JPS6243501B2 - - Google Patents
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- JPS6243501B2 JPS6243501B2 JP54021789A JP2178979A JPS6243501B2 JP S6243501 B2 JPS6243501 B2 JP S6243501B2 JP 54021789 A JP54021789 A JP 54021789A JP 2178979 A JP2178979 A JP 2178979A JP S6243501 B2 JPS6243501 B2 JP S6243501B2
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Description
本発明は、心筋梗塞のマーカーとして知られる
アイソザイムLDH1の免疫化学的分析に関してい
る。 アメリカ合衆国特許4046634はLDHアイソザイ
ムを包含するアイソザイムの分析について記載し
ているが、この方法では、イオン交換クロマトグ
ラフイーによりLDH1およびLDH2アイソザイム
の混合物を分離し、それらをWacker LDH法の
ような従来からの技術で検出している。 ドイツ特許2128670はLDHアイソザイムを含む
アイソザイムを分析する方法を記載している。こ
の方法では、試料を大過剰のLDH1またはLDH2
アイソザイムのいずれかに対する特異抗体で処理
して抵原−抗体複合体を定量的に沈殿させてい
る。。沈殿複合体をインキユベートし遠心してか
ら、上清の酵素活性を、Z.Klin.Chemie and
Klin.Biochemie８，658（1970）に記載の方法で
測定している。 Sussman等は、Journal of Biological
Chemistry243160（1968）は、２段階による、ヒ
トアルカリホスフアターゼの各臓器に特異的なア
イソザイムの分析を記載している。第１段階で
は、望むアイソザイムに特異的な抗体と試料とを
反応させて、ついで引続く段階で、抗体―抗原複
合体を、第２の抗体である（抗―γ―グロブリ
ン）と反応させる。遠心したあとの上清について
残存アイソザイム活性を試験する。 ラジオイムノアツセイ法において固体担体上に
固定化された第２の抗体を使用することは、アメ
リカ合衆国特許4048298に記載されている。この
記載によれば、重合体固体担体材料の表面に吸着
させた第２の抗体を使用している。 アメリカ合衆国特許3843443は、フルオルカー
ボン重合体担上に蛋白質を固定する方法を記載し
ている。ここで扱つている蛋白質には抗体も含ま
れそして有利な担体材料はポリビニリデンフルオ
ライド（Kynar）である。 本発明方法では、血清試料のような被験試料
を、LDHアイソザイムのＭサブユニツトたとえ
ばLDH2，LDH3，LDH4およびLDH5のようなＭ
ザブユニツトに対して特異的な可溶性抗体で処理
する。短時間混合しインキユベートしたあとで、
固体相担体材料上に不溶化した第２の抗体を添加
し、この混合物を混合しついで短時間インキユベ
ートする。不溶の抗原―抗体(1)―抗体(2)―固体担
体複合物を遠心し、上清のLDH酵素活性を試験
する。観察される活性は本質的に、もとの試料の
LDH1アイソザイム成分である。 本発明の方法は、アイソザイム分析に従来用い
られていた方法に比して実質的な利点を有する。
この方法は非常に迅速で、高度に正確で、再現性
を有する。LDH1含有上清は、これまでの免疫学
的方法が実質的に数時間を要したのに、数分で調
製されうる。さらに、本発明方法では、他の
LDHアイソザイムよりLDH1をきれいに分離で
き、これは、イオン交換カラム法では達成しえぬ
のである。 本発明で使用するLDHのＭサブユニツトに対
する特異的抗体はこの方面の技術で知られてい
る。たとえば上記引用のドイツ特許2128670をみ
よ。このような抗体については、さらに、J.S.
Burd等Clinica Chimica Acta46，205―216
（1973）およびJ.S.Burd等、Biochimica
Biophysica Acta310，238―247（1973）に記載
されている。 第２の抗体は、特異的な第１の抗体を調製した
動物とは別の動物について、第１の抗体の調製に
用いた動物の血液よりのガンマーグロブリンを用
いて調製する。それで第２の抗体は第１の抗体と
免疫反応性で、それと複合物を形成する。 第２の抗体は、これを不溶性の担体材料に結合
させて不溶化する。適当な担体材料には、水に不
溶の有機重合体物質たとえばセルロースまたは他
の多糖類、ビニル付加重合体または縮合重合体ま
たは重合体性の水不溶性無機物質たとえばガラス
またはケイ素樹脂がある。さらに、第２の抗体
は、固体担体たとえばポリスチレン、ポリプロピ
レン、ポリフルオルエチレンまたはポリビニリデ
ンフルオライドのような固体担体の表面に吸着さ
せうる。固体担体上に第２の抗体を結合さす方法
は、限定されるわけでなく、(1)可溶性の第２の抗
体を不溶性の重合体物質に共有結合により結合さ
す方法；(2)不溶化剤との反応のごとき方法で、可
溶性の第２の抗体を不溶性の重合した形状に変換
すること；(3)架橋されたポリアクリルアミドのよ
うなゲル重合体の孔の中に第２の抗体の粒子を捕
捉させること；(4)不溶性の重合体物質上の物理的
に吸着させる方法がある。 本発明の有利な具体例として、アメリカ合衆国
特許3843443に記載の一般的方法を用いて、活性
化kynar上に吸着させることにより、第２の抗体
を支持する方法がある。 本発明方法を実施例によりさらに説明する。 例 １ 試剤 (a) LDH5に対する抗血清：LDH酵素活性測定の
ためのFisher Diagnostic試薬またはそれに相
当する試薬を用いて精製LDH5アイソザイムの
300―400IU／リツトルを結合する濃度にヤギ
抗LDH5血清を希釈する。抗血清の希釈には、
0.1％NaN3を加えた0.02MトリスPH7.5を使用す
る。 (b) ヤギガンマーグロブリンに対する不溶性抗血
清。 つぎの段階に従つて、やぎガンマーグロブリン
に対する不溶性抗血清（第２の抗体）を調製す
る。出発材料は、Pennwalt社のカ焼していない
Kynar（ビニリデンフルオライド）樹脂紛末、グ
レード301Fである。紛末は、1000mlのイソプロ
パノールについて50グラムのKynarの割合でイソ
プロパノール（２―プロパノール）に分散させ
る。懸濁液は、ついで、Bainkmann Polytrnで、
4000C.P.S.のパルス周波数で５分間ホモジナイズ
する。Kynar―イソプロパノール混合物はつい
で、10リツトルの生理食塩水を含有するシリンダ
ーに移し、かくはん分散させる。ついでKynarを
放置沈降させ、上清の大部分をけいしやして除
く。２度水洗したあとで、Kynarは、メルチオレ
ート（0.01％）添加リン酸塩緩衝生理食塩水（PH
7.0）に再懸濁させ２％Kynar濃度とする。Kynar
は活性化された状態となり、蛋白質を受容しう
る。イソプロパノール活性化Kynarをかくはんし
ながら、Kynar1グラムについて0.5mlのろばの抗
やぎガンマーグロブリン血清を加える。混合物
は、上記と同じパルス周波数でPolytronにより５
分間ふたたびホモジナイズする。懸濁液は室温で
６時間以上連続かくはんし、ついで４度ｃで12時
間以上かくはんする。ここで懸濁液は洗浄しうる
状態となる。それには、1500×ｇで10分間遠遠心
し、0.1％NaN3添加PH7.5 0.02Mトリスヒドロキ
シメチルアミノメタン（Tham）に再懸濁させ
る。これをもう１度くり返し、最終物は、01％
NaN3添加0.02M Tris PH7.5に再懸濁させ、緩衝
液1000mlについてKynar100グラムの割合とす
る。混合物はふたたびかくはんし、Kynar100グ
ラムについて５グラムの割合で牛血清アルブミン
（BSA）を添加する。最後の段階として4000C.P.
S.でPolytronで５分間ホモジナイズする。 ２ 操作法 (a) 患者の血清200μに10μの可溶性ヤギ抗
LDH5血清を加え、うず巻き状にかくはんす
る。５分間放置する。 (b) 200μの不溶性の第２の抗体を加える。こ
の際、不溶性の抗体の懸濁液を使用前に、必ず
よく混合しておく。試剤びんには小型のかくは
ん棒を入れ、抗体添加中にも混合を続ける。第
２の抗体を加えたらうず巻き状にかくはんす
る。５分間放置する。 (c) 約1000ｇで５分間遠心する。 (d) 上清より、従来法によるLDH活性分析に必
要な量を取り出す。同様な分析法を使用する。 ３ 計算 LDH1活性＝上清中の活性×2.05 ４ 評価 LDH1についてのカツト―オフポイントを定め
るために、任意の値を設定する。この値は、用い
る酵素分析法の与える全LDHの正常な範囲に応
じて、それぞれの実験室で異なるであろう。
LDH1（H4）についての正常値の上限を設定する
のにLDH全酵素活性の分析値の正常範囲の上限
の30％の値を取つた。たとえば、Fisher
Diagnostic LDH分析での正常値の範囲（52−
149I.．／ｌ）の上限は149I.．／ｌである。
それで、採用したカツト―オフポイントは、149
の30％、つまり45I.．／ｌである。 LDH1活性が4.5I.．／ｌを超える血清は、心
筋梗塞について陽性とみなした。 臨床試験 心臓疾患を扱う病院より106人の患者の血清を
入手し、LDH1の上昇を調べた。心筋梗塞と診断
された72人すべての患者について、LDH1の上昇
を認めた。しかし、心筋梗塞でない患者34人はす
べて、LDH1の上昇を示さなかつた。45IU／ｌ
を、心筋梗塞の生化学的診断のカツト―オフポイ
ントとした。心筋梗塞の患者のLDH1活性の範囲
は46−470IU／ｌであつた。心筋梗塞でない患者
では９−44IU／ｌであつた。最近、大部分の実
験室では、LDH1／LDH2“フリツプ（flip）”を
電気泳動で測定している。この方法は面倒であ
り、時間がかかる。それとは対照的には本発明の
免疫化学的方法は、単純で迅速である。さらに、
LDH1の上昇の測定は、フリツプによるよりも感
度が高い。72人の心筋梗塞患者のうち59人におい
ては、LDH1の上昇と同じ日にフリツプがおきて
いる。しかし８例では、LDHフリツプは、LDH1
の上昇の翌日に始めておこつている。さらに５人
の患者ではフリツプが認められない。（表１，２
および３をみよ）。
アイソザイムLDH1の免疫化学的分析に関してい
る。 アメリカ合衆国特許4046634はLDHアイソザイ
ムを包含するアイソザイムの分析について記載し
ているが、この方法では、イオン交換クロマトグ
ラフイーによりLDH1およびLDH2アイソザイム
の混合物を分離し、それらをWacker LDH法の
ような従来からの技術で検出している。 ドイツ特許2128670はLDHアイソザイムを含む
アイソザイムを分析する方法を記載している。こ
の方法では、試料を大過剰のLDH1またはLDH2
アイソザイムのいずれかに対する特異抗体で処理
して抵原−抗体複合体を定量的に沈殿させてい
る。。沈殿複合体をインキユベートし遠心してか
ら、上清の酵素活性を、Z.Klin.Chemie and
Klin.Biochemie８，658（1970）に記載の方法で
測定している。 Sussman等は、Journal of Biological
Chemistry243160（1968）は、２段階による、ヒ
トアルカリホスフアターゼの各臓器に特異的なア
イソザイムの分析を記載している。第１段階で
は、望むアイソザイムに特異的な抗体と試料とを
反応させて、ついで引続く段階で、抗体―抗原複
合体を、第２の抗体である（抗―γ―グロブリ
ン）と反応させる。遠心したあとの上清について
残存アイソザイム活性を試験する。 ラジオイムノアツセイ法において固体担体上に
固定化された第２の抗体を使用することは、アメ
リカ合衆国特許4048298に記載されている。この
記載によれば、重合体固体担体材料の表面に吸着
させた第２の抗体を使用している。 アメリカ合衆国特許3843443は、フルオルカー
ボン重合体担上に蛋白質を固定する方法を記載し
ている。ここで扱つている蛋白質には抗体も含ま
れそして有利な担体材料はポリビニリデンフルオ
ライド（Kynar）である。 本発明方法では、血清試料のような被験試料
を、LDHアイソザイムのＭサブユニツトたとえ
ばLDH2，LDH3，LDH4およびLDH5のようなＭ
ザブユニツトに対して特異的な可溶性抗体で処理
する。短時間混合しインキユベートしたあとで、
固体相担体材料上に不溶化した第２の抗体を添加
し、この混合物を混合しついで短時間インキユベ
ートする。不溶の抗原―抗体(1)―抗体(2)―固体担
体複合物を遠心し、上清のLDH酵素活性を試験
する。観察される活性は本質的に、もとの試料の
LDH1アイソザイム成分である。 本発明の方法は、アイソザイム分析に従来用い
られていた方法に比して実質的な利点を有する。
この方法は非常に迅速で、高度に正確で、再現性
を有する。LDH1含有上清は、これまでの免疫学
的方法が実質的に数時間を要したのに、数分で調
製されうる。さらに、本発明方法では、他の
LDHアイソザイムよりLDH1をきれいに分離で
き、これは、イオン交換カラム法では達成しえぬ
のである。 本発明で使用するLDHのＭサブユニツトに対
する特異的抗体はこの方面の技術で知られてい
る。たとえば上記引用のドイツ特許2128670をみ
よ。このような抗体については、さらに、J.S.
Burd等Clinica Chimica Acta46，205―216
（1973）およびJ.S.Burd等、Biochimica
Biophysica Acta310，238―247（1973）に記載
されている。 第２の抗体は、特異的な第１の抗体を調製した
動物とは別の動物について、第１の抗体の調製に
用いた動物の血液よりのガンマーグロブリンを用
いて調製する。それで第２の抗体は第１の抗体と
免疫反応性で、それと複合物を形成する。 第２の抗体は、これを不溶性の担体材料に結合
させて不溶化する。適当な担体材料には、水に不
溶の有機重合体物質たとえばセルロースまたは他
の多糖類、ビニル付加重合体または縮合重合体ま
たは重合体性の水不溶性無機物質たとえばガラス
またはケイ素樹脂がある。さらに、第２の抗体
は、固体担体たとえばポリスチレン、ポリプロピ
レン、ポリフルオルエチレンまたはポリビニリデ
ンフルオライドのような固体担体の表面に吸着さ
せうる。固体担体上に第２の抗体を結合さす方法
は、限定されるわけでなく、(1)可溶性の第２の抗
体を不溶性の重合体物質に共有結合により結合さ
す方法；(2)不溶化剤との反応のごとき方法で、可
溶性の第２の抗体を不溶性の重合した形状に変換
すること；(3)架橋されたポリアクリルアミドのよ
うなゲル重合体の孔の中に第２の抗体の粒子を捕
捉させること；(4)不溶性の重合体物質上の物理的
に吸着させる方法がある。 本発明の有利な具体例として、アメリカ合衆国
特許3843443に記載の一般的方法を用いて、活性
化kynar上に吸着させることにより、第２の抗体
を支持する方法がある。 本発明方法を実施例によりさらに説明する。 例 １ 試剤 (a) LDH5に対する抗血清：LDH酵素活性測定の
ためのFisher Diagnostic試薬またはそれに相
当する試薬を用いて精製LDH5アイソザイムの
300―400IU／リツトルを結合する濃度にヤギ
抗LDH5血清を希釈する。抗血清の希釈には、
0.1％NaN3を加えた0.02MトリスPH7.5を使用す
る。 (b) ヤギガンマーグロブリンに対する不溶性抗血
清。 つぎの段階に従つて、やぎガンマーグロブリン
に対する不溶性抗血清（第２の抗体）を調製す
る。出発材料は、Pennwalt社のカ焼していない
Kynar（ビニリデンフルオライド）樹脂紛末、グ
レード301Fである。紛末は、1000mlのイソプロ
パノールについて50グラムのKynarの割合でイソ
プロパノール（２―プロパノール）に分散させ
る。懸濁液は、ついで、Bainkmann Polytrnで、
4000C.P.S.のパルス周波数で５分間ホモジナイズ
する。Kynar―イソプロパノール混合物はつい
で、10リツトルの生理食塩水を含有するシリンダ
ーに移し、かくはん分散させる。ついでKynarを
放置沈降させ、上清の大部分をけいしやして除
く。２度水洗したあとで、Kynarは、メルチオレ
ート（0.01％）添加リン酸塩緩衝生理食塩水（PH
7.0）に再懸濁させ２％Kynar濃度とする。Kynar
は活性化された状態となり、蛋白質を受容しう
る。イソプロパノール活性化Kynarをかくはんし
ながら、Kynar1グラムについて0.5mlのろばの抗
やぎガンマーグロブリン血清を加える。混合物
は、上記と同じパルス周波数でPolytronにより５
分間ふたたびホモジナイズする。懸濁液は室温で
６時間以上連続かくはんし、ついで４度ｃで12時
間以上かくはんする。ここで懸濁液は洗浄しうる
状態となる。それには、1500×ｇで10分間遠遠心
し、0.1％NaN3添加PH7.5 0.02Mトリスヒドロキ
シメチルアミノメタン（Tham）に再懸濁させ
る。これをもう１度くり返し、最終物は、01％
NaN3添加0.02M Tris PH7.5に再懸濁させ、緩衝
液1000mlについてKynar100グラムの割合とす
る。混合物はふたたびかくはんし、Kynar100グ
ラムについて５グラムの割合で牛血清アルブミン
（BSA）を添加する。最後の段階として4000C.P.
S.でPolytronで５分間ホモジナイズする。 ２ 操作法 (a) 患者の血清200μに10μの可溶性ヤギ抗
LDH5血清を加え、うず巻き状にかくはんす
る。５分間放置する。 (b) 200μの不溶性の第２の抗体を加える。こ
の際、不溶性の抗体の懸濁液を使用前に、必ず
よく混合しておく。試剤びんには小型のかくは
ん棒を入れ、抗体添加中にも混合を続ける。第
２の抗体を加えたらうず巻き状にかくはんす
る。５分間放置する。 (c) 約1000ｇで５分間遠心する。 (d) 上清より、従来法によるLDH活性分析に必
要な量を取り出す。同様な分析法を使用する。 ３ 計算 LDH1活性＝上清中の活性×2.05 ４ 評価 LDH1についてのカツト―オフポイントを定め
るために、任意の値を設定する。この値は、用い
る酵素分析法の与える全LDHの正常な範囲に応
じて、それぞれの実験室で異なるであろう。
LDH1（H4）についての正常値の上限を設定する
のにLDH全酵素活性の分析値の正常範囲の上限
の30％の値を取つた。たとえば、Fisher
Diagnostic LDH分析での正常値の範囲（52−
149I.．／ｌ）の上限は149I.．／ｌである。
それで、採用したカツト―オフポイントは、149
の30％、つまり45I.．／ｌである。 LDH1活性が4.5I.．／ｌを超える血清は、心
筋梗塞について陽性とみなした。 臨床試験 心臓疾患を扱う病院より106人の患者の血清を
入手し、LDH1の上昇を調べた。心筋梗塞と診断
された72人すべての患者について、LDH1の上昇
を認めた。しかし、心筋梗塞でない患者34人はす
べて、LDH1の上昇を示さなかつた。45IU／ｌ
を、心筋梗塞の生化学的診断のカツト―オフポイ
ントとした。心筋梗塞の患者のLDH1活性の範囲
は46−470IU／ｌであつた。心筋梗塞でない患者
では９−44IU／ｌであつた。最近、大部分の実
験室では、LDH1／LDH2“フリツプ（flip）”を
電気泳動で測定している。この方法は面倒であ
り、時間がかかる。それとは対照的には本発明の
免疫化学的方法は、単純で迅速である。さらに、
LDH1の上昇の測定は、フリツプによるよりも感
度が高い。72人の心筋梗塞患者のうち59人におい
ては、LDH1の上昇と同じ日にフリツプがおきて
いる。しかし８例では、LDHフリツプは、LDH1
の上昇の翌日に始めておこつている。さらに５人
の患者ではフリツプが認められない。（表１，２
および３をみよ）。
【表】
【表】
【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (A) LDHアイソザイム類のＭサブユニツト
に対して免疫的に選択性のある第１の抗体で血
清試料を処理し、それにより、該試料中に存在
するLDH2，LDH3，LDