JPH11248711A - カルボキシメチル化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 血液中のＡＧＥのひとつであるカルボキシメ
チル化ヘモグロビンを免疫学的に測定する際に、再現性
良く測定することの出来る新規な方法を提供すること。 【解決手段】 ＣＭ−Ｈｂを抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を用いて
免疫学的に定量するに際して、抗原抗体反応を親水疎水
度が１０〜１７の非イオン性界面活性剤の存在下で行う
ことで、血液中のカルボキシメチル化ヘモグロビンを測
定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カルボキシメチル
化ヘモグロビンの測定方法に関する。更に詳しくは、測
定再現性の高いカルボキシメチル化ヘモグロビンの測定
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、カルボキシメチル化タンパク質
（以下「ＣＭ−タンパク」と表記することもある。）は
メイラード反応後期生成物（以下「ＡＧＥ」と略すこと
もある。）の主要成分であると考えられており（Iked
a，Ｋ．，et．al．，Biochemistry，vol．35，p8075，1
996）、これらの定性或いは定量方法としては、特異抗
体を用いる方法や、ＣＭ−タンパクを加水分解してガス
クロマトグラフィー／質量分析にてカルボキシメチル化
（以下「ＣＭ化」と略すこともある。）されたアミノ酸
を検出する方法等が知られている。しかしながら、ガス
クロマトグラフィー／質量分析にてＣＭ−タンパクを間
接的に測定する方法は操作が煩雑であり感度も低いとい
う問題があることから、測定が容易であり感度も高い特
異抗体を用いた抗原抗体反応による方法が多用されてい
る。

【０００３】上記の特異抗体を用いた測定方法として
は、酵素標識免疫学的測定法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオ
イムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、ウエスタンブロッティ
ング法等がある。しかしながら、特異抗体として抗カル
ボキシメチル化ヘモグロビン抗体（以下「抗ＣＭ−Ｈｂ
抗体」と略すこともある。）を用いて血液中のカルボキ
シメチル化ヘモグロビン（以下「ＣＭ−Ｈｂ」と略すこ
ともある。）を抗原抗体反応を利用して免疫学的に測定
した場合には、測定毎に測定値がばらつき、検体溶液中
のＣＭ−Ｈｂの量を精度良く測定することは困難であっ
た。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】体液中のＡＧＥの中で
も特に血液中のＣＭ−Ｈｂは、糖尿病或いは糖尿病合併
症との関連性が強く示唆されており、該ＣＭ−Ｈｂ量を
測定することは臨床検査等の見地から意義のあることで
あるが、上記したように、抗原抗体反応を利用して再現
性良く血液中のＣＭ−Ｈｂ量を簡単に測定する方法はこ
れまで知られていない。

【０００５】本発明は、血液中のＣＭ−Ｈｂを抗ＣＭ−
Ｈｂ抗体との抗原抗体反応を利用して免疫学的に定量す
る方法であって、血液中のＣＭ−Ｈｂを簡単にしかも再
現性良く測定する方法を開発することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＣＭ−Ｈｂを
抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を用いて免疫学的に定量するに際し
て、抗原抗体反応をその親水疎水度が１０〜１７である
非イオン性界面活性剤の存在下に行うことにより、血液
中のＣＭ−Ｈｂを再現性良く定量できることを見い出し
本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明は抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を用いて
血液中のＣＭ−Ｈｂを抗原抗体反応により測定する方法
において、抗原抗体反応を親水疎水度が１０〜１７の非
イオン性界面活性剤の存在下に行うことを特徴とするＣ
Ｍ−Ｈｂの測定方法である。

【０００８】上記測定方法において抗原抗体反応を親水
疎水度が１０〜１７の非イオン性界面活性剤の存在下で
行うに当たり、血液と親水疎水度が１０〜１７の非イオ
ン性界面活性剤の水溶液とを混合して調製した溶血溶液
を測定試料として使用した場合には、特に測定再現性が
高くなるという効果がある。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明では抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を用
い、抗原抗体反応を利用して血液中のＣＭ−Ｈｂを測定
する。

【００１０】本発明で使用する抗ＣＭ−Ｈｂ抗体として
は、ＣＭ−Ｈｂを認識する特異抗体であれば特に制限さ
れず、ＣＭ−Ｈｂの特定部位を認識するモノクローナル
抗体であっても良く、またＣＭ−Ｈｂの任意の部位を認
識するポリクローナル抗体であっても良い。ここでＣＭ
−Ｈｂとは、ヘモグロビン（以下「Ｈｂ」と略すことも
ある）のＮ末端アミノ基または側鎖アミノ基の水素が少
なくとも１箇所以上ＣＭ化されたＨｂを言う。なお、Ｃ
Ｍ化部位はＨｂのα鎖でもβ鎖でも良い。

【００１１】本発明で使用する抗ＣＭ−Ｈｂ抗体は、Ｃ
Ｍ−Ｈｂのみならずアミノ基がＣＭ化されたα−アミノ
酸やアミノ基がＣＭ化されたペプチドを認識する抗体で
あっても良いが、ＣＭ−Ｈｂの検知感度の点から、ＣＭ
−Ｈｂとのみ強く反応する抗体を使用するのが好適であ
る。この様な抗体としては、ＣＭ化ＨＳＡ（ＨＳＡ：人
血清アルブミン）、ＣＭ化コラーゲン、ＣＭ化γグロブ
リン等の、ＣＭ−Ｈｂ以外のＣＭ−タンパクとは反応し
ないか、若しくは反応したとしても非常に弱くしか反応
しない、例えばこれらＣＭ−タンパクに対する反応アフ
ィニティーがＣＭ−Ｈｂの１００分の１程度以下である
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が挙げられ
る。

