JPS60501271A - ヒト絨毛性ゴナドトロピンのイムノアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト絨毛性ゴナドトロピンのイムノアッセイここに記載する発明は、アメリカ保 健衛生省国立衛生研究所（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ 　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ。

ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　）から の認可番号ＨＤ−１５４５４及びＲＲ−００６４５のちとになされ１こ一連の研 究過程より得られたものである。

発明の背景 本出願をなづにあたって、本発明の完全な理解に有ＩＩ］である背景知識を示す 多数の文献を参照する。これ等の文献の開示内容を本出願にそっくりそのまま併 合する。

ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のイムノアッセイ【よ公知であり、特に妊 娠の診断について広く利用されてｌ／入る。Ａイブリドーマ及びモノクローナル 抗体を包含する最近の免疫学の進歩は従来のイムノアッセイの感度を飛躍的に増 大ゼしめた。

例えば、Ｅｈｒｌ　ｉｃｈ、　Ｐ、　Ｈ他、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕ ｎｏｌｏｇｙ　二２７０９（１９８２）、Ｗａｄａ、Ｈ，Ｇ、他、Ｃｌ１ｎ、　 Ｃｈｅｍ、、２８：１８６２（１９８２）　、Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ｓ、Ｙ、他、Ｃ ｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、、　２８：５４６（１９８２）、及びＰｅｔｔｅｒｓｏｎ、 　Ｋ、他、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、、　２９：６０（１９８３）を参照された（１ ゜面清白来の抗体モ使用されている。例えば５ｅｋｒｙａ、　Ｔ、他、八ｃｔａ 　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ清由来抗体を使用するイムノアッセイはｈＣ Ｇのβサブユニットの独特のカルボキシ末端部位に対する抗体を含んでいる（功 張へ及びＢｉｒｋｅｎ、Ｓ、他、　ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏＧＶ、１１０　：１ ５５５［１９８２］）。

ｈＣＧイムノアッセイにおける従来の改良は感度あるいは特異性あるいはその両 方を増加せしめたが、本明細書及び請求の範囲に記載しているイムノアッセイを 使用して達成される非常な高感度と殆んど完璧な特異性は本発明までは不可能で あったものである。この新規なイムノアッセイにより、以前に可能であったもの よりもより小さなｈＣＧレベルの増加の検出及び授精後より早い時点での検出が 可能となった。また本発明は有意なｈｌ　Ｈ交差反応によっても田舎されない癌 診断におけるｈＣＧの測定をも可能にするものである。

発明の要旨 本発明はサンプル中のｈＣＧの検出あるいはｈＣＧレベル測定のためのイムノア ッセイに係る。本アッセイはｈＣＧのβすブコニットのカルボキシ末端部位に対 する抗体及びｈＣＧ上の決定因子に対するモノクロ−太ル抗体を含んでおり、前 記ｈｃＧＪ：の決定因子は前記両抗体が同時にｈＣＧに結合できるようにｈＣＧ のβサブユニットのカルボキシ末端部位から充分に離れた部位にあり、ｈＣＧ上 に両者が結合した場合少なくとも一方の抗体は検出可能である。

好ましい態様において、本イムノアッセイは尿サンプル中のｈＣＧあるいはｈＣ Ｇβを検出あるいはそのレベルを測定することができ、ｈＣＧのβサブユニット のカルボキシ末端部位に対する検出可能な精製された血清由来抗体と、カルボキ シ末端部位から充分に離れたβサブユニツト上の部位に対するマトリックス結合 モノクロ−プール抗体とを含／υでおり、両抗体は同時にｈＣＧに結合できるよ うになっている。

本アッセイは尿サンプル中のｈＣＧの検出あるいはｈＣＧレベルの測定に使用し 得る。かくしてｈＣＧ産生新生物、潜伏性自然流産及び子宮外妊娠の診断が可能 である。

図面の簡単な説明 第１図は本アッセイを使用してバッファー中（Ｏ・・・・・・０）及び尿中（△ ・・・・・・△）のｈＣＧを測定する標準曲線及び尿中のｈＬＨによる交差反応 性の程度を示している（［］・・・・・・口）。

第２図は人工授精女性患者のｂＣＧレベル測定における従来のラジオイムノアッ セイ（Ｃａｎ　Ａ　Ａｓ５ａｙ、△・・・・・・△）と新規に開発したサンドイ ッチアッセイ（Ｏ・・・・・・０）の感度の比較を示す。

