JPS59175459A - セクレチン関連誘導体および製法 - Google Patents
セクレチン関連誘導体および製法Info
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- JPS59175459A JPS59175459A JP4865883A JP4865883A JPS59175459A JP S59175459 A JPS59175459 A JP S59175459A JP 4865883 A JP4865883 A JP 4865883A JP 4865883 A JP4865883 A JP 4865883A JP S59175459 A JPS59175459 A JP S59175459A
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- Japan
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- enzyme
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はセクレチン関連誘導体、当該誘導体を酵素標識
抗原として使用することを特徴とするセクレチンの測定
方法および測定試薬に関する。
抗原として使用することを特徴とするセクレチンの測定
方法および測定試薬に関する。
セクレチンを測定するためには、従来より一般にセクレ
チンの生物活性をｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはがｖｉｖｏ
の各種の方法により測定することがおこなわれてきた。
チンの生物活性をｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはがｖｉｖｏ
の各種の方法により測定することがおこなわれてきた。
しかしながらこれら従来法はこれを実施するためには動
物を扱う上での特別に習熟した手技が必要であり、また
数多くの試料を短時間に処理する必要のある場合には不
正確な結果を招きやすい欠点がある。かかる事情から免
疫測定法の実施が提案されるようになり、とりわけＲＩ
Ａキットを使用する放射免疫測定法が推奨されている。
物を扱う上での特別に習熟した手技が必要であり、また
数多くの試料を短時間に処理する必要のある場合には不
正確な結果を招きやすい欠点がある。かかる事情から免
疫測定法の実施が提案されるようになり、とりわけＲＩ
Ａキットを使用する放射免疫測定法が推奨されている。
しかしながら放射性同位元素で標識したセクレチンは不
安定であり、またそれによって高い測定感度がもたらさ
れるとは必ずしも言えないものであって、セクレチンの
測定方法はいまだ満足できる状況に至っていない。
安定であり、またそれによって高い測定感度がもたらさ
れるとは必ずしも言えないものであって、セクレチンの
測定方法はいまだ満足できる状況に至っていない。
かかる状況にかんがみ本発明者は特別の手技を要するこ
とな（、単純簡便な操作によって実施することができ、
しかも検量性、特異性および感度の高い測定が可能とな
るセクレチンの測定方法を提供すべく検討をおこなった
。その結果、セクレチンまたはセクレチンのＮ末端から
１０番目までのアミノ酸を欠（フラグメントに架橋剤を
もって酵素を標識せしめた酵素標識抗原を使用して酵素
免疫測定法をおこなうことにより所期の目的が達成され
ることを知り特願昭５８−７９７３号に係る発明として
完成した。
とな（、単純簡便な操作によって実施することができ、
しかも検量性、特異性および感度の高い測定が可能とな
るセクレチンの測定方法を提供すべく検討をおこなった
。その結果、セクレチンまたはセクレチンのＮ末端から
１０番目までのアミノ酸を欠（フラグメントに架橋剤を
もって酵素を標識せしめた酵素標識抗原を使用して酵素
免疫測定法をおこなうことにより所期の目的が達成され
ることを知り特願昭５８−７９７３号に係る発明として
完成した。
すなわち同上発明の目的は単純簡便な操作によって検量
性、特異性および感度の高い測定が可能となるセクレチ
ンの測定方法並びにそのためにあらかじめ準備された測
定試薬の提供であり、同上発明は当該目的の達成のため
に、セクレチンまたはセクレチンのＮ末端から１０番目
までのアミノ酸を欠くフラグメンＨこ架橋剤をもって酵
素を標識せしめた酵素標識抗原を使用する技術手段を開
示するものであった。
性、特異性および感度の高い測定が可能となるセクレチ
ンの測定方法並びにそのためにあらかじめ準備された測
定試薬の提供であり、同上発明は当該目的の達成のため
に、セクレチンまたはセクレチンのＮ末端から１０番目
までのアミノ酸を欠くフラグメンＨこ架橋剤をもって酵
素を標識せしめた酵素標識抗原を使用する技術手段を開
示するものであった。
さて、その後１本発明者は同上発明における測定感度を
さらにいっそう向上させるための検討を進めた。その結
果、同上発明におけるフラグメントとは異なるフラグメ
ント、すなわちセクレチンのＮ末端から１７番までのア
ミノ酸を欠（フラグメントをとりあげ、これに架橋剤を
もって酵素を標識せしめた酵素標識抗原を使用して酵素
免疫測定法をおこなうことにより所期の目的が達成され
ることを知り９本発明を完成した。
さらにいっそう向上させるための検討を進めた。その結
果、同上発明におけるフラグメントとは異なるフラグメ
ント、すなわちセクレチンのＮ末端から１７番までのア
ミノ酸を欠（フラグメントをとりあげ、これに架橋剤を
もって酵素を標識せしめた酵素標識抗原を使用して酵素
免疫測定法をおこなうことにより所期の目的が達成され
ることを知り９本発明を完成した。
すなわち９本発明の目的は単純簡便な操作によって検量
性、特異性が高く、かつ特願昭５８−７９７３号に係る
発明におけるよりもさらに感度が４〜５倍高い測定を可
能とするセクレチンの測定方法並びにそのためにあらか
じめ準備された測定試薬の提供であり１本発明は当該目
的の達成のために。
性、特異性が高く、かつ特願昭５８−７９７３号に係る
発明におけるよりもさらに感度が４〜５倍高い測定を可
能とするセクレチンの測定方法並びにそのためにあらか
じめ準備された測定試薬の提供であり１本発明は当該目
的の達成のために。
セクレチンのＮ末端から１７番までのアミノ酸を欠くフ
ラグメント１こ架橋剤をもって酵素を標識せしめた酵素
標識抗原を使用する技術手段を開示するものである。
ラグメント１こ架橋剤をもって酵素を標識せしめた酵素
標識抗原を使用する技術手段を開示するものである。
以下に本発明の構成をさらに詳細番こ説明する。
本発明酵素標識抗原は物質としては下記式によって示さ
れるセクレチン関連誘導体である。
れるセクレチン関連誘導体である。
ここで式中ＸはＸ−ＮＨ２がセクレチンのＮ末端から１
７番までのアミノ酸を欠くフラグメントである残基を意
味しており、またＹはＹ−３Ｈがβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼである残基を意味する。さらに具体的に説明すれば
次のごとくである。
７番までのアミノ酸を欠くフラグメントである残基を意
味しており、またＹはＹ−３Ｈがβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼである残基を意味する。さらに具体的に説明すれば
次のごとくである。
まず、セクレチンは次の一次構造式によって示される。
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ −Ａｓｐ −Ｇｌｙ −Ｔｈｒ
−Ｐｈｅ −Ｔｈｒ −Ｓｅｒ −Ｇｌｕ−Ｌｅｕ −
Ｓｅｒ −Ａｒｇ −Ｌｅｕ −Ａｒｇ −Ａｓｐ −
Ｓｅｒ −Ａｌａ −Ａｒｇ−Ｌｅｕ −Ｇｉｎ −Ａ
ｒｇ −Ｌｅｕ −Ｌｅｕ −Ｇｉｎ −Ｇｌｙ −Ｌ
ｅｕ−ＶａｌＨ２ またセクレチンのＮ末端から１７番までのアミノ酸を欠
くフラグメント（以下セクレチンフラグメントと略称す
る）は次の一次構造式によって示される。
−Ｐｈｅ −Ｔｈｒ −Ｓｅｒ −Ｇｌｕ−Ｌｅｕ −
Ｓｅｒ −Ａｒｇ −Ｌｅｕ −Ａｒｇ −Ａｓｐ −
Ｓｅｒ −Ａｌａ −Ａｒｇ−Ｌｅｕ −Ｇｉｎ −Ａ
ｒｇ −Ｌｅｕ −Ｌｅｕ −Ｇｉｎ −Ｇｌｙ −Ｌ
ｅｕ−ＶａｌＨ２ またセクレチンのＮ末端から１７番までのアミノ酸を欠
くフラグメント（以下セクレチンフラグメントと略称す
る）は次の一次構造式によって示される。
Ｈ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ −Ｇｉｎ −Ａｒｇ −Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ −Ｇｉｎ −Ｇｌｙ−Ｌｅｕ −Ｖａｌ −
ＮＨ２ なお、前記Ｘ−ＮＨ２において記載される一ＮＨ２はセ
クレチンまたはセクレチンフラグメント分子中に存在す
るもっとも塩基性の高い一級アミノ基（Ｎ末端アミノ基
）を意味しており、上記−次槽造式におけるＣ末端■ａ
１に酸アミド結合するアミド基を意味するものではない
。
−Ｌｅｕ −Ｇｉｎ −Ｇｌｙ−Ｌｅｕ −Ｖａｌ −
ＮＨ２ なお、前記Ｘ−ＮＨ２において記載される一ＮＨ２はセ
クレチンまたはセクレチンフラグメント分子中に存在す
るもっとも塩基性の高い一級アミノ基（Ｎ末端アミノ基
）を意味しており、上記−次槽造式におけるＣ末端■ａ
１に酸アミド結合するアミド基を意味するものではない
。
またＹ−８Ｈにおいて記載される一３Ｈはβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ分子中に存在するチオール基を意味してい
る。β−Ｄ−ガラクトシダーゼはβ−Ｄ−ガラクトサイ
ドの加水分解酵素であり９例えば基質として４−メチル
ウンベリフェリル−β−Ｄ−／’／ラクトサイドを使用
した場合には、４−メチルウンベリフェロンおよびβ−
Ｄ−ガラクトースを遊離する。
クトシダーゼ分子中に存在するチオール基を意味してい
る。β−Ｄ−ガラクトシダーゼはβ−Ｄ−ガラクトサイ
ドの加水分解酵素であり９例えば基質として４−メチル
ウンベリフェリル−β−Ｄ−／’／ラクトサイドを使用
した場合には、４−メチルウンベリフェロンおよびβ−
Ｄ−ガラクトースを遊離する。
前記セクレチン関連誘導体はセクレチンの抗原活性およ
びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を併有しているので、
セクレチンの酵素免疫測定法における酵素標識抗原とし
て使用することができる。
びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を併有しているので、
セクレチンの酵素免疫測定法における酵素標識抗原とし
て使用することができる。
本発明セクレチン関連誘導体の調製は、架橋剤として例
えばサクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シ
