PT97839B

PT97839B - Processo para a deteccao e/ou doseamento de hormonas e anticorpos utilizaveis no referido processo de deteccao

Info

Publication number: PT97839B
Application number: PT97839A
Authority: PT
Inventors: Marie-Christine Maurel
Original assignee: Agronomique Inst Nat Rech; Centre Nat Rech Scient
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1991-05-31
Publication date: 1998-10-30
Also published as: AU7958091A; FR2662804A1; EP0533719B1; NZ238394A; WO1991019195A3; PT97839A; ATE148562T1; ZA914121B; FR2662804B1; DE69124511D1; IE911894A1; WO1991019195A2; DE69124511T2; DK0533719T3; ES2099746T3; EP0533719A1; US5674700A

Description

INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE-INRA e CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE-CNRS

PROCESSO PARA A DETECÇÃO E/OU DOSEAMENTO DE HORMONAS E ANTICORPOS UTILIZÁVEIS NO REFERIDO PROCESSO DE DETECÇÃO”

A presente invenção diz respeito a um processo para a detecção e/ou doseamento de hormonas compreendendo as hormonas placentárias, assim como aos anticorpos utilizáveis no referido processo de detecção.

Por hormonas entendem-se as substâncias elaboradas pelas diferentes glândulas endócrinas humanas e animais e, particularmente, as hormonas hipofisárias (FSH, LH, TSH, GH, ACTH, prolactina, ocitocina, MSH, ADH), as hormonas placentárias aparentadas [coriogonadotropinas humanas (hCG) e equinas (eCG), coriosomatomamotropina (CS), GH placentária], as hormonas tiroidianas, as hormonas supra-renais, as hormonas gonádicas e as hormonas pancreáticas.

De acordo com a sua estrutura química estas hormonas pertencem a diferentes categorias :

as hormonas derivadas de aminoácidos (hormonas tiroidianas, hormonas da medula supre-renal), as hormonas peptídicas e protídicas (hormonas pancreãticas, GH, ACTH, prolactina, MSH, ADA, ocitocina), as hormonas esteroidianas (hormonas gonãdicas, hormonas do córtex supra-renal) e as hormonas glicoproteicas (LH, FSH, TSH, hCG, eCG).

As hormonas glicoproteicas são caracterizadas por uma mesma organização estrutural: são formadas pela associação de duas sub-unidades sub-unidade o< é igual para todas as hormonas glicoproteicas de uma mesma espécie animal. Pelo contrário, a sub-unidade β é diferente de uma hormona para a outra e confere a especificidade de acção. As hormonas peptídicas apresentam, do mesmo modo, um parentesco estrutural assim como as hormonas polipeptídiças (exemplo: GH e prolactina).

De uma maneira geral, estas hormonas não são segregadas com taxas constantes mas apresentam, pelo contrário, variações de concentração circulante de fraca amplitude (micropulsatilidade) ou, em certos casos, de forte amplitude (ex: pico de secrecão da FSH depois da LH em período pré-ovulatório). É, portanto, necessário, dispor-se de métodos de doseamento que permitam medir de modo preciso e específico a taxa circulante destas diferentes hormonas, no sangue ou em qualquer outro fluído biológico possível.

Estes métodos de doseamento deverão ser, além disso, muito sensíveis, na medida em que as concentrações basais destas dife-3-

rentes hormonas sao relativamente fracas (para as hormonas hipofi sãrias por exemplo, de 0,1 ng/ml a alguns ng/ml), fora todos os casos patológicos.

A título de exemplo, a detecção e/ou o doseamento das hormonas gonadotrópicas LH e FSH é particularmente importante no estudo da fisiologia da reprodução masculina e feminina nos animais e no homem. Nos mamíferos, por exemplo, o funcionamento do ovãrio comporta durante o período da actividade genital (contínua ou em épocas de acordo com as espécies) uma sucessão de ciclos ovarianos durante os quais os gâmetas femininos amadurecem com intervalos regulares.

ciclo ovariano comporta duas fases: a fase folicular (crescimento do folículo e maturação do ovocito) leva à ovulação, período propício para a fecundação, e a fase luteal (formação do corpo amarelo). A FSH é responsável pelo crescimento e pela maturação do folículo pré-ovulatório; a LH intervém mais particularmente, no crescimento folicular terminal deste último e no desencadear da ovulação. Com efeito, a ovulação ocorre em um momento muito exacto e constante, para cada espécie, depois do pico da LH (entre 17 e 24 horas de acordo com as espécies).

Parece portanto útil e importante poder dispor-se, tanto no laboratório para doseamentos muito exactos como no local ou domicílio para a detecção do pico pré-ovulatório da LH (para prever o melhor momento para uma inseminação artificial, por exemplo), de instrumentos para a detecção específica da LH, nos diferentes animais e no homem.

Do mesmo modo, a possibilidade de detectar níveis circulantes muito baixos da coriogonadotropína (CG) é particularmente importante para a realização de conjuntos (Kits) para diagnósticos de gravidez o mais precoces possível, especialmente na mulher.

No homem, um certo número de testes realizáveis no domicílio a partir da urina foram desenvolvidos e comercializados para a LH e a hCG.

No que diz respeito â LH, existe um certo número de Kits) que estão actualmente disponíveis e que permitem determinar de modo exacto a data da ovulação. Estes testes utilizam anticorpos monoclonais e baseiam-se quer em uma reacção de aglutinação (DISCRETEST, CHEFARO para ORGANON; HI GONADO TEST, MOSHIDA), .quer em uma reacção imunoenzimática (OVUSTICK, MONOCLONAL ANTIBODIES; OVUTEST, CLONATEC; FIRST RESPONSE; REVELATEST 0, ARLEY-DIAGNOSTIC).

No que diz respeito â hCG, existem vários testes de gravidez disponíveis e realizam-se a partir de anticorpos policio nais ou, o mais frequentemente, de anticorpos monoclonais.

Pode-se distinguir de acordo com o seu princípio:

os testes de hemaglutinação (ou testes de anéis)

(PRIMOTEST RAPID de FUMOUZE; BETA-TEST 100 UI de SOEKAMI-LEFRANCQ; G-TEST de THERANOL; ELLE-TEST BETA de DEGLAUDE);

os testes de aglutinação de partículas de ouro (PREDICTOR COLOR de NICHOLAS);

os testes imunoenzimáticas de leitura indirecta (aparecimento de uma cor azul sobre a placa BLUE TEST de CLONATEC) ou de leitura directa [aparecimento de um sinal particular (ponto, barra ou sinal +) : BLUE POINT de CLONATEC; G-TEST LOGIC de THERANOL; PREVISION de PHARMYGIENE];

os testes que associam anticorpos monoclonais e migração em membrana, sem enzima de revelação; CLEAR BLUE EVIDENCE de POLIVE-TRICOSTERIL; PRIMOTEST MINUTE de FUMOUZE; G-TEST PRO de THERANOL; FIRST RESPONSE de TALCO; TEST PACK PLUS hCG de ABBOTT). São caracterizados pelo aparecimento de um sinal colorido (bandas rosas, barra azul, etc.).

De uma maneira geral, os métodos de doseamento, actualmente utilizados em clínica humana, para estas diferentes hormonas são, por um lado, métodos radioimunológicos (por exemplo: sistema AMERLEX-M de AMERSHAM, sistema MAIAclone de SERONO para hLH, hFSH, hTSH, hCG, etc.) e, por outro lado, métodos enzimo-imunométricos ou imunométricos (utilizando um marcador nao-enzimático:

partículas de latex, quelato de európio). Entre os sistemas enzimo-ímunométricôs, alguns utilizam um sinal fluorescente (sistema enzimo-microparticular IMx de ABBOTT; STRATUS SYSTEM de AMERICAN DADE para LH, FSH, hCG, etc.) ou luminescente (sistema AMERLITE de AMERSHAM para LH, TSH, FSH, hCG; sistema MAGIC LITE de CIBA CORNING para TSH, prolactina, etc.). Entre os sistemas imunométricos, pode-se citar particularmente o processo de doseamento DELFIA de PHARMACIA que utiliza o európio como marcador fluorescente, para hLH, hFSH, hTSH, hCG, etc. .

Nos animais, os métodos de doseamento da LH são especialmente :

o doseamento da LH na urina do Gorila (N. M. CZEKALA e colab., J. Reprod. Fert., 1988, 82, 255-261), que utiliza dois anticorpos monoclonais estando um fixado sobre uma placa de microtitulação e o outro ligado â fosfatase alcalina. 0 tempo de incubação total deste teste é de 4 horas (2 horas: incubação da amostra sobre o anticorpo fixado; 1 hora: incubação do segundo anticorpo ligado; 30 a 50 minutos: revelação enzimática). A sensibilidade deste doseamento é de 0,5 ng/ml.

o doseamento da LH bovina plasmática (soro ou meio de cultura), por um método radioimunolégico (R. HOIER e colab., Theriogenology., 1988, 30, 235-243). Este doseamento realiza-se

na presença de dois anticorpos (ACp anti-LH feito no coelho,

AC₂: anti-IgG de coelho) e LH radioactiva (marcada com iodo 125).

Trata-se de um método por competição, ligando-se o primeiro anticorpo (ACp à LH da amostra ou ãLH~ radioactiva adicionada (incubação de 36 a 48 horas). A separação do complexo anticorpo*

-LH, da LH livre realiza-se utilizando o segundo anticorpo (AC₂) imobilizado sobre as paredes de um tubo (incubação: 3 horas, sob agitação a 37°C).

A sensibilidade deste método é da ordem de 1,5 ng/ml.

um doseamento ELISA da LH de murganho, de rato, de ovinos e de bovinos, aplicável ao soro, aos meios de cultura de tecidos e aos tampões, (J. L. SPEAROW e colab., Biol. Reprod., 1987, 37, 595-605), que utiliza o princípio da competição entre uma LH ligada à peroxidase e a LH da amostra, em relação a um anticorpo (ACp que é quer um imuno-soro anti-LH ovino produzido no coelho, quer um anticorpo monoclonal anti-LH bovino, quer um imuno-soro anti-L ovino produzido no frango.

Para o anticorpo preparado no coelho, a incubação AC^-amostra é da ordem de 16 a 24 horas a 20°C sob agitação; a adição da LH-peroxidase necessita de uma nova incubação de 16 a 24 horas a 4°C. A revelação realiza-se com TMB (30 minutos a 2 horas).

z ss

Nestas condições, a sensibilidade do método é de 79 pg/ml.

um método de doseamento ELISA da LH bovina plasmâtica (W. G. ABDUL-AHAD e colab., J. Reprod. Fert., 1987, 80, 1-9). Trata-se de um método sanduíche sobre placas de microtitulação.

primeiro anticorpo (AC^) é uma IgG anti-LH bovina de coelho e o segundo anticorpo (AC₂) ê o fragmento Fab' preparado a partir do primeiro anticorpo, conjugado com a peroxidade.

Apresentam um protocolo curto (4 horas) e um protocolo longo (20 horas). 0 limiar de detecção obtido com o protocolo curto é de 260 pg/ml e o obtido com o protocolo longo é de 70 pg/ml.

A revelação da peroxidase faz-se com OPD.

Uma outra publicação dos mesmos autores (620th Meeting Dublin, Biochem. Soc. Transactions, 1985, .15, 277-278), descreve o mesmo processo de doseamento, utilizando como AC₂ um conjugado Fab’-^ lactamase.

Neste artigo, está especificado que o tempo do doseamento é de 4 horas e 30 minutos e que o limiar de detecção é de 420 pg/ml.

ê igualmente necessário citar o doseamento da LH em macacos Rhésus por um RIA que utiliza LH ovina marcada e um anti9-soro anti-LH ovina que reage como as LH de numerosas espécies.

Os métodos de doseamento da FSH nos animais são essencialmente do tipo radioimunológico, mesmo para as outras hormonas.

Um doseamento imunoenzimático da prolactina de rato foi descrito (A. P. SIGNORELLA e colab., Anal. Biochem., 1984, 136, 372-381). Este doseamento, do tipo competitivo, dá um limiar de detecção fixado em 0,6 ng/ml aplicando um protocolo longo (24 horas).

Contudo, de uma maneira geral, para o doseamento das hormonas, tanto no homem como no animal, apesar da diversidade dos métodos de doseamento propostos e aplicados, numerosos trabalhos mencionam o problema de interferências não-específicas nos doseamentos, que leva â obtenção de resultados falsos (caso de falsos positivos ou de falsos negativos [J. P. GOSLING, Clin. Chem., 1990, 36, 1408-1427; K. A. BRENSING, Horm. Metabol Res.','> 1989, 21, 697-698; P. E. GARRETT, J. Clin. Immunoassay, 1989, 12, 18-19]. Este problema de interferências não-específicas leva a uma perda de sensibilidade e do limiar de detecção do doseamento. Pode-se partieularmente citar o caso de um doseamento imunoenzimático da hCG (B. LONGHI e colab., 1986, J. Immun. Meth., 92, 89-95) para o qual o limiar de detecção foi determinado em 2,2 UI/1 em um meio sem soro e em 10,4 UI/1 em um meio contendo 20% de soro humano hCG negativo.