また、潜伏性自然流産の結果として起るｈＣＧレベルの仮想パターンも示してい る（・・・・・・）。

発明の詳細な説明 イムノアッセイにおける最近の技術の進歩特にモノクローナル抗体の開発により 、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のアッセイの感度も向上した。しかしな がら本発明以前には、授精して数日後のｈＣＧレベルの増加を検出することがで き月っｈＬＨとの交差反応をもたずに本質的にｈＣＧに対する絶対的持具性を示 すようなアッセイは実用化されてぃなかった。

特定的に、本発明はサンプル中のｈＣＧの検出もしく鵠ｈＣＧレベルの測定又は これらの双方を可能にするイムノアッセイを提供する。このイムノアッセイはｈ ｔ−Ｈには見られない独特のペプチド配列たるｈＣＧのβザブユニットのカルボ キシ末端部位に対する抗体を含む。このイムノアッセイはまたｈＣＧ上の決定因 子に対するモノクローナル抗体をも含み、のｈＣＧ十の決定因子は前記両抗体が 同時にｈＣＧと結合し得るようにβサブユニットのカルボキシ末端部位から充分 に離れた部位にある。また、これら両抗体がｈＣＧに結合している状態で少なく とも一方の抗体は検出可能である。

原則的にはｈＣＧのβザブユニットのカルボキシ末端部位に対する抗体は全て有 効であるが、現在入手し得る好ましい抗体は精製された血清由来抗体である。そ の−例としてＲ５２５及びＲ５２９があるが、これらを後で詳細に説明する。し かしながら本発明はこのような血清由来抗体のみに限定されず、βサブユニツ１ −のカルボキシ末端部位に対するモノクローナル抗体をも、このようなモノクロ ーナル抗体を産生する努力が成功した場合には包含する。

前記両抗体がｈｃＧに結合すると、いずれか一方又は双方の抗体が検出可能であ る。抗体を検出可能にするための方法は当業者に多数知られている。例えば、適 切な方法として１２５Ｉ標識の如き放射性標識、蛍光標識又は検出可能反応を触 媒する酵素への結合（ｌｉｎｋ）、即ちホースラディツシュパーオキシダーゼと 抗体の結合の如きＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。その他、アッセイの抗体のうち の１つに対する第三抗体を用いる方法もある。この第三抗体は血清由来抗体又は モノクローナル抗体であってもよ（、例えばラジオアイソトープ又は蛍光成分で 標識すると検出可能である。

本発明のイムノアッセイは液相のみ、固相のみ又は液相／固相の混合システムで 実施される。現在のところ、前記抗体の一方、好ましくはβサブユニットのカル ボキシ末端部位から離れた部位に対するモノクローナル抗体をアガロースもしく はセファロースの如き固体マトリックスに結合（ａｔｔａｃｈ）するのが好まし い。

本発明のイムノアッセ１′は尿２プラスマ、血清又は他の試料に使用し得るが、 採取し易いという理由がら尿サンプルに用いるのが特に望ましい。実際、これは 本発明の重要利点の１つである。何故なら現在使用し得るｈＣＧ用イムノアッゼ イは尿サンプルには向かないからである。

本発明の好ましい態様はｈＣＧβを検出するが又はそのレベルを測定するイムノ アッセイであり、これによりｈＣＧの検出又は測定が可能になる。このイムノア ッセイは、ｈＣＧのβザブユニットのカルボキシ末端部位に対する精製した血清 由来抗体と、カルボキシ末端部位から充分に離れたβサブユニット上の部位に対 するモノクローナル抗体とを含んでおり、これらの両方の抗体は同時にｈＣＧと 結合することができる。好ましい態様では、精製した血清由来抗体は、両抗体が ｈＣＧβ単独に又はｈＣＧとしてのｈＣＧβに結合し、モノクロ−太ル抗体が固 体マトリックスに結合した場合検出可能である。

本発明はまた、ｈＣＧのβザブユニットのカルボキシ末端部位に対する精製した 抗体、好ましくは標識又はその他の方法で検出可能とした該抗体例えば１２５Ｉ で標識した該抗体にも係る。

