない患者から採 取した対照液体中のその量とを比較すること（増加したＨｐｒ量は腫瘍細胞の増 殖を示す）； から成る上記方法。
22. ２２．対照液体は比較的早い時期に採取した固形腫瘍患者からの液体である、請 求項２１の方法。
23. ２３．生物学的液体は血漿または血清である、請求項２１の方法。
24. ２４．固形腫瘍は乳癌である、 請求項２１の方法。