-10Foi proposto um certo número de soluções para este problema de interferência, mas estas levam, em todos os casos, a uma perda de sensibilidade do doseamento. Trata-se particularmente :

de suprimir a parte Fc do segundo anticorpo e de ligar directamente a enzima a um fragmento Fab' [W. G. ABDUL-AHAD e colab., J. Reprod. Fert., 1987, 80, 1-9]. É necessário, neste caso, aplicar tempos de incubação e de revelação enzimática maiores para atenuar a perda de sensibilidade devida ao tratamento do segundo anticorpo: um limiar de detecção de 70 pg/ml para a LH bovina exige um protocolo de 20 horas, um protocolo curto de 4 horas apenas dá um limiar de detecção de 260 pg/ml.

de aplicar um teste que permita determinar o nível dos sinais não-específicos dependentes da amostra; para isto, substitui-se o anticorpo especifico não-marcado (ACp por um outro anticorpo semelhante ao ACp mas de qualquer outra especificidade (P. KASPAR e colab., J. Immun. Meth., 1982, 108, 61-69). Isto permite determinar o valor do sinal nao-específico, intrínseco a cada amostra, e de o ter em conta para a calibração do doseamento, mas isto não suprime em nada o problema.

de saturar o anticorpo específico com avidina, no caso de um doseamento ELISA de o estradiol-l7p , do tipo competitivo utilizando o complexo avidina-biotina (D. M. BODMER e L. X.

TIEFENAUER, 1990, J. Immunoassay, 11, 139-145).

Assim, o conjunto dos métodos anteriormente referidos, apresentam um certo número de inconvenientes :

tempos de incubação longos, particularmente no caso das LHs animais, não adaptados ao doseamento ou â detecção no local (4 horas a mais de 24 horas);

. doseamentos que, por vezes, não podem ser realizados sobre o sangue total.

. a ausência de poliespecificidade de espécies deste doseamento;

. a existência de sinais não-específicos importantes, quando da leitura dos resultados, que podem levar, particularmente, a dificuldades de interpretação destes últimos;

. um limiar de detecção elevado, que em resultado, varia entre 100 pg e 1500 pg/ml no caso das LHs animais por exemplo.

Por este motivo, a requerente tem por objectivo um processo para o doseamento de hormonas elaboradas pelas diferentes glândulas endócrinas, aplicáveis a numerosas espécies animais, compre endendo o homem, que responda melhor às necessidades da prática que os processos da técnica anterior, particularmente :

-12pelo facto de acordo com um protocolo ficadas de rústicas, se poder realizar em menos de 3 horas, de simples em condições que podem ser quali-

»Β pelo facto de oferecer uma leitura não-ambígua do resultado, do tipo tudo ou nada, pela obtenção de uma cor no caso da detecçâo de um pico de secreção aguda de uma hormona (exemplo: pico pré-ovolatório da LH) , enquanto os testes da técnica anterior, quando baseados em uma reacção colorimêtrica, necessitam de uma interpretação dos resultados bem delicada para uma pessoa não-experimentada (por exemplo a distinção de um azul pálido ou carregado ou qualquer outra tonalidade de cor, tonalidades de cor que podem, além disso, estar directamente dependentes da temperatura, o que introduz um factor suplementar de erro), pelo facto de poder ser semi-quantitatívo sem necessidade de nenhum aparelho de leitura, se se depositar uma gama padrão de hormonas a dosear, para além das amostras a testar, particularmente para distinguir, para um mesmo animal, a colheita contendo, para a LH por exemplo, o início do pico da LH, a contendo o topo do pico (valor máximo) e a contendo o fim do pico (valor descendente); no caso da LH um tal processo permite, deste modo, sincronizar a inseminação artificial em relação ao início do pico ou em relação ao topo do pico e permite igualmente distinguir as pulsações da secrecção da LH no macho ou na fêmea

depois de uma incubação do substrato compreendido entre 15 e 30 minutos se necessário, para um estudo da micropulsatilidade, pelo facto de apresentar simultaneamente, uma poliespecificidade de espécie e uma especificidade de substância, pelo facto de ser reprodutível;

pelo facto de ser realisável no local (leitura a olho nu) e pelo facto de ser perfeitamente quantitativo aumentando de modo importante a sensibilidade do doseamento e diminuindo o limiar de detecção.

A presente invenção tem por objectivo um processo para aumentar a sensibilidade e a especificidade da detecção e/ou do doseamento imunológico de hormonas humanas ou animais, em meios de cultura ou em fluídos biológicos, utilizando pelo menos dois anticorpos iguais ou diferentes, específicos da hormona a dosear, caracterizado pelo facto de se prê-incubar pelo menos um dos referidos anticorpos em um meio contendo plasma ou soro desprovido da hormona (das hormonas) a detectar e/ou a dosear.

Por anticorpo pré-incubado entende-se, no sentido da presente invenção, um anticorpo esgotado, -pelo contacto ou passagem em coluna de cromatografia conveniente-, por qualquer substância que pode induzir uma interferência sérica não hormonal e não específica.

De acordo com a presente invenção, o fluído biológico é com vantagem soro, plasma, sangue total, leite ou urina.

Na continuação do presente pedido de patente de invenção, o meio contendo soro ou plasma, desprovido de hormona a detectar e/ou a dosear ê denominado meio INC.

De acordo com um modo de realização vantajoso deste processo, o referido meio INC compreende um soro ou um plasma de um animal que sofreu a extracção de uma glândula endócrina, apropriada para o doseamento, e está, eventualmente associado a um tampão conveniente.

De acordo com uma disposição vantajosa deste modo de realização, o meio INC é desprovido de hormonas hipofisárias e compreende, com vantagem, um soro ou um plasma de um animal hipofisectomizado apropriado, eventualmente associado a um tampão apropriado.

Pode-se especialmente citar como tampão apropriado um tampão com PH neutro associado a um agente tencioactivo e particularmente um tampão PBS-Tween-BSA.

-15De acordo com uma modalidade vantajosa desta disposição, o meio INC compreende um soro ou um plasma de carneiro hipofisectomizado, associado a um tampão apropriado.

De acordo com uma outra disposição vantajosa deste modo de realização, o plasma ou soro de animal que sofreu extracção de uma glândula endócrina apropriada e o tampão apropriado encontram-se em uma relação de 1:1.

De acordo com a presente invenção, o dito processo ê, com vantagem, um teste enzimo-imunométrico, altamente específico e sensível, para a detecção de pelo menos uma hormona.

De acordo com um modo de realização vantajoso do dito teste enzimo-imunométrico, fixa-se o primeiro anticorpo sobre um suporte sólido apropriado e o segundo anticorpo pré-incubado em um meio contendo um plasma ou um soro desprovido da hormona a detectar e/ou a dosear (meio INC), e eventuaimente ligado a uma enzima apropriada, são postos em contacto com o fluído biológico a testar, depois do que se revela a actividade enzimãtica ligada â fase sólida e/ou livre mediante qualquer meio apropriado.

De acordo com uma disposição vantajosa deste modo de realização, quando o segundo anticorpo pré-incubado no dito meio INC não está ligado a uma enzima, a revelação da reacção realiza-se então mediante introdução de um terceiro anticorpo ligado a

uma enzima apropriada, pre-incubada no dito meio INC e que se liga especificamente ao segundo anticorpo.

De acordo com uma outra disposição vantajosa deste modo de realização, o referido meio INC é desprovido de hormonas hiposifárias.

De acordo com esta última disposição, o primeiro e segundo anticorpos são, com vantagem, escolhidos no grupo que compreende os anticorpos monoclonais anti-FSH, anti-LH, anti-TSH, anti-GH, anti-ACTH, anti-prolactina, anti-ocitocina, anti-ADH, anti-MSH, anti-hCG e anti-eCG e os anticorpos policlonais anti-FSH, anti-LH, anti-TSH, anti-GH, anti-ACTH, anti-prolactina, anti-ocitocina, anti-ADH, anti-MSH, anti-hCG e anti-eCG.

De acordo com uma modalidade vantajosa desta disposição, os anticorpos policlonais anti-LH são particularmente obtidos mediante imunização de um animal apropriado com uma mistura de diferentes isoformas de LH ovina, depois mediante purificação conveniente do imuno-soro obtido, anticorpos policlonais esses que apresentam uma percentagem de reacções cruzadas com outras hormonas glicoproteicas tais como a FSH, inferior a 4%, quer dizer uma especificidade relativamenteàLH, apresentando uma poliespecificidade de reconhecimento da LH de numerosas espécies animais e particularmente pelo menos das espécies ovinas, bovinas, caprinas, porcinas, caninas, camelinas, murinas assim como os

cervídeos e apresentando uma afinidade face â LH ovina da ordem dos 9-1

Μ , respectivamente em duas especies animais diferentes.

De acordo com esta modalidade vantajosa, o primeiro e o segundo anticorpos são com vantagem escolhidos no grupo que compreende os anticorpos policlonais de coelho anti-LH ovina e os anticorpos policlonais de cavalo anti-LH ovina e o terceiro anticorpo ã, com vantagem, escolhido no grupo que compreende os anticorpos IgG de cavalo e os anti-IgG de coelho ligados a uma enzima apropriada.

Igualmente de acordo com esta modalidade vantajosa, o primeiro anticorpo é -um anticorpo policlonal de coelho anti-LH ovina, o segundo anticorpo é um anticorpo policlonal de cavalo anti-LH ovina e o terceiro anticorpo é um anti-IgG de cavalo ligado a uma enzima apropriada e particularmente a uma peroxidade ou a uma -galactosidase.

Igualmente de acordo com esta modalidade vantajosa, a mistura de diferentes isoformas de LH ovinas utilizada para a imunização contém, com vantagem, pelo menos duas isoformas de LH ovinas.

As diferentes isoformas de LH ovinas encontram-se de preferência em quantidades equimolares.

Pode-se realizar uma purificação conveniente dos ditos anticorpos policlonais anti-LH, segundo o caso, quer mediante cromatografia de afinidade, quer mediante cromatografia de permuta iónica.

De acordo com um outro modo de realização do dito teste enzimo-imunométrico, antes da introdução do segundo anticorpo, satura-se o suporte sólido com meio INC.

Com efeito, de maneira inesperada, a pré-incubação com o meio INC, tal como definido antes, permite :

eliminar os problemas de sinal não-específico habitualmente encontrados neste tipo de doseamento, mediante neutralização de qualquer interferência sérica não específica que possa conduzir a uma diminuição da sensibilidade de um doseamento, aumentar consideravelmente, desta maneira, a sensibilidade deste tipo de doseamento, particularmente importante no caso das hormonas de baixa taxa circulante, dosear deste modo o conjunto das hormonas e particularmente das hormonas hipofisãrias e placentãrias apropriadas, obtendo-se resultados correctamente e facilmente interpretáveis.

19Consequentemente, o doseamento imunológico e mais particular mente o doseamento enzimo-imunométrico das hormonas, de acordo com a presente invenção, apresenta simultaneamente caracteristicas de um doseamento quantitativo com uma sensibilidade muito boa assim como uma reprodutibilidade muito boa e um doseamento qualitativo pela sua facilidade de realização e de interpretação.

A eficácia e as vantagens do processo de acordo com a presente invenção anteriormente descrito é ilustrada em particular pelo doseamento enzimo-imunométrico da hormona luteinizante (LH). Com efeito, este doseamento apresenta simultaneamente as caracteristicas de um doseamento quantitativo com uma sensibilidade muito boa (limiar de detecção: 60 pg/ml) assim como uma reprodutibilidade muito boa e de um doseamento qualitativo pela sua facilidade de realização e de interpretação. Pode, por conseguinte, ser utilizado quer no laboratório para doseamentos muito exactos (ex: determinação da micropulsatilidade da secreção da LH) quer no local (detecção do pico pré-ovolatório da LH para a inseminação artificial de fêmeas sincronizadas e/ou de fêmeas superovuladas, dadoras de embriões).

Este doseamento da LH, utilizável em numerosas espécies: bovina, ovina, caprina, porcina, camelina, canina, murina, cervídeos, permite a detecção exacta do pico pré-ovulatório da LH na fêmea e apresenta um interesse fisiológico e agronómico evidente.

Permite, além disso, uma boa estimativa do momento óptimo escolhido para a inseminação artificial em cada espécie em questão. Com efeito, o intervalo entre o pico da LH e a ovulação é constante para cada espécie; pelo contrário, o intervalo de tempo que separa o aumento da temperatura (calores) (referência utilizada até hoje) e o pico da LH é muito flutuante consoante os indivíduos de uma mesma raça.

teste de acordo com a presente invenção demonstrou, por conseguinte, ser um instrumento indispensável para dominar este factor de variabilidade importante para o êxito da fecundação dos ovocitos e.da recolha de embriões de boa qualidade. Com efeito, conhecendo o momento exacto da ovulaçao, graças a detecção do pico da LH, e da inseminação artificial, pode-se deduzir em que estádio de desenvolvimento estarão os embriões que se pretende colher, este ponto ê importante na medida em que embriões muito jovens ou muito avançados não são comercializáveis (ex: com membrana transparente rompida).

Finalmente, este teste de doseamento da LH animal ê interes sante no quadro da utilização de um novo tratamento (sincronização, superovulação) ou da extensão destes tratamentos a uma raça, até mesmo a uma espécie cuja fisiologia pré-ovulatória é mal conhecida (ex: cervídeos).

.-21(.

Do mesmo modo, o doseamento enzimo-imunométrico da LH humana, realizado pelo processo de acordo com a presente invenção, apresenta simultaneamente as características de um doseamento quantitativo pela sua sensibilidade muito boa adquirida graças ao dito processo e de um doseamento qualitativo pela sua facilidade de realização e de interpretação adquiridas igualmente pelo processo de acordo com a presente invenção. Pode, por conseguinte, ser utilizado no laboratório ou no domicílio para uso individual (Home test); servirá, neste último caso, de kit para a detecção do pico pré-ovulatório da LH, caracterizado pelo aparecimento de uma cor verde não-ambígua e permite prever o momento da ovulação na mulher.

