JPH0721499B2 - ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の測定法 - Google Patents
ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の測定法Info
- Publication number
- JPH0721499B2 JPH0721499B2 JP60221930A JP22193085A JPH0721499B2 JP H0721499 B2 JPH0721499 B2 JP H0721499B2 JP 60221930 A JP60221930 A JP 60221930A JP 22193085 A JP22193085 A JP 22193085A JP H0721499 B2 JPH0721499 B2 JP H0721499B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmin
- antibody
- human
- plasmin inhibitor
- complex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ａ 産業上の利用分野 本発明は、汎発生血管内凝固疾患（DIC）等の患者血漿
中に存在する、ヒトプラスミン−α２−プラスミンイン
ヒビター複合体の測定法に関する。更に詳しくは、本発
明は、血漿検体をある一定以上に希釈することにより、
血漿中に存在するヒトプラスミン−α２−プラスミンイ
ンヒビター複合体を、正確にしかも再現性良く、免疫学
的に測定する方法に関する。
中に存在する、ヒトプラスミン−α２−プラスミンイン
ヒビター複合体の測定法に関する。更に詳しくは、本発
明は、血漿検体をある一定以上に希釈することにより、
血漿中に存在するヒトプラスミン−α２−プラスミンイ
ンヒビター複合体を、正確にしかも再現性良く、免疫学
的に測定する方法に関する。
ｂ 従来技術 ヒトのα２−プラスミンインヒビターは、青木と諸井に
よつて最初に単離・精製された。これは、線維素（フイ
ブリン）溶解酵素であるプラスミンのエステラーゼ活性
（線維素溶解作用）を、瞬間的に阻害する強力なプラス
ミンインヒビターであり、11.7％の糖を含む分子量約6
7,000の１本鎖の糖タンパクであることが知られている
（Moroi ＆ Aoki;The Journal of Biological Chemistr
y,251,5956−5965（1976）参照）。このα２−プラスミ
ンインヒビターは、プラスミンの線維溶解作用を阻止す
る部位（B.Wiman ＆ D.Collen,J.B.C.254,9291−9297
（1979）参照）以外に、カルボキシル基末端側のプラス
ミン結合部位（B.Wimal ＆ D.Collen;European Journal
of Biochemistry,84,537−578（1978）参照）とアミノ
基末端のフイブリン結合部位（Y.Sakata,et al;,Thromb
osis Research 16 279−282（1979）参照）を有してい
る。従つて、ヒトα２−プラスミンインヒビターは、プ
ラスミン活性をほとんど瞬間的に阻害し、かつプラスミ
ンと1:1の割合で結合し複合体を形成する（B.Wiman ＆
D.Collen;J.B.C,254,9291−9297（1979）参照）。
よつて最初に単離・精製された。これは、線維素（フイ
ブリン）溶解酵素であるプラスミンのエステラーゼ活性
（線維素溶解作用）を、瞬間的に阻害する強力なプラス
ミンインヒビターであり、11.7％の糖を含む分子量約6
7,000の１本鎖の糖タンパクであることが知られている
（Moroi ＆ Aoki;The Journal of Biological Chemistr
y,251,5956−5965（1976）参照）。このα２−プラスミ
ンインヒビターは、プラスミンの線維溶解作用を阻止す
る部位（B.Wiman ＆ D.Collen,J.B.C.254,9291−9297
（1979）参照）以外に、カルボキシル基末端側のプラス
ミン結合部位（B.Wimal ＆ D.Collen;European Journal
of Biochemistry,84,537−578（1978）参照）とアミノ
基末端のフイブリン結合部位（Y.Sakata,et al;,Thromb
osis Research 16 279−282（1979）参照）を有してい
る。従つて、ヒトα２−プラスミンインヒビターは、プ
ラスミン活性をほとんど瞬間的に阻害し、かつプラスミ
ンと1:1の割合で結合し複合体を形成する（B.Wiman ＆
D.Collen;J.B.C,254,9291−9297（1979）参照）。
例えば、DIC患者血漿中や、ウロキナーゼによる血栓溶
解療法実施中の患者血漿中では、プラスミンの前駆体で
あるプラスミノーゲンの活性化が起こり、生成したプラ
スミンとα２−プラスミンインヒビターが反応して両者
の複合体が形成される。
解療法実施中の患者血漿中では、プラスミンの前駆体で
あるプラスミノーゲンの活性化が起こり、生成したプラ
スミンとα２−プラスミンインヒビターが反応して両者
の複合体が形成される。
最近、血漿中のプラスミン−α２−プラスミンインヒビ
ター複合体の定量は、血栓溶解療法のモニターやDICの
診断等に有効であると考えられるようになつた。そし
て、このためには、血液又は血漿中のプラスミン−α２
−プラスミンインヒビター複合体の量を、正確且つ簡便
に測定する必要がある。従来知られているプラスミン−
α２−プラスミンインヒビター複合体の測定方法として
は、３つの方法がある。第１の方法は、二次元交叉免疫
電気泳動を用いる方法である。第２の方法は、プラスミ
ン−α２−プラスミンインヒビター複合体のネオアンチ
ゲンに対する、ポリクローナル抗体を用いたラテツクス
凝集法である。第３の方法は、プラスミノーゲンに対す
るポリクローナル抗体と、α２−プラスミンインヒビタ
ーに対するポリクローナル抗体を、一方を固定抗体にし
他方を酵素標識抗体にした、酵素免疫測定法である。
ター複合体の定量は、血栓溶解療法のモニターやDICの
診断等に有効であると考えられるようになつた。そし
て、このためには、血液又は血漿中のプラスミン−α２
−プラスミンインヒビター複合体の量を、正確且つ簡便
に測定する必要がある。従来知られているプラスミン−
α２−プラスミンインヒビター複合体の測定方法として
は、３つの方法がある。第１の方法は、二次元交叉免疫
電気泳動を用いる方法である。第２の方法は、プラスミ
ン−α２−プラスミンインヒビター複合体のネオアンチ
ゲンに対する、ポリクローナル抗体を用いたラテツクス
凝集法である。第３の方法は、プラスミノーゲンに対す
るポリクローナル抗体と、α２−プラスミンインヒビタ
ーに対するポリクローナル抗体を、一方を固定抗体にし
他方を酵素標識抗体にした、酵素免疫測定法である。
ｃ 発明が解決しようとする問題点 しかしながら、第１の方法は、感度と定量性が低いとい
う欠点があり、第２の方法は、特異性の点で問題があ
る。また、第３の方法は、感度の面では良好な方法であ
るが、以下に述べる様な問題を有している。即ち、ヒト
α２−プラスミンインヒビターに対する一定の活性を有
する抗血清を、安定して得ることが困難なゆえに、測定
における再現性にその問題がある。また、免疫反応が２
ステツプであるため（第１段；検体中の複合体と固相抗
体との反応、第２段；固相抗体に結合した複合体と酵素
標識抗体との反応）、その操作が煩雑であり、測定に長
時間を有するという欠点がある。煩雑な２ステツプの操
作をよぎなくされる理由として、血漿中に存在する遊離
のプラスミノーゲン（プラスミンの前駆体）とα２−プ
ラスミンインヒビターは、免疫測定法を阻害する因子で
あり、かつこれらの因子は血漿中において、一般的に、
プラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体に比
して多量に存在するという事実が存在する。それ故に２
ステップに分けて、これらの影響を除く必要があるので
ある。従つて、簡更な１ステツプの方法をとると、その
測定値の正確性ならびに再現性を犠牲にしてしまうこと
になる。
う欠点があり、第２の方法は、特異性の点で問題があ
る。また、第３の方法は、感度の面では良好な方法であ
るが、以下に述べる様な問題を有している。即ち、ヒト
α２−プラスミンインヒビターに対する一定の活性を有
する抗血清を、安定して得ることが困難なゆえに、測定
における再現性にその問題がある。また、免疫反応が２
ステツプであるため（第１段；検体中の複合体と固相抗
体との反応、第２段；固相抗体に結合した複合体と酵素
標識抗体との反応）、その操作が煩雑であり、測定に長
時間を有するという欠点がある。煩雑な２ステツプの操
作をよぎなくされる理由として、血漿中に存在する遊離
のプラスミノーゲン（プラスミンの前駆体）とα２−プ
ラスミンインヒビターは、免疫測定法を阻害する因子で
あり、かつこれらの因子は血漿中において、一般的に、
プラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体に比
して多量に存在するという事実が存在する。それ故に２
ステップに分けて、これらの影響を除く必要があるので
ある。従つて、簡更な１ステツプの方法をとると、その
測定値の正確性ならびに再現性を犠牲にしてしまうこと
になる。
ｄ 問題点を解決するための手段 本発明者らは、かかる事情に鑑みて、ヒトプラスミン−
α２−プラスミンインヒビター複合体を、簡便な１ステ
ツプ法で、正確に再現性良く定量する方法を開発すべく
鋭意研究の結果、抗原親和性の高いα２−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクローナル抗体を用い、かつ検
体血漿を最終希釈倍率1200倍以上に希釈することによ
り、簡便で正確で再現性の良いヒトプラスミン−α２−
プラスミンインヒビター複合体の１ステツプ測定法が可
能であることを確認し、本発明に到達した。
α２−プラスミンインヒビター複合体を、簡便な１ステ
ツプ法で、正確に再現性良く定量する方法を開発すべく
鋭意研究の結果、抗原親和性の高いα２−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクローナル抗体を用い、かつ検
体血漿を最終希釈倍率1200倍以上に希釈することによ
り、簡便で正確で再現性の良いヒトプラスミン−α２−
プラスミンインヒビター複合体の１ステツプ測定法が可
能であることを確認し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、ヒトプラスミン−α２−プラスミ
ンインヒビター複合体を、不溶性担体に結合した抗体
と、これとは異なる標識抗体とを用いるサンドイツチ法
により測定するに際し、（１）いずれか一方の抗体とし
て、ヒトα２−プラスミンインヒビターを特異的に認識
するモノクローナル抗体を用い、他方の抗体としてヒト
プラスミノーゲンを認識する抗体を用いること、（２）
血漿検体を最終希釈倍率1200倍以上に希釈して回収率83