本発明のイムノアッセイは尿サンプル中のｈＣＧ検出又はｈＣＧレベルの測定、 あるいはその両方を行う方法を提供する。

検出可能又は測定可能なｈＣＧの複合体の形成を可能ならしめる適正条件のもと で、テストされるサンプルをイムノアッセイにおく。次に生成した複合体がもし 存在すればこれを検出し、あるいは既知量のｈＣＧを含有づる標準に照らして存 在するｈＣＧレベルを決定する。

ｈｃＧレベルの順次測定は、ｈＣＧの生成もしくはそのレベルアップを誘発する 病気の診断又は識別に使用することができる。この種の病気の例としては、ある 種の腫瘍、例えば男性精巣癌、潜伏性自然流産及び子宮外妊娠がある。

イムノアッセイをこのような目的に使用する方法は当業者に良く知られているか ら、これ以上の詳しい説明はざしひかえる。

実験の詳細と題する次の項では本発明の理解を目的とした説明をおこなうが、こ の説明は請求の範囲に記載した本発明を限定することを意図したものではなく、 またそのように解されるこの実験に用いた抗体はＲ５２５及びＲ５２９（Ｂｉｒ ｋｅｎ、Ｓ等。

ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇＶ、　１１東１５５５（１９８２））即ちｈＣＧβ− ＣＴＰ決定因子に対するウザギ抗血清、並びに８１０１　（Ｅｈｒｌｉｃｈ、　 Ｐ、Ｈ等。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２８：２７０９（１９８２） ）即ちｈＣＧβ配座決定因子に対するマウスモノクローナル抗体である。これら の抗体の製法及び特性は上記二つの参考文献に開示されているとおりである。

高度に精製されたｈＣＧ及びｈＣＧβザブユニットの調製については既に記述さ れている。（Ｃａｎｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｅ、及びＨ□ｒｇａｎ。

Ｆ、Ｊ、Ｈｅｔｈｏｄｓ　ｉｎｌｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　ａｎｄ　Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｃ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ。

ｐ、７２７（１９７４）、Ｂｅｒｓｏｎ、Ｓ、Ａ、及びＹａｌｏｗ、Ｒ，Ｓ、、 　Ｎｏｒｔｈ　−Ｈｏｌｌａｎｄ。

Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、編集）。ヒト黄体形成ホルモンは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐ ｉｔｕｒｔａｒｙ　Ａ（ｌｅｎｃＶ（υｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍａｒｙｌ ａｎｄ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）Ｎ　ＩＡＨＤＤ、　Ｎ　ＩＨ より寄贈を受けた。アガロースに共有結合した］ンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ八セ へァロース）、無水α−メチル−Ｄ−マンノシド、並びにウシγ−グロブリン、 コーンフラクション■（Ｃｏｈｎ　ｆｒａｃｔｉｏｎ■）はｓｒｇｍａ７１から 購入した。臭化シアン（ＣｎＢｒ）活性化セフ７０−ス４ＢはＰｈａｒｍａｃｉ ａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｔｓから、またＤＥＡＥ　Ａｆｆｉ−Ｇｅｔ　Ｂ ｌｕｅはＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。購入した材 料は製造者の支持に従って使用した。

モノクローナル抗体の腹水中での製造 精製並びにセファロース４Ｂとの結合 抗１１０Ｇβモノクローナル抗体の製造を、マウス腹水腫瘍系を用いて促進した （Ｚｏｌａ、Ｈ及びＢｒｏｏｋｓ、Ｈｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎｓ、　Ｊ、Ｇ、Ｒ，１ｌｕｒｒｅｌｌ　編集、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ 、、　Ｂｏｃａ　ＲａｔＯｎ、ｚｕｒｌｄａ、（１９８２）ｐ、５０）。

ＣＤ２Ｆ１系統マウス（Ｗｅｓｔ　５ｅｎｅｃａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） ３　Ｑ匹を１７２ｄのプリスタンで感作し、２週間後前記マウスにＢ１０１産生 ハイブリドーマ細胞１００万個を注射した。上記細胞注射の３週間後に腹水の採 取を開始し、該採取を２力月間継続した。

合計で３３０ｄの腹水を採取し、−８０″Ｃで貯蔵した。

４６ｍの１つのアリコートを０．０５ＭＮａｃｚと０．０２％のアジ化ナトリウ ムとを含む１）８７．５の０．０２５Ｍトリス−ＨＣＲに対し４℃で全体的に透 析した。透析物を２５Ｘ３００舖の叶ＡＥ　Ａ［１−Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅカラムに 入れ、透析に使用したものと同じバッファーで５ｄずつのフラクションを溶出し た。２８０ｎｍにおいてピーク吸光度を有する１００フラクシヨンを集めた。