【００１２】このような抗ＣＭ−Ｈｂ抗体は、該抗体が
ポリクロナール抗体である場合には、公知の方法で作成
されたＣＭ−Ｈｂを免疫用の抗原（以下「免疫原」とい
うこともある）としてウサギ、マウス、ヤギ、モルモッ
ト等の宿主動物に免疫して得られた抗血清、或いは該血
清を従来公知の方法である塩析法、ゲル濾過法、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、電気泳動等で精製することによって得ることが
できる。例えば、In vitroでグルコースとＨｂを３７℃
で６０日間インキュベーション（メイラード反応のモデ
ル反応）して作成したＡＧＥ−ＨｂをＣＭ−Ｈｂに精製
した後、ウサギに免疫すると約６週間後にＣＭ−Ｈｂに
対する抗血清が得られ、該抗血清を精製することによっ
てＣＭ−Ｈｂとの反応特異性が高いポリクロナール抗体
が得られる。

【００１３】また、抗ＣＭ−Ｈｂ抗体がモノクロナール
抗体である場合には、ＣＭ−Ｈｂ及びＣＭ−ＨｂのＮ末
端或いは側鎖リジン残基を含む特定のアミノ酸配列を持
ったペプチドのアミノ基がＣＭ化されたペプチド（以
下、「ＣＭ−ペプチド」と略すこともある）で感作した
哺乳動物の脾細胞やリンパ細胞等の抗体産生細胞とミエ
ローマ細胞を融合して得たハイブリドーマの培養上清と
して、又は該上清を塩析法、ゲル濾過法、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、電気泳動等で精製することにより得ることができ
る。この様にして得られたモノクロナール抗体を使用し
た場合にはＣＭ−Ｈｂ中の特定のＣＭ化部位を検出する
ことができる。

【００１４】なお、上記抗ＣＭ−Ｈｂ抗体のタイプ（グ
ロブリンクラス）は特に限定されず、現在知られている
どのようなグロブリンクラスのものも含まれる。また、
上記抗ＣＭ−Ｈｂ抗体には、通常のモノクローナル抗体
のみならず、該抗体の部分分解物（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、
Ｆａｂ'２等）、及び該抗体の活性フラグメント（抗体
の抗原認識部位）が存在する部分構造等も含まれる。

【００１５】上記抗ＣＭ−Ｈｂ抗体はＣＭ−Ｈｂに特異
的に反応するため、該抗体を用いて、ＣＭ−Ｈｂとの抗
原抗体反応を利用して後述する検体溶液中のＣＭ−Ｈｂ
を測定することが出来る。

【００１６】抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を用いて抗原抗体反応に
よりＣＭ−Ｈｂを測定する方法は、抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を
用いる方法であれば特に限定されず、抗原抗体反応によ
り抗原を測定する方法として知られている公知の方法が
使用できる。例えば、抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を不溶性担体に
担持させた試薬を検体溶液と接触させ、その時に起こる
抗原抗体反応に伴う試薬の凝集を検知して検体溶液中の
ＣＭ−Ｈｂを検出する免疫凝集法を採用することが出来
る。また、抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を検体溶液と接触させてＣ
Ｍ−Ｈｂとの抗原抗体反応を行う前若しくは行った後
に、放射性物質、各種色素類、コロイド類、酵素等の標
識物質を抗ＣＭ−Ｈｂ抗体又はＣＭ−Ｈｂに結合させ、
上記標識物質に由来する放射活性、酵素活性等を測定す
ることによって、ＣＭ−Ｈｂを検出する標識免疫測定法
も採用することが出来る。このとき、使用できる標識物
質としては、放射性物質としては放射性ヨード、放射性
炭素等が使用でき、色素としてはフルオレセインイソチ
オシアネート、テトラメチルローダミン等の蛍光色素類
等が使用でき、コロイドとしては金コロイド等が使用で
きる。また、酵素としてはぺルオキシダ−ゼ、アルカリ
ホスファターゼ等が使用できる。さらに抗ＣＭ−Ｈｂ抗
体とともに、上記色素、コロイド類、酵素等を標識した
二次抗体を使用してＣＭ−Ｈｂの検出に用いることもで
きる。

【００１７】前記免疫凝集法について具体的に例示すれ
ば、定性的方法としてはラテックス凝集法、マイクロタ
イター法等が、定量的測定法としてはラテックス定量法
等がそれぞれ挙げられる。これら各方法により検体溶液
中のＣＭ−Ｈｂを測定する際の操作は、通常の基本操作
と特に変わるところはなく、例えば赤血球凝集反応法、
受身凝集反応法、免疫比蝋法、免疫比濁法等において一
般的に採用されている操作、手順等に準じて行うことが
できる。

【００１８】また、前記標識免疫測定法について具体的
に例示すれば、定量的測定法としてはラジオイムノアッ
セイ法、エンザイムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ
法、化学発光イムノアッセイ法等を、半定量的測定法と
してはウエスタンブロッティング法、ドットブロッティ
ング法等をそれぞれ例示できる。これら各測定法におけ
る操作、手順等は一般に採用されているそれらと特に異
ならず、公知の非競合法や競合法、サンドイッチ法等に
準ずることができる。

【００１９】例えば標識免疫測定法における非競合法を
例示すると、検体溶液由来の既知量のＨｂを固定化した
固相に対し、酵素あるいは放射性同位元素等によって標
識された抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を反応させ、洗浄した後、固
相に結合した酵素活性あるいは放射活性を測定すること
によって行われる。反応及び洗浄後の残存活性が大きい
ほど、固相に結合した抗ＣＭ−Ｈｂ抗体の量が多いこと
になる。あるいは抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を固相に固定し、酵
素あるいは放射性同位元素等によって標識された検体溶
液由来の既知量のＨｂを反応させてもよい。

【００２０】また競合法を例示すると、抗ＣＭ−Ｈｂ抗
体を固定化した固相に対し、酵素あるいは放射性同位元
素等によって標識された人工的に作製した標準ＣＭ−Ｈ
ｂと検体溶液とを競合的に反応させ、洗浄した後、固相
に結合した酵素活性あるいは放射活性を測定することに
よって行われる。固相に残存する酵素あるいは放射活性
が少ないほど、検体溶液中のＣＭ−Ｈｂによって標準Ｃ
Ｍ−Ｈｂの結合が競合的に阻害されたことになる。