Por outro lado, quando se pretender realizar um doseamento que apresente uma poliespecificidade de espécie, os anticorpos devem apresentar qualidades particulares5 neste caso, a escolha dos anticorpos é importante para a realização apropriada do processo de acordo com a presente invenção. Com este objectivo a requerente conseguiu igualmente anticorpos particularmente adaptados ao processo de acordo com a presente invenção.

A presente invenção tem igualmente por objectivo anticorpos policlonais anti-LH, caracterizados pelo facto de se obterem mediante imunização de um animal apropriado com uma mistura de diferentes isoformas de LH ovina, seguida da purificação conveniente do imuno-soro obtido, pelo facto de os referidos anti-

corpos policlonais apresentarem uma percentagem de reacções cruzadas com outras hormonas glicoproteícas tais como a FSH, inferior a quer dizer uma especificidade face â LH, pelo facto de apresentarem uma poliespecificidade de reconhecimento da LH de numerosas espécies animais e particularmente pelo menos das espécies ovinas, bovinas, caprinas, porcinas, caninas, camelinas, murinas assim como dos cervídeos e pelo facto de apresen9 -1 tarem uma afinidade face a LH ovina da ordem de 10 M

De acordo com um modo de realização vantajoso dos ditos anticorpos, o animal apropriado é o coelho; obtêm-se deste modo anticorpos policlonais anti-LH ovina no coelho.

De acordo com um outro modo de realização vantajoso dos ditos anticorpos o animal apropriado é o cavalo; obtêm-se deste modo anticorpos policlonais anti-LH ovina no cavalo.

De acordo com um outro modo de realização vantajoso dos ditos anticorpos, a mistura das diferentes isoformas de LH ovina, utilizada para a imunização, contém com vantagem pelo menos duas isoformas de LH ovina.

De acordo com uma disposição vantajosa deste último modo de realização, as diferentes isoformas de LH ovina estão presentes em quantidades equimolares.

Realiza-se uma purificação conveniente dos ditos anticorpos policlonais anti-LH, de acordo com o caso, quer mediante cromatografia de afinidade quer mediante cromatografia de permuta iónica.

A presente invenção tem, além disso, por objectivo um reagente para a realização do processo de detecção e/ou de doseamento imunológico de hormonas no animal, compreendendo o homem, de acordo com a presente invenção, caracterizado pelo facto de comportar um anticorpo anti-hormona próprio para ser utilizado como primeiro, segundo, e/ou terceiro anticorpo no dito processo, anticorpo esse que se pré-incuba em um meio INC.

A presente invenção tem, além disso, por objectivo um estojo para a detecção e/ou diagnóstico de hormonas tais como as hormonas hipofisárias (a FSH, a LH, a TSH, a GH, a ACTH, a prolactina, a ocitocina, a ADH, a MSH), as hormonas tiróidianas, as hormonas supra-renais, as hormonas genitais e as hormonas pancreãticas no homem ou no animal, a hCG e a eCG, ou kit para a realizaçao do teste de acordo com a presente invenção, caracterizado pelo facto de comportar, para além das quantidades úteis de tampões apropriados para a realização da dita detecção :

doses apropriadas de um anticorpo escolhido entre os anticorpos anti-hormona conveniente, compreendendo os anticorpos anti-LH e os reagentes de acordo com a presente invenção;

doses apropriadas de conjugados enzima apropriada e anticorpo, anticorpo esse que se escolhe no grupo que compreende os anticorpos anti-hormona conveniente, compreendendo os anticorpos anti-LH e os reagentes de acordo com a presente invenção, ou no grupo que compreende as anti-igG convenientes, conjugados esses que se pré-incubam em um meio INC, de acordo com o reagente descrito antes;

quantidades ou doses apropriadas de um substrato de revelaçao da enzima;

um suporte sólido apropriado, se necessário; e quantidades ou doses apropriadas de um meio INC.

De acordo com um modo de realização vantajoso, do dito kit, quando se utiliza para o doseamento da LH, ele compreende :

doses apropriadas de um anticorpo policlonal escolhido entre os anticorpos policlonais de coelho anti-LH ovina, os anticorpos policlonais de cavalo anti-LH ovina de acordo com a presente invenção e os reagentes de acordo com a presente invenção contendo um dos anticorpos policlonais anti-LH ovina referidos antes;

doses apropriadas de conjugados enzima apropriada e anticorpo, anticorpo esse que se escolhe no grupo que compreende os anticorpos policlonais de coelho anti-LH ovina, anticorpos policlonais de cavalo anti-LH ovina de acordo com a presente invenção ou no grupo que compreende as anti-IgG de cavalo e as anti-IgG de coelho, conjugados esses que são pré-incubados em um meio INC, de acordo com o reagente descrito antes;

quantidades ou doses apropriadas de um substrato de revelaçao da enzima;

um suporte sólido apropriado, se necessário;

um capilar de colheita; e eventualmente, quantidades ou doses apropriadas de um meio INC.

De acordo com um outro modo de realização vantajoso deste kit, a enzima escolhe-se no grupo que compreende as peroxidades e a p-galactosidase.

Os substratos de revelação da peroxidase são, com vantagem, o OPD e o ABTS; o substrato de revelação da β -galactosidase é, com vantagem, o 4-metilumbeliferil-^-D-galactopiranosido (MUG) e o orto-nitrofenil- -O-galactopiranosido (ONPG).

suporte solido escolhe-se, com vantagem, entre os suportes conhecidos tais como as placas de microtitulação, as varinhas, as faixas, as esferas ou as membranas.

De acordo com um outro modo de realização vantajoso deste kit, ele compreende:

uma série de suportes sólidos convenientes revestidos com um anticorpo escolhido entre os anticorpos anti-hormona conveniente, compreendendo os anticorpos anti-LH e os reagentes de acordo com a presente invenção, sendo esses suportes sólidos e eventuaimente saturados com meio INC;

doses apropriadas de um anticorpo escolhido no grupo que compreende os anticorpos anti-FSH, anti-LH, compreendendo os anticorpos anti-LH de acordo com a presente invenção, anti-TSH, anti-GH, anti-ACTH, anti-prolactina, anti-ocitocina, anti-ADH, anti-hCG, anti-eCG e anti-PMSG, diferentes do primeiro anticorpo e os reagentes de acordo com a presente invenção;

doses apropriadas de conjugados peroxidase-anti-IgG convenientes, pré-incubados em um meio INC, de acordo com o reagente descrito antes; e quantidades apropriadas de um substrato de revelação da peroxidase.

Ζ *

De acordo com uma disposição vantajosa deste modo de reali zação, ele compreende :

uma série de suportes sólidos convenientes revestidos com um anticorpo escolhido no grupo que compreende os anticorpos policlonais de coelho anti-LH ovina de acordo com a presente invenção e contendo os reagentes segundo a presente invenção o anticorpo policlonal de coelho referido antes, suportes sólidos esses que são eventualrnente saturados em meio INC;

doses apropriadas de um anticorpo escolhido no grupo que compreende os anticorpos policlonais de cavalo anti-LH ovina e contendo os reagentes de acordo com a presente invenção o anti corpo policlonal de cavalo referido antes;

doses apropriadas de conjugados peroxidade-anti-IgG de cavalo pré-incubados em um meio INC, de acordo com o reagente descrito antes;

quantidades apropriadas de um substrato de revelação da peroxidase; e um capilar de colheita.

De acordo com uma outra disposição vantajosa deste modo de realização, ela compreende :

uma série de suportes sólidos convenientes revestidos com um anticorpo escolhido no grupo que compreende os anticorpos policlonais de coelho anti-LH ovina de acordo com a presente invenção e contendo os reagentes de acordo com a presente invenção o anticorpo policlonal de coelho referido antes, suportes sólidos esses que sao eventualmente saturados em meio INC;

doses apropriadas de conjugados β-galactosidase-anticorpos policlonais de cavalo anti-LH ovina pré-incubados em um meio INC, de acordo com o reagente descrito antes;

-galact quantidades apropriadas de um substrato de revelação da osidase; e um capilar de colheita.

Para além das disposições anteriores, a presente invenção compreende ainda outras disposições que sobressairão da descrição que se segue.

A presente invenção sera melhor compreendida com a ajuda do complemento de descrição que se segue, que se refere a exemplos para a obtenção de anticorpos policlonais de acordo com a presente invenção e a exemplos de realização do teste de acordo com a presente invenção.

Deve entender-se, como é evidente, que estes exemplos e desenhos são dados unicamente a título de ilustração do objectivo da presente invenção, pelo que não constituem de modo algum uma limitação.

EXEMPLO 1: Preparação de anticorpos policlonais anti-LHs animais de acordo com a presente invenção.

1) Característica do imunogénio :

antigénio utilizado para as imunizações é uma mistura equimolar de diferentes fracções purificadas de LH ovina (oLH). Estas fracções foram assim enumeradas :

oLH 1051	1083
1055	1085
1072	1086

2- Processo para a obtenção dos anticorpos policlonais anti-LH :

a.2) anticorpos obtidos no cavalo (põnei MWJ.

Cada injecção contêm 1 mg da mistura oLH referida antes dissolvida em 2,5 ml de soro fisiológico estéril e preparada em emulsão em 2,5 ml de adjuvante de Freund completo.

protocolo de imunização consiste em 6 injecções seguidas de 8 reforços realizando-se após cada um deles uma sangria duas semanas mais tarde. A sequência exacta das injecções está ilustrada no esquema I dado a seguir :

injecções -f- reforço t

1 2345	6 1	^R1 ^R2	r₃	^R4	%	^R6	^R7	^R8
Todas as 2	1 1 > 1	1 2	3	2	5	7	2	1
semanas	1 1 1 ( 1 Ψ	mês mês	mês	mês	mês	mês	mês	mês
	1/2
sem sangria	uma sangria	2 semanas	depois	de cada re	forço

Esquema I

b.2) anticorpos obtidos no coelho :

Cada injecção contém 0,1 mg da mistura oLH, dissolvida em 0,5 ml de soro fisiológico estéril. Prepara-se o conjunto mediante emulsão em 0,5 ml de adjuvante de Freund completo e injecta-se em pontos múltiplos ao longo da coluna vertebral (injecções intra-dérmicas).

O protocolo de imunização consiste em 4 injecções realizadas de duas em duas semanas. Segue-se uma série de 12 reforços efectuados de acordo com a sequência ilustrada no esquema II dado a seguir :

-31^R5 ^R6 ^R7 ^R8 ^R9 ^R10 ^R11 ^R12

R, R_o R_o R, 12 3 4

e_i— 2 mes

-¹— 3 mes f ’

I 2 mês t

-1-1— 2 mes 1 mes 1

t . 5 mês

r

» , 4 mês r

---------«.. —, 2 mes f 1

t , 2 mês r

2 mês r

-1- 1 mês r »

r

sangrias : S ^S4^S5 ^S6 ^S7

Esquema II

As sangrias realizam-se duas semanas depois dos reforços indicados com excepção da que se realiza quatro semanas depois de R?.

São imunizados três coelhos: dois recebem 12 reforços, um apenas recebe 6 reforços.

3) Processos para a purificação dos anticorpos policlonais anti-LH :

a.3) Purificação do imuno-soro de cavalo :

Esta purificação faz-se mediante cromatografia de permuta iónica sobre DEAE-Trisacryl (IBF-FRANCE) em coluna K26/40 de PHARMACIA.

imuno-soro (15 ml) é dialisado durante uma noite contra um tampão Tris-HCL 0,025 M, NaCl 0,035 M, pH 8,8 a 4°C. Paralelar¹mente, equilibra-se a coluna com o mesmo tampão. Após filtração do soro dialisado, passa-se este último na coluna com um débito de 50 ml/hora. A fracção eluída obtida â saída da coluna, contém as IgG do soro e representa a fracção enriquecida em anticorpos que se utiliza no doseamento. Antes de se utilizar, dialisa-se esta fracção contra PBS pH 7,4 (0,01 M de KF^PO^/IC^HPO^, NaCl 0,15 M). Concentra-se, em seguida, mediante ultrafiltração sobre um suporte MINICON (AMICON, Irlanda) até se obter uma concentração compreendida entre 5 e 10 ng/ml. Armazena-se sob a forma de alíquotas a -20°C diluída em 507 de glicerol bidestilado.

b.3) purificação do imuno-soro de coelho :

A purificação faz-se mediante cromatografia de afinidade sobre proteína A. Utiliza-se o gel Proteína A-Sepharose CL-4B (PHARMACIA) vazado em uma coluna de 2 x 10 cm (PHARMACIA). Dialisa-se previamente o soro (5 ml) contra tampão de fosfato 0,1 M pH 8, filtra-se e passa-se sobre a coluna equilibrada com o mesmo tampão (débito: 15 ml/hora).

As imunoglobulinas são desorvidas utilizando um gradiente de pH compreendido entre 6 e 4,5 e preparado com um tampão de citrato/ãcido cítrico 0,1 M depois com um tampão de pH 3 (ácido acético 0,1 N, NaCl 0,15 M).

As fracções eluídas sao neutralizadas com tampão de fosfato 1 M pH 8 e dialisadas contra PBS antes de serem concentradas mediante ultrafiltração (referida antes) e armazenadas a -20°C em 50% de glicerol bidestilado.