この調製物中に含有されるタンパク質の総量は、Ｗａｒｂｕｒｇ及びＣｈｒｉｓ ｔｉａｎの方法（Ｗａｒｂｕｒｇ、０　及びＣｈｒｉｓｔｉａｎＪ、、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ｚ、。

３１０：３８４（１９４１））で計算すると、１．４６ｇであった。得られた調 製物を、非還元性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での電気泳動（Ｗｅｂｅｒ、 に、ａｎｄ　０ｓｂｏｒｎ、Ｈ，、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　孜４４０６（ １９６９））にかけると含有タンパク質の少なくとも８０％がγ−グロブリンで あることが判明した。

部分的に精製された、約８０ｒＲ９のγ−グロブリンを含有する上記腹水からの 調製物４０ｄを、０．５ＭＮａｃｘを含む１）Ｈ８，０の０．１ＭＮａＨｃＯ３ に対し４℃で透析した。得られた透析物をＣｎＢｒ活性化セファロース４Ｂ１０ ｙに、該セフ７０一ス製造者の指示に従い結合した。１０ｍＭＮａ２ＥＤＴ△、 ０．１％のアジ化す（〜リウム及び０．１％のウシニーグロブリン（バッファー Ｂ）とを含有するｐＨ７，４の１０ｒｎＭリン酸バッファー塩溶液中のＢ１０１ 結合セファロース４Ｂの５０％（Ｖｏｌ、／ｖｏ１．）懸濁液を調製し、４℃で 貯蔵した。

ウサギ抗ｈＣＧβ−ＣＴＰ　（Ｒ５２５）の精製及びヨウ素化ｈＣＧβ１０ｍｇ をｃｎｓｒ活性化セフｒｏ−ス４Ｂ２ｇと結合させた。ｈＣＧβ結合セファロー ス４Ｂを使用して０．９Ｘ’ｌ０ｃｍのカラムを形成し、Ｒ５２５のアフィニテ ィー精製に使用した。ブースティング間の数個の異なる溶出から得たＲ　５２５ のプール５４ｍを、蛙動ポンプを用いて４℃で３０時間連続的にカラム上に循環 させた。カラムを塩溶液で全体的に洗浄し、ゆるく付着している物質を除去した 。次に、カラムをｐＨ３゜０の３ｄグ）７ニジンー１」ｃｉ！２０ｄと１１３． ０の６Ｍグアニジン−１」Ｃｉ’　２０　ｄとで順次溶出した。溶出液を１ｄの フラクション毎に収集し、２８０１１１１にお（づる吸光度を測定した。吸光度 曲線は、３Ｍ及び６Ｍのグアニジン−ＨＧ’による溶出領域に対応する位置に２ 個の顕著なタンパクピークを含Ｉυでいた。

２８０ｎｍにピーク吸光度を有するフラクションをプールした後、４℃でｐＨ５ ，５の１０ｍＭ１ｉ−酸ナトリウム、次イテｐＨ７，５の０．３ＭＮａＰＯ４に 対して全体的に透析した。透析物、未精製Ｒ５２５プールのアリコート、及びｈ ＣＧβアフィニティーカラムを循環させたＲ５２５プールの１２”Ｉ−ｈＣＧ結 合能を試験した。未精製のＲ５２５プール、及び６Ｍグアニジン−ＨＯ２により カラムから溶出した精製物のみが顕著な結合を示し１：、５．７威の精製Ｒ５２ ５の全量から得た１：１５００希釈液は未精製抗血清プールの１：６００希釈液 に対し５０％の標識を結合させ、精製Ｒ５２５の総タンパク質含有量は１．９Ｒ ｇと計算される（Ｗａｒｂｕｒｇ、０．　ａｎｄ　Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ、　Ｗ、 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｚ、、　３１東３８４（１９４１））。

酸化剤としてｌｏｄｏｇｅｎ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ社）を使用す ることにより、３０μ９の精１！ＩＪＲ５２５を１ｍＣｉ　Ｎａ　１２”１（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ）で放射活性標識した（Ｆｒａｋｅｒ、　Ｐ、　Ｊ、及び５ｐｅ ｃｋ、Ｊｒ、Ｊ。