【００２１】更にサンドイッチ法を例示すると、抗ＣＭ
−Ｈｂ抗体を固定化した固相と検体溶液とを接触させ、
該固相に結合した検体溶液中のＣＭ−Ｈｂの量を、酵素
等によって標識された抗ＣＭ−Ｈｂ抗体によって測定す
ることによって行われる。

【００２２】本発明では血液中のＣＭ−Ｈｂを測定する
が、検体溶液となる測定試料としては血液中に含まれる
Ｈｂを含有する溶液であれば特に限定されない。ここで
血液とは、Ｈｂを含有する血液であればその起源は特に
限定されないが、糖尿病或いは糖尿病合併症に関する情
報を得るという本発明の究極的な目的からして、上記血
液としては人体から採取した血液を用いるのが一般的で
ある。

【００２３】なお、ＣＭ−Ｈｂの起源がＨｂであること
から分かるように、通常、ＣＭ−ＨｂはＨｂと混在した
形で血液中の赤血球中に存在している。このため、抗Ｃ
Ｍ−Ｈｂ抗体との抗原抗体反応を効率よく起こさせるた
めには、血液中の赤血球を溶血させておくことが好まし
い。

【００２４】一般に赤血球は、蒸留水や塩濃度の低い緩
衝液、或いは界面活性剤等と接触させると溶血すること
が知られている。本発明においても溶血手段としては、
これらの方法が何ら制限なく使用出来るが、特に、血液
を親水疎水度が１０〜１７の非イオン性界面活性剤の水
溶液と混合して溶血する方法を採用した場合には、ＣＭ
−Ｈｂの測定の再現性が特に高く、また、抗原抗体反応
時に新たに親水疎水度が１０〜１７の非イオン性界面活
性剤を加える必要も特になくなることから測定操作が容
易になる。このため、本発明の測定法方においては、血
液と親水疎水度が１０〜１７の非イオン性界面活性剤の
水溶液とを混合して調整した溶血溶液を測定試料として
使用するのが好適である。ここで、親水疎水度とは界面
活性剤の分子が持つ親水性と疎水性の相対的な強さのバ
ランスを示す指標として良く知られているＨＬＢ（hydr
ophile-lipophile balance）のことであり、ほとんどの
場合、界面活性剤の構造から計算できる値である｛W.C.
Griffin., J.Soc.Cosmet.Chem.,5,249(1954).｝。代表
的な非イオン界面活性剤のＨＬＢ値は、例えば１９７５
年発行のバイオキミカ エト バイオフィジカ アクタ
第４１５巻第２９頁｛A. Helenius, K. Simons, Biochi
m. Biophys. Acta.,415,29(1975) ｝に記載されてい
る。

【００２５】上記の親水疎水度が１０〜１７の非イオン
性界面活性剤としては、ソルビタンモノラウレート（Ｔ
ｗｅｅｎ２０：親水疎水度 １６．７）、ソルビタンモ
ノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０：親水疎水度 １５．
０）、（９，１０）ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００：親水疎水度 １３．５）、
セチルエーテル（Ｂｒｉｊ−５８：親水疎水度１５．
７）、オクチルグルコシド（親水疎水度 １１）、オク
チルチオグルコシド（親水疎水度 １１）等が挙げられ
る。これらの中でも入手のしやすさの点からＴｗｅｅｎ
２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、オクチルグルコシドの
中から選ばれる少なくとも１種の非イオン性界面活性剤
を使用するのが最も好適である。

【００２６】また、これら非イオン系界面活性剤の水溶
液と血液とを混合して溶血させるときの条件は特に限定
されないが、溶血を確実に行うためには該水溶液中の非
イオン系界面活性剤の濃度は０．０１％以上であること
が好適である。

【００２７】本発明のＣＭ−Ｈｂの測定方法は抗原抗体
反応を利用しているため、試料中には種々の夾雑タンパ
ク質が含まれていてもＣＭ−Ｈｂを測定することができ
る。このため、上記試料としては全血由来の種々の夾雑
タンパク質を含む溶液を試料として使用することが出来
る。この時Ｈｂについて、ＣＭ化されたものとＣＭ化さ
れていないものとの割合（以下、「ＣＭ化率」と略すこ
ともある）を測定することができる。また、上記全血由
来の溶液から予めＨｂを分離精製して調製した溶液を試
料としてＣＭ化率を測定しても良く、この場合には該方
法は夾雑タンパク質の影響を考慮しなくて良いため好適
である。なお、該ＣＭ化率は、血液中のＣＭ−Ｈｂ濃度
と同様に糖尿病、糖尿病合併症、透析アミロイドーシス
等に関して臨床的意義を持つことが強く示唆されている
パラメータである。

【００２８】本発明のＣＭ−Ｈｂの測定方法で使用する
検体溶液は全て血液に由来するものであるため、検体溶
液調整時の希釈倍率や濃縮倍率に応じて測定結果を換算
することにより、血液中のＣＭ−Ｈｂ量を知ることが出
来る。

【００２９】本発明は、抗カルボキシメチル化ヘモグロ
ビン抗体を用いて血液中のカルボキシメチル化ヘモグロ
ビンを抗原抗体反応により測定するに際して、抗原抗体
反応を親水疎水度が１０〜１７の非イオン性界面活性剤
の存在下に行うことを最大の特徴とする。上記抗原抗体
反応を非イオン性界面活性剤の存在下に行わない場合に
は測定再現性が低くなる。また、非イオン性界面活性剤
の存在下で行った場合でも使用する非イオン性界面活性
剤の親水疎水度が１０未満である場合には測定試料溶液
に溶解しにくく、親水疎水度が１７を越える場合には測
定再現性が低くなる。