Os protocolos experimentais utilizados em 3a) e b) efectuam-se de acordo com as indicações dadas pelos fornecedores e completadas com Techniques immunoenzymatiques Th. TERNYNCK e S. AVRAMEAS, edições INSERM, 1987.

Em todos os casos, calcula-se a concentração exacta das fracções purificadas mediante determinação da densidade óptica a 280 nm, considerando que uma d.o. de 1,4 corresponde aproximadamente a uma solução de IgG com 1 mg/ml.

4) Características e especificidade dos anticorpos anti-LH de acordo com a presente invenção :

. reacções cruzadas ;

Tendo em conta o parentesco estrutural com outras hormonas glicoproteicas, é indispensável para se obter um doseamento fiável, dispor-se de anticorpos que apenas reconheçam a LH e não apresentem nenhuma reacção cruzada com a FSH e a TSH nas espécies animais estudadas. Em consequência, diversas FSH e TSH foram estudadas no doseamento para determinar a percentagem de reacções cruzadas.

-34Do mesmo modo, testou-se LH de diferentes espécies animais mediante doseamento e determinou-se a sua percentagem de reacção cruzada.

A percentagem de reacção cruzada é calculada de modo clássico comparando as curvas de dose/resposta obtidas por um lado com uma gama de concentrações de cada LH ensaiada e, por outro lado, com uma gama de concentrações de LH ovina. A partir da curva referência obtida com a LH ovina, tém-se a concentração

Y e que dá 50% do sinal óptico máximo (E. D. 50). A partir da curva obtida com uma outra LH, têm-se a concentração X que corresponde â mesma densidade óptica que a utilizada para definir

Y :

A percentagem da reacção cruzada é igual a X x 100 Y

a) Reacções cruzadas obtidas com as diferentes LH ensaiadas :

Origem da LH	Bovina	Caprina	porcina	Canina	Cami1ina	Murina (rato)
Percentagem de reacção cruzada	97 %	45,5 %	34 !	20 %	55,6 %	20 %

b) Reacções cruzadas obtidas com as FSH e TSH das espécies animais em que a LH é reconhecida pelos dois anticorpos (AP1 e AP2) específicos do doseamento :

Espécie animal	Ovina	Bovina	Porcina	Murina (rato)
FSH	0,05 1	3,12 l	0,06 1	0,03 1
TSH	8 I	2 7„	0,62 l	1,15 %

Ê necessário notar que a percentagem de reacções cruzadas com a TSH ovina é elevada (8%) e pode ser devida a uma contaminação elevada na preparação hormonal utilizada.

. Afinidade dos anticorpos anti-LH (anticorpos de coelho e de cavalo) utilizados no doseamento.

Determinou-se a constante de afinidade (Ka) de acordo com o método descrito por B. FRIGUET e colab. [(1985), J. Immunol. Methods, vol. 77, 305-319] e calculou-se de acordo com a repre sentação de KLOTZ :

. anticorpos de coelho anti-LH ovina,

Ka : 1,87.10¾^-1 . anticorpos de cavalo anti-LH ovina,

Ka : 2,10¾^-1.

-36EXEMPLO 2 : Teste imuno-enzimomé trico de acordo com a presente invenção : doseamento de LHs animais.

A - Princípio do doseamento :

Trata-se de um doseamento ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbant -Assay) quer dizer que o conjunto dos reagentes está ligado a uma fase sólida. A fase sólida utilizada é, de maneira não limitativa, uma placa de microtitulação com 96 cavidades em Luxlon (plástico hidrófobo), mas o doseamento pode realizar-se sobre outros tipos de placas ou outros tipos de suportes, particularmente as varinhas, as placas, as esferas ou as membranas.

doseamento de acordo com a presente invenção, do tipo Sanduíche, utiliza dois anticorpos policlonais tais como definidos antes, quer dizer fabricados a partir de um mesmo antigénio, a LH ovina, mas produzidos em duas espécies animais diferentes (o coelho e o pónei) :

o primeiro anticorpo (AP1) fixa-se sobre o fundo das cavidades de uma placa de microtitulação. Este primeiro anticorpo ê produzido no coelho;

após lavagem da placa, satura-se eventualmente esta última com um meio apropriado a que se adicionou soro ou plasma desprovido de LH. Este meio é denominado adiante meio INC;

-37incuba-se a amostra a dosear, é necessário um volume de y(l por cavidade, quer dizer que o doseamento se pode fazer a partir de uma gota de plasma ou de sangue. O doseamento a partir do sangue faz-se em um meio modificado contendo eparina, denominado adiante meio S;

lavagens da placa, incubação do segundo anticorpo previamente diluído no meio INC. Este segundo anticorpo é produzido num pónei;

lavagens da placa, incubação de um terceiro anticorpo ligado a uma enzima (anticorpo de cabra anti-igG de cavalo ligado à peroxidase ou à -galactosidade). Antes de se depositar, dilui-se previamente o anticorpo no meio INC;

após lavagens, revela-se a actividade enzimática ligada á fase sólida com a ajuda de um substrato cromogénico ou fluorogénico especifico da enzima utilizada. A intensidade da reacção colorida ou do sinal fluorescente obtidos é proporcional â concentração da LH contida na amostra doseada como o demonstram as curvas da figura 1. 0 tempo de reacção necessário é de 5 minutos para uma detecção do pico pré-ovulatório e de 15 minutos para uma determinação quantitativa precisa de taxas circulantes baixas.

-38A lista da ordem de utilização dos dois anticorpos específicos foi determinada mediante comparação das duas combinações possíveis :

. curva (-^-) : AP1 coelho

AP2 cavalo e . curva (----) : AP1 cavalo

AP2 coelho.

Os resultados, apresentados na figura 1, foram obtidos a partir de uma gama de diluições da LH ovina realizada em tampão de fosfato (gama padrão).

Como se distingue muito nitidamente, a combinação AP1 coelbo/AP2 cavalo (-^-) dá melhores resultados quer do ponto de vista do limiar de detecção como da sensibilidade do doseamento.

Este facto de se ter utilizado dois anticorpos feitos em duas espécies animais distintas é crucial para a obtenção da sensibilidade melhorada do teste de acordo com a presente invenção, em relação aos testes da técnica anterior. Esta selecção particular de anticorpos policlonais dá maior probabilidades para a molécula de LH ser reconhecida por epitopos diferentes para cada um dos imuno-soros em relação aos imuno-soros feitos na mesma espécie. A figura 2 mostra a diminuição da sensibilidade do doseamento quando se utilizam dois anticorpos

(ΑΡ1 e AP2) feitos na mesma espécie (Cavalo, por exemplo: AP1 = AP Cavalo com 10 ^ig/ml e AP2 = AP Cavalo-^-galactosidase com 5 g/ml).

A utilização de um mesmo anticorpo como AP1 e como AP2 (curva -*-) leva a uma perda considerável da sensibilidade do doseamento como o demonstram as curvas da figura 2. Observa-se, para a concentração de oLH que dá 50% de ligação, uma sensibilidade de 250 pg/ml no caso de um protocolo de acordo com a presente invenção [AP1 Coelho, AP2 Cavalo, AP3 anti-cavalo-peroxidase; curva (. .Q|..) contra 1,8 ng/ml no caso de um protocolo com dois anticorpos iguais (curva -*-), como definidos antes].

Este último número corresponde a uma eficácia residual de 15%, em relação ao doseamento realizado em condições óptimas (de acordo com a presente invenção, ver, espeeialmente, Exemplo 3 a seguir).

A percentagem de ligação calcula-se de acordo com a fórmula B-NS/T, em que B representa a densidade óptica medida para cada ponto da gama, NS representa a densidade óptica medida para o ponto zero da gama e T representa a densidade óptica medida para o ponto mais alto da gama.

B - Características dos meios de incubação de acordo com a presente invenção :

1) Meio de diluição do sangue :

No caso de um doseamento realizado directamente a partir do sangue ao meio de diluição da colheita deve ser adicionada heparina para evitar a coagulação, o sangue é portanto recuperado em PBS-Tween-BSA a que se adicionou 0,2% de heparina, ou seja sem 2*1 de heparina por 50 ml de PBS-Tween-BSA (ver Exemplo 3).

2) Meio INC :

2.a) Composição do meio INC :

Este meio ê constituído por pelo menos 50% de soro ou de plasma de carneiro hipofisectomizado diluído em PBS-Tween-BSA.

2.b) Obtenção do soro de carneiro hipofisectomizado :

Põe-se o animal em jejum durante 48 horas antes da operação. Realiza-se esta última sob anestesia; a extracção da hipófise faz-se mediante pelo palato bocal.

As colheitas de sangue efectuam-se todos os dias para se controlar a queda da taxa de LH circulante depois da hipofisectomia. Quando já não ê detectãvel, anestesia-se o animal e sangra-se completamente. Recolhe-se o sangue em heparina para recuperar o plasma ou deixa-se coagular para se separar o soro. Plasma e soro são conservados a -20°C.

-41ζ

Ο animal é sangrado entre 5 e 7 dias depois da hipofisectomia.

2.c) Interesse do meio INC no doseamento :

É indispensável, no doseamento plasmático, realizar a gama padrão em um meio de diluição contendo a mesma proporção de plasma que as preparações de amostras a dosear. Se estas se diluírem dez vezes, a gama padrão será realizada com soro de animal hipofisectomizado (LH ) diluído dez vezes em tampão de diluição normal (PBS-BSA-Tween). A figura 3 reune os resultados obtidos com uma gama padrão preparada em tampão de diluição (-B-) e os obtidos com uma gama realizada neste mesmo tampão a que se adicionou 10% de soro de animal hipofisectomizado (--JjJ--) (doseamento do tipo AP3-peroxidase/oPD, ver Exemplo 3). Observa-se uma interferência, particularmente incómoda, do soro LH no doseamento, sobretudo na zona das baixas concentrações de LH ovina (oLH), que mascara toda a sensibilidade real do doseamento.

Consequentemente, esgotam-se os dois imuno-soros anti-LH sobre IgG de carneiro para se eliminar qualquer interferência entre IgG proveniente de espécies animais diferentes (ovina por um lado, coelha e equina por outro lado). Os resultados obtidos apenas mostram uma fraca diminuição do sinal não-específico importante, observado sem esgotamento prévio.

Parece que uma outra espécie de interferência pode intervir, devida por exemplo a uma substância iminologicamente próxima da LH e reconhecida como tal.

Resultados semelhantes foram descritos em um doseamento radioimunológico da LH no macaco Rhésus (NEILL e colab., 1977, PECKHAM e colab., 1977). Utilizando a LH ovina como marcador iodado e um anticorpo anti-LH ovino, os autores observaram uma interferência não específica muito importante para as baixas concentrações da gama; pelo contrário não se observam interferências utilizando a LH de macaco iodado e um anticorpo anti-LH de macaco. Esta substância LH-like não ê purificada e o seu efeito interferente não foi contornado pelos autores.

processo de acordo com a presente invenção tem, por seu lado, a vantagem de permitir eliminar esta dificuldade, graças ao meio INC que permitiu realizar um doseamento muito sensível, fiável e rápido.

C - Substratos e conjugados enzimáticos :

Este doseamento não depende da enzima utilizada como marcador. Foram utilizadas duas enzimas até ao presente, a peroxidase e a β-galactosidase, a primeira com dois substratos cromogénicos, a segunda com um substrato fluorogénico.

1) Substratos utilizados :

* para a peroxidase :

. a OPD (orto-fenilenodiamina) o ABTS (ãcido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6 -sulfónico).

A OPD prepara-se extemporaneamente com 0,5 mg/ml em tampão de acetato (0,1 M de acetato de sódio) pH 5,6, a que se adicionou peroxido de hidrogénio a 0,2%.

A medida da densidade óptica faz-se a 492 nM; a reacção traduz-se pelo aparecimento de uma cor laranja a castanho e é interrompida com 50 ^1 de ácido sulfúrico 2 N.

o ABTS prepara-se em um tampão de citrato 0,05 M pH 4 para 12 ml de tampão de citrato juntam-se 60 ynl de ABTS padrão 50 yal de peróxido de hidrogénio a 2%, fazendo-se a determinação da densidade óptica a 405 nm.

Sob a acção da peroxidase, o ABTS incolor torna-se verde.

Tampão de citrato : 2 volumes de ãcido cítrico [(5,3 g/1) CgHgOy, 1H₂O] + um volume de fosfato de sódio (Na^PO^, 12 H₂0) (17,73 g/1). A reacção pode ser interrompida com 20 yil de SDS a 10%, não tendo este qualquer carácter obrigatório.

% * Para a ^-galactosidase :

o 4-metilumbeliferil-^ - D-galactopiranosido (MUG), produto comercial (SIGMA. M 1633) :

Dissolvem-se 2,5 mg em 12,5 ml de tampão de fosfato 0,1 M, pH 7,4 (ver composição no Exemplo 3). Interrompe-se a reacção com 50 jjí de carbonato de sódio 2M.

A leitura do sinal fluorescente faz-se com um espectrofluorímetro para placas ELISA.

comprimento de onda de excitação = 360 nm, o comprimento de onda de emissão = 448 nm.

2) Conjugados enzimáticos :

* o anticorpo conjugado com a peroxidase (AP3 : anticorpo -anti-IgG de cavalo ligado à peroxidase está disponível no comércio : Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., código NQ 108-035-003.

* o anticorpo conjugado com a p-galactosidase realizou-se de acordo com duas ópticas :

quer ligando o anticorpo anti-LH de cavalo directamente à fc-galactosidase (AP2-F>-galactosidase),

-45/ quer ligando um anticorpo anti-IgG de cavalo à

-galactosidase (AP3- ^-galactosidase).

* realização da ligação :

Efectuou-se de acordo com o processo de ligação ao glutaraldeído em dois tempos [Techniques Immunoenzymatiques, Th.

TERNYNCK e S. AVRAMEAS, Edições INSERM, 1987, páginas 33-34).

Purifica-se o anticorpo anti-LH de cavalo mediante cromatografia de permuta iónica (DEAE) assim como o anticorpo anti-IgG de cavalo (produzido no carneiro).

D - Tampões :

* Tampão de carbonato 0,1 M pH 9,6 : dilui-se 10 vezes uma solução molar de carbonato/hidrogenocarbonato de sódio em ãgua destilada.

* PPS : diluiu-se 100 vezes uma solução molar de fosfato de potássio mono- e bi-potãssico pH 7,4 em uma solução 0,15 M de NaCl.

* PBS-Tween : adiciona-se 0,1% (1 ml em 1 litro) de Tween ao PBS.

* PBS-Tween-BSA : adiciona-se 0,2% de BSA ao PBS-Tween.

EXEMPLO 3 : Doseamento colorimétrico quantitativo com o sistema AP3-peroxidase : doseamento de LHs animais

l.a) Sistema AP3-peroxidase/substrato ABTS :

* sensibilização das placas ou revestimento :

destribuiu-se 100 do anticorpo anti-LH ovina de coelho (AP1) preparado em tampão de carbonato 0,1 M pH 9,6 na concentração de 7,5 ^g/ml por cavidades. Incuba-se a placa durante 1 hora a 37°C e depois durante uma noite a 4°C. Lava-se em seguida a placa com PBS-Tween 5 vezes à razão de 300 por cavidade, quer manualmente, quer com um lavador automático para placa ELISA.

APl pode preparar-se com uma concentração diferente : 10yxg/ml ou 5y*g/ml; as concentrações extremas estão compreendidas entre 20j^g/ml e 2,5 y*g/ml.

Sobre-revestimento ou saturação das cavidades :

Após lavagem, enche-se as cavidades com 100 y*l de meio INC e incuba-se a placa durante 30 minutos a 37°C. Nesta etapa, a placa é utilizada quer para continuar o doseamento, ou despeja-se,

-47seca-se a 37°C e guarda-se depois em uma atmosfera seca, selada com plástico.

* incubaçao das amostras e da gama

A gama de oLH (LH ovina) prepara-se com PBS-Tween-BSA contendo soro do animal hipofisectomizado diluído a 1/10.

Comporta as seguintes concentrações : 60 pg/ml, 125 pg/ml, 250 pg/ml, 500 pg/ml, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 4 ng/ml, 8 ng/ml e, eventualmente, 40 ng/ml de oLH. Deposita-se em duplicado à razão de 100 nl por cavidade.

Os plasmas a dosear são diluídos 10 vezes em PBS-Tween-BSA. Depositam-se em duplicado ou em triplicado à razão de 100 jul por cavidade. (A diluição de 1/10 não ê imperativa e poderá ser superior ou inferior se for necessário). Incuba-se o conjunto que se lava a placa 5 vezes com mesmo modo que anteriormente.

durante 1 hora a 37 C. Apos o PBS-Tween (300 ^1/cavidade) do incubação do segundo anticorpo anti-LH (cavalo) :

Este anticorpo, AP2, prepara-se previamente em meio INC : dilui-se até à concentração de 5 ^g/ml em meio INC e incuba-se durante 30 minutos a 37°C antes de se depositar nas cavidades â razão de 100 j^l por cavidade.

Uma vez distribuído ο AP2, incuba-se a placa durante 1 hora a 37°C. Como no caso do APl de coelho, a concentração de 5 j^g/ml para ο AP2 não é obrigatório mas deve ser em todos os casos inferior â da do APl. Pode estar compreendida entre 15 yig/ml (se o APl for a 20 jug/ml e 2,5 ^»g/ml, até mesmo 1 yitg/ml (se o APl for a 2,5^ug/ml). Depois da incubação, lava-se a placa 5 vezes de acordo com o processo descrito antes com PBS-Tween.

* incubação do terceiro anticorpo anti-igG de cavalo ligado à peroxidase :

Pré-incuba-se igualmente ο AP3 durante 30 minutos a 37°C em meio INC com a diluição de 1/5000 (de acordo com a indicação do fabricante) antes de se depositar nas cavidades (100 jul por cavidade). Deixa-se incubar durante 1 hora a 37°C. Lava-se em seguida a placa 5 vezes com PBS-Tween.

* depósito do substrato da peroxidase :

Depositam-se 100 y*l de ABTS preparado de acordo com o referido antes (C) ; ao fim de 5 minutos, as cavidades correspondentes a uma forte concentração em oLH, ficam coradas de verde.

Após 15 minutos de incubação a 37°C, efectua-se uma primeira medida da densidade óptica para se obter uma primeira indicação do desenvolvimento da reacção. Após o que se incuba de novo a

-49placa durante 15 minutos a 37°C, se a reacção necessitar de continuar, particularmente no caso de amostras de baixo teor em

LH. Procede-se depois, a uma leitura definitiva dos resultados.

Pode-se interromper a reacção enzimãtica mediante adição de 20 y*l de SDS a 107 por cavidade.

A leitura da densidade óptica faz-se com a ajuda de um espectrofotómetro automático para placas ELISA, equipado com um filtro a 405 nm.

A figura 4 apresenta os resultados de um tal doseamento realizado na presença de meio INC, com uma gama de concentrações de oLH feita em PBS-BSA-Tween (--J|--) é com uma gama realizada em LH (soro de animal hipofisectomizado) diluído a 1/10 com PBS-BSA-Tween (-)^-). A sobreposição perfeita das duas curvas indica que a interferência não-específica descrita antes foi totalmente eliminada. Verifica-se igualmente um melhoramento da sensibilidade do doseamento em relação à curva (-J-) da figura 3 efeito do meio INC ê o mesmo, quer seja constituído por 507 de plasma ou de soro de animal hipofisectomizado.

A proporção de 507 de LH no meio INC não é imperativa e pode ser aumentada. Abaixo de 507, contudo, a interferência não-especlfica descrita jã não ê totalmente eliminada.

-50A figura 5 ilustra a curva obtida, nestas condições, com uma gama padrão preparada no meio de diluição indicado antes. [Afigura 5 foi obtida de acordo com as mesmas condições experimentais descritas para a curva (--^--) da figura 4]. 0 limiar de detecção do doseamento é de 60 pg/ml. 0 coeficiente de variação intra-doseamento é de 2,5% (n = 10), o coeficiente de variação inter-doseamento é de 6% (n = 8).

O protocolo anteriormente exposto é um modo de realização não limitativo quer para as concentrações de anticorpo quer para os tempos de incubação do substrato que se pode variar. As condições experimentais apresentadas antes representam um modo de realização preferido para o desenvolvimento de um doseamento muito sensível e muito fiável (pouca variabilidade intra e inter-doseamento) utilizando as mais baixas concentrações em reagentes possíveis.

l.b) Revelação da peroxidase com OPD :

A OPD pode ser utilizada como substrato, de acordo com o protocolo experimental descrito antes. Distribui-se 100 de substrato por cavidade; a revelação enzimática faz-se ã temperatura ambiente a 4°C durante 5 a 20 minutos; interrompe-se com 50 ^wl de solução ácida como referido antes (C). A leitura da densidade óptica faz-se a 492 nm, com a ajuda do mesmo tipo de aparelho.

-51Este doseamento é igualmente utilizável em meios de cultura de células e o leite em particular.

EXEMPLO 4 : Doseamento fluorimétrico quantitativo com o sistema

AP2-p-galactosidase : doseamento de LHs animais.

* Sensibilização das placas (revestimento) :

Prepara-se o anticorpo anti-LH de coelho (AP1) na concentração de 2,5 y»g/ml em tampão de carbonato 0,1 M, pH 9,6. Distribui-se à razão de 100 Jttl por cavidade. A incubação é de 1 hora a 37°C e depois durante 18 horas a 40°C.

* Sobre-revestimento ou saturação das cavidades :

Após 5 lavagens com PBS-Tween, depositam-se 100 jll de meio INC por cada cavidade. Incuba-se durante 30 minutos a 37°C. A placa quer se conserva em meio seco, quer se utiliza directamente.

* Incubação das amostras.

Faz-se de acordo com o mesmo protocolo descrito no Exemplo 3 A duração da incubação pode variar entre 1 hora e 1 hora e 30 minutos .

* Incubação do segundo anticorpo (anti-LH de cavalo ligado â A-galactosidase, AP2) :

Após lavagens da placa, deposita-se a AP2-^-galactosidase à razão de 100 yt»l por cavidade. Aquela foi preparada previamente no meio INC na diluição de l^g/ml e pré-incubada durante 30 minutos a 37°C.

A incubação nas cavidades faz-se durante 1 hora a 37°C depois do que se lava a placa 5 vezes com PBS-Tween.

* Revelação da -galactosidase com um substrato fluorogénico (4-MUG) :

Depositam-se 200 ^1 de MUG preparada de acordo com as indicações dadas antes em C, em cada cavidade. Incuba-se a placa a 42°C durante 1 a 2 horas. Mede-se a fluorescência com um fluorímetro automático para placas ELISA (Microfluor de DYNATECH USA) .

O seu comprimento de onda de excitação ê de 360 nm, regista-se um comprimento de onda de 448 nm.

Os resultados obtidos com uma gama padrão realiza-se no meio PBS-BSA-Tween-LH 1/10 estão reunidos na figura 6. Incuba-se o MUG durante 1 hora; observa-se que o limiar de detecção não é tão bom como no protocolo descrito no Exemplo 3 (entre 250 e 500 pg/ml). Por outro lado, os coeficientes de variação intra e inter -doseamento são mais elevados neste caso. 0 interesse deste

protocolo é o de permitir a realização do doseamento em um menor intervalo de tempo.

As concentrações dos reagentes escolhem-se de maneira que a relação quantidade de reagentes utilizados/qualidade do doseamento seja a mais favorável. É evidente que as concentrações podem ser modificadas salvaguardando sempre um doseamento correcto.

EXEMPLO 5 : Doseamento de LHs animais com o sistema AP2-peroxidase.

Pode-se realizar, de acordo com as condiçoes descritas no Exemplo 4, um doseamento da LH, em que AP2 está ligado a uma peroxidase.

EXEMPLO 6 : Doseamento colorométrico quantitativo e qualitativo da LH, realizado pelo sistema AP3-peroxidase a partir do sangue, desenvolvimento de um kit para a detecção do pico da LH nos animais, utilizado no laboratório ou no local :

doseamento a partir do sangue pode ser utilizado com um objectivo tanto quantitativo como qualitativo, entende-se por doseamento qualitativo, um ensaio que permita a detecção do pico prê-ovulatório da LH na fêmea, no local, sem aparelho de medida,

simplesmente interpretável a olho nu. Este teste permite mesmo a detecção de pulsações de LH na fêmea ou no macho.

a) Processo para a colheita de sangue :

Um doseamento realizado em plasma apresenta um verdadeiro esforço na medida em que necessita de uma etapa de centrifugação, pipetagem do plasma após centrifugação e a sua transferência de novo para tubos e uma etapa de diluição antes da utilização no doseamento (quer dizer pipetagem, homogeneização em tampão de diluição).

Para eliminar este problema, aplica-se neste ensaio um processo novo de colheita de sangue em animais. Consiste em introduzir uma agulha muito fina na veia jugular do animal, deixar apurar uma gota de sangue e aplicar a extremidade de um capilar em vidro, heparinado e calibrado com um volume bem exacto (10 ou 25 jul). 0 capilar deve manter-se na horizontal, para que o sangue possa migrar até â outra extremidade do capilar. Com a ajuda de uma pequena pera em plástico, adaptada ao diâmetro do capilar, recupera-se o conteúdo deste último para um tubo contendo 225 ^1 de PBS-Tween-BSA heparinado no caso de um capilar de 25fll. Dilui-se deste modo o sangue 10 vezes e apenas se tem que destribuir em 2 vezes 100 jwl nas cavidades previstas de uma placa.

-55Pode-se evitar esta última etapa, enchendo todas as cavidades da placa com 90 jul de PBS-BSA-Tween heparinado. Basta então utilizar capilares de 10 μΐ de volume e esvaziar cada um directamente numa cavidade da placa de microtitulação. A amostra a dosear é, deste modo, directamente diluída e depositada na placa.

b) Protocolo :

* Sensibilização das placas :

Dilui-se ο AP1 a 7,5 ju>g/ml em tampão de carbonato 0,1 pH 9,6 e incuba-se durante 1 hora a 37°C e depois durante 18 horas a 4°C. Lavam-se em seguida as placas com PBS-Tween, 5 vezes e enchem-se depois com 100 ^1 por cavidade de meio INC. Incubam-se durante 30 minutos a 37°C, esvaziam-se e secam-se, selam-se depois com plástico ou utilizam-se directamente.

* Depósito das amostras :

quer se depositam os 10 μΐ de sangue directamente na cavidade correspondente â amostra após enchimento prévio de todas as cavidades com 90 yul de PBS-BSA-Tween heparinado;

quer se depositam 100 μΐ por cavidade dos 25 μΐ de sangue diluído em 225 ul de PBS-BSA-Tween heparinado.

-56A incubação tem a duração de 1 hora ou menos a 37°C ou a temperatura ambiente. Durante a incubação, agita-se a placa de 15 em 15 minutos, oscilando-a manualmente para re-homogeneizar as hemácias na fase líquida. Efectuam-se deste modo 5 lavagens com PBS-Tween se for no laboratório, ou com soro fisiológico (NaCl 0,15 M) ou com água corrente da torneira se for no local.

* Depósito do segundo anticorpo :

Depositam-se 100 ytl de AP2 preparado no meio INC com 5 y,g/ml em cada cavidade. A incubação realiza-se durante 45 minutos a 37°C ou â temperatura ambiente. Lava-se em seguida a placa de acordo com as indicações anteriores.

* Depósito do terceiro anticorpo :

Depositam-se 100 y»l de AP3-peroxidase por cavidade; ο AP3 foi preparado em meio INC â diluição de 1/5000 de acordo com as indicações descritas no Exemplo 3.

No kit particularmente, AP2 e AP3 serão fornecidos completamente preparados. Depois de uma incubação de 45 minutos a 37°C ou à temperatura ambiente, lava-se a placa de acordo com o processo descrito antes e procede-se à revelação enzimãtica.

-57c) Leitura do doseamento a olho nu, interpretação das. observações :

A solução de ABTS (preparada de acordo com as indicações definidas antes em c) e o peróxido de hidrogénio a 2% apenas são misturados extemporaneamente quer dizer até imediatamente antes da utilização. Depositam-se 100 ul de substrato por cavidade.

A reacção enzimática é instantânea e faz-se â temperatura ambiente. Ao fim de 2 minutos, ê visível o aparecimento de uma cor verde nas cavidades correspondentes a um pico pré-ovulatório da LH. Ao fim de 5 minutos, distinguem-se as colheitas de sangue portadoras de um pico pré-ovulatório da LH comparativamente âs outras cujo substrato continua incolor.

* Este teste tipo tudo ou nada ê possível graças à combinação AP1-AP2 e meio INC, que neutraliza qualquer sinal não-específico, quer dizer que as amostras de baixo teor em LH, preparados de acordo com este protocolo, não levam a nenhuma coloração do substrato contrariamente aos de forte teor em LH que provocam o aparecimento instantâneo de uma cor verde.

meio INC evita assim ter que distinguir em verde mais ou menos claro (caso de um sinal não específico elevado, por exemplo) de um verde escuro (nível de LH elevado) com todos os riscos de variabilidade que isso representa. Com efeito, o carácter de tudo

ou nada deste teste apresenta uma vantagem importante em relação aos kits imuno-enzimãticos vendidos para a LH humana ou para outras hormonas animais.

d) Doseamento quantitativo da LH a partir do sangue :

doseamento realizado a partir do sangue pode ser simultaneamente qualitativo e quantitativo. Basta aplicar o protocolo experimental optimizado para o doseamento descrito antes no Exemplo 3 e ter a precaução de agitar a placa durante a incubação do sangue.

cálculo do coeficiente de correlação entre a medida da concentração da LH no sangue e no plasma proveniente da mesma colheita, realiza-se mediante comparação dos resultados obtidos a partir dos dois meios biológicos (ver figura 7).

coeficiente de correlação = 0,9788 (n = 40), a equação da direita de regressão : Y = 1,14 x + 0,889 em que Y representa a concentração da LH (ng/ml) medida no sangue e X representa a concentração de LH (ng/ml) medida no plasma de acordo com o protocolo exposto no Exemplo 3.

O valor obtido para o coeficiente de correlação indica que um doseamento quantitativo muito exacto a partir do sangue é efectivamente possível com o protocolo indicado antes.

EXEMPLO 7 : Outras variantes do teste de detecção de LHS animais de acordo com a presente invenção :

A incubação simultânea do AP2 e do AP3-peroxidase (1 hora) diminui a duração total do doseamento.

Os ensaios realizados deram uma curva dose/resposta de menor sensibilidade que a obtida de acordo com o protocolo descrito antes mas suficiente para a detecção de fortes concentrações em LH (a partir de 15 ng/ml). A incubação do substrato deve em contrapartida ser superior a 30 a 45 minutos se necessário para a detecção de picos pré-ovulatórios.

EXEMPLO 8 : Detecção do pico de LH em leite na cabra e na ovelha :

1) Na cabra :

exemplo ilustrado aqui foi realizado com um rebanho de 20 cabras sincronizadas para tratamento de inseminação artificial.

protocolo experimental é o anteriormente descrito no Exemplo 3, com a diferença de se depositar 100 y*l de leite em cada cavidade. Neste caso não se faz nenhuma diluição, o leite é utilizado no estado bruto, não diluído, contrariamente ao plasma ou ao sangue.

Depois de se terem eliminado os primeiros jactos de leite, os 100 y»l de amostra podem ser colhidos com um capilar calibrado, do mesmo modo que no caso do sangue. Do mesmo modo, lava-se a placa com PBS-Tween ou com água da torneira de acordo com o sítio da realização do doseamento.

A figura 8 apresenta o perfil de secreção do pico da LH de uma cabra, no sangue (curva -*-) e no leite (--Q--). Verifica-se que as concentrações de LH encontradas no leite são ínfimas em relação às concentrações plasmãticas. Por esta razão, é necessário utilizar um espectrofotómetro de placas de microtitulaçao. Verifica-se que o aparecimento do pico de LH no leite está desfasado de 4 horas em relação ao sangue, se se utilizar o início do pico como ponto de comparação.

quadro I a seguir reune as concentrações de LH medidas no sangue e no leite durante 7 colheitas efectuadas de 4 em 4 horas nos dois meios simultaneamente. A comparação dos resultados mostra que o aparecimento do pico da LH no leite está desfasado de 4 ou 8 horas em relação ao sangue, se se comparar o máximo do pico. 0 início do pico, pelo contrário, estã sempre desfasado de 4 horas no leite em relaçao ao sangue, e isto de modo constante. Fora do pico pré-ovulatório, as concentrações de LH no leite não são detectãveis.

Detecção do pico de LH na cabra no sangue e no leite

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0,86 0,119

0,54 0,205

1,75 0,120

2,12 0,197

0,65 0,133

2,21 0,210

2,19 0,257

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0,30 0,097

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Este Quadro I ilustra bem a importância da utilização do processo de acordo com a presente invenção na condução da reprodução no interior dos rebanhos caprinos mas igualmente e de maneira mais geral para qualquer espécie em que possa ser utilizado (bovinos, ovinos, etc.). Permite eliminar fêmeas sem pico prê-ovulatório (por conseguinte sem ovulação) e fecundar no momento óptimo as fêmeas que apresentam um pico prê-ovulatório precoce. Isto permite o estabelecimento de esquemas de inseminação tais como o esquema III a seguir, muito útil em particular para rentabilizar ao máximo as campanhas de inseminação artificial dirigidas nas diferentes espécies animais referidas.

* VARIABILIDADE DO INTERVALO TERMINADO 0 TRATAMENTO — PICO DE LH*

intervalo terminado o tratamento pico de LH (h)	16h	20h	24h	28h	32	ti 36h	40h	I.A. 45h não detectado ãs 40 horas
número de fêmeas	(D	(2) 17,5%	(7)	(9)	(12) (9) 63,2%	(6)	(11) 19,3%
taxa de gestação	(0/1)	(2/2) 40%	(2/7)	(9/9)	(8	/12) (7/ 80,5 %	9) (6/6)	(5/11) 45,5%

Esquema III

2) Na ovelha :

exemplo aqui ilustrado realizou-se em um rebanho de 12 ovelhas leiteiras Lacaune escolhidas entre as boas leiteiras.

Estas fêmeas receberam um tratamento de sincronização (acetato de fluorogestona), durante 14 dias, após o que receberam uma injecção de 500 U.I. de eCG (hormona estimulante do ovário).

As colheitas de sangue e de leite foram feitas de quatro em quatro horas, a partir da detecção do comportamento do estro. Efectuam-se deste modo nove colheitas em cada fêmea, durante 32 horas.

A medida da concentração de LH ê feita nos dois meios, sangue e leite, de acordo com o protocolo experimental exposto no Exemplo 3 descrito antes.

Quadro II dado a seguir reune os resultados em ng/ml e mostra um desfasamento perfeito de quatro horas entre o pico de LH no sangue e o detectado no leite, no qual, fora do pico prê-ovulatório, as concentrações em LH não são detectáveis.

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-Β5A detecção do pico de LH no leite oferece várias vantagens :

. a sua duração é mais importante do que no sangue (20 e 24 horas contra 8 a 12 horas no sangue), sendo necessárias menos colheitas, podendo o intervalo entre cada colheita ser maior (por exemplo de 8 em 8 horas);

. uma colheita de leite é menos stressante do que uma colheita de sangue, e pode fazer-se quando se trata os animais;

além disso, na ovelha, a leitura do teste no leite pode fazer-se a olho nu.

A figura 16 representa o perfil da secreção do pico de LH em ng/ml, em função do tempo, em uma ovelha, no sangue, (curva -*-) e no leite (-^5-).

EXEMPLO 9 : Aplicações no local.

Estes exemplos são ilustrados por Quadros e apoiados por um estudo da correlação entre as concentrações obtidas por doseamento ELISA e as obtidas por doseamento radioimunológico realizado no plasma.

a) Detecção de picos pré-ovulatórios de LH em ovelhas super-ovuladas (figuras 9A e B) :

-66As figuras 9 sao fotos de placas comportando 12 colunas denominadas 1 a 12 e 8 linhas denominadas A a H.

As colunas 1 e 2 correspondem â gama padrão das concentrações e as colunas 3 a 11 correspondem às colheitas feitas em oito ovelhas.

A figura 9A dá a ordem da deposição das amostras, as colheitas de uma fêmea são depositados em colunas (colunas 3 a 11), cada colheita é doseada em duplicado . Os picos de LH aparecem em verde escuro, o que nesta figura e nas figuras seguintes é representado em cinzento escuro como se vê em pormenor na figura 9B, em que a gama de concentrações é igualmente depositada à esquerda da placa em duas colunas (colunas 1 e 2).

As colheitas são realizadas de 4 em 4 horas a partir do início dos calores. Para a ovelha 1 (coluna 3), observa-se um pico nas duas primeiras colheitas (cavidades A^-B^ e C^-Dg).

Este doseamento foi realizado a partir de plasmas. 0 tempo da revelação foi de 15 minutos à temperatura ambiente.

A figura 10 ilustra um perfil de secreção da LH obtida em uma ovelha (Exemplo 3) por doseamento ELISA (AP3-peroxidase/ABTS) e por RIA (radio imunoassay) a partir do plasma.

-67b) Detecção de picos prê-ovulatorios em cabras super-ovuladas (figura 11) :

Esta figura representa uma foto de uma placa do mesmo tipo da anterior (colunas 1 a 12), linhas A a H).

As colheitas foram realizadas de 4 em 4 horas depois do início dos calores.

Os doseamentos foram feitos a partir do sangue. A revelação foi de 10 minutos à temperatura ambiente.

As colheitas por animal foram depositadas em coluna: a coluna 2 mostra, por exemplo, um pico nas cavidades D₂~E₂ depois o fim do pico em F₂· 0 cimo do pico é em D^. Fora dos picos, o substrato continua incolor. Na coluna 6, observa-se o mesmo máximo de um pico em Dg-Eg e o fim do pico em Fg.

c) Detecção de picos pré-ovulatórios em vacas (figura 12)

Depois de uma injecção de GnRH, fazem-se colheitas de 30 em 30 minutos. As amostras são doseadas em duplicado e depositadas em coluna (vaca 1: colunas 2 e 3; vaca 2: colunas 4 e 5; vaca 3: colunas 6 e 7; vaca 4: colunas 8 e 9). A gama padrão deposita-se nas duas primeiras linhas A e B (figura 12A).

680 doseamento faz-se a partir do sangue. 0 tempo de revelação é de 5 minutos na figura 12A e de 15 minutos na figura 12D à temperatura ambiente. Verifica-se a ausência de pico de LH na vaca 2, um início de pico da LH na 4ã e 5ã colheitas (Fg-Fg/Gg-Gg) para a vacanQl. Nos dois animais seguintes, o pico aparece mais rapidamente: na segunda colheita (D^-Dy) para a vaca nQ 3 e a partir da lã colheita (Cg-Cg) para a vaca nQ 4. Observa-se muito bem a queda do pico para esta última.

A figura 13 dá a totalidade do perfil da secreção da LH em uma vaca tratada com GnRH. Pode-se verificar uma sobreposição das concentrações medidas por ELISA e por RIA.

d) Estudo da micropulsatilidade em carneiros (figura 14) :

Os doseamentos foram realizados no plasma de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 3. As colheitas realizam-se de 20 em 20 minutos. São depositadas em linha (carneiro 1: linhas C e D; linas E e F; carneiro 3: linhas G e H) e doseadas em duplicado (os duplicados são dispostos verticalmente.

tempo de revelação é de 30 minutos. Observa-se uma pulsação em Cg-Dg para o carneiro nQ 1, em E^-F^ e E^q-F^q para o carneiro nQ 2 e um muito ligeiro em G^-H^ para o carneiro nQ 3, o mesmo em Eg-Fg para o animal nQ 2.

-69A figura 15 ilustra ο perfil da secreção de LH obtido em carneiros com os doseamentos ELISA e RIA. As consentrações obtidas em ELISA têm valores absolutos mais baixos que os obtidos em RIA; pelo contrário, o perfil é igual. Esta diferença é devida â melhor sensibilidade do doseamento ELISA que permite detectar valores mais baixos que a RIA.

e) Cálculo do coeficiente de correlação obtido entre doseamentos realizados por ELISA e doseamentos por RIA :

doseamento RIA utilizado é o publicado por J. PELLETIER e colab., 1982.