〜108％とすること、及び（３）標識抗体と血漿検体を
同時に、不溶性担体に結合した抗体を接触させることを
特徴とする、ヒト血漿検体中のヒトプラスミン−α２−
プラスミンインヒビター複合体の測定法である。
ンインヒビター複合体を、不溶性担体に結合した抗体
と、これとは異なる標識抗体とを用いるサンドイツチ法
により測定するに際し、（１）いずれか一方の抗体とし
て、ヒトα２−プラスミンインヒビターを特異的に認識
するモノクローナル抗体を用い、他方の抗体としてヒト
プラスミノーゲンを認識する抗体を用いること、（２）
血漿検体を最終希釈倍率1200倍以上に希釈して回収率83
〜108％とすること、及び（３）標識抗体と血漿検体を
同時に、不溶性担体に結合した抗体を接触させることを
特徴とする、ヒト血漿検体中のヒトプラスミン−α２−
プラスミンインヒビター複合体の測定法である。
次に、以下の例により、本発明によるヒトプラスミン−
α２−プラスミスインヒビター複合体の含有量の測定方
法を、具体的に説明する。
α２−プラスミスインヒビター複合体の含有量の測定方
法を、具体的に説明する。
ヒトプラスミン又はプラスミノーゲンに対する抗体を、
適当な不溶性担体に固定化する（固定化抗体）。つい
で、不溶性担体を測定しようとする試薬又は検体試料と
の非特異的結合を避けるために、適当な物質で不溶性担
体の表面を被覆する。
適当な不溶性担体に固定化する（固定化抗体）。つい
で、不溶性担体を測定しようとする試薬又は検体試料と
の非特異的結合を避けるために、適当な物質で不溶性担
体の表面を被覆する。
ついで、600倍以上に希釈した検体試料（例えば、ヒト
血漿）と、適当な標識物質で標識したヒトα２−プラス
ミンインヒビターに対するモノクローナル抗体（標識抗
体）を、等量ずつ同時に加えて最終希釈倍率1200倍で、
固定抗体と一定時間および一定温度で接触させ反応させ
る（１ステツプ法）。この間に、固定化抗体と検体試料
中のヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複
合体と標識抗体が結合する、これを適当な洗浄液で洗
い、次いで、不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定
量する。かくして、その値から、検体試料中のヒトプラ
スミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の量を算
出することができる。最終希釈倍率が1600倍より小さい
血漿検体希釈倍率を採用した場合は、血漿中の遊離のプ
ラスミノーゲン、またはα２−プラスミンインヒビター
により測定系が干渉される結果、測定されるプラスミン
−α２−プラスミンインヒビター複合体の値が干渉をう
けてしまうことになり、測定値は正確な値ではないこと
になる。
血漿）と、適当な標識物質で標識したヒトα２−プラス
ミンインヒビターに対するモノクローナル抗体（標識抗
体）を、等量ずつ同時に加えて最終希釈倍率1200倍で、
固定抗体と一定時間および一定温度で接触させ反応させ
る（１ステツプ法）。この間に、固定化抗体と検体試料
中のヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複
合体と標識抗体が結合する、これを適当な洗浄液で洗
い、次いで、不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定
量する。かくして、その値から、検体試料中のヒトプラ
スミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の量を算
出することができる。最終希釈倍率が1600倍より小さい
血漿検体希釈倍率を採用した場合は、血漿中の遊離のプ
ラスミノーゲン、またはα２−プラスミンインヒビター
により測定系が干渉される結果、測定されるプラスミン
−α２−プラスミンインヒビター複合体の値が干渉をう
けてしまうことになり、測定値は正確な値ではないこと
になる。
本発明の測定法に使用される不溶性担体としては、例え
ばポリエチレン，ポリプロピレン，ポリ塩化ビニル，ポ
リエステル，ポリアクリロニトリル，弗素樹脂，架橋デ
キストラン，ポリサツカライドなどの高分子，その他、
紙，ガラス，金属，アガロース及びこれらの組合せなど
を例示することができる。
ばポリエチレン，ポリプロピレン，ポリ塩化ビニル，ポ
リエステル，ポリアクリロニトリル，弗素樹脂，架橋デ
キストラン，ポリサツカライドなどの高分子，その他、
紙，ガラス，金属，アガロース及びこれらの組合せなど
を例示することができる。
標識物質としては、放射性物質；酵素又は蛍光物質を使
用するのが有利である。放射性物質としては、125I,132
I,14C,3H等、酵素としてはアルカリフオスフアターゼ，
パーオキシダーセ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼなど、ま
た、蛍光物質としてはフルオレンセインイソチオシアネ
ートなどを使用することができる。
用するのが有利である。放射性物質としては、125I,132
I,14C,3H等、酵素としてはアルカリフオスフアターゼ，
パーオキシダーセ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼなど、ま
た、蛍光物質としてはフルオレンセインイソチオシアネ
ートなどを使用することができる。
本発明のヒトα２−プラスミンインヒビターに対するモ
ノクローナル抗体は、例えば、ヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターで免疫したマウスの脾臓細胞と、マウスの骨