【００３０】ここで、親水疎水度が１０〜１７の非イオ
ン性界面活性剤としては検体溶液となる測定試料調製時
に溶血に用いることができる親水疎水度が１０〜１７の
非イオン性界面活性剤と同じものが使用できる。なお、
上記非イオン性界面活性剤の中では入手のしやすさの点
からＴｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、オク
チルグルコシドの中から選ばれる少なくとも１種の非イ
オン性界面活性剤を使用するのが最も好適である。

【００３１】抗原抗体反応時に存在させる親水疎水度が
１０〜１７の非イオン性界面活性剤の至適濃度は該界面
活性剤の種類によって異なるため一概に決定できない。
しかしながら、一般に、上記非イオン性界面活性剤の濃
度が低すぎる場合には本発明の効果が得られ難く、また
過剰量使用しても使用量に見合った効果は得られないた
め、抗原抗体反応が実際に行われる溶液中の上記非イオ
ン性界面活性剤の濃度は、０．００１〜０．５重量％の
範囲であることが好ましい。

【００３２】親水疎水度が１０〜１７の非イオン性界面
活性剤の存在下に抗原抗体反応を行う方法は特に限定さ
れず、予め上記非イオン性界面活性剤を検体溶液に添加
しておいてもよいし、抗原抗体反応を行う際の反応溶液
中に添加してもよい。前者の場合には、上記非イオン性
界面活性剤は、前記の溶血操作を行う際に用いる蒸留水
や塩濃度の低い緩衝液等に添加してもよいし、検体溶液
調製時に希釈溶液液として使用する緩衝液中に添加して
もよい。なお、溶血操作時等に使用する非イオン性界面
活性剤の量が多すぎる場合には、緩衝液や純水等で希釈
する方法、被検体溶液Ｈｂ溶液から限外濾過、ゲル濾
過、イオン交換クロマトグラフィー等で非イオン性界面
活性剤を除去する方法等により非イオン性界面活性剤を
除去し、反応溶液中の濃度が前記好適な範囲となるよう
に調製するのが好ましい。

【００３３】なお、再現性の良い測定値を得るために
は、抗原抗体反応を行う３分以上前に検体溶液に上記非
イオン性界面活性剤を添加しておくことが好ましい。

【００３４】本発明では、前記した検体溶液を用いて親
水疎水度が１０〜１７の非イオン性界面活性剤の存在下
に抗ＣＭ−Ｈｂ抗体とＣＭ−Ｈｂの抗原抗体反応が行わ
れるようにして、前記の免疫凝集法、或いは標識免疫測
定法を適用することにより、検体溶液中のＣＭ−Ｈｂを
再現性良く測定することが出来、結果として血液中のＣ
Ｍ−Ｈｂを再現性良く測定することが出来る。

【００３５】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明は以下の実施例によって限定されるもので
はない。

【００３６】実施例１〔サンドイッチＥＬＩＳＡ法によ
る血液中のＣＭ−Ｈｂの測定〕 （１）〔抗原の作成〕 以下の方法によりＣＭ−Ｈｂの生成及び精製を行った。
Ｈｂ（ＳＩＧＭＡ社）をホウ酸緩衝液（０．１Ｍ ｐＨ
９．０）中１ｍｇ／ｍｌとなるように調整し、この溶液
２００ｍｌを室温で２時間、１Ｍグリオキシル酸溶液１
８０ｍｌと共に撹拌後、さらに室温で２時間、１０ｍｇ
／ｍｌ水素化シアノホウ素ナトリウム溶液２０ｍｌと共
に撹拌することでＣＭ−Ｈｂを生成した。また、対照と
して、グリオキシル酸を添加しないこと以外は同様の方
法でＨｂを処理した。

【００３７】上記各処理後のＨｂのＣＭ化率を、トリニ
トロベンゼンスルホン酸（以下「ＴＮＢＳ」と略すこと
もある）を用いて、ＣＭ化されたアミノ基と未反応のア
ミノ基の比を測定することで、以下に示すような方法に
より求めた。

【００３８】即ち、前記のＣＭ−Ｈｂ及びグリオキシル
酸処理していないＨｂの各試料０．５ｍｌを、０．１Ｍ
の四ホウ酸ナトリウムを含む０．１Mの水酸化ナトリウ
ム水溶液０．５ｍｌにそれぞれ加えた。次いで、再結晶
化し希塩酸で洗浄した後、蒸留水で１．１Ｍに調製した
ＴＮＢＳを、２０μｌ加え撹拌した。３０分後に１．５
ｍＭの亜硫酸ナトリウムを含む９８．５ｍＭのリン酸二
水素ナトリウムを２ｍｌ加えて反応を停止させ、蒸留水
で１０倍に希釈した後に４２０ｎｍの吸光度を測定し
た。ＣＭ−Ｈｂの吸光度は０．０３であり、グリオキシ
ル酸処理をしていないＨｂ（対照）の吸光度は１．２５
であった。上記のいずれのＨｂも含まない系で同様の測
定を行ったところ、吸光度は０．０３であったので、Ｃ
Ｍ−ＨｂのＣＭ化率は１００％であることが解った。

【００３９】かかる方法で得られたＣＭ−Ｈｂは、２０
ｍＭ ＰＢＳで４℃にて２日間透析し、未反応のグリオ
キシル酸や水素化シアノホウ素ナトリウムを除去した
後、限外濾過を行い精製ＣＭ−Ｈｂを得た。

【００４０】（２）〔マウスの免疫〕 上記の方法で精製されたＣＭ−Ｈｂを、リン酸緩衝生理
食塩水（以下「ＰＢＳ」と略すこともある）に０．２ｍ
ｇ／ｍｌとなるよう希釈後、フロイントの完全アジュバ
ントと等量混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、５週令）
一匹当り０．２ｍｌを腹腔内投与することによって初回
免疫した。以後２週間間隔で３回、ＣＭ−ＨｂのＰＢＳ
溶液をフロイントの不完全アジュバントと等量混合した
溶液を、マウス１匹当り０．２ｍｌ腹腔内投与し追加免
疫を行った。最後の追加免疫の２週間後、ＣＭ−Ｈｂの
ＰＢＳ溶液０．１ｍｌを静脈内投与することにより最終
免疫した。

【００４１】（３）〔細胞融合〕 上記の方法で最終免疫を行った３日後に免疫マウスから
脾臓を摘出し、脾臓細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）を含むＲＰＭＩ‐１６４０培地に懸濁した。一方、
マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１を１０％ＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ‐１６４０培地で培養し、対数増殖期で細胞を集
め細胞融合に用いた。マウス脾臓細胞とＰ３Ｕ１をそれ
ぞれ血清を含まないＲＰＭＩ‐１６４０培地で3回洗浄
した後、５：１の比率で混合し、１，５００ｒｐｍで５
分間遠心して培地を除去した。細胞沈殿物に５０％ポリ
エチレングリコール１５００を０．５ｍｌ徐々に加え、
１，８００ｒｐｍで８分遠心した。次に血清を含まない
ＲＰＭＩ‐１６４０培地２０ｍｌを徐々に加えた後、
１，５００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去した。沈
殿した細胞をＨＡＴ培地（１×１０^-4Ｍヒポキサンチ
ン、４×１０^-7Ｍアミノプテリン、１．５×１０^-5Ｍチ
ミジン、２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地）
５０ｍｌに懸濁し、９６ウェルマイクロプレートの各ウ
ェルに０．１ｍｌずつ分注した。この融合細胞を５％Ｃ
Ｏ₂、３７℃で培養した。細胞融合の1日後に各ウェルに
０．１ｍｌずつＨＡＴ培地を加えた。７〜１０日後に増
殖したハイブリドーマのコロニーが観察された。ハイブ
リドーマが増殖してきたウェルは全部で２３５ウェル
（５３％）であった。

【００４２】（４）〔スクリーニング〕 ハイブリドーマが十分増殖したウェルの上清を採取し、
以下のようにしてＥＬＩＳＡ法を行うことにより、ＣＭ
−Ｈｂに対する抗体を産生しているハイブリドーマを選
択した。

【００４３】上記の方法で得られたＣＭ−ＨｂをＰＢＳ
で１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェルのＥＩＡ用
マイクロプレートに１ウェル当り１００μｌずつ分注
し、４℃で一晩インキュベーションした。マイクロプレ
ートからＣＭ−Ｈｂ溶液を除去し、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ８０を含むＰＢＳ（以下「Ｔ−ＰＢＳ」と略すことも
ある）で３回洗浄した後、各ウェルに１％ウシ血清アル
ブミンを含むＰＢＳ（以下「Ｂ−ＰＢＳ」と略すことも
ある）を２５０μｌ加え４℃に保存し抗原吸着プレート
として以後の操作に用いた。抗原吸着プレートをＴ−Ｐ
ＢＳで３回洗浄し、ハイブリドーマ培地上清をそれぞれ
のウェルに１００μｌずつ加え３７℃で1時間インキュ
ベーションした。その後培地上清を除去し、Ｔ−ＰＢＳ
で３回洗浄した後、二次抗体溶液を各ウェルに１００μ
ｌずつ加え３７℃で１時間インキュベーションした。二
次抗体としては、ぺルオキシダ−ゼ標識抗マウス免疫グ
ロブリン抗体（カッペル社）をＢ−ＰＢＳで５００倍希
釈して用いた。二次抗体溶液を除去し、Ｔ−ＰＢＳで３
回洗浄した後、発色基質溶液を各ウェルに１００μｌず
つ加え室温で３０分間インキュベーションした。発色基
質溶液は、０．０１％過酸化水素、０．３ｍｇ／ｍｌＡ
ＢＴＳ、［2、2'−アジノビス（３−エチルベンゾチア
ゾリン−6−スルホン酸）二アンモニウム］、を含む
０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いた。適当
量の発色を確認後に１％ＳＤＳを各ウェルに加え反応を
停止し、波長４１０ｎｍでの吸光度を測定した。

【００４４】（５）〔ハイブリドーマのクローニング〕 上記の方法のスクリーニングによってＣＭ−Ｈｂと強く
反応するハイブリドーマを選択し、限界希釈法によりク
ローニングを行った。ハイブリドーマを２０％ＦＣＳを
含むＲＰＭＩ‐１６４０培地で０．５個／０．１ｍｌの
濃度となるように希釈し、９６ウェルマイクロプレート
の各ウェルに０．１ｍｌずつ分注した。この細胞を５％
ＣＯ₂、３７℃で培養した。ハイブリドーマが単一のコ
ロニーで増殖してきたウェルの培養上清について、上記
の方法と同様にしてＥＬＩＳＡ法を行い、ＣＭ−Ｈｂに
対する抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。
その中でＣＭ−Ｈｂと最も強く反応するモノクローナル
抗体を安定的に産生するハイブリドーマとして２Ｂ３を
得た。得られたハイブリドーマ２Ｂ３は、「ハイブリド
ーマ ＣＭ−Ｈｂ ２Ｂ３」として工業技術院生命工学
工業技術研究所へ寄託した｛寄託番号：生命研菌寄託第
１６６３２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１６６３２）｝。

【００４５】（６）〔モノクローナル抗体（抗ＣＭ−Ｈ
ｂ抗体）の免疫グロブリンクラス〕 ＥＬＩＳＡ法によるモノクローナル抗体タイピングキッ
ト（アメリカン・コ−レックス社）を用い、ハイブリド
ーマ培養上清中の抗体の免疫グロブリンクラスを調べ
た。このキットはマウス免疫グロブリンの各クラス、サ
ブクラスに特異的なウサギＩｇＧ抗体を用いて、上記の
ようなＥＬＩＳＡ法に準じた方法で免疫グロブリンクラ
スを調べるものである。ハイブリドーマ２Ｂ３が産生す
るモノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスはＩｇＧ
であった。