クロヘキサン−１−カルボキシレートを使用する場合に
次のようにおこなえばよい。
えばサクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シ
クロヘキサン−１−カルボキシレートを使用する場合に
次のようにおこなえばよい。
まず、セクレチンフラグメントにサクシニミジル４−（
Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（ＳＭＣＣと略記する）を反応させ、セクレ
チンフラグメントのＮ末端にＮ−マレイミドメチルーシ
クロヘキザン基を導入する。
Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（ＳＭＣＣと略記する）を反応させ、セクレ
チンフラグメントのＮ末端にＮ−マレイミドメチルーシ
クロヘキザン基を導入する。
ここでゲルｒ過して反応生成物と未反応ＳＭＣＣとを分
離する。次に反応生成物にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを
反応させ、当該ガラクトシダーゼ中のＳＨ基を介してマ
レイミド基に附加せしめる。限外ｒ過により濃縮後再び
ゲルｒ過し、 ２２５ｎｍ吸光値並びにβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ活性を測定して所定のフラクションを集めれ
ばよい。上記調製によって得られる本発明セクレチン関
連誘導体はセクレチン関連誘導体の前記式においてＺが
である誘導体である。この場合においてＸ−ＮＨ２がセ
クレチンのＮ末端から１７番までのアミノ酸を欠くフラ
グメントであることを５Ｉ８−２７によって示し１本発
明セクレチン関連誘導体を Ｓ＋ａ−−７ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼと略
記する。
離する。次に反応生成物にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを
反応させ、当該ガラクトシダーゼ中のＳＨ基を介してマ
レイミド基に附加せしめる。限外ｒ過により濃縮後再び
ゲルｒ過し、 ２２５ｎｍ吸光値並びにβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ活性を測定して所定のフラクションを集めれ
ばよい。上記調製によって得られる本発明セクレチン関
連誘導体はセクレチン関連誘導体の前記式においてＺが
である誘導体である。この場合においてＸ−ＮＨ２がセ
クレチンのＮ末端から１７番までのアミノ酸を欠くフラ
グメントであることを５Ｉ８−２７によって示し１本発
明セクレチン関連誘導体を Ｓ＋ａ−−７ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼと略
記する。
架橋剤としてＳＭＣＣの代わりにサクシニミジル４−（
ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートまたはｍ−マレイ
ミドベンゾイルＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル
を使用する点を除いて上記調製と同様に調製すれば、や
はり本発明セクレチン関連誘導体を得ることができる。
ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートまたはｍ−マレイ
ミドベンゾイルＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル
を使用する点を除いて上記調製と同様に調製すれば、や
はり本発明セクレチン関連誘導体を得ることができる。
これらの場合において得られるセクレチン関連誘導体は
前記式において２がそれぞれ である誘導体である。
前記式において２がそれぞれ である誘導体である。
次に本発明測定方法について説明する。
本発明測定方法は酵素免疫測定法であって、競合法（固
相）を利用するものである。従って本発明測定方法の一
例として、抗原系としてのセクレチン（被検試料中のセ
クレチン）およびセクレチン関連誘導体（酵素標識抗原
）並びに抗体系としてのセクレチン抗体（第一抗体）お
よび固相化−（第二抗体）を構成要素とする測定方法が
ある。
相）を利用するものである。従って本発明測定方法の一
例として、抗原系としてのセクレチン（被検試料中のセ
クレチン）およびセクレチン関連誘導体（酵素標識抗原
）並びに抗体系としてのセクレチン抗体（第一抗体）お
よび固相化−（第二抗体）を構成要素とする測定方法が
ある。
特にこの方法について詳細に述べれば次のごとくである
。
。
まずセクレチン抗体（第一抗体）としては、セクレチン
で免疫した家兎の抗血清を使用するが。
で免疫した家兎の抗血清を使用するが。
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ −Ｂｅｈｒｉｎｇ社より市販品
として入手することのできるセクレチン抗血清をそのま
ま使用してもよい。このセクレチン抗血清は合成豚セク
レチンで免疫した家兎の抗血清であって、ｐＨ７，６の
リン酸緩衝液から凍結乾燥したものである。
として入手することのできるセクレチン抗血清をそのま
ま使用してもよい。このセクレチン抗血清は合成豚セク
レチンで免疫した家兎の抗血清であって、ｐＨ７，６の
リン酸緩衝液から凍結乾燥したものである。
第二抗体としては９例えば家兎ＩｇＧで免疫したヤギの
抗血清をアフィニティークロマトグラフィーでＩｇＧ分
劃したものを使用する。家兎ＩｇＧで免疫したヤギの抗
血清としては例えばＣａｐｐｅｌ Ｌａｂ。
抗血清をアフィニティークロマトグラフィーでＩｇＧ分
劃したものを使用する。家兎ＩｇＧで免疫したヤギの抗
血清としては例えばＣａｐｐｅｌ Ｌａｂ。
より市販品として入手することのできる凍結乾燥品を使
用することができる。アフィニティークロマトグラフィ
ーのためのカラムとしては例えばＢｒＣＮで活性化した
セファローズ４Ｂに家兎γ−グロブリンをカップリング
させた樹脂を充填したものを使用すればよい。アフィニ
ティークロマトグラフィーは９例えば前記凍結乾燥品を
０．１ＭＮａ Ｃ１を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
緩衝液（ｐＨ７，８）に溶解してカラムに通し２次に５
０ ｎＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣＩ 緩衝液（ｐＨ２，
３）で溶出すればよい。
用することができる。アフィニティークロマトグラフィ
ーのためのカラムとしては例えばＢｒＣＮで活性化した
セファローズ４Ｂに家兎γ−グロブリンをカップリング
させた樹脂を充填したものを使用すればよい。アフィニ
ティークロマトグラフィーは９例えば前記凍結乾燥品を
０．１ＭＮａ Ｃ１を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
緩衝液（ｐＨ７，８）に溶解してカラムに通し２次に５
０ ｎＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣＩ 緩衝液（ｐＨ２，
３）で溶出すればよい。
固相化のための固相としては当分野で通常使用されるも
のを使用すればよ（９例えばシリコンピースなどを使用
することができる。固相化は例えば次のようにおこなえ
ばよい。
のを使用すればよ（９例えばシリコンピースなどを使用
することができる。固相化は例えば次のようにおこなえ
ばよい。
まずシリコンピースをよ（洗滌した後９次に前記第二抗
体を加えて撹拌することにより吸着させる。
体を加えて撹拌することにより吸着させる。
本発明はセクレチン関連誘導体およびセクレチン関連誘
導体を使用することを特徴とする測定方法並びに測定試
薬であるから、アフィニティークロマトグラフィーのた
めの樹脂および方法あるいは固相化のための固相および
方法については１本発明の目的を損わない限りにおいて
自由に選択することができる。従ってここにおける記述
並びに後記実施例は単に好ましい態様例を示すにすぎず
。
導体を使用することを特徴とする測定方法並びに測定試
薬であるから、アフィニティークロマトグラフィーのた
めの樹脂および方法あるいは固相化のための固相および
方法については１本発明の目的を損わない限りにおいて
自由に選択することができる。従ってここにおける記述
並びに後記実施例は単に好ましい態様例を示すにすぎず
。
本発明を限定するものではない。
さて、当該測定方法は具体的には次のように実施される
。
。
まず、セクレチン抗体（第一抗体）、被検試料および本
発明セクレチン関連誘導体（酵素標識抗原）を混合し１
例えば４°Ｃで一夜放置後、固相化ＩｇＧを加え、３７
℃で２〜６時間インキュベートする。固相を分離し、固
相に結合した酵素の活性を測定する。なお酵素活性は次
のように測定すればよい。
発明セクレチン関連誘導体（酵素標識抗原）を混合し１
例えば４°Ｃで一夜放置後、固相化ＩｇＧを加え、３７
℃で２〜６時間インキュベートする。固相を分離し、固
相に結合した酵素の活性を測定する。なお酵素活性は次
のように測定すればよい。
固相に基質溶液（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ
−ガラクトサイド）を加え、３７℃で一定時間反応させ
た後９反応を停止する。次に生成した４−メチルウンベ
リフェロン量を蛍光分析（励起波長３６０ ｎｍ、蛍光
波長４５０ ｎｍ ）によって測定する。
−ガラクトサイド）を加え、３７℃で一定時間反応させ
た後９反応を停止する。次に生成した４−メチルウンベ
リフェロン量を蛍光分析（励起波長３６０ ｎｍ、蛍光
波長４５０ ｎｍ ）によって測定する。
次に本発明測定試薬は酵素標識抗原としてのセクレチン
関連誘導体を必須の構成成分として含有する試薬である
。従って、前記例示の酵素免疫測定方法に対応する試薬
の具体的態様を示せば次のごとくである。すなわち９本
発明測定試薬はセクレチン関連誘導体それ自体あるいは
同誘導体とセクレチン抗体（第一抗体）および／または
固相化ＩｇＧ （第二抗体）とを組合せたセットである
。
関連誘導体を必須の構成成分として含有する試薬である
。従って、前記例示の酵素免疫測定方法に対応する試薬
の具体的態様を示せば次のごとくである。すなわち９本
発明測定試薬はセクレチン関連誘導体それ自体あるいは
同誘導体とセクレチン抗体（第一抗体）および／または
固相化ＩｇＧ （第二抗体）とを組合せたセットである
。
ここで固相化ＩｇＧ’がその製造原料１例えば抗家兎Ｉ
ｇＧヤギ血清あるいはそのＩｇＧ分劃および／または固
相のままで提供されることは自由である。この場合には
測定にあたり製造原料から固相化−を用時調製して使用
する。また測定操作の便益のために適当なる希釈用の緩
衝液、基質（例えば４−メチルウンペリフエリルーβ−
Ｄ−ガラクトサイド）その他をセット中に添付すること
も自由であり。
ｇＧヤギ血清あるいはそのＩｇＧ分劃および／または固
相のままで提供されることは自由である。この場合には
測定にあたり製造原料から固相化−を用時調製して使用
する。また測定操作の便益のために適当なる希釈用の緩
衝液、基質（例えば４−メチルウンペリフエリルーβ−
Ｄ−ガラクトサイド）その他をセット中に添付すること
も自由であり。
これらは本発明を限定するものではない。
以下に記載する実験例をもって本発明の詳細な説明する
。
。
実施例
被検試料としてセクレチン、セクレチンフラグメント（
Ｓ、ａ、−、、） 、グルカゴン、 ＶＩＰをとりあげ
、実施例３に記載の測定方法によって各被検試料につい
てのＢ／Ｂｏ（至）を求め、タテ軸にＢ／ＢＯ圀を、ま
たヨコ軸に各被検試料の濃度（Ｐｇ／ａｓｓａｙ ）を
とる検量線を作成した。
Ｓ、ａ、−、、） 、グルカゴン、 ＶＩＰをとりあげ
、実施例３に記載の測定方法によって各被検試料につい
てのＢ／Ｂｏ（至）を求め、タテ軸にＢ／ＢＯ圀を、ま
たヨコ軸に各被検試料の濃度（Ｐｇ／ａｓｓａｙ ）を
とる検量線を作成した。
結果を図１に示す。図中・印実線はセクレチンについて
、○印点線はセクレチンフラグメントについて、ム印一
点破線はグルカゴンについて、および印点線はＶＩＰに
ついてのものを示す。
、○印点線はセクレチンフラグメントについて、ム印一
点破線はグルカゴンについて、および印点線はＶＩＰに
ついてのものを示す。
図１より本発明測定試薬並びに本発明測定方法はセクレ
チンフラグメント（Ｓ、Ｓ−２，）を含めてセクレチン
に対して特異性の高いものであり。
チンフラグメント（Ｓ、Ｓ−２，）を含めてセクレチン
に対して特異性の高いものであり。
類似ペプタイドとの交差反応性が２５〜１１０００Ｐ／
ａｓｓａｙの測定範囲内ではみられないことが判明する
。
ａｓｓａｙの測定範囲内ではみられないことが判明する
。
実施例
被検試料として合成豚セクレチンをとりあげ。
実施例３に記載の測定方法によりＢ／ＢＯ（ｆｌを求め
。
。
タテ軸にＢ／Ｂｏ□□□を、またヨコ軸にセクレチン濃
度（Ｐｇ／ａｓｓａｙ ）をとる検量線を作成した。別
に被検試料として同じく合成豚セクレチンをとりあげ、
実施例３において５Ｉ８−２□−ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼの代わりに５ｌｌ−２？−ＳＭＣＣ−β
−Ｄ−ガラクトシダーゼを使用した点を除いて実施例３
に記載の測定方法と同一の測定方法をおこない、 Ｂ／
Ｂｏ％を求め、同様にタテ軸にＢ’Ｂ。
度（Ｐｇ／ａｓｓａｙ ）をとる検量線を作成した。別
に被検試料として同じく合成豚セクレチンをとりあげ、
実施例３において５Ｉ８−２□−ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼの代わりに５ｌｌ−２？−ＳＭＣＣ−β
−Ｄ−ガラクトシダーゼを使用した点を除いて実施例３
に記載の測定方法と同一の測定方法をおこない、 Ｂ／
Ｂｏ％を求め、同様にタテ軸にＢ’Ｂ。
圀を、またヨコ軸にセクレチン濃度（Ｐｇ／ａｓｓａｙ
）をとる検量線を作成した。
）をとる検量線を作成した。
結果を図２に示す。図中・印実線は酵素標識抗原として
５Ｉ８−２？ ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を使用した場合の、またＯ印点線は酵素標識抗原として
Ｓｌ＋−２□−ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを
使用した場合の各検量線を示す。
５Ｉ８−２？ ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を使用した場合の、またＯ印点線は酵素標識抗原として
Ｓｌ＋−２□−ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを
使用した場合の各検量線を示す。
５１１−２□−ＳＭＣＣ−β〜Ｄ−ガラクトシダーゼは
特願昭５８−７９７３号に係る発明において使用される
酵素標識抗原である。従って図２より本発明測定試薬並
びに本発明測定方法は、特願昭５８−７９７３号に係る
発明の測定試薬並びに測定方法に比較して、４〜５倍高
い測定感度を有するものであることが判明する。
特願昭５８−７９７３号に係る発明において使用される
酵素標識抗原である。従って図２より本発明測定試薬並
びに本発明測定方法は、特願昭５８−７９７３号に係る
発明の測定試薬並びに測定方法に比較して、４〜５倍高
い測定感度を有するものであることが判明する。
以下に記載する実施例をもって本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
実施例１
セクレチンフラグメント（５Ｉ８−２７ ） ０−５
ｍｙを１ｍＬの５０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
に溶解した。これに１００ ｔｔＬのＳＭＣＣ−ジオキ
サン溶液（３１ｎｇＳＭＣＣｈｎＬ ）を加え、室温で
１時間反応させた。
ｍｙを１ｍＬの５０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
に溶解した。これに１００ ｔｔＬのＳＭＣＣ−ジオキ
サン溶液（３１ｎｇＳＭＣＣｈｎＬ ）を加え、室温で
１時間反応させた。
この反応液をセファデックスＧ−２５のカラムに通し、
未反応のＳＭＣＣを除去した。溶出は、５０ｍＭリン酸
緩衝液、ｐＨ７，０で行なった。
未反応のＳＭＣＣを除去した。溶出は、５０ｍＭリン酸
緩衝液、ｐＨ７，０で行なった。
このカラムクロマトグラフィーを図３に示を図中■はＳ
１８−２７−ＳＭＣＣ反応生成物、（わは未反応ＳＭＣ
Ｃの各ピークを示す。
１８−２７−ＳＭＣＣ反応生成物、（わは未反応ＳＭＣ
Ｃの各ピークを示す。
次に得られた５Ｉ８−２□−ＳＭＣＣ反応生成物約５μ
ｇに、１ｍｇのβ−Ｄ−ガラクトチダーゼを加えてカッ
プリングさせた。カップリング反応は、室温で１時間、
ついで４°Ｃで、１夜、放置させることで行なった。つ
ぎに、この反応液を限外ｒ過（分画分子量：５万）によ
って濃縮したものを。
ｇに、１ｍｇのβ−Ｄ−ガラクトチダーゼを加えてカッ
プリングさせた。カップリング反応は、室温で１時間、
ついで４°Ｃで、１夜、放置させることで行なった。つ
ぎに、この反応液を限外ｒ過（分画分子量：５万）によ
って濃縮したものを。
セファデックスＧ−７５のカラムに通した。溶出は、５
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） テ行ない、目的と
するＳ、、２７−ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を得た。
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） テ行ない、目的と
するＳ、、２７−ＳＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を得た。
このカラムクロマトグラフィーを図４に示す。
図中実線は２２５ ｎｍにおける吸光値によって求めた
ものである。
ものである。
実施例２
実施例１において得られたＳ、、、７− ＳＭＣＣ−β
−Ｄ−ガラクトシダーゼと下記■〜■の試薬とを組合せ
てセクレチン測定用試薬セットとした。
−Ｄ−ガラクトシダーゼと下記■〜■の試薬とを組合せ
てセクレチン測定用試薬セットとした。
■ 固相化ＩｇＧ （抗家兎ＩｇＧヤギ血清のＩｇＧ分
劃物側シリコンピースに固相化した固相化ＩｇＧ ）の
製造原料 ■ 抗セクレチン家兎血清 ■ 希釈用緩衝液 なお、固相化ＩｇＧの製造原料から固相化ＩｇＧを以下
ａ、およびす、の二段の操作を経て用時調製した。
劃物側シリコンピースに固相化した固相化ＩｇＧ ）の
製造原料 ■ 抗セクレチン家兎血清 ■ 希釈用緩衝液 なお、固相化ＩｇＧの製造原料から固相化ＩｇＧを以下
ａ、およびす、の二段の操作を経て用時調製した。
ａ、第二抗体の精製
ＢｒＣＮで活性化したセファロース４Ｂ：５ｇに対して
１００ｍｇの家兎γ−グロブリンをカップリングさせた
樹脂を用いて、アフィニティークロマトグラフィーを行
なった。
１００ｍｇの家兎γ−グロブリンをカップリングさせた
樹脂を用いて、アフィニティークロマトグラフィーを行
なった。
ヤギの抗家兎ＩｇＧ血清の凍結乾燥品（ＩｇＧとして約
２４■を含む）を、４ｍｊの０．ＩＭＮａＣｌを含む５
０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，８）に溶
解し、先の樹脂を充填したカラムに通した。同緩衝液で
カラムを洗い、未吸着のものを除去した後、 ０．１Ｍ
ＮａＣ１を含む５ＱｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣＩ緩衝
液（ｐＨ２，５）を用いて、家兎γ−グロブリンと特異
的に結合した抗体を溶出させた。
２４■を含む）を、４ｍｊの０．ＩＭＮａＣｌを含む５
０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，８）に溶
解し、先の樹脂を充填したカラムに通した。同緩衝液で
カラムを洗い、未吸着のものを除去した後、 ０．１Ｍ
ＮａＣ１を含む５ＱｍＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣＩ緩衝
液（ｐＨ２，５）を用いて、家兎γ−グロブリンと特異
的に結合した抗体を溶出させた。
溶出液には、直ちに、ＩＭＴｒｉｓを加えてｐＨ−７，
９とした。得られた特異的抗体を第二抗体とした。
９とした。得られた特異的抗体を第二抗体とした。
ｂ、シリコンピースへの第二抗体の吸着シリコンピース
をあらかじめ蒸留水で、つづイテ１５０ｍＭノＮａＣ１
を含む５ＱｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄して
使用した。
をあらかじめ蒸留水で、つづイテ１５０ｍＭノＮａＣ１
を含む５ＱｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄して
使用した。
第二抗体５ｍｇを同緩衝液５０ ｒｔｔＬに溶解させ。
これにシリコンピース５００個を加えて、室温で２時間
撹拌後、４°Ｃにて数日放置した後測定に使用した。
撹拌後、４°Ｃにて数日放置した後測定に使用した。
また抗セクレチン血清は合成豚セクレチンで免疫した家
兎の抗血清を、また希釈用緩衝液は実施例１の■の試薬
と同じ試薬を使用した。
兎の抗血清を、また希釈用緩衝液は実施例１の■の試薬
と同じ試薬を使用した。
実施例３
被検試料を実施例２記載の試薬セットをもって測定した