０、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍ、、８０ ：８４９（１９７８））　。Ｅつ素化生成物の比活性はタンパク質μｇ当たり約 ２０μＣｉであった。

サンドイッチアッセイの実施 以下に記載のサンドイッチアッセイの条件は、最大のｈＣＧ結合を得るために必 要な試薬濃度、インキュベーション時間及び温度を精密に分析して得られた最適 の結果である。検定に先立ち、尿試料をＮａＯＨで１）Ｒ７，４に調整し、３０ ００Ｘｇで１５分間遠心した。標準的にバッフｉ７−　Ｂｄ中に０．００４〜０ ．５１ＲｇのｈＣＧを含むか又はバッファーＢのみを含む（非特異結合、ｈｃＧ 不在下の標識［１２５Ｔ　−Ｒ５２５］の結合の定量の場合）４ｍの塊アリコー ト２個又は３個を１２Ｘ７５＃のポリエチレン管内に採取した。約２５μグのγ −グロブリンを含有するバッファーＢ中のＢ１０１結合セファロース４Ｂの６． ２５％懸濁液２／１０−を各管内に取った。試料からｈＣＧを抽出すルタめに、 管に栓をしＬａｂｑｕａｋｅｌｆｉ盪器（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）に水 平に配置し、振盪させながら室温で２時間インキュベートした。管を、３０００ Ｘｇで１５分間遠心した。吸引にまり上清を除去し、Ｂ１０１−セファロース４ Ｂペレツトを２＃Ｉｉ２バツフア−Ｂ＋１％Ｔｗｅｅｎ２Ｑで２回洗浄した。

５００００ＣＰＭ　１２５１−Ｒ５２５を含むバッファーＢ　１／１０Ｉｎｅを 台管に添加した。試料をＬａｂｑｕａｋｅ振緩器で振盪させながら４℃で４８〜 ７２時間垂直にしてインキュベートした。次に管を２戒のバッファーＢ＋１％Ｔ ｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、非特異結合を減少させた。

洗浄後に残っている放射活性をパラカードオートガンマシンチレーションスペク トロメータで定量した。標準曲線形成のためのデータ減少は、４パラメータロジ ステイツクフイツトを用いて達せられた（Ｒｏｄｂａｒｄ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｈｕ ｔｔ、Ｄ、Ｈ，、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｒａｄｉ ｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｐｒｏｓｅｄｕｒｅｓ　 ｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅ、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｔｏｍｉｃ　Ｅｎｅ ｒｇｙ　Ａｇｅｎｃｙ、　Ｖｉｅｎｎａ。

Ａｕ５ｔｒｉａ、口ｎ１ｐｕｂ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、ｐ、１６５（１９７４ ））　。

ｈＣＧ　ＲＩＡの実施 ｈＧＧβＣＴＰ決定因子に対するＲ５２９抗血清を用いてｈＣＧのラジオイムノ アッセイを行い、コンカナバリンＡにより尿から抽出したｈｃＧ’ｍ測定した（ Ｗｈｅｍａｎｎ、Ｒ，Ｅ、等。

Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２７：１９９７（１９８１）参照） 。

被検者 コロンビア長老派教会医療センター（Ｃｏｌｕｍｂｉａ　Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉ ａｎＭｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ）で正常なサンプル提供者から起床後最初の 尿を収集し無作為サンプルを抽出して、ｈＣＧ分泌の正常範囲を設定した。妊娠 の早期検出のために被検者の起床後最初の尿のｈＣＧを測定した。被検者はコロ ンビア医科歯科大学産婦人科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　０ｂｓｔｅｔｒｉ ｃｓ　ａｎｄ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、　Ｃｏｌｕｍｂｉａ　ＣｏＣｏ１１ｅ　 ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ　ａｎｄ　Ｓｕｒｇｅｏｎｓ）に於いて、配偶者た る男性が無精子症であるため人工授精した正常な婦人連である。

収集した種々の尿の比重の差を補正するために、尿のｈＣＧ濃度をクレアヂニン 濃度に標準化した。

結　果 サンドイッチアッセイ標準曲線 サンドイッチアッセイで生じたｈＣＧ結合の典型的標準曲線を第１図に示す。３ 　ｍａｘの１０％及び９０％〈ＥＤｌｏ及びＥＤ９ｏ）と等価の結合を生じるｈ ｃＧｆｉｌを試験的に標準曲線の有効範囲の両端値と考えた。第１図のアッセイ では、ＥＤｌｏ及びＥＤ９ｏが夫々０．０１及び０．５０ｎＭｄのｈＣＧに対応 しており５０倍の有効範囲を与える。Ｔｗｅｅｎ２０とウシγ−グロブリンとを 含有するバッファーでペレットを全体的に洗浄してアッセイ中の非特異的結合（ ＮＳＢ）を許容レベルまで減少させる。第１図のアッセイではＮＳＢレベルが測 定値合計の２．５％であった。

第１図はまた、正常な男性の尿から抽出したｈＣＧの用量作用曲線を示す。この 曲線は、標準曲線での用量と等しい用量での測定値から得られた。即ち、尿中の ｈＣＧの用量作用曲線はバッファーＢ中のｈＣＧの用量作用曲線に本質的に等し い。尿中のｈＣＧでは用量作用曲線の勾配及びＥＤ５ｏが夫々１．１７３及び０ ．０６６ｎＭｄであり、バッファー中のｈＣＧでは夫々１．０９８及び０．０７ ２ｎＭｍであった。

第１図はまた、正常な男性の尿に加えたｈＬＩ−１の用量作用曲線を示す。注目 すべきは、ｈｃＧ′ａ度には単位ｎＭｄを使用したがｈＬＨｉｌ１度には単位μ ９／ｄが使用されていることである。

０．０１ｎｏ／厩のｈｃＧに等価の用量作用を得るためには２μｇ／威のｈｌ　 Ｈ２Ｎ度が必要である。従って、サンドイッチアッセイに於けるこの濃度のｈＬ Ｈの交差反応性は質量で見ると０．０００５％である。このｈＬＨレベルは、月 経周期中間のｈＬＨ量が急増する時期の婦人から採取した尿中に存在するｈｌＨ Ｌ／ベルの約５０倍である（Ｂ、　Ｂ、　５ａｘｅｎａ等、Ｆｅｒｔ　ｉ　ｌ　 ｉ　ｔｙａｎｄ　５ｔｅｒｉｌｉｔｙ、２８：１６３（１９７７））　。従って 、生理的濃度のｈＬＨはサンドイッチアッセイを阻害することはできない。

要約すれば、第１図はアッセイがバッファー中及び尿中のｈＣＧの測定に同等に 有効であり高い感度を有すること、即ち０．００４１１（１／ｄに至るような低 いレベルのｈＣＧを検出し得ることを示しており、また、ｈＬＨとの交差反Ｉｔ −が極度に低いこと、即ち約０．０００５％であり従ってアッセイが完全にｈＣ Ｇに特異的であることを示す。

第２図は、人工授精した婦人被検者について授精後の種々の日数に於ける尿中の ｈＣＧレベルを本発明のアッセイを使用して測定した結果を示す。第２図ではま た比較のために、同じ被検者の尿中のｈＣＧレベルを標準ラジオイムノアッセイ を使用して測定した結果を示ず。第２図から明らかな如く、本発明のアッセイに よれば、授精６日後に増加したｈｃＧレベルを検出し得る。対照的に標準ＲＩＡ （サンドイッチアッセイ）は感度が劣っており、授精１０日後まではｈＣＧを検 出することができない。

第２図はまた、潜伏性自然流産を診断Ｊるためにアッセイが使用された結果を示 す。第２図の仮想パターンは、標準ＲＩＡでは潜伏性自然流産の結果生じるｈＣ Ｇの増減を検出できないが本発明のアッセイは極めて高い感受性を有するためか かるｈＣＧの増減の検出が可能であることを示す。

浄書（内容に変更なし） ＣＰｔ−Ｉ　Ｂｄ　ＸＩＱ−３ 手続補正歯 昭和６０年２月ノ２日 ［有］ 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　８４１００５７２２、発明の名称　ヒト絨毛性 ゴナドトロピンのイムノアッセイ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ザ・トラステイーズ・オブ・コロンビア・ユニヴアーシティ・イン・ザ ・シティ・Ａブ・ニコ−−・ヨーク ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４何　山田ビル６　補正により 増加する発明の数 ７、補正の対象　特許払第１８４条の５第１項の規定による古血中、出願人の代 表者の欄、図面の翻訳文及び委任状８、補正の内容 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面中、出願人の（（国際調査 報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｈＣＧのβサブユニットのカルボキシ末端部位に対する抗体と、ｈＣＧのβ サブユニットのカルボキシ末端部位から充分に離れた部位にあるｈＣＧの決定因 子に対するモノクローナル抗体とからなり、両抗体は同時にｈｃＧに結合し得、 両者がｈＣＧに結合している状態でそのうちの少なくとも１つが検出可能である ことを特徴とするサンプル中のｈＣＧを検出して測定するイムノアッセイ。 ２、ｈＣＧのβサブユニットのカルボキシ末端部位に対する抗体が精製した血清 由来抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のイムノアッセイ。 ３、ｔｌｃＧのβサブコニツ１−のカルボキシ末端部位に対する抗体がモノクロ ーナル抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のイムノアッセイ。 ４、ｈＣＧのβサブユニットのカルボキシ末端部位に対する抗体が検出可能であ ることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のイムノアッセイ。 ５、検出可能な抗体が放射性同位元素で標識されていることを特徴とする請求の 範囲第４項に記載のイムノアッセイ。 ６、抗体が１２５１で標識されていることを特徴とする請求の範囲第５項に記載 のイムノアッセイ。 ７、検出可能な反応で触媒の役割を果す酵素に抗体が結合していることを特徴と する請求の範囲第４項に記載のイムノアッセイ。 ８、酵素がホースラデイシュパーオキシダーゼであることを特徴とする請求の範 囲第７項に記載のイムノアッセイ。 ９、抗体が、標識されている第三抗体との複合体を形成した上で検出可能である ことを特徴とする請求の範囲第４項に記載のイムノアッセイ。 １０、抗体がＲ５２５又はＲ５２９であることを特徴とする請求の範囲第２項に 記載のイムノアッセイ。 １１、Ｒ５２５又はＲ５２９が１２５Ｉで標識されていることを特徴とする請求 の範囲第１０項に記載のイムノアッセイ。 １２、ｈＣＧのβサブユニットのカルボキシ末端部位に対する抗体が固体マ］〜 リックスに結合していることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のイムノアッ セイ。 １３、モノクローナル抗体がｈＣＧのβサブユニツト上の決定因子に対するもの であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のｈＣＧβ用イムノアッセイ。 １４、モノクローナル抗体が８１０１であることを特徴とする請求の範囲第１３ 項に記載のイムノアッセイ。 １５、ｈＣＧ上の離れた決定因子に対するモノクローナル抗体が検出可能である ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のイムノアッセイ。 １６、ｈＣＧ上の離れた決定因子に対するモノクローナル抗体が固体マトリック スに結合していることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のイムノアッセイ。 １７．７１〜リツクスがアガロース又はゼファロースであることを特徴とする請 求の範囲第１６項に記載のイムノアッセイ。 １８、サンプルが尿サンプルであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の イムノアッセイ。 １９、ｈＣＧのβサブユニットのカルボキシ末端部位に対する精製した血清由来 抗体と、カルボキシ末端部位から充分に離れているβサブユニットＬの部位に対 するモノク［１−ナル抗体とからなり、両抗体は同時にｈＣＧに結合し得、両抗 体がｈＣＧ又はｈＣＧβに結合している状態で精製した血清由来抗体が検出可能 であり、モノクローナル抗体が固体マトリックスに結合していることを特徴とす るｈＣＧ又はｈＣＧβを検出して測定するイムノアッセイ。 ２０、ｈｃＧのβサブユニットのカルボキシ末端部位に対する精製抗体。 ２１、請求の範囲第２０項に記載している標識した精製抗体。 ２２、　１２５■で標識した精製Ｒ５２５゜、、、１２５Ｉで標識した精製Ｒ５ ２９゜２４、尿サンプル中のｈＣＧを検出するか又は該ｈＣＧのレベルを測定す るか又はその両方を行うための方法であって、ｈＣＧの検出可能又は測定可能複 合体を形成し得るような適当な条件下に該サンプルを請求の範囲第１項に記載の イムノアッセイにおき、得られる複合体を検出し又は測定することを特徴とする 前記方法。 ２５、請求の範囲第２４項の方法に従ってｈＣＧレベルを測定し、測定したレベ ルを新生物に特徴的な値と比較することからなる、率丸癌に付随するようなｈＣ Ｇ産生新生物の存在を診断する方法。