【００４６】（７）〔モノクローナル抗体（抗ＣＭ−Ｈ
ｂ抗体）の調製〕 ハイブリドーマ２Ｂ３株を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地で培養した。ハイブリドーマの培養上
清に等量の飽和硫酸アンモニウムを加え、遠心分離し沈
殿を分取した。この沈殿を少量の１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．５）に溶解させ、同じ緩衝液に対して透
析した。透析後遠心分離し不溶物を除き、これをＤＥＡ
Ｅ−セルロースカラムにかけた。緩衝液で洗浄後、食塩
濃度勾配により溶出しＩｇＧ画分を分取した。この画分
をゲル濾過ＨＰＬＣカラム（バイオラッド社、Bio−Sil
TSK250）にかけ、クロマトグラフィーを行うことによ
り抗ＣＭ−Ｈｂ抗体である精製モノクローナル抗体を得
た。

【００４７】（８）〔抗Ｈｂポリクローナル抗体のビオ
チン標識〕 抗Ｈｂポリクローナル抗体のビオチン標識はプロテイン
ビオチニレーションシステム（GIBCO社製）を用いて行
った。

【００４８】市販の抗Ｈｂポリクローナル抗体（（株）
日本バイオテスト研究所製）を、１．５ｍｇ／ｍｌにな
るように２０ｍＭのＰＢＳで調製した溶液に、０．０５
Ｍになるように炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を
加えた。次いで、該抗体溶液６．７ｍｌに説明書に従っ
て作成した５０ｍｇ／ｍｌのＣＡＢ−ＮＨＳエステル溶
液２６μｌを加え、室温で１時間緩やかに撹拌し、０．
１１Ｍになるように塩化アンモニウムを加えて反応を停
止させた。その後、本キットに付属のカラムで抗体溶液
を脱塩した。更に、キット付属のａｖｉｄｉｎ／ＨＡＢ
Ａを用いて、導入されたビオチンのモル数を測定したと
ころ、抗Ｈｂポリクローナル抗体１モルに対してビオチ
ンは１４モル結合していた。

【００４９】（９）〔検体溶液の調整〕 健常者及び糖尿病患者それぞれ２検体溶液よりＥＤＴＡ
−２Ｋを含む真空採血管にて採取した血液を以下の方法
で処理し、下記のサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定試料
溶液として用いる検体溶液を調整した。

【００５０】上記血液のＨｂ濃度をシアンメトヘモグロ
ビン法を用いて測定した後、該血液１０μｌを２０ｍＭ
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４、１％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含
む）９０μｌ中で溶血させ、更に２０ｍＭ ＭＯＰＳ
（ｐＨ７．４、０．１５ＭNaCl を含む）２．４ｍｌで
希釈することでＴｗｅｅｎ２０の終濃度を０．０４％に
調整した。更にその後、Ｈｂの終濃度が１００μｇ／ｍ
ｌとなるように２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ 、０．０４％ Ｔｗｅｅｎ２０を含
む）で希釈した（被検体溶液１）。該検体溶液を、２０
ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ
を含む）で倍希釈することで、更に検体溶液２（Ｈｂ濃
度 ５０μｇ／ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ２０濃度 ０．０２
％）、及び検体溶液３（Ｈｂ濃度 ２５μｇ／ｍｌ、Ｔ
ｗｅｅｎ２０濃度 ０．０１％）を調整した。

【００５１】（１０）〔サンドイッチＥＬＩＳＡ法によ
る血液中のＣＭ−Ｈｂの測定〕 健常者及び糖尿病患者由来の血液から調製した上記各検
体溶液について、上記の方法で得られた抗ＣＭ−Ｈｂ抗
体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＣＭ−Ｈｂ
を測定した。

【００５２】上記の方法で得られた抗ＣＭ−Ｈｂ抗体
を、炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）に３μg／ｍｌと
なるよう希釈したものを、９６ウェルのＥＩＡ用マイク
ロプレートの各ウェルに０．３ｍｌずつ加え、３７℃で
１時間放置し固定した。マイクロプレートから抗体溶液
を除去し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄
した。該プレートの各ウェルに、上記の方法で調整した
検体溶液１〜３を、それぞれ各ウェル当たり０．１ｍｌ
ずつ加え、３７℃で１５分放置した。各ウェルより溶液
を除去し、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄
した後、ビオチン化した抗Ｈｂポリクローナル抗体を２
０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ）に１μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、各ウェルに０．
１ｍｌずつ加え３７℃で１５分放置した。

【００５３】次いで、溶液を除去し０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むトリス塩酸緩衝液（ｐH７．４、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、ＡＢＣキット（ベクター
社）に従いアビジンを介して抗原抗体複合体（抗ＣＭ−
Ｈｂ抗体―ＣＭ−Ｈｂ―ビオチン化抗Ｈｂポリクローナ
ル抗体）をアルカリホスファターゼ標識した。

【００５４】次いで、溶液を除去し０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むトリス塩酸緩衝液（ｐH７．４、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ）で３回洗浄した後、発色基質溶液を各ウェル
に０．１ｍｌずつ加え、室温で4分放置した。発色基質
溶液はｐ−ニトロフェニルリン酸の２−エタノールアミ
ン水溶液（BIO-RAD社）を使用した。

【００５５】反応後、０．５Ｍの ＮａＯＨを各ウェル
に０．１ｍｌずつ加え反応を停止し、波長４６０ｎｍで
の吸光度を測定することで、検体溶液中のＣＭ−Ｈｂに
由来する、発色強度の測定値を得た。同様の測定を５回
行い、測定値の再現性を評価した。上記と同様の方法で
検体処理及び発色強度の測定を行った標準健常者検体の
発色強度の測定値を１Ｕ（ユニット）とした時の各測定
値の換算Ｕ値に関して、平均値、標準偏差、変動係数を
表１に示す。

【００５６】

【表１】

【００５７】比較例１ サンドイッチＥＬＩＳＡ法によ
る血液中のＣＭ−Ｈｂの測定 実施例１で用いた抗ＣＭ−Ｈｂ抗体と同じ抗体を用い
て、実施例１（１０）と同様の方法でサンドイッチＥＬ
ＩＳＡ法を行った。

【００５８】但し、使用した検体溶液は、実施例１で用
いた各血液を以下の方法で処理したものである。

【００５９】即ち、検体溶液の調整は、抗原抗体反応時
に系中に非イオン性界面活性剤が存在しないように、血
液１０μｌを２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）９０μ
ｌ中で溶血させ、更に２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．
４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ を含む）でＨｂの終濃度が
１００μｇ／ｍｌとなるように希釈し検体溶液４を調製
した。次いで、該検体溶液４を、２０ｍＭ ＭＯＰＳ
（ｐＨ７．４、０．１５ＭＮａＣｌ を含む）で倍希釈
することで、更に被検体溶液５（Ｈｂ濃度 ５０μｇ／
ｍｌ）、及び被検体溶液６（Ｈｂ濃度 ２５μｇ／ｍ
ｌ）を調整した。該検体溶液４〜６を用いて、検体溶液
血液中のＣＭ−Ｈｂを測定した。

【００６０】なお、測定は同様の測定を５回行い、測定
値の再現性を評価した。上記実施例１と同様に、標準健
常者検体の発色強度の測定値を１Ｕ（ユニット）とした
時の各測定値の換算Ｕ値に関して、平均値、標準偏差、
変動係数を表２に示す。

【００６１】

【表２】

【００６２】実施例１及び比較例１の測定結果より、測
定系中に親水疎水度１０〜１７の非イオン生界面活性剤
を添加した系におけるＣＭ−Ｈｂ測定結果の変動係数が
小さくなっており、測定再現性が良いことが明らかとな
った。

【００６３】実施例２〔ドットブロッティング法による
血液中のＣＭ−Ｈｂの測定〕 （１）〔ＣＭ−Ｈｂに対するヤギポリクローナル抗体
（抗ＣＭ−Ｈｂヤギポリクローナル抗体）の作成〕 免疫用の動物としてヤギを選び、実施例１（１）の方法
で作成したＣＭ−Ｈｂを抗原として以下の要領で免疫し
た。

【００６４】２ｍｇ／ｍｌになるように調製した該抗原
溶液１．５ｍｌにフロイントの完全アジュバント１．５
ｍｌを加えたものをヤギの背中の皮下に注射した。その
後、２週間おきに２ｍｇ／ｍｌの該抗原０．７５ｍｌ
に、フロイントの完全アジュバント０．７５ｍｌを加え
たものを追加免疫した。この間、ＣＭ−Ｈｂに対するポ
リクローナル抗体が産生されたか否かを確認するため
に、２週間に１回ヤギの静脈から部分採血した。６週間
後、抗ＣＭ−Ｈｂヤギポリクローナル抗体が産生された
ことをＥＬＩＳＡ法で確認し、全採血した。

【００６５】（２）〔抗ＣＭ−Ｈｂヤギポリクローナル
抗体用アフィニティ精製カラムの作成〕 ２５ｍｌのアフィゲル１５を７５ｍｌの１０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ４．５）で洗浄した後、１０ｍｇ／ｍｌのＨ
ｂ溶液を６２．５ｍｌ加え、室温で１時間緩やかに撹拌
した。次いで、未反応のＨｂを濾過にて除去し、１Ｍの
エタノールアミンを３０ｍｌ加え、室温で緩やかに撹拌
し、未反応のＮ−ヒドロキシサクシイミドエステルをブ
ロッキングした。該Ｈｂを固定化した支持体をカラムに
詰め、２８０ｎｍの吸光度が０になるまでイオン交換水
で洗浄した。更に、２０ｍＭのＰＢＳでカラムを平衡化
した。

【００６６】（３）〔抗ＣＭ−Ｈｂヤギポリクローナル
抗体のアフィニティ精製〕 作成した抗ＣＭ−Ｈｂヤギポリクローナル抗体を１ｍｇ
／ｍｌになるように２０ｍＭのＰＢＳで希釈したもの
を、１００ｍｇ程度になるように該アフィニティ精製カ
ラムにアプライした。次いで、２８０ｎｍの吸光度が０
になるまで２０ｍＭのＰＢＳを流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
で流した。カラムに結合しなかった抗体を抗ＣＭ−Ｈｂ
ヤギポリクローナル抗体として回収した。２８０ｎｍの
吸光度が０になったところで、２０ｍＭのＰＢＳから
０．１Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）に換え、カラ
ムに結合している不要なタンパク質を溶離させ、２０ｍ
ＭのＰＢＳでカラムを平衡化し、回収した抗体を再度カ
ラムにアプライし、カラムに結合しなかった抗体を回収
した。この操作を更に１回繰り返し、アフィニティ精製
した抗ＣＭ−Ｈｂヤギポリクローナル抗体を得た。

【００６７】（４）〔抗ＣＭ−Ｈｂ抗体溶液の調整〕 上記の方法で得られた抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を以下の方法で
処理し、下記のドットブロッティング法で用いる抗体溶
液１を調整した。

【００６８】該抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を実施例１（８）の方
法でビオチン標識した後、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む）に１μｇ／ｍ
ｌの濃度となるように加えた。更に、該抗体溶液に終濃
度０．０１％となるようにオクチルグルコシドを添加し
た（抗体溶液１）。

【００６９】（５）〔ドットブロッティング法による血
液中のＣＭ−Ｈｂの測定〕 健常者及び糖尿病患者それぞれ２検体溶液よりＥＤＴＡ
−２Ｋを含む真空採血管にて採取した血液中のＣＭ−Ｈ
ｂを、ドットブロッティング法により測定した。

【００７０】該血液のＨｂ濃度をシアンメトヘモグロビ
ン法を用いて測定した後、該Ｈｂが５００ｎｇとなるよ
うにドットブロッティング装置（バイオラッド社製）を
用いてＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）に吸着させた。
該膜を１０％のスキムミルクを含む２０ｍＭのリン酸緩
衝液（ｐＨ７．４）に室温で１時間浸せきした後、上記
の方法で得られた抗体溶液１を５ｍｌ塗布し、室温で１
時間インキュベーションし抗原抗体反応を行った。反応
終了後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭの
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで該膜を３回洗浄
した後、該膜にアビジン−ペルオキシダーゼ標識ビオチ
ン複合体溶液（ベクスタインＡＢＣキット：フナコシ社
製）を５ｍｌ加え、室温で１時間インキュベーションし
た。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭのリン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍｌで該膜を３回洗浄した
後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（アマシ
ャム社製）を２ｍｌ加えた。該膜における発色度の検出
は、バイオラッドＧＳ−３６３モレキュラーイメージャ
ーを用いて行った。これにより、検体溶液中のＣＭ−Ｈ
ｂに由来する、発光強度の測定値を得た。同様の測定を
５回行い、測定値の再現性を評価した。上記と同様の方
法で発光強度の測定を行った標準健常者検体の発光強度
の測定値を１Ｕ（ユニット）とした時の各測定値の換算
Ｕ値に関して、平均値、標準偏差、変動係数を表３に示
す。

【００７１】

【表３】

【００７２】比較例２〔ドットブロッティング法による
血液中のＣＭ−Ｈｂの測定〕 実施例２で用いた検体溶液と同じ検体溶液を用いて、実
施例２（５）と同様の方法でドットブロッティング法を
行った。実施例２で用いた抗体と同じ抗体を以下の方法
で処理した抗体溶液２を用いて、該検体溶液血液中のＣ
Ｍ−Ｈｂを測定した。即ち抗体溶液の調整において、抗
原抗体反応時に系中に非イオン性界面活性剤が存在しな
いように、該抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を実施例１（８）の方法
でビオチン標識した後、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む）に１μｇ／ｍｌ
の濃度となるように加えた。該抗体溶液にはオクチルグ
ルコシドを添加しなかった（抗体溶液２）。

【００７３】同様の測定を５回行い、測定値の再現性を
評価した。上記実施例２と同様に標準健常者検体の発光
強度の測定値を１Ｕ（ユニット）とした時の各測定値の
換算Ｕ値に関して、平均値、標準偏差、変動係数を表４
に示す。

【００７４】

【表４】

【００７５】以上の結果より、測定系中に非イオン生界
面活性剤を添加した系ではＣＭ−Ｈｂ測定値においてよ
り小さい変動係数が得られた（実施例２）のに対し、測
定系中に非イオン生界面活性剤を添加しなかった系では
より大きい変動係数が得られた（比較例２）。このこと
から、検体溶液中のＣＭ−Ｈｂを抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を用
いてドットブロッティング法により免疫学的に測定する
際には、抗原抗体反応系中に非イオン性界面活性剤を添
加することで再現性良く測定出来ることが明らかとなっ
た。

【００７６】比較例３ 〔サンドイッチＥＬＩＳＡ法に
よる血液中のＣＭ−Ｈｂの測定〕 実施例１において、Ｔｗｅｅｎ２０に代えてｎ−ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、親水疎水度４０、イオン性
界面活性剤）を用いる他は実施例１と同様にして、抗Ｃ
Ｍ−Ｈｂ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により
ＣＭ−Ｈｂを測定した。結果を表５に示す。

【００７７】

【表５】

【００７８】抗原抗体反応時にイオン系界面活性剤であ
るＳＤＳを添加する方法（比較例３）は、非イオン性界
面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を添加する方法（実施例
１）と比較して再現性良く測定することが出来なかっ
た。

【００７９】比較例４ 〔サンドイッチＥＬＩＳＡ法に
よる血液中のＣＭ−Ｈｂの測定〕 実施例１において、Ｔｗｅｅｎ２０に代えてソルビタン
ミリステート（Ｓｐａｎ−４０、親水疎水度６．７）を
用いる他は実施例１と同様にして、抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を
用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＣＭ−Ｈｂの測
定を試みた。親水疎水度が１０未満の非イオン性界面活
性剤であるＳｐａｎ−４０を添加する方法（比較例４）
は、界面活性剤の溶解が困難であった。

【００８０】比較例５ 〔サンドイッチＥＬＩＳＡ法に
よる血液中のＣＭ−Ｈｂの測定〕 実施例１において、Ｔｗｅｅｎ２０に代えて（３０）ｐ
−ｔ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
３０５：親水疎水度 １７．３）を用いる他は実施例１
と同様にして、抗ＣＭ−Ｈｂ抗体を用いたサンドイッチ
ＥＬＩＳＡ法によりＣＭ−Ｈｂを測定した。結果を表６
に示す。

【００８１】

【表６】

【００８２】抗原抗体反応時に親水疎水度が１７以上の
非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−３０５
を添加する方法（比較例５）は、親水疎水度が１６．７
の非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を添加す
る方法（実施例１）と比較して再現性良く測定すること
が出来なかった。

【００８３】

【発明の効果】本発明の測定方法によれば、血液由来の
検体溶液中のＣＭ−Ｈｂを再現性良く測定することがで
き、血液中のＣＭ−Ｈｂの正確な量を知ることが出来
る。このことは、糖尿病、糖尿病合併症或いは透析アミ
ロイドーシス等のマーカーであるＣＭ−Ｈｂを用いた診
断システムの信頼性を高めるものであり、その意義は大
きい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三浦 圭介 山口県徳山市御影町１番１号 株式会社ト クヤマ内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗カルボキシメチル化ヘモグロビン抗体
   を用いて血液中のカルボキシメチル化ヘモグロビンを抗
   原抗体反応により測定する方法において、抗原抗体反応
   を親水疎水度が１０〜１７の非イオン性界面活性剤の存
   在下に行うことを特徴とするカルボキシメチル化ヘモグ
   ロビンの測定方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載のカルボキシメチル化ヘモ
   グロビンの測定方法において、血液と親水疎水度が１０
   〜１７の非イオン性界面活性剤の水溶液とを混合して調
   製した溶血溶液を測定試料として使用することを特徴と
   するカルボキシメチル化ヘモグロビンの測定方法。