1) Correlação nos bovinos: (n = 60) coeficiente de correlação: r: 0,9705 . equação da direita de regressão: Y = l,09x - 0,971

2) Correlação nos caprinos: (n = 60) . coeficiente de correlação: r = 0,9759 . equação da direita de regressão: Y = l,031x - 0,978

3) Correlação nos ovinos (n = 67) coeficiente de correlação: r = 0,9808 equação da direita de regressão: Y = l,0745x - 2,45

-70em que Y é a concentração de LH (ng/ml) medida por

ELISA,

X é a concentração de LH (ng/ml) medida por RIA.

EXEMPLO 10: Detecção do pico de LH na corça.

Os doseamentos foram feitos a partir de colheitas de sangue realizadas de duas em duas horas durante todo o período dos calores, na corça Rusa da Nova-Caledónia. As colheitas foram feitas em sete corças e os doseamentos foram realizados de acordo com o processo descrito no Exemplo 3. Os testes são lidos a olho nu como para as outras espécies. A figura 17 mostra o perfil de secreção de LH em ng/ml em função do tempo em uma corça (corça ηθ 80). Os resultados obtidos no conjunto das fêmeas mostram ainda que o momento do pico LH ê muito variável durante o período dos calores: tém lugar, em geral, no início dos calores.

Isto ilustra bem a importância do processo de acordo com a presente invenção para poder estabelecer com precisão o momento da inseminação, dada a variabilidade do aparecimento do pico de LH.

Pode-se, em particular, verificar o interesse deste processo na inseminação artificial, de fêmeas dadoras de embriões, em raças da família dos cervídeos em via de extinção.

/-71EXEMPLO 11 :

Detecção do pico de LH na cadela.

Os doseamentos foram realizados de acordo com o processo descrito no Exemplo 3, a partir das colheitas de sangue diárias feitas em duas cadelas durante o período dos calores. Na cadela, o pico pré-ovulatório da LH estende-se por um lapso de tempo superior às outras espécies descritas: a duração é em média de 24 horas. Por este facto, pode ser detectado fazendo apenas uma colheita de sangue por dia, o que apresenta uma vantagem para a clientela de uma clínica veterinária. Os resultados obtidos com a cadela DIXIE ilustrados na figura 18 demonstram-no claramente Os resultados são lidos ã vista desarmada como para as outras espécies.

A figura 18 representa o perfil de secreção de LH, (-Q-) e da progesterona (-*-) em ng/ml, obtidos na cadela DIXIE.

Observa-se que, para além das 48 horas depois do pico pré-ovulatório (3.9.90), o teor em progesterona aumenta considerável mente (> 50 ng/ml). Isto testemunha a presença de um corpo amarelo (responsável pela forte secreção em progesterona) que resulta de uma ovulação.

Dado o comprimento do período dos calores na cadela, o kit permitirá conhecer com precisão o momento da ovulação na cadela em estudo permitindo praticar a inseminação no momento

óptimo (a fecundação tem lugar 48 horas depois da ovulação, na cadela). Permite ainda estabelecer um esquema de inseminação exacta, com a ajuda do processo de acordo com a presente invenção.

EXEMPLO 12 : Detecçâo do pico de LH na porca.

Foi estabelecida uma correlação entre os valores de concentração em LH estabelecidos por um doseamento radioimunológico e os obtidos com o processo de acordo com a presente invenção, realizado de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 3. Os doseamentos foram feitos em plasma de porcas.

o coeficiente de correlação n = 0,943 . a equação da direita de regressão :

Y = 0,1719x + 0,069 (n = 20), em que:

Y é a concentração de LH (ng/ml) medida por ELISA; e X é a concentração de LH (ng/ml) medida por RIA.

A figura 19 ilustra um perfil de secreção de LH em ng/ml obtido mediante doseamento de acordo com a presente invenção (-*-) e mediante doseamento RIA (- □->·

EXEMPLO 13 : Doseamento da FSH ovina com o processo de acordo com a presente invenção.

a- Anticorpos utilizados para o doseamento :

primeiro anticorpo (ACp e um anticorpo monoclonal específico da sub-humidade da FSH de numerosas espécies (bovina, ovina, equina, porcina, humana, rato, coelho, cão, avestruz). Foi fornecido graciosamente pelo Senhor Professor Jacques LUSSIER para estes ensaios experimentais. Este anticorpo monoclonal foi produzido pelo Doutor LUSSIER e a sua equipa (Universidade de Montreal - Faculdade de medicina veterinária -CRRA - CP 5000 - St Hyacinthe J297C6 - Québec). Trata-se de um anticorpo monoclonal do tipo IgGl.

o segundo anticorpo (AC₂) ê um anticorpo policlonal especifico da FSH ovina, produzido no coelho. Foi produzido e está disponível na estação de fisiologia da reprodução - INRA - 37380 NOUZILLY.

o terceiro anticorpo (AC_g) ê um anticorpo policlonal comercializado pelos Laboratórios Jackson (USA). Trata-se de um anticorpo anti-IgG de coelho ligado à peroxidase e produzido na cabra-referência 111-035-003.

b - Protocolo experimental protocolo utilizado é o descrito no Exemplo 3:

(1) o primeiro anticorpo prepara-se em tampão de carbonato 0,1 M pH 9,6 na concentração de 7,5 ug/ml. Distribuem-se 100 fcl

-:74por cavidade. Os tempos de incubação para a sensibilização das placas são os mesmos: 1 hora a 37°C e 18 horas a 4°C.

(2) as lavagens e a saturação das cavidades (sobre revestimento) realizam-se de acordo com o processo descrito no Exemplo 3, (3) a incubação das amostras e da gama: de acordo com o processo descrito no Exemplo 3, a gama de FSH ovina (padrão do NIH: OFSH-13-AFP-2846-C) prepara-se em tampão PBS-Tween-BSA contendo soro do animal hipofisectomizado diluído a 1/10. Compreende as concentrações: 125 pg/ml, 250 pg/ml, 500 pg/ml, 1 ng/ml, ng/ml, 4 ng/ml, 8 ng/ml e 40 ng/ml. É depositada a duplicar à razão de 100 pl por cavidade. Os plasmas a dosear são diluídos dez vezes em PBS-Tween-BSA. A duração da incubação é de uma hora a 37°C, (4) lavagens iguais âs do Exemplo 3, (5) preparação e incubação do segundo anticorpo (ACg), anti-FSH ovino. Prepara-se no meio INC para a concentração de õyig/ml. A sua preparação realiza-se do mesmo modo que no Exemplo

3. A incubação é de uma hora a 37°C, (6) lavagens idênticas às do Exemplo 3, (7) preparação e incubação do terceiro anticorpo (AC^) anti-IgG de coelho ligado â peroxidase. Prepara-se de acordo com o protocolo do Exemplo 3 na diluição de 1/5000 (de acordo com as indicações do fabricante). Incubação durante uma hora a 37°C, (8) lavagens iguais as descritas no Exemplo 3, (9) depósito do substrato da peroxidase e leitura da densidade óptica.

C - Resultados :

* a figura 20 representa os resultados de um tal doseamento realizado de acordo com o protocolo INC (curva B). O limiar de detecção é de 0,25 ng/ml e a sensibilidade do doseamento estã consideravelmente aumentada comparativamente â curva A que foi obtida sem se aplicar o processo INC. Com efeito, neste caso da curva A, o tampão utilizado para o sobre-revestimento, a incubação de AC₂ e AC^ foi o PBS-BSA-Tween simples. Só a gama padrão da oFSH foi realizada de acordo com as mesmas condições descritas para a curva B, quer dizer em PBS-BSA-Tween a que se adicionou soro do animal hipofisectomizado diluído a 1/10. A comparação destas duas curvas mostra a importância do processo INC para a obtenção de uma boa sensibilidade neste doseamento da oFSH. Estes resultados demonstram igualmente que a eficácia do processo INC não estã limitada ao doseamento de LHs animais pelos

APe AP₂ definidos antes mas que se aplica igualmente ao doseamento de uma outra hormona hipofisãria, a FSH que faz intervir outros anticorpos. A utilização do meio INC permitiu, como no doseamento LHs animais e da hLH, neutralizar todas as interferências sêricas não específicas e melhorar assim consideravelmente o limiar de detecção e a sensibilidade de doseamento da oFSH.

* 53 plasmas de carneiros foram doseados para a FSH de acordo com o processo INC. Os resultados obtidos por esta técnica foram correlacionados com os obtidos por um doseamento radioimuno lógico.

o coeficiente de correlação é de 0,9759. a equação da direita de regressão é Y = 0,5856x - 0,845 na qual Y representa a concentração de oFSH (ng/ml) medida por ELISA e X representa a concentração de oFSH (ng/ml) medida por RIA.

É de salientar, finalmente, que concentrações plasmáticas elevadas (15 a 20 ng/ml) em oFSH são sempre detectãveis a olho nu, sem necessidade de aparelho de leitura, e distinguem-se nitidamente das taxas plasmáticas baixas (0,5 a 2 ng/ml). Isto pode permitir detectar e medir o pico de FSH segregado antes da ovulação em condições realmente rústicas, fora do laboratório.

Pelo limiar de detecção que ele permite no doseamento, o processo INC dá a possibilidade de detectar níveis circulantes baixos (entre 0,25 e 5 mg/ml), o que apresenta um interesse fisiológico evidente.

EXEMPLO 14 : Doseamento da LH humana.

a - Anticorpos utilizados para o doseamento;

o primeiro anticorpo (AC-^) e um anticorpo monoclonal específico da LH humana (hLH) comercializado pela Sociedade Pierce - referência 37110. Trata-se de um anticorpo monoclonal do tipo IgG-^, proveniente do clone ZMLHZ.

•I· ^Λ o segundo anticorpo (AC₂) e um anticorpo policlonal anti-hLH, produzido no coelho e comercializado pela Sociedade UCB - referência: 1504/001.

JL ** — o terceiro anticorpo (AC^) e um anticorpo policlonal comercializado pelos laboratórios Jackson - referência 11-035-003. Este anticorpo anti-IgG de coelho ligado â peroxidase é produzido na cabra.

b - Protocolo experimental :

o protocolo aplicado é o descrito no Exemplo 3:

(1) AC^ prepara-se em tampao de carbonato 0,1 M Ph 9,6 na concentração de 10 yjg/ml (ou 7,5 y*g/ml) sendo destribuídos 100 pl por cavidade.

A incubação realiza-se durante 1 hora a 37°C e durante 18 horas a 4°C.

(2) lavagens e sobre-revestimento (como no Exemplo 3), (3) incubação das amostras e da gama: como descrito no Exemplo 3. Dilui-se 10 vezes (ou 5 vezes) as amostras a dosear em tampão PBS-BSA-Tween. A gama hLH prepara-se em PBS-BSA-Tween a que se adicionou soro de animal hipofisectomizado diluído 10 vezes. Compreende as seguintes concentrações: 62,5 pg/ml, 125 pg/ml, 250 pg/ml, 500 pg/ml, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 4 ng/ml, 8 ng/ml e 40 ng/ml.

(4) lavagens - como descrito no Exemplo 3 (5) AC₂ é preparado com 2,5^tg/ml e pré-incubado no meio INC de acordo com o processo descrito no Exemplo 3.

(6) lavagens (7) ACg é preparado com 1/5000 em meio INC, de acordo com o processo descrito no Exemplo 3.

-79/ (8) lavagens (9) depósito do substrato (ABTS) e leitura dos resultados ao fim de uma hora.

c - Resultados * a figura 21 mostra os resultados obtidos com uma gama padrão de hLH utilizando o processo INC de acordo com o protocolo descrito antes (curva B) e os obtidos com uma mesma gama padrão sem aplicar o processo INC (curva A). Neste último caso, o tampão utilizado para o sobre-revestimento, a incubação do AC₂ e AC^ foi PBS-BSA-Tween simples. A comparação das duas curvas ilustra ainda o interesse e o impacto do processo INC que apresenta uma melhoria muito nítida na sensibilidade do doseamento e no seu limiar de detecção, neutralizando qualquer sinal não específico devido a interferências sérias nao específicas.

* Doseou-se 20 plasmas de mulheres em hLH de acordo com o processo anteriormente apresentado. Os resultados obtidos por esta técnica ELISA são correlacionados com os obtidos pelo kit de doseamento de hLH fabricado por Abbott (sistema imuno-enzimo-micro-particular - IMX Abbott) :

o coeficiente de correlação é de 0,8808 . a equação da direita de regressão é Y = 0,0483x + 0,0986

-80na qual Y é a concentração de hLH (ng/ml) medida por ELISA e X é a concentração de hLH (UI/1) medida pelo sistema IMX Abbott).

* Dada a ausência de qualquer sinal não-específico e a grande sensibilidade do doseamento, será possível discriminar os valores altos (pico préovulatôrio da LH) que dão uma cor verde dos valores baixos que se mantêm incolores. Esta interpretação a olho nu permitirá utilizar este processo para a realização de um kit de detecção do pico pré-ovulatório de LH na mulher, em casa. Poderá, igualmente, ser utilizado para um doseamento quantitativo fiável nos laboratórios. Estes resultados demonstram que a eficácia do processo INC não estã limitada â utilização de anticorpos policlonais AP-^ e AP₂ anteriormente definidos no doseamento das LHs animais, mas que contribui para melhorar igualmente o doseamento de uma outra LH (a LH humana) fazendo intervir outros anticorpos (AG monoclonal· anti-hLH, PIERGE; AG₂ policlonal anti-hLH feito no coelho-UCB).

