JPS6281568A - ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ　産業上の利用分野 本発明は、汎発性血管内ＰＪ固疾患ＣＤＩＣ）等の患者
血漿中に・存在する。しトブラスミンーα婁−プラスミ
ンインしビター複合体の測定う叛に関する。更に詳しく
は１本発明は、血漿検体をある一定以上に希釈するとと
Ｋより、血漿中に存在スるヒトプラスミン−α８−プラ
スミンインＬビター複合体を、正確にしかも再現性良く
、免疫学的に測定する方法に関する。

ｂ　従来技術 ヒトのα、−１ラスミンインヒビターは、青水と諸井に
よって最初に単離・精製された。これは、綜維素（フィ
ブリン）溶解酵素であるプラスミンのエステラーゼ活性
（線ｍｔ、ｔｔｘｕ作用＞を、瞬間的Ｋ１１１１害する
強力なプラスミンインヒビタ−であり、　１１．７チの
糖を含む分子量約６７．０００の１本釦の糖タンパクで
あることが知らｉｔている（　Ｍｏｒｏｉ　＆　Ａｏｋ
ｉ　；　Ｔｈｓ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５１．５９５６−５
９６５（１９７６）参照）。このα、−プラスミンイン
ヒビターは、プラスミンの線維溶解作用を阻止する部位
（Ｂ、ｆｉｍａｎ　＆　Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ、　Ｊ、Ｂ、
Ｃ，２５４，９２９１−９２ｓ＋７（１９７９）参照）
以外Ｋ、カルボキシル基末端側の１ラスミン結合部位（
Ｂ、Ｗｉｍａｎ　＆　Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ　：Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｉｏｅｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、　＆４ｔ　５７３−５７８（１９７８）参照）と
７ミノ基末端のフィブリン結合部位（Ｙ、５ａｋａｔａ
ｔ　ｅｔ　ａｌ　；＋　ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅ
ａｒｃｈ　１６２７９−２８２（１９７９）参照）を有
していかつ１ラスミンとｌ：ｌの割合で結合し複合体を
形成する（Ｂ−Ｗｉｍａｎ　＆　Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ　；
　Ｊ、Ｂ−Ｃ＠２５４＋９２９１−９２９７（１９７９
）参照）。

例えば、ＤＩＣ患者血漿中や、ウロキナーゼによる血栓
溶解療法実施中の患者血漿中では、１ラスミンの前駆体
であるプラスミノーゲンの活性化が起こり、生成したプ
ラスミンとα、−プラスミンインヒビターが反応して両
者の複合体が形成される。

最近、血漿中のプラスミン−α、−プラスミンインＬビ
ター複合体の定ｆｋは、血栓溶解療法のモニターやＤＩ
Ｃの診断等に有効であると考えられるようになった。そ
して、このためには。

血液又は血漿中の１ラスミンーα、−グラスミンインヒ
ビター複合体の量を、正確且つ簡便に測定する必要があ
る。従来知られているプラスミン−α２−プラスミンイ
ンヒビター複合体の測定方法としては、３つの方法ｂ％
ある。ｔＡｌの方法は、二次元交叉免疫電気泳動を用い
る方法である。第２の方法は、プラスミン−α、−プラ
スξンインヒビター複合体のネオアンチグンに対する。

ポリクローナル抗体を用いたラテックス凝集法でおる。

四３の方法は、プラスミノーゲンに対するボＩＩり１二
ナル抗体と、α、−プラスミンインヒビターに対するポ
リクローナル抗体を、一方を固定抗体にし他方を酵素標
識抗体にした、酵素免疫測定法である。

Ｃ発明が解決しようとする問題点 しかしながら、第１の方法は、感度と定量性が低いとい
う欠点があり、紹２の方法・τ、特異性の点で問題ｈ−
ある。また、第３の方法は、感度の面では良好な方法で
あるが、以下に述べる様な問題を有している。即ち、ヒ
トα８−グラスミンインヒビターに対する一定の活性を
有する抗血清を、安定して得ることが困難なゆえに、測
定における再現性にその問題がある。また、免疫反応が
２ステツプであるため（第１鐘；検体中の複合体と同相
抗体との反応、第２す々；固するという欠点がある。煩
雑な２スナツプの操作をよぎなくされる理由として、血
漿中に存在する遊離のプラスミノーゲン（プラスミンの
前駆体）とα、−プラスミンインヒビターは、免疫測定
法を阻害する因子であり、かつこれらの因子は血漿中に
おいて、一般的に、プラスミン−α−プラスミンインヒ
ビター複合体に比し゛て多量に存在するという事実が存
在する。それ故に２スデツプに分けて、これらの影響を
除く必要があるのである。従って、簡更なｌステップの
方法をとると、その測定値の正確性ならびに再現性を犠
）シにしてしまうことになる。

ｄ　問題点を解決するための手段 本発明者らは、かかる事情に鑑みて、ヒトプラスミン−
α、−プラスミンインヒビター複合体を、簡便なｌステ
ップ法で、正確に再現性良く定量する方法を開発すべく
鋭意研究の結果、抗原親和性の高いα、−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクローナル抗体を用い、かつ検
体血漿を最終希釈倍率１２００倍以上に希釈することＫ
より、簡便で正確で再現性の良いヒトプラスミン−α、
−プラスミンインヒビター複合体のｌステップ測定法が
可能であることを確ｇＬ、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、ｌ？、）プラスミン−α、−プラ
スミンインヒビター複合体を、不溶性担体Ｋｍ合した抗
体と、これとは異なる標識抗体とを用いるサンドインチ
法により測定するに際し、（１）いずれか一方の抗体と
して、ヒトα、−グラスミンインヒビターを特異的に認
識するモノクローナル抗体を用いること、（２）血漿検
体を最終希釈倍率１２００倍以上に希釈すること、及び
（３）標識抗体と血漿検体を同時に、不溶性担体に結合
した抗体に接触させることを特備とする、七ト血漿検体
中のヒトプラスミン−α、−プラスミンインヒビター複
合体の測定法である。

次に、以下の例により、本発明によるヒトプラスミン−
α、−プラスミスインＬビター複合体の含有量の測定方
法を、具体的に説明する。

ヒト１ラスミン又はプラスミノーゲンに対する抗体を、
適当な不溶性担体に固定化する（固定化抗体）。ついで
、不溶性担体を測定しようとする試薬又は検体試料との
非特異的結合を避けるためＫ、適当な物質で不溶性担体
の表面を被覆する。

ついで、６００倍以上に希釈した検体試料（例えば、ヒ
ト血漿）と、適当な標識物質で標識したヒトαオープラ
スミンヒビターに対するモノクローナル抗体（標識抗体
）を、等量ずつ同時に加えて最終希釈倍率１２００倍で
、固定抗体と一定時間および一定温度で接触させ反応さ
せる（ｌステップ法）。この間に、固定化抗体と検体試
料中のしドブラスξンーα、−グラスミンインヒビター
複合体と標識抗体が結合する、これを適当な洗浄液で洗
い、次いで、不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定
量する。かくして、その値から、検体試料中のヒトプラ
スミン−α、−１ラスミンインしビター複合体の量を算
出することができる。最終希釈倍率が１６００倍よシ小
さい血漿検体希釈倍率を採用した場合は、血漿中の遊離
のプラスミノーゲン、また＆言α、−プラスミンインヒ
ビターにより測定系ｂ；干渉される結果、測定されるプ
ラスミン−α、−プラスミンインＬビター複合体の値が
干渉をうけてしまうととＫな＃）、＠定値は正確な値で
はないととＫなる。

本発明の測定法に使用される不溶性担体としては、例え
ば、ポリエチレン、ｌヒリプロピレン。

ポリ塩化ビニル・、ポリエステル、ポリ７りＩＪＩｆｆ
ニトリル、弗素樹脂、架橋デキストラン、ポリサ°ンカ
ライドなどの高分子、その他、凧、ガラス、金！！４．
アガロース及びこれらの組合せなどを例示することがで
きる。

標識物質としては、放射性物質、酵素又は蛍光物質を使
用するのが有利である。放射性物質トＬ　−Ｃｉｔ、ｉ
ｌｌ　Ｉ、　１８１１　、１４（、ＩＨなど、酵素とし
てはアルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、β
−９−ガラクトシダーゼなど、また、蛍光物質としては
フルオレンセインインチオシ＋コＬ１−一−１Ｊ表）ｊ
ｆ０２＋＃＋＋Ｌ）−１，ｊ−；岬フーー多２本発明の
ヒトαヨープラスミンインヒビタ−に対するモノクロー
ナル抗体は、例えば、ヒトα。

−プラスミンインヒビターで免疫したマウスの牌ＩＩ細
兜と、マウスの骨髄腫細胞とを融合させて、所望のモノ
クローナル抗体を産生ずるＩ〜イブリドーマを得、これ
をｉｎ　ｖｉマＯ又はｉｎ　ｖｉｔｒ。

で培養することによって任意に得ることができる。特に
好ましいのは、本発明者の一人が先に提案した（ｑ！Ｉ
願昭５９−７５７７８号）、ヒトα、−プラスミ゛ンイ
ンヒビター中に存在する、１ラスミンの線維素溶解作用
を阻止する部位を特異的に認識し、かかる作用を抑制す
るという性質を有するモノクローナル抗体である。

８　　作　　用 かくして、本発明により、血漿検体中に存在する遊離の
プラスミン、プラスミノーゲン、α。

−プラスミンインヒビター等の挟雑物の影響を全く受け
ずに、正確に再現性よく、血漿検体中のヒトプラスミン
−α３−プラスミンインヒビター複合体を、簡便に１ス
テツプで測定するととが可能となった。

本発明による測定法が、血漿検体中忙存在すない理由は
１次のごとくと推定される。

本発明は固定化抗体と標識抗体により抗原をはさみこむ
サンドインチ法を用いておシ、このサントイツキ法は、
抗原をすべて測定系で捕捉することをその基本原理とし
ており（非競合法）この点が他の競合法と比べて、安定
で高感度であるゆえんである。そこで本発明は、プラス
ミンとα、−プラスミンインしビターとの複合体を、そ
の測定対照物としているが、血漿中では、本測定系の免
疫学的な阻害物質である１ラスミノーゲン（平均的１２
０μｍ１／ｍｌ）、α、−プラスミンインヒビター（平
均的６０μｍ１／ｓｌ）の方が、それらの複合体（３〜
６０μＥｌ／ｌ１ｌ）Ｋ比して圧倒的に多く、一般的に
は、これらの阻害を回避するのは非常に困難であるとさ
れている。しかし、測定系内のこれらの阻害因子を含め
た複合体をすべて結合しうる条件を設定しつれば、阻害
因子の影響を回避し複合体を正確に定量しうるわけであ
り１本発明は上記の条件を満たしているのであ、る。す
なわち、血漿検体を十分に希釈し、かつ、抗原親和性の
高い、α、−プラスミンインヒビター忙対するモノクロ
ーナル抗体を使用することによ）、測定系内の阻害因子
に影響されることなくプラスミン−α、−プラスミンイ
ンヒビター複合体を、正確Ｖｃｌステップで定量するこ
とを可能ならしめたと推定される。

本発明を、以下実施例によって説明するが、と九によっ
て限定されるものではない。

実施例！ 酵素免疫測定法（ＥＩＡ）による精製ヒトプラスミン−
α、−グラスミンインヒビター複合体の測定 （１）　　固相抗体の調整 ウサギをしトプラスミノーゲンで免疫して得た、ヒトプ
ラスミノーゲンに対する抗血清よりＩｇＧ成分を分離精
製した。

得られた抗プラスミノーゲン抗体を、タンパク濃度２０
　ｐｇ／　ｒｎｌ　ＫなるようにＰＢＳ　Ｋ　ｉ：　ｉ
整乙、これＩｅｒＨリスチレンポーｌしを加えて３昼夜
浸漬し、抗プうスミノーゲン抗体固定ポリスチレンボー
ルを得た。

（２）　　標識抗体の調製（勢願昭５９−７５７７８号
参照）青水と諸井の方法によって得られたにトα２−プ
ラスミンインヒビターを用いて、常法に従つＣＢＡＬＢ
／Ｃマウスを免疫し、その膵臓細胞とマウス骨髄腫細胞
Ｐ３−Ｕｌを融合させた。その後、常法に従ってヒトα
８−プラスミンインヒビターを認識するモノクローナル
抗体を産生するハイプリドーマを選別しクローニングし
、このハイブリドーマをＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔で培
養し、腹水から大量のモノクローナル抗体を得た。この
モノクローナル抗体は、ヒトαヨープラスミンインヒビ
タ−中の、プラスミンの線維素溶解作用を阻止する部位
を特異的ｉｃ　ＰＪ　ｇｍ　Ｌ、かかる作用を抑制する
という性質を有していた。このモノクローナル抗体を、
常法に従ってホースラディシュバーオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）で標識化し、標識抗体を得た。

（３）　　ＩＩ製ヒトプラスミン−α、−プラスミンイ
ンζビター複合体の調製。ＰＩ　ｏｗらの方法（Ｊ、Ｌ
ａｂ。

Ｃ１１ｎ、　Ｍａｄ、　９３．１９９．　（１９７９）
参照３に従って精製した。すなわち、１ｍのヒト血漿（
健常人）　ｔ　ＩＪ　ｓ）ンーセファロースヵラム（１
＋ｗｌベッド容）に通過させ、得られ、たプラスミ／　
−グンを除いた血漿に、６０μｇのプラスミン水溶液（
１０ＫＩＵ　／　Ｔｄ　Ｔｒａｓｙｌｏｌ　）　ｌ　ｍ
ｌを除々忙加え反応させた。反応液を３７℃で１０分間
放ｆｌ後、ｚｍｌのりジン−セファロースカラムに通り
、　プラスミン−Ｃ２−プラスミンインヒビター複合体
を十分結合させ、次いでリン酸緩命生理食塩水ＣＰＢＳ
）でカラムを洗浄した後、０．０５　Ｍε−７ミノカプ
ロン酸含有ＰＢＳでこの複合体を溶出させウルトラグル
ＡｃＡ４４カラムで精製した。　　゛ （４）検量線の作製 前記（１）で得られた抗プラスミノーゲン抗体固定Ｊ　
リス＋　Ｉｚ　ンボールなＯ−５％　ＢＳＡ−Ｐｕｓ　
Ｋで一昼夜浸漬した。次にこれに、前記（３）の精！ｌ
１１シトプラスミンーα、−グラスミンイン辷ビター複
合体、　５０ｎｊｉ／ｄ　、　ｌ　Ｏｎｌ／Ｉｌ／、　
５ｎ、Ｆ／　Ｍｌ　＊　ｌ　ｎｌ　／　Ｉｄ　−０，５
ｎｆｌ／　ｄの希釈系列の生理食塩水溶液各２００％と
、前記（２）のホースラデイシュベルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）ａｌｌモノクローナル抗体のＯ，Ｓ慢ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ溶液２００μｌを加え、３７℃で１時間反応させた
。

次いで生理食塩水にて洗浄後、ＨＲＰ用基質液（０，１
Ｍリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）中に、ＡＢＴ
Ｓ　５０マ／ｄｌとハＩＨ，０，５０μｌ／ｄｉを含む
）４００ｐｌにて、３７℃で３０分発色させた。０．２
Ｍシュウ酸水溶液１．０１Ｌ（で停止反応を行ない、４
２０ｎｍｌＣて吸光度を測定した。

得られた検量籾を、第１図番で示した。

実施例２ 本測定系への阻害因子の影響 実施例１の方法に従がい、プラスミン−α、−１ラスミ
ンインヒビターの存在しない健常人血漿を次のごとく添
加し、健常人血漿に含まれる１ラスミノーゲンおよびα
、−プラスミンインヒビターの、本測定系への阻害効果
を調べた。

精製プラスミン−α３−プラスミンインヒビター複合体
を２０難ｆｌ／１ｄＶｃ固定し、これに、健常人血漿の
各々２５．５０．１００．２００．２５０．３００　　
倍希釈溶液（最終希釈倍率が各々２００．４００．８０
０゜１６０Ｇ、　２０００．２４００倍希釈）を各５０
ｐｌずつ加え、次いで、それぞれＫＨＲＰｆ１認識抗体
２００μｌを加え、抗プラスミノーゲン抗体固定ポリス
チレンポールと１時間反応させた、精製プラスミンαヨ
ープラスミンインヒビタ−複合体のみの検量線を基準と
して、健常人血漿を加えたときの複合体の測定値の回収
率を第２図に示した。図から、最終希釈倍率１２００倍
以上では、回収率が９０’％以上でおり、血漿中の１ラ
スミノーゲン、α、−プラスミンインしビターの影響が
ほとんどないことがあきらかである。一方、低希釈倍率
の血漿検体は、複合体の回収率が９０チ以下であり、測
定値の正確さの点で問題がある。

実施例３ 精製ヒトプラスミン−α、−グラスミンインヒビター複
合体の添加回収試験 血漿検体の最終希釈倍率４００および１６００倍にて、
４種の検体（Ａ、　Ｂ（１１常人）　；　Ｃ−Ｄ（ＤＩ
Ｃ患者）　）　中のプラスミン−α、−プラスミンイン
ヒビター複合体の定量を行ない、次いでそわぞｎの検体
に精製複合体２．５．５．０．　ｌ　Ｏ，０μｇ／−を
添加し、添加回収試験を行なった。

結果は、第１表に示すごとく、血漿検体の最終希釈倍率
１６００倍において回収率８３〜１０８％と良好な回収
率が得られた。一方、血漿検体の最終希釈倍率４００倍
では、回収率が５９〜８１チと不良であり、最終希釈倍
率１６００倍における測定の有効性が確認された。

Ｗ４Ｌ　表 実施例４ 実施例ＩＫ準じて、血漿検体の最終希釈倍率１６００倍
にて、４１４の検体の日内および月間の再現性試験を行
なった。戸内再現試験は、１日のうちで同じ操作を５回
行ない検体の測定値を得て、その変動係数を算出した。

日間再現性試験は、１日に１回測定操作を行ない、それ
を５日間測定を行ない、検体の測定値を得て、その変動
係数を算出した。

結果は、第２表に示したごとくであり、それぞわの測定
値の変動係数は、日内９日間ともＫ１０％以内であり良
好な再現性を示した。

第２表 実施例５ 実施例１の測定法に準じ、血漿検体の廠終希釈倍率１６
００倍にて検体を希釈し、健常人ｌｏ検体、ＤＩＣｔ４
検体中のプラスミン−α。

−プラスミンイン−ビター複合体の定量を行なった。結
果は第３図に示した如く、健常人に比しＤＩＣ群は明ら
かに複合体の出現を示して、いる。

ｆ　発明の効果 以上詳記したよ５に１本発明により、血漿中の遊離のプ
ラスミノーゲン、α、−プラスミンインヒビターの干渉
を排除して、患者血漿中等のプラスミン−α、−プラス
ミンインしビター複合体の濃度を、簡便なｌステップサ
ンドインチ法により正確ＶＣ測定することが初めて可能
になった。

従ッて、患者血漿中等の１ラスミンーα、−プラスミン
インヒビター複合体と病態との関係について、阻害因子
なしく正確な対応を知ることが可能になり、本発明は、
ＤＩＣ等の診断及び病理研究環Ｋｍ用な方法を提供し５
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトプラスミン−α、−プラスミンインヒビ
ター複合体の足置用の検ＩＬＩＱを示す。 第２図は、健常人血漿添加による複合体の回収率の変動
を示す。第３図は、健常人とＤＩＣ患者の複合体の測定
値を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトプラスミン−α＿２−プラスミンインヒビター
   複合体を、不溶性担体に結合した抗体と、これとは異な
   る標識抗体とを用いるサンドイッチ法により測定するに
   際し、（１）いずれか一方の抗体として、ヒトα＿２−
   プラスミンインヒビターを特異的に認識するモノクロー
   ナル抗体を用いること、（２）血漿検体を最終希釈倍率
   １２００倍以上に希釈すること、（３）標識抗体と血漿
   検体を同時に、不溶性担体に結合した抗体に接触させる
   ことを特徴とする、ヒト血漿検体中のヒトプラスミン−
   α＿２−プラスインヒビター複合体の測定法。 ２、不溶性担体に結合した抗体が、抗ヒトプラスミノー
   ゲン抗体である、特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ３、標識抗体が、酵素標識されたモノクロナールな抗ヒ
   トα＿２−プラスミンインヒビター抗体である、特許請
   求の範囲第１項記載の測定法。 ４、モノクローナル抗体が、ヒトα＿２−プラスミンイ
   ンヒビター中に存在する、プラスミンの線維素溶解作用
   を阻止する部位を特異的に認識する抗体である、特許請
   求の範囲第１項記載の測定法。