JPS6353510B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

癌胚抗原（以下CEAという）の定量について
は多くの報告がある。また、精度および感度よく
定量するためには、被検サンプル中に存在するあ
る種の非特異的妨害物質をなんらかの方法で除去
または中和しなければならないこともよく知られ
ている。 生物学的液体たとえば血清または血漿中に存在
する強力な妨害物質をCEA試験前に除去または
中和する操作については、これまで多くの操作が
知られているが、与えられた分析法におけるこの
種の妨害物質の除去操作を、時間、費用また試験
操作の難易度の点で単純化することが有利なこと
はいうまでもない。 たとえばFreedmanらの米国特許第3663684号
の定量法では、血清サンプルをまずCEAが可溶
の糖タンパク溶媒で処理し、得られた溶液を澄明
化する。この種の溶媒の例としては過クロル酸、
三塩化酢酸、リンタングステン酸等を挙げること
ができる。血液サンプルを糖タンパク溶媒で処理
する目的は沈殿性の正常タンパクおよび妨害抗原
物質を除去することにある。沈殿した妨害タンパ
ク物質はついで遠心分離によりサンプルから除去
する。 さらに最近Hirai：Cancer Research37、2267
−2274（1977）およびKimら：Clinical
Chemistry25、773−776（1979）は糖タンパク溶
媒たとえば過クロル酸による抽出の代わりに準備
熱処理を用いるサンプルの前処理法を報告してい
る。後者の文献には、サンプルを酢酸緩衝液でPH
4.8〜5.0に緩衝化し、70℃〜80℃に10〜20分間加
熱して妨害物質を除去するサンプルの調製方法が
記載されている。酸性PHにおける高イオン強度緩
衝液中でのこの熱処理では、加熱により妨害タン
パクが変性し、凝固する。したがつてサンプルを
遠心分離して凝固物質を除去することが必須にな
る。この操作には、サンプル中に存在するCEA
が凝固物質中に捕集され、したがつて試験サンプ
ルから除去されてしまい、以後の定量の精度が損
われる欠点がある。 本発明はCEAの定量分折用ヒト血清または血
漿サンプルの前処置方法を開示するものであり、
本発明は公知の準備方法よりも迅速、容易かつ安
価であつて、サンプルの遠心分離を必要としな
い。 本発明は従来用いられていた方法に比し、迅
速、簡便かつ安価な癌胚抗原（CEA）測定用ヒ
ト血清または血漿サンプルの前処置方法を提供す
る。本発明はサンプルを水で希釈し、そのサンプ
ルのイオン強度およびPHにおいてタンパクが凝固
しない温度、すなわち約85℃から約105℃、好ま
しくは95℃に比較的短時間加熱する方法である。 本発明の前処置方法の加熱工程では、試験する
患者血清または血漿サンプルを約３分から約30分
加熱する。本発明を実施するにあたつて、サンプ
ルを上記温度に保持する時間にはとくに限定はな
い。上記特定温度にサンプルが加熱されることが
必要なだけであつて、保持時間は短時間たとえば
５分から10分でよい。本明細書に示した加熱時間
は例示のために示したのみであつて、サンプルが
所望の温度に加熱され、全サンプルが所望の温度
に達することが保証できる短時間、その温度に保
持されればよい。前述のように、本発明の方法に
よれば、低イオン強度、中性またはわずかにアル
カリ性のPHにおいてタンパクが凝固しない温度に
加熱するのでなければならない。 試験サンプルの水による希釈は、サンプルのイ
オン強度を低値、すなわちたかだか正常の生理的
イオン強度の1/8のイオン強度に保つために必要
である。この希釈工程には水道も使用できるが、
蒸留水または脱イオン水の使用が望ましい。一般
に約１：８から１：50に希釈され、１：16程度が
とくに好ましい。このように希釈されたサンプル
のイオン強度は低く、PHは中性またはわずかにア
ルカリ性、すなわちPH約７から約９である。上述
の希釈範囲においては、サンプルの希釈に緩衝剤
を含んだ水を使用する必要はないことがわかつて
いる。しかしながら、以下の定量の感度を最大に
するためには、サンプルの希釈に用いる水には緩
衝剤を添加し、PHをわずかにアルカリ性に維持す
ることが好ましい。サンプルの希釈に緩衝剤を用
いる場合には、慣用アルカリ緩衝液たとえばトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液が適
当である。緩衝剤はサンプルのPHをわずかにアル
カリ性、すなわちPH約7.5から約9.0に保持するこ
とを保証できる十分量使用する。 従来技術の熱処理法で必要なサンプルの遠心分
離を回避し得たのに加えて、本発明の前処理は従
来法で実用的と考えられていた量よりも少ないサ
ンプル量、すなわち100μでも、以下の定量を
容易に実施できる。たとえば現在一般に行われて
いるCEAの放射免疫定量法では0.5mlのサンプル
が使用される。公知の定量法に比べてCEA定量
用のサンプル量を減少させることができ、しかも
定量法の感度には全く影響がない。さらに、本発
明の前処置法の使用により、定量に要する時間お
よび費用が著しく節減され、CEAの定量を比較
的大規模に、たとえばマススクリーニングを行う
ことが可能になる。本発明の前処置法を採用した
場合、CEAの全定量過程は約４時間で完了する。
一夜透析を必要とする現行のCEA定量法に対し、
著しく改良された点である。しかも本発明の前処
置を行つたのちのCEAの定量では、現行の方法
に比し定量の感度の点できわめて有利である。こ
の点については後述する。 本発明の前処置法は、血漿または血清サンプル
を約１：８から約１：50、好ましくは約１：16に
希釈し、この希釈サンプルをサンプル中に存在す
るタンパクの凝固が起こらない温度すなわち約85
℃から約105℃、好ましくは約95℃に加熱する方
法である。従来、妨害タンパクはサンプル中から
物理的に除去されなければならないと考えられて
いた点を否定したのが本発明の原理であり、この
点で本発明は新規である。 本発明によつて前処置されたサンプルは常温に
もどし、ついで適当なCEA定量法に付すことが
できる。CEAの免疫定量法について、どのよう
な方法を選択するかにはとくに制限はない。一般
に放射免疫法または酵素免疫法が好ましく、とく
に放射免疫が好ましい。 一般に、CEAの定量は次のように行われる。 (a) 患者の血清または血漿サンプルを上述のよう
に前処理して強力な妨害物質を中和する。 (b) 試験サンプルに過剰のCEAに対する抗体を
加え、あらかじめ定められた時間インキユベー
トする。 (c) 標識CEAをサンプルに加え、あらかじめ定
められた時間インキユベートする。 (d) (b)と(c)の混合物に不溶化剤を加え、抗体結合
CEAを含む固相と非結合CEAを含む液相とを
生成させる。 (e) 固相と液相を分離する。 (f) 固相または液相いずれかの標識量を測定す
る。 (g) 標準曲線と比較してサンプル中に存在する
CEA量を決定する。 上記定量において、妨害物質を「中和する」の
語を用いたが、この語は本発明における処置と同
時に、従来法における妨害物質のサンプルからの
物理的除去をも意味するものである。いずれの場
合もその効果は同一である。すなわち、この語は
妨害物質の免疫学的作用を消失させるの意味であ
る。 前述のように、上記定量においてCEAをラベ
ルするのに用いる標識は、定量分折によく適合す
る任意の免疫学的に適合性ある標識物質、たとえ
ば放射性同位元素、酵素、螢光もしくは化学発光
物質等を使用出きる。酵素および放射性同位元素
標識が好ましく、放射性同位元素はとくに好まし
い。放射免疫定量に慣用される放射性同位元素
中、ヨウ素の同位元素が好ましく、とくに ¹²⁵I
が好ましい。 抗体結合CEAを含む固相および非結合CEAを
含む液相を生成させるのに用いる不溶化剤にはこ
の目的で本技術分野において慣用されている任意
の物質が使用できる。たとえば、ある種の脂肪族
アルコール、イオン交換樹脂および無機塩、なら
びにCEA抗体に対する抗体が、抗体結合CEAを
含有するタンパクの沈殿を生成させる。好ましい
不溶化剤は二次抗体すなわちCEA抗体に対する
抗体の非可動型すなわち非可溶化型である。 上述の二次抗体の非可動化には、免疫学的成分
の非可溶化のために本技術分野で認められている
多くの方法のうち任意の方法が使用できる。たと
えば各種サイズの粒子、ビーズ、ステイツクまた
は支持メジウムのストリツプが使用できる。不溶
化物質として重合性の物質、たとえばスチレンポ
リマーまたはコポリマーを用いる場合には、その
性質に応じて上述の型の２種以上のものを使用で
きる。二次抗体の不溶化にとくに好ましい物質
は、非半融ポリ（ビニリデンフルオライド）であ
り、たとえば微粉末剤型またはフイルムとして用
いられる。抗体は不溶化剤上に物理的に吸着させ
るかまたは本技術分野で慣用される方法で化学的
に結合させることができる。 CEA定量時の配合比率、インキユベーシヨン
時間および温度は、CEAに関する多くの報告か
ら本発明技術分野の熟練者には自明のとおりであ
る。本発明の新規前処置法を用いて放射免疫法で
CEAを定量する場合、現行のCEA定量法に比し
て有意に小容量のサンプルおよび試薬を使用で
き、しかも感度は全く損われないことが明らかに
されている。このため小さい試験管、読み取り装
置を使用するのが便利である。また、本発明の方
法で前処置したサンプルの場合、CEAの定量操
作に使用するCEAに対する抗体の量は約1/5に減
少させることができる。現行のCEA放射免疫定
量法に比較してCEAに対する抗血清の標準化の
頻度を減少させることができるわけであるから、
これが所要時間と費用を大幅に減少させる。本発
明によりサンプルの前処置を行つたのちのCEA
の定量は、現行のCEA放射免疫定量法がCEA約
20nｇ／mlまでしか正確に定量できないという点
でも現行法に比べて優れている。化学療法をモニ
ターする場合には、もつと高濃度のCEAを定量
しなければならない場合がある。このような高濃
度の定量には、他の定量法すなわち直接定量法を
採用する必要があつた。この定量法ではCEA濃
度は最低約40nｇ／mlから正確に定量でき、この
値と現行のCEA放射免疫法での定量限界との間
には約20nｇ／mlのギヤツプが残つてしまう。本
発明の方法によつてサンプルを前処置したのちの
CEAの定量では、CEA濃度約100nｇ／mlまで正
確に定量することができ、これによつて上述のギ
ヤツプはうめられ、同時に定量時間と患者が要す
る費用を低減させることができる。すなわち、濃
度が20nｇ／mlを越えた場合でも、CEAの定量を
二度行う必要はない。 本発明によれば試験サンプルは約0.1mlあれば
十分で、サンプルおよび標準の両者に加える
CEA抗血清も約5μで十分である。抗血清の反
応および、その後の標識CEAとの反応の場合の
好ましいインキユベーシヨン時間は約80分から約
２時間で、90分がとくに好ましい。これらのイン
キユベーシヨンは約45℃で実施される。酵素標識
を使用する場合には、上述の温度で酵素が不安定
であれば、酵素の不活性化を防止するために、イ
ンキユベーシヨン時間および温度を適当に調整す
る必要がある。非可動化二次抗体を不溶化剤とし
て使用する場合は、サンプルは常温で約15分から
約30分、好ましくは約20分インキユベートする。
サンプル中のCEAの定量は常法により標準曲線
と比較して行う。標識の濃度の測定も同様に標識
の種類に応じて常法で実施する。放射性同位元素
を用いた場合はガンマーシンチレーシヨンスペク
トロメーターを使用する。 次に本発明を以下の実施例によつてさらに詳細
に説明する。とくに指示のない限り、温度はすべ
て摂氏で表示する。 例 １ 現行のCEAの定量は次のように行われる。 結腸癌が疑われる患者の血漿（二重法で）サン
プル（0.5ml）を冷1.2モル過塩素酸2.5mlにより、
うずまき型混合機を用い30秒間抽出し、1000×ｇ
で20分間遠心分離した。上澄液を集めて透折袋に
移し、脱イオン水に対し、最低３時間間隔で３回
水を交換して透析した。最終透析液を酢酸アンモ
ニウム緩衝液で処理して、PHを約6.5とした。透
析後、透析袋の内容を試験管に移し、市販CEA
抗血清各25μをうずまき型混合機で混合しなが
ら加えた。試験管を３分間、45℃でインキユベー
トした。各試験管に ¹²⁵I−CEA25μを混合しな
がな加え、45℃で再び30分間インキユベートし
た。計2.5mlのジルコニルホスフエートゲルPH
6.25を各試験管に加え、内容物を1000×ｇで５分
間遠心分離した。上澄液を除去し、５mlの酢酸ア
ンモニウム緩衝液PH6.25を混合しながら加えた。
試験管の内容物を再び前回と同様に遠心分離し、
上澄液を除去した。残つたゲル中の結合 ¹²⁵I−
CEA量をガンマーシンチレーシヨンスペクトロ
メーターで１分間カウントして測定した。 標準阻止曲線は次のようにして作成した。 試験管を対にして準備し、１：10に脱イオン水
で希釈したEDTA緩衝液（PH6.5）5.0mlを加え
た。各対の試験管に標準量のCEAすなわち０、
1.25、3.125、6.25および12.5nｇ／mlCEA活性に
相当する０、10、25、50および100μを加え、
内容物をうずまき型混合機で混合した。ついで試
験管を上述の方法と同様にしてCEAの抗血清お
よび ¹²⁵I−CEAで処理した。各読み取り値から
標準曲線を作成し、患者サンプルについて得られ
た値と比較した。 例 ２ 本発明によつて前処理したサンプルのCEA定
量を以下のとおり実施した。 血漿サンプル（0.1ml）を脱イオン水1.5mlで希
釈し、ボルテツクス型混合機で混合した。試験管
を95℃の水浴に10分間つけたのち取り出し、室温
に放冷した。各試験管に市販CEA抗血清5μを
うずまき型混合機で混合しながら加えた。試験管
を45℃で90分間インキユベートした。各試験管に
¹²⁵I−CEA25μを混合しながら加え、試験管を
45℃で90分間再びインキユベートした。各試験管
に、ポリ（ビニリデンフルオライド）の粒子に吸
着不溶化したCEA抗血清に対する抗体の水懸濁
液500μを加えた。試験管を再び混合し、室温
で20分間インキユベートした。ついでサンプルを
1000×ｇで10分間遠心分離した。上澄液を傾瀉
し、試験管をガンマーシンチレーシヨンスペクト
ロメーターでカウントした。 標準阻止曲線は次のようにして作成した。 試験管を対にし、凍結乾燥ヒト血清を再生し、
脱イオン水1.5mlで希釈した液0.1mlを加えた。試
験管の内容物をうずまき型混合型で混合し、95℃
で10分間インキユベートした。各対の試験管に標
準量のCEAすなわち、０、0.625、1.25、3.125、
6.25および12.5nｇ／mlCEA活性に相当する０、
５、10、25、50および100μを加え、内容物を
うずまき型混合機で混合した。ついで試験管を上
述の方法と同様にしてCEAの抗血清、 ¹²⁵I−
CEAおよび不溶化二次抗体で処理した。各読み
取り値から標準曲線を作成し、患者血漿サンプル
について得られた値と比較した。 第１表は例１の従来法の透析法で得られたサン
プルについての結果、および例２の本発明の方法
で得られたサンプルについての結果である。 第１表の結果は、CEA濃度20nｇ／mlまでは例
１および例２の方法がよく相関し、相関係数は
0.963、勾配は1.03であることを示している。

【表】 例 ３ 例１の方法で定量したサンプルの場合、サンプ
ル中のCEA濃度が20nｇ／mlを越えたときにはこ
のような濃度の場合の従来の測定法にしたがつて
以下のように定量を実施した。 血漿サンプル（50μ）を酢酸アンモニウム緩
衝液（酢酸塩0.01M、PH6.8）５mlを含む試験管
にとつた。各試験管にCEA抗血清25μを加え、
内容物をうずまき型混合機で混合した。試験管を
45℃で30分間インキユベートした。ついで各試験
管に ¹²⁵I−CEA25μを加え、ついで試験管を45
℃で30分間、再びインキユベートした。各試験管
に計2.5mlのジルコニルホスフエートゲルPH6.25
を加え、内容物を1000×ｇで５分間遠心分離し
た。上澄液を除去し、酢酸アンモニウム緩衝液
（PH6.25）５mlを混合しながら加えた。試験管の
内容物を前回と同様に再び遠心分離し、上澄液を
除去した。残つたゲル中の結合 ¹²⁵I−CEAをガ
ンマーシンチレーシヨンカウンタースペクトロメ
ーターで１分間カウントして定量した。 標準阻止曲線は次のようにして作成した。 試験管を対にし、各試験管に0.01M酢酸塩緩衝
液（PH6.8）5.0mlを加えた。各試験管に正常ヒト
血漿50μを加え、内容物を完全に混合した。各
対の試験管に標準量のCEAすなわち０、1.25、
3.125、6.25および12.5nｇ／mlCEA活性に相当す
る０、10、25、50および100μを加え、内容物
をうずまき型混合機で混合した。ついで試験管を
上述の場合と同様にしてCEAに対する抗血清お
よび ¹²⁵I−CEAで処理した。各読み取り値から
標準曲線を作成し、患者血漿サンプルについて得
られた値と比較した。 本発明の例２の方法で同一のサンプルについて
も分折を行い、結果を第２表に比較した。 第２表に示した結果は、本発明の前処置法が
CEA濃度20nｇ／mlを越えても正確な定量値を与
えることを示している。本例において試験サンプ
ルを希釈してCEA濃度を20nｇ／ml以下として、
例１の方法で希釈サンプルについて行つた定量に
よれば、本発明の方法が従来の本例に記述した方
法よりも、高いCEA濃度についてはより正確な
値を与えることを示している。

【表】

【表】

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ １：８から１：50に希釈するのに十分な量の
   水をヒト血清または血漿サンプルに加え、希釈サ
   ンプルを85℃〜105℃の温度に３分から30分加熱
   し、ついでサンプル中の定量妨害物質を中和する
   ことを特徴とする癌胚抗原濃度測定用ヒト血清ま
   たは血漿サンプルの前処置方法。 ２ サンプルを１：16に希釈する特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３ 希釈サンプルを５分から10分加熱する特許請
   求の範囲第１項または第２項のいずれか一つに記
   載の方法。 ４ サンプルを95℃に加熱する特許請求の範囲第
   １項〜第３項のいずれか一つに記載の方法。 ５ サンプルの希釈に使用する水はサンプルのPH
   を7.5から９に緩衝化するのに適当な緩衝液の十
   分量を含有する特許請求の範囲第１項〜第４項の
   いずれか一つに記載の方法。