Sobressai, deste modo, do anteriormente descrito, que a presente invenção não se limita de modo nenhum a estes modos de utilização, de realização e de aplicação que se acabam de descrever de modo mais explícito; ela engloba, pelo contrário, todas as variantes que possam vir ao espirito do técnico na matéria, sem se sair do quadro, nem do alcance, da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para aumentar a sensibilidade e a especificidade da detecção e/ou do doseamento imunológico de hormonas humanas ou animais, em meios de cultura ou em fluidos biológicos, utilizando pelo menos dois anticorpos iguais ou diferentes, específicos de hormona a dosear, caracterizado pelo facto de se pré-incubar pelo menos um dos referidos anticorpos, em um meio contendo plasma ou soro desprovido da hormona a detectar e/ou a dosear (meio INC).
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido meio INC comportar, com vantagem, um soro ou um plasma de um animal que sofreu a ablação de uma glândula endócrina, apropriada para o doseamento, e de estar eventuaimente associado a um tampão conveniente.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, ou a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o meio INC ser de£ provido de hormonas hipofisárias e comportar, com vantagem, um soro ou um plasma de um animal hipofisectomizado apropriado, eventuaimente associado a um tampão apropriado.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, carac terizado pelo facto de o meio INC comportar um soro ou um plasma de carneiro hipofisectomizado, associado a um tampão apropria do.
5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 4, caracterizado pelo facto de o plasma ou soro de animal que sofreu a ablação de uma glândula endócrina apropriada e o tampão apropriado estarem em uma relação de 1:1.
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 5, caracterizado pe o facto de ser, com vantagem, um teste enzimo-imunométrico, altamente específico e sensível, para a detecção de pelo menos uma hormona.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o primeiro anticorpo estar fixado sobre um suporte sólido apropriado e de o segundo anticorpo pré-incuba do em um meio contendo um plasma ou um soro desprovido da hormona a detectar e/ou a dosear (meio INC), e eventuaimente ligado a uma enzima apropriada, serem postos em contacto com o fluido bio lógico a testar, depois do que se revela a actividade enzimãtica ligada à fase sólida e/ou livre, mediante qualquer meio apropriado .
8. - Processo de acordo com a reivindicação 6 ou a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de quando o segundo anticorpo pré-incubado no referido meio INC não está ligado a uma enzima, a revelação da reacção ser então realizada mediante introdução de um terceiro anticorpo ligado a uma enzima apropriada, pré-incubado no referido meio INC e ligando-se especificamente ao segundo anticorpo.
9. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 6 a 8, caracterizado pelo facto de o referido meio INC ser desprovido de hormonas hipofisãrias.

-8410. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo facto de se escolher, com van tagem, os primeiro e segundo anticorpos no grupo que compreende os anticorpos monoclonais anti-FSH, anti-LH, anti-TSH, anti-GH, anti-ACTH, anti-prolactina, anti-ocitocina, anti-ADH, anti-MSH, anti-hCG e anti-eCG e os anticorpos policlonais anti-FSH, anti-LH, anti-TSH, anti-GH, anti-ACTH, anti-prolactina, anti-ocitocina, anti-ADH, anti-MSH, anti-hCG e anti-eCG.
11. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo facto de os anticorpos policlonais anti-LH serem partiçularmente obtidos mediante imunização de um animal apropriado com uma mistura de diferentes isoformas de LH ovina, depois mediante purificação conveniente do imuno-soro obtido, apresentando os referidos anticorpos policlonais uma percentagem de reacções cruzadas com as outras hormonas glicoproteícas tais como a FSH, inferior a 4%, quer dizer uma especificidade em relação â LH, de apresentarem uma poliespecifi cidade de reconhecimento da LH de numerosas espécies animais e, partiçularmente, pelo menos das espécies ovinas, bovinas, caprinas, porcinas, caninas, camelinas, murinas assim como dos cer vídeos e de apresentarem uma afinidade em relação â LH ovina da

9 -1 ordem de 10 Μ , respectivamente em duas especies animais diferentes .
12. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 6 a 11, caracterizado pelo facto de se escolherem o primei ro e segundo anticorpos com vantagem, no grupo que compreende os anticorpos policlonais de coelho anti-LH ovino e os anticorpos policlonais de cavalo anti-LH ovino e de se escolher o terceiro anticorpo com vantagem, no grupo que compreende as anti-IgG de cavalo e as anti-IgG de coelho ligadas a uma enzima apropriada.
13. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 12, caracterizado pelo facto de o primeiro anticor po ser um anticorpo policlonal de coelho anti-LH ovino, o segundo anticorpo ser um anticorpo policlonal de cavalo anti-LH ovino e o terceiro anticorpo ser um anti-IgG de cavalo ligado a uma enzima apropriada e particularmente a uma peroxidase ou a uma

-galactosidade.
14. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 12, caracterizado pelo facto de a mistura de diferentes isoformas de LH ovinas, utilizada para a imunização, conter, com vantagem, pelo menos duas isoformas de LH ovinas.
15. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 14, caracterizado pelo facto de, previamente à introdução do segundo anticorpo, se saturar o suporte sólido em meio INC.

,616.- Anticorpos policlonais anti-LH, caracterizados pelo facto de se obterem mediante imunização de um animal apropriado com uma mistura de diferentes isoformas de LH ovina, depois mediante purificação conveniente do imunosoro obtido, de os referidos anticorpos policlonais apresentarem uma percentagem de reacções cruzadas com outras hormonas glicoproteícas tais como a FSH, inferior a 4%, quer dizer uma especificidade relativamente à LH, e de apresentarem uma poliespecificidade de reconhecimento da LH de numerosas espécies animais e, particu- . larmente, pelo menos das espécies ovinas, bovinas, caprinas, porcinas, caninas, camelinas, murinas assim como dos cervídeos e de apresentarem uma afinidade em relação à LH ovina da ordem de
17.- Anticorpos policlonais de acordo cora a reivindicação 16, caracterizados pelo facto de o animal apropriado ser o coelho e de se obter, deste modo, anticorpos policlonais anti-LH ovino no coelho.
18.- Anticorpos policlonais de acordo com a reivindi cação 16, caracterizados pelo facto de o animal apropriado ser o cavalo e de se obter, deste modo, anticorpos policlonais anti-LH ovino no cavalo.
19.- Anticorpos policlonais de acordo com uma qual-87- quer das reivindicações 16 a 18, caracterizados pelo facto de a mistura de diferentes isoformas de LH ovina, utilizada para a imunização, conter com vantagem pelo menos duas isoformas de LH ovina.
20. - Anticorpos policlonais de acordo com a reivindicação 19, caracterizados pelo facto de as diferentes isoformas de LH ovina estarem em quantidades equimolares.
21. - Reagente para a realização do processo de detec ção e/ou de doseamento imunológico de hormonas no animal e no homem, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo facto de compreender um anticorpo anti-hormona próprio para ser utilizado como primeiro, segundo e/ou terceiro anticorpo no dito processo, o qual é pré-incubado em um meio

INC.
22. - Estojo para a detecçâo e/ou para o diagnostico de hormonas tais como as hormonas hipofisárias (a FSH, a LH, a TSH, a GH, a ACTH, a prolactina, a ocitocina, a ADH, a MSH) , · as hormonas tiroidianas, as hormonas supra-renais, as hormonas genitais e as hormonas pancreãticas no homem ou no animal, a hCG, e a eCG, ou conjunto oara a realização do ensaio de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo facto de compreender, para além das quantidades úteis de tampões apropriados para a realização da dita detecção:

- doses apropriadas de um anticorpo escolhido entre os anticorpos anti-hormona conveniente, compreendendo os anticorpos anti-LH de acordo com uma qualquer das reivindicações 16 a 20 e os reagentes de acordo com a reivindicação 21;

τ· doses apropriadas de conjugados enzima apropriada e anticorpo, anticorpo este que se escolhe no grupo que comporta os anticorpos anti-hormona convenientes, compreendendo os anticorpos anti-LH de acordo com uma qualquer das reivindicações 16 a 20 e os reagentes de acordo com a reivindicação 21, ou no grupo que compreende as anti-IgG convenientes, conjugados esses que são pré-incubados em um meio INC, de acordo com o reagente descrito antes?

- quantidades ou doses apropriadas de um substrato de revelação da enzima.

- um suporte sólido apropriado se necessário; e

- quantidades ou doses apropriadas de um meio INC.
23.- Estojo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de, quando se utilizar para o doseamento da LH, compreender:

- doses apropriadas de um anticorpo policlonal escolhido entre os anticorpos policlonais de coelho anti-LH ovina, os anticorpos policlonais de cavalo anti-LH ovina de acordo com uma

-89qualquer das reivindicações 16 a 20 e os reagentes de acordo com a reivindicação 21 contendo um dos anticorpos policlonais anti-LH ovina referido antes;

- doses apropriadas de conjugados enzima apropriada e anticorpo, anticorpo este que se escolhe no grupo que compreende os anticorpos policlonais de coelho anti-LH ovina, os anticorpos policlonais de cavalo anti-LH ovina de acordo com uma qualquer das reivindicações 16 a 20 ou no grupo que compreende as anti-IgG de cavalo e as anti-IgG de coelho, conjugados esses que são pré-incubados num meio INC, de acordo com o reagente descrito antes;

- quantidades ou doses apropropriadas de um substrato de revelação da enzima;

- um suporte sólido apropriado se necessário;

- um capilar de colheita; e

- eventualmente, quantidades ou doses apropriadas de um meio INC.
24. - Estojo de acordo com a reivindicação 23, carae terizado pelo facto de se escolher a enzima no grupo que compreende as peroxidades e a -galactosidase.
25. - Estojo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de comportar:

- uma série de suportes sólidos convenientes revesti- dos com um anticorpo escolhido entre os anticorpos anti-hormona conveniente, compreendendo os anticorpos. anti-LH de acordo com uma qualquer das reivindicações 16 a 20, e os reagentes de acor do com a reivindicação 21, suportes sólidos que são, eventualmente, saturados em meio INC;

- doses apropriadas de um anticorpo escolhido no gru po que comporta os anticorpos anti-FSH, anti-LH, compreendendo os anticorpos anti-LH de acordo com uma qualquer das reivindica ções 16 a 20, anti-TSH, anti-GH, anti-ACTH, anti-prolactina, anti-ocitocina, anti-ADH, anti-hCG, anti-eCG e anti-PMSG, diferentes do primeiro anticorpo e os reagentes de acordo com a reivindicação 21;

- doses apropriadas de conjugados peroxidase-anti^-lgG convenientes, pré-incubados em um meio INC, de acordo com o rea gente descrito antes; e τ quantidades apropriadas de um substrato de revela-sção da peroxidase.
26.- Estojo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de comportar:

- uma série de suportes sólidos convenientes revestidos com um anticorpo escolhido no grupo que compreende os anticor pos policlonais de coelho anti-LH ovina de acordo com uma qualquer das reivindicações 16 a 20 e reagentes de acordo com a reivindicação 21 contendo o anticorpo policlonal de coelho referido r

antes, suportes sólidos esses que, eventualmente, estão saturados em meio INC;

- doses apropriadas de um anticorpo escolhido no gru po que compreende os anticorpos policlonais de cavalo anti-LH ovina e os reagentes de acordo com a reivindicação 21, contendo o anticorpo policlonal de cavalo referido antes;

doses apropriadas de conjugados peroxidase-anti

-igG de cavalo pré-incubados em um meio INC, de acordo com o reagente descrito antes;

- quantidades apropriadas de um substrato de revelação da peroxidase; e

- um capilar de colheita.
27.- Estojo de acordo com a reivindicação 25 ou a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de comportar;

- uma série de suportes sólidos convenientes revesti dos com um anticorpo escolhido no grupo que compreende os anticorpos policlonais de coelho anti-LH ovina de acordo com uma qualquer das reivindicações 16 a 20 e os reagentes de acordo cora a reivindicação 21 contendo o anticorpo policlonal de coelho referido antes, suportes sólidos esses que são,, eventualmente, saturados em meio INC;

- doses apropriadas de conjugados P-galactosidase-anticorpos policlonais de cavalo anti-LH ovina pré-incubados em um meio INC, de acordo com o reagente descrito antes;

- quantidades apropriadas de um substrato de revelação da ^-galactosidase; e

- um capilar de colheita.

Lisboa, 31 de Maio de 1991 O Ageníe Oficial da Propriedade industriai

RESUMO

PROCESSO PARA A DETECÇÃO E/OU DOSEAMENTO DE HORMONAS E ANTICORPOS UTILIZÁVEIS NO REFERIDO PROCESSO DE DETECÇÁO

Descreve-se um processo para a detecção e/ou para o doseamento de hormonas, compreendendo as hormonas placentãrias e os anticorpos utilizáveis no dito processo de detecção.

Este processo, aumenta a sensibilidade e a especificidade da detecção e/ou do doseamento imunolôgico de hormonas humanas ou animais, em meios de cultura ou em fluidos biológicos, utilizando pelo menos dois anticorpos iguais ou diferentes, específicos da hormona a dosear, caracterizado pelo facto de se pré-incubar pelo menos um dos referidos anticorpos, em um meio contendo plasma ou soro desprovido da hormona a detectar e/ou a dosear (meio INC).

Lisboa, 31 de Maio de 1991 O Agente Oficial da Propriedade Inausrria»