。すなわち被検試料、抗セクレチン家兎血清Ｉ ５１８
−２□−３ＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを希釈用
緩衝液で希釈し、各１００μｔを混合し４°Ｃで一夜放
置した。実施例２で用時調製した固相化ＩｇＧを加え、
３７°Ｃで６時間振とうし。
。すなわち被検試料、抗セクレチン家兎血清Ｉ ５１８
−２□−３ＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを希釈用
緩衝液で希釈し、各１００μｔを混合し４°Ｃで一夜放
置した。実施例２で用時調製した固相化ＩｇＧを加え、
３７°Ｃで６時間振とうし。
シリコンピースをとりだし、希釈用緩衝液で洗滌シ、シ
リコンピースを集めシリコンピースに結合しているβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素活性（Ｂｌを測定した。
リコンピースを集めシリコンピースに結合しているβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素活性（Ｂｌを測定した。
別に被検試料を除いて、すなわち抗セクレチン家兎血清
＋ ５Ｉ８−２□−３ＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼを希釈用緩衝液で希釈し、以下上記と同じ操作によ
りシリコンピースに結合しているβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼの酵素活性（Ｂ、）を測定した。
＋ ５Ｉ８−２□−３ＭＣＣ−β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼを希釈用緩衝液で希釈し、以下上記と同じ操作によ
りシリコンピースに結合しているβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼの酵素活性（Ｂ、）を測定した。
最後に次式によりＢ／ＢＯ□□□を求めた。
なお酵素活性は次のように測定した。
固相に１００μＬの基質溶液（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂ
ｅｌ］１−ｆｅｒｙｌ−β−］） −ｇａｌａｃｔｏｓ
ｉｄｅを、 １．５ Ｘ １０−’Ｍあるいは１．５
Ｘ １０−’Ｍになるように、 １ｍＭ ＭｇＣｈを含
む、５０ｍＭ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し
たもの）を加え、１時間３７°Ｃで反応させた後、２．
５ｒｒｔＬの０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐ
Ｈ１０，３）を加えて反応を止めた。
ｅｌ］１−ｆｅｒｙｌ−β−］） −ｇａｌａｃｔｏｓ
ｉｄｅを、 １．５ Ｘ １０−’Ｍあるいは１．５
Ｘ １０−’Ｍになるように、 １ｍＭ ＭｇＣｈを含
む、５０ｍＭ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し
たもの）を加え、１時間３７°Ｃで反応させた後、２．
５ｒｒｔＬの０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐ
Ｈ１０，３）を加えて反応を止めた。
生成した４ −ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎ
ｅ量を蛍光分析した。蛍光は、励起波長３６０ｎｍ、蛍
光波長４５０ｎｍで測定した。
ｅ量を蛍光分析した。蛍光は、励起波長３６０ｎｍ、蛍
光波長４５０ｎｍで測定した。
図１は実験例１において記載される図１に相応し、タテ
軸にＢ／Ｂ、□□□、ヨコ軸にセクレチン、セクレチン
フラグメント、グルカゴン、 ＶＩＰの各濃度をとった
各検量線を示す。 図２は実験例２において記載される図２に相応し、タテ
軸にＢ／ＢＯ％、ヨコ軸にセクレチンの濃度をとった検
量線を示す。 図３１図４は実施例１において記載される図３゜図４に
相応し、それぞれカラムクロマトグラフィーを示す。 特許出願人 工一ザイ株式−＆社 図 １ Ｂ／Ｂ。 ２．５ ５ １０ ２５ ５０ １００
５００ １０００濃度 （ｐｇ／ａｓｓａｙ） 図 ２ Ｂ／Ｂ。 １ ２．５ ５ １０ ２５ ５０ １００
５００セクレチン （ｐｇ／ ａＳｓａｙ）図
３ ０ １０ ２０Ｐｒａｃ
ｔ、ｉｏｎ Ｎｏ、 （１，６ｍｌ／い、Ｉ
ｂｅ）図 ４ ０ ｔｏ ２０
軸にＢ／Ｂ、□□□、ヨコ軸にセクレチン、セクレチン
フラグメント、グルカゴン、 ＶＩＰの各濃度をとった
各検量線を示す。 図２は実験例２において記載される図２に相応し、タテ
軸にＢ／ＢＯ％、ヨコ軸にセクレチンの濃度をとった検
量線を示す。 図３１図４は実施例１において記載される図３゜図４に
相応し、それぞれカラムクロマトグラフィーを示す。 特許出願人 工一ザイ株式−＆社 図 １ Ｂ／Ｂ。 ２．５ ５ １０ ２５ ５０ １００
５００ １０００濃度 （ｐｇ／ａｓｓａｙ） 図 ２ Ｂ／Ｂ。 １ ２．５ ５ １０ ２５ ５０ １００
５００セクレチン （ｐｇ／ ａＳｓａｙ）図
３ ０ １０ ２０Ｐｒａｃ
ｔ、ｉｏｎ Ｎｏ、 （１，６ｍｌ／い、Ｉ
ｂｅ）図 ４ ０ ｔｏ ２０
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）式 によって示されるセクレチン関連誘導体。 〔ただし式中ＸはＸ−ＮＨ２がセクレチンのＮ末端から
１７番までのアミ・）酸を欠くフラグメントである残基
を意味し、ＹはＹ−３Ｈがβ−Ｄ−ガラクトシダーゼで
ある残基を意味する。また２はする〕 によって示される架橋剤にＸ −ＮＨ，を反応させてを
生成せしめ、当該生成物にＹ−３Ｈを反応させることを
特徴とする特 許 によって示されるセクレチン関連誘導体の製法。 〔ただしＸ、 Ｙ、 Ｚは特許請求の範囲第１項におけ
るただし書き記載と同一の残基を意味する〕（３）セク
レチンを酵素免疫測定法によって測定するにあたり、当
該測定における酵素標識抗原として特許請求の範囲第１
項記載のセクレチン関連誘導体を使用することを特徴と
するセクレチンの測定方法 （４）セクレチンを酵素免疫測定法によって測定する試
薬であって、当該測定における酵素標識抗原として特許
請求の範囲第１項記載のセクレチン関連誘導体が含まれ
ることを特徴とするセクレチンの測定試薬
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4865883A JPS59175459A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | セクレチン関連誘導体および製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4865883A JPS59175459A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | セクレチン関連誘導体および製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59175459A true JPS59175459A (ja) | 1984-10-04 |
Family
ID=12809441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4865883A Pending JPS59175459A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | セクレチン関連誘導体および製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59175459A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04340018A (ja) * | 1990-12-28 | 1992-11-26 | Ichiro Kanesaka | ガスヒータ |
| US5321142A (en) * | 1989-07-10 | 1994-06-14 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Compounds from biopolymers and effector substances which are linked via optically active amino acid derivatives, processes for the preparation thereof and the use thereof |
-
1983
- 1983-03-25 JP JP4865883A patent/JPS59175459A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5321142A (en) * | 1989-07-10 | 1994-06-14 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Compounds from biopolymers and effector substances which are linked via optically active amino acid derivatives, processes for the preparation thereof and the use thereof |
| US5484722A (en) * | 1989-07-10 | 1996-01-16 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Biopolymer and effector substance conjugates, process for the preparation thereof and their use |
| US5744315A (en) * | 1989-07-10 | 1998-04-28 | Behring Diagnostics Gmbh | Compounds from biopolymers and effector substances which are linked via optically active amino acid derivatives, processes for the preparation thereof and the use thereof |
| JPH04340018A (ja) * | 1990-12-28 | 1992-11-26 | Ichiro Kanesaka | ガスヒータ |
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