髄腫細胞とを融合させて、所望のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを得、これをin vivo又はin vi
troで培養することによつて任意に得ることができる。
特に好ましいのは、本発明者の一人が先に提案した（特
願昭59−75778号）、ヒトα２−プラスミンインヒビタ
ー中に存在する、プラスミンの線維素溶解作用を阻止す
る部位を特異的に認識し、かかる作用を抑制するという
性質を有するモノクローナル抗体である。
ノクローナル抗体は、例えば、ヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターで免疫したマウスの脾臓細胞と、マウスの骨
髄腫細胞とを融合させて、所望のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを得、これをin vivo又はin vi
troで培養することによつて任意に得ることができる。
特に好ましいのは、本発明者の一人が先に提案した（特
願昭59−75778号）、ヒトα２−プラスミンインヒビタ
ー中に存在する、プラスミンの線維素溶解作用を阻止す
る部位を特異的に認識し、かかる作用を抑制するという
性質を有するモノクローナル抗体である。
ｅ 作 用 かくして、本発明により、血漿検体中に存在する遊離の
プラスミン，プラスミノーゲン，α２−プラスミンイン
ヒビター等の挟雑物の影響を全く受けずに、正確に再現
性よく、血漿検体中のヒトプラスミン−α２−プラスミ
ンインヒビター複合体を、簡便に１ステツプで測定する
ことが可能となつた。
プラスミン，プラスミノーゲン，α２−プラスミンイン
ヒビター等の挟雑物の影響を全く受けずに、正確に再現
性よく、血漿検体中のヒトプラスミン−α２−プラスミ
ンインヒビター複合体を、簡便に１ステツプで測定する
ことが可能となつた。
本発明による測定法が、血漿検体中に存在する遊離のプ
ラスミン，プラスミノーゲン，及びα２−プラスミンイ
ンヒビター等の挟雑物の影響をうけない理由は、次のご
とくと推定される。
ラスミン，プラスミノーゲン，及びα２−プラスミンイ
ンヒビター等の挟雑物の影響をうけない理由は、次のご
とくと推定される。
本発明は固定化抗体と標識抗体により抗原をはさみこむ
サンドイツチ法を用いており、このサンドイツチ法は、
抗原をすべて測定系で捕捉することをその基本原理とし
ており（非競合法）この点が他の競合法と比べて、安定
で高感度であるゆえんである。そこで本発明は、プラス
ミンとα２−プラスミンインヒビターとの複合体を、そ
の測定対照物としているが、血漿中では、本測定系の免
疫学的な阻害物質であるプラスミノーゲン（平均約120
μg/ml）、α２−プラスミンインヒビター（平均約60μ
g/ml）の方が、それらの複合体（３〜60μg/ml）に比し
て圧倒的に多く、一般的には、これらの阻害を回避する
のは非常に困難であるとされている。しかし、測定系内
のこれらの阻害因子を含めた複合体をすべて結合しうる
条件を設定しうれば、阻害因子の影響を回避し複合体を
正確に定量しうるわけであり、本発明は上記の条件を満
たしているのである。すなわち、血漿検体を十分に希釈
し、かつ、抗原親和性の高い、α２−プラスミンインヒ
ビターに対するモノクローナル抗体を使用することによ
り、測定系内の阻害因子に影響されることなくプラスミ
ン−α２−プラスミンインヒビター複合体を、正確に１
ステツプで定量することを可能ならしめたと測定され
る。
サンドイツチ法を用いており、このサンドイツチ法は、
抗原をすべて測定系で捕捉することをその基本原理とし
ており（非競合法）この点が他の競合法と比べて、安定
で高感度であるゆえんである。そこで本発明は、プラス
ミンとα２−プラスミンインヒビターとの複合体を、そ
の測定対照物としているが、血漿中では、本測定系の免
疫学的な阻害物質であるプラスミノーゲン（平均約120
μg/ml）、α２−プラスミンインヒビター（平均約60μ
g/ml）の方が、それらの複合体（３〜60μg/ml）に比し
て圧倒的に多く、一般的には、これらの阻害を回避する
のは非常に困難であるとされている。しかし、測定系内
のこれらの阻害因子を含めた複合体をすべて結合しうる
条件を設定しうれば、阻害因子の影響を回避し複合体を
正確に定量しうるわけであり、本発明は上記の条件を満
たしているのである。すなわち、血漿検体を十分に希釈
し、かつ、抗原親和性の高い、α２−プラスミンインヒ
ビターに対するモノクローナル抗体を使用することによ
り、測定系内の阻害因子に影響されることなくプラスミ
ン−α２−プラスミンインヒビター複合体を、正確に１
ステツプで定量することを可能ならしめたと測定され
る。
本発明を、以下実施例によつて説明するが、これによつ
て限定されるものではない。
て限定されるものではない。
実施例１ 酵素免疫測定法（EIA）による精製ヒトプラスミン−α
２−プラスミンインヒビター複合体の測定 （１） 固相抗体の調整 ウサギをヒトプラスミノーゲンで免疫して得た、ヒトプ
ラスミノーゲンに対する抗血清よりIgG成分を分離精製
した。
２−プラスミンインヒビター複合体の測定 （１） 固相抗体の調整 ウサギをヒトプラスミノーゲンで免疫して得た、ヒトプ
ラスミノーゲンに対する抗血清よりIgG成分を分離精製
した。
得られた抗プラスミノーゲン抗体を、タンパク農度20μ
g/mlになるようにPBSにて調整し、これにポリスチレン
ボールを加えて３昼夜浸漬し、抗プラスミノーゲン抗体
固定ポリスチレンボールを得た。
g/mlになるようにPBSにて調整し、これにポリスチレン
ボールを加えて３昼夜浸漬し、抗プラスミノーゲン抗体
固定ポリスチレンボールを得た。
（２） 標識抗体の調整（特願昭59−75778号参照） 青木と諸井の方法によつて得られたヒトα２−プラスミ
ンインヒビターを用いて、常法に従つてBALB/Cマウスを
免疫し、その脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞P3−U1を融合
させた。その後、常法に従つてヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターを認識するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを選別しクローニングし、このハイブリド
ーマをBALB/Cマウスの腹腔で培養し、腹水から大量のモ
ノクローナル抗体を得た。このモノクローナル抗体は、
ヒトα２−プラスミンインヒビター中の、プラスミンの
線維素溶解作用を阻止する部位を特異的に認識し、かか
る作用を抑制するという性質を有していた。このモノク
ローナル抗体を、常法に従つてホースラデイシユパーオ
キシダーゼ（HRP）で標識化し、標識抗体を得た。
ンインヒビターを用いて、常法に従つてBALB/Cマウスを
免疫し、その脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞P3−U1を融合
させた。その後、常法に従つてヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターを認識するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを選別しクローニングし、このハイブリド
ーマをBALB/Cマウスの腹腔で培養し、腹水から大量のモ
ノクローナル抗体を得た。このモノクローナル抗体は、
ヒトα２−プラスミンインヒビター中の、プラスミンの
線維素溶解作用を阻止する部位を特異的に認識し、かか
る作用を抑制するという性質を有していた。このモノク
ローナル抗体を、常法に従つてホースラデイシユパーオ
キシダーゼ（HRP）で標識化し、標識抗体を得た。
（３） 精製ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒ
ビター複合体の調製。Plowらの方法（J.Lab.Clin.Med.9
3,199,（1979）参照）に従つて精製した。すなわち、1m
lのヒト血漿（健常人）をリジン−セフアロースカラム
（1mlベツド容）に通過させ、得られたプラスミノーゲ
ンを除いた血漿に、60μｇのプラスミン水溶液（10KIU/
ml Trasylol）1mlを徐々に加え反応させた。反応液を37
℃で10分間放置後、2mlのリジン−セフアロースカラム
に通し、プラスミン−α２−プラスミンインヒビター複
合体を十分結合させ、次いでリン酸緩衡生理食塩水（PB
S）でカラムを洗浄した後、0.05Mε−アミノカプロン酸
含有PBSでこの複合体を溶出させウルトラゲルAcA44カラ
ムで精製した。
ビター複合体の調製。Plowらの方法（J.Lab.Clin.Med.9
3,199,（1979）参照）に従つて精製した。すなわち、1m
lのヒト血漿（健常人）をリジン−セフアロースカラム
（1mlベツド容）に通過させ、得られたプラスミノーゲ
ンを除いた血漿に、60μｇのプラスミン水溶液（10KIU/
ml Trasylol）1mlを徐々に加え反応させた。反応液を37
℃で10分間放置後、2mlのリジン−セフアロースカラム
に通し、プラスミン−α２−プラスミンインヒビター複
合体を十分結合させ、次いでリン酸緩衡生理食塩水（PB
S）でカラムを洗浄した後、0.05Mε−アミノカプロン酸
含有PBSでこの複合体を溶出させウルトラゲルAcA44カラ
ムで精製した。
（４） 検量線の作製 前記（１）で得られた抗プラスミノーゲン抗体固定ポリ
スチレンボールを0.5％BSA−PBSにて一昼夜浸漬した。
次にこれに、前記（３）の精製ヒトプラスミン−α２−
プラスミンインヒビター複合体、50ng/ml,10ng/ml,5ng/
ml,1ng/ml,0.5ng/mlの希釈系列の生理食塩水溶液各200
μと、前記（２）のホースラデイシユペルオキシダー
ゼ（HRP）標識モノクローナル抗体の0.5％BSA−PBS溶液
200μを加え、37℃で１時間反応させた。次いで生理
食塩水にて洗浄後、HRP用基質液（0.1Mリン酸／クエン
酸緩衡液（pH4.5）中に、ABTS50mg/dlと2MH2O250μ/d
lを含む）400μにて、37℃で30分発色させた。0.2Mシ
ユウ酸水溶液1.0mlで停止反応を行ない、420nmにて吸光
度を測定した。得られた検量線を、第１図に示した。
スチレンボールを0.5％BSA−PBSにて一昼夜浸漬した。
次にこれに、前記（３）の精製ヒトプラスミン−α２−
プラスミンインヒビター複合体、50ng/ml,10ng/ml,5ng/
ml,1ng/ml,0.5ng/mlの希釈系列の生理食塩水溶液各200
μと、前記（２）のホースラデイシユペルオキシダー
ゼ（HRP）標識モノクローナル抗体の0.5％BSA−PBS溶液
200μを加え、37℃で１時間反応させた。次いで生理
食塩水にて洗浄後、HRP用基質液（0.1Mリン酸／クエン
酸緩衡液（pH4.5）中に、ABTS50mg/dlと2MH2O250μ/d
lを含む）400μにて、37℃で30分発色させた。0.2Mシ
ユウ酸水溶液1.0mlで停止反応を行ない、420nmにて吸光
度を測定した。得られた検量線を、第１図に示した。
実施例２ 本測定系への阻害因子の影響 実施例１の方法に従がい、プラスミン−α２−プラスミ
ンインヒビターの存在しない健常人血漿を次のごとく添
加し、健常人血漿に含まれるプラスミノーゲンおよびα
２−プラスミンインヒビターの、本測定系への阻害効果
を調べた。
ンインヒビターの存在しない健常人血漿を次のごとく添
加し、健常人血漿に含まれるプラスミノーゲンおよびα
２−プラスミンインヒビターの、本測定系への阻害効果
を調べた。
精製プラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体
を20ng/mlに固定し、これに、健常人血漿の各々25,50,1
00,200,250,300倍希釈溶液（最終希釈倍率が各々200,40
0,800,1600,2000,2400倍希釈）を各50μずつ加え、次
いで、それぞれにHRP標準抗体200μを加え、抗プラス
ミノーゲン抗体固定ポリスチレンボールと１時間反応さ
せた。精製プラスミンα２−プラスミンインヒビター複
合体のみの検量線を基準として健常人血漿を加えたとき
の複合体の測定値の回収率を第２図に示した。図から、
最終希釈倍率1200倍以上では、回収率が90％以上であ
り、血漿中のプラスミノーゲン，α２−プラスミンイン
ヒビターの影響がほとんどないことがあきらかである。
一方、低希釈倍率の血漿検体は、複合体の回収率が90％
以下であり、測定値の正確さの点で問題がある。
を20ng/mlに固定し、これに、健常人血漿の各々25,50,1
00,200,250,300倍希釈溶液（最終希釈倍率が各々200,40
0,800,1600,2000,2400倍希釈）を各50μずつ加え、次
いで、それぞれにHRP標準抗体200μを加え、抗プラス
ミノーゲン抗体固定ポリスチレンボールと１時間反応さ
せた。精製プラスミンα２−プラスミンインヒビター複
合体のみの検量線を基準として健常人血漿を加えたとき
の複合体の測定値の回収率を第２図に示した。図から、
最終希釈倍率1200倍以上では、回収率が90％以上であ
り、血漿中のプラスミノーゲン，α２−プラスミンイン
ヒビターの影響がほとんどないことがあきらかである。
一方、低希釈倍率の血漿検体は、複合体の回収率が90％
以下であり、測定値の正確さの点で問題がある。
実施例３ 精製ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複
合体の添加回収試験 血漿検体の最終希釈倍率400および1600倍にて、４種の
検体（A,B（健常人）;C,D（DIC患者））中のプラスミン
−α２−プラスミンインヒビター複合体の定量を行な
い、次いでそれぞれの検体に精製複合体2.5,5.0,10.0μ
g/mlを添加し、添加回収試験を行なつた。
合体の添加回収試験 血漿検体の最終希釈倍率400および1600倍にて、４種の
検体（A,B（健常人）;C,D（DIC患者））中のプラスミン
−α２−プラスミンインヒビター複合体の定量を行な
い、次いでそれぞれの検体に精製複合体2.5,5.0,10.0μ
g/mlを添加し、添加回収試験を行なつた。
結果は、第１表に示すごとく、血漿検体の最終希釈倍率
1600倍において回収率83〜108％と良好な回収率が得ら
れた。一方、血漿検体の最終希釈倍率400倍では、回収
率が59〜81％と不良であり、最終希釈倍率1600倍におけ
る測定の有効性が確認された。
1600倍において回収率83〜108％と良好な回収率が得ら
れた。一方、血漿検体の最終希釈倍率400倍では、回収
率が59〜81％と不良であり、最終希釈倍率1600倍におけ
る測定の有効性が確認された。
実施例４ 実施例１に準じて、血漿検体の最終希釈倍率1600倍に
て、４種の検体の日内および月間の再現性試験を行なつ
た。月内再現試験は、１日のうちで同じ操作を５回行な
い検体の測定値を得て、その変動係数を算出した。
て、４種の検体の日内および月間の再現性試験を行なつ
た。月内再現試験は、１日のうちで同じ操作を５回行な
い検体の測定値を得て、その変動係数を算出した。
日間再現性試験は、１日に１回測定操作を行ない、それ
を５日間測定を行ない、検体の測定値を得て、その変動
係数を算出した。
を５日間測定を行ない、検体の測定値を得て、その変動
係数を算出した。
結果は、第２表に示したごとくであり、それぞれの測定
値の変動係数は、日内，日間ともに10％以内であり良好
な再現性を示した。
値の変動係数は、日内，日間ともに10％以内であり良好
な再現性を示した。
実施例５ 実施例１の測定法に準じ、血漿検体の最終希釈倍率1600
倍にて検体を希釈し、健常人10検体,DIC14検体中のプラ
スミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の定量を
行なつた。結果は第３図に示した如く、健常人に比しDI
C群は明らかに複合体の出現を示している。
倍にて検体を希釈し、健常人10検体,DIC14検体中のプラ
スミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の定量を
行なつた。結果は第３図に示した如く、健常人に比しDI
C群は明らかに複合体の出現を示している。
ｆ 発明の効果 以上詳記したように、本発明により、血漿中の遊離のプ
ラスミノーゲン，α２−プラスミンインヒビターの干渉
を排除して、患者血漿中等のプラスミン−α２−プラス
ミンインヒビター複合体の濃度を、簡便な１ステツプサ
ンドイツチ法により正確に測定することが初めて可能に
なつた。
ラスミノーゲン，α２−プラスミンインヒビターの干渉
を排除して、患者血漿中等のプラスミン−α２−プラス
ミンインヒビター複合体の濃度を、簡便な１ステツプサ
ンドイツチ法により正確に測定することが初めて可能に
なつた。
従つて、患者血漿中等のプラスミン−α２−プラスミン
インヒビター複合体の病態との関係について、阻害因子
なしに正確な対応を知ることが可能になり、本発明は、
DIC等の診断及び病理研究等に有用な方法を提供しうる
ものである。
インヒビター複合体の病態との関係について、阻害因子
なしに正確な対応を知ることが可能になり、本発明は、
DIC等の診断及び病理研究等に有用な方法を提供しうる
ものである。
第１図は、ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビ
ター複合体の定量用の検量線を示す。第２図は、健常人
血漿添加による複合体の回収率の変動を示す。第３図
は、健常人とDIC患者の複合体の測定値を示す。
ター複合体の定量用の検量線を示す。第２図は、健常人
血漿添加による複合体の回収率の変動を示す。第３図
は、健常人とDIC患者の複合体の測定値を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (72)発明者 鷲見 芳彦 東京都日野市旭が丘４−３―２ 帝人株式 会社中央研究所内 (72)発明者 青木 延雄 栃木県河内郡南河内町大字薬師寺3311―１ (56)参考文献 特開 昭57−16355（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃ ｏｌ．，15（１），（1985），Ｐ．21−32 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．60, （1977），Ｐ．361 Ｂｌｏｏｄ，51（４），（1978）Ｐ. 563−570 Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ，12（４），（1978），Ｐ．687−692 Ｎａｔｕｒｅ，256，（1975），Ｐ．495 −497
Claims (4)
- 【請求項１】ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒ
ビター複合体を、不溶性担体に結合した抗体と、これと
は異なる標識抗体とを用いるサンドイッチ法により測定
するに際し、（１）いずれか一方の抗体として、ヒトα
２−プラスミンインヒビターを特異的に認識するモノク
ローナル抗体を用い、他方の抗体としてヒトプラスミノ
ーゲンを認識する抗体を用いること、（２）血漿検体を
最終希釈倍率1200倍以上に希釈して回収率83〜108％と
すること、（３）標識抗体と血漿検体を同時に、不溶性
担体に結合した抗体を接触させることを特徴とする、ヒ
ト血漿検体中のヒトプラスミン−α２−プラスミンイン
ヒビター複合体の測定法。 - 【請求項２】不溶性担体に結合した抗体が、抗ヒトプラ
スミノーゲン抗体である、特許請求の範囲第１項記載の
測定法。 - 【請求項３】標識抗体が、酵素標識されたモノクローナ
ルな抗ヒトα２−プラスミンインヒビター抗体である、
特許請求の範囲第１項記載の測定法。 - 【請求項４】モノクローナル抗体が、ヒトα２−プラス
ミンインヒビター中に存在する、プラスミンの線維素溶
解作用を阻止する部位を特異的に認識する抗体である、
特許請求の範囲第１項記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60221930A JPH0721499B2 (ja) | 1985-10-07 | 1985-10-07 | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60221930A JPH0721499B2 (ja) | 1985-10-07 | 1985-10-07 | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6281568A JPS6281568A (ja) | 1987-04-15 |
| JPH0721499B2 true JPH0721499B2 (ja) | 1995-03-08 |
Family
ID=16774384
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60221930A Expired - Lifetime JPH0721499B2 (ja) | 1985-10-07 | 1985-10-07 | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0721499B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103713104B (zh) * | 2013-12-26 | 2015-02-11 | 中华人民共和国淮安出入境检验检疫局 | 一种检测食品中阪崎肠杆菌的双抗体夹心法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH642458A5 (en) * | 1980-04-25 | 1984-04-13 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
-
1985
- 1985-10-07 JP JP60221930A patent/JPH0721499B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Ｂｌｏｏｄ，５１（４），（１９７８）Ｐ．５６３−５７０ |
| Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１５（１），（１９８５），Ｐ．２１−３２ |
| Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０，（１９７７），Ｐ．３６１ |
| Ｎａｔｕｒｅ，２５６，（１９７５），Ｐ．４９５−４９７ |
| ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１２（４），（１９７８），Ｐ．６８７−６９２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6281568A (ja) | 1987-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Amiral et al. | Application of enzyme immunoassays to coagulation testing. | |
| JP3108103B2 (ja) | ヒト心筋ミオグロビンに対するモノクローナル抗体 | |
| US11506674B2 (en) | Monoclonal antibody against D-dimer and diagnosis agent for detecting D-dimer, crosslinked fibrin and its derivatives containing D-dimer by using the antibody | |
| EP0182495A1 (en) | Immunoassay means and methods useful in human native prothrombin and human abnormal prothrombin determinations | |
| WO2005071407A2 (en) | Methods of diagnosing acute coronary syndrome by measuring urotensin ii | |
| JP4751555B2 (ja) | 脳卒中のための診断アッセイ | |
| US20040091940A1 (en) | Reagent and method for immunoanalysis of elastase 1 and method of detecting pancreatic disease | |
| JPH07325083A (ja) | 糖タンパク質の特定糖鎖割合の測定方法 | |
| WO1994018560A1 (en) | Method of assaying human tau protein, kit therefor, and diagnostic method | |
| US5811242A (en) | Marker and reagent for diabetes mellitus and diabetes mellitus complication | |
| JPH0721499B2 (ja) | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の測定法 | |
| JP2507317B2 (ja) | プラスミン―α２プラスミンインヒビタ―複合体の測定方法 | |
| JPH0580053A (ja) | ヒト子宮体癌細胞の免疫化学的検出方法 | |
| JP3499875B2 (ja) | 解離性大動脈瘤を検出するための抗体試薬及びその用途 | |
| WO2003104812A2 (en) | ASSAY FOR THE DIAGNOSIS OF ALZHEIMER'S DISEASE BASED ON THE DETERMINATION OF THE RATIO OF hAβ42:hAβ40 | |
| JP3896303B2 (ja) | チトクロムｃ測定によるｓｉｒｓにおける多臓器不全の検査試薬 | |
| JP2915530B2 (ja) | ラミニン フラグメント | |
| JPH0313864A (ja) | ＴＮＦ―αの測定方法，キット及び診断方法 | |
| JP3973169B2 (ja) | トランスフェリン−トランスフェリンレセプター・コンプレックス測定試薬および測定方法 | |
| US6258552B1 (en) | Estimation of change in bone mineral density and diagnosis of osteoporosis | |
| JP2878317B2 (ja) | ラミニン測定試薬 | |
| US20240133904A1 (en) | Monoclonal antibody against d-dimer and diagnosis agent for detecting d-dimer, crosslinked fibrin and its derivatives containing d-dimer by using the antibody | |
| JPH06289020A (ja) | 歯槽骨由来タンパクの測定方法 | |
| JP2024060569A (ja) | 本態性高血圧症を検出するためのバイオマーカー、それを用いた検出方法及び検出試薬 | |
| JP2762058B2 (ja) | カルボニル化合物− タンパク質複合体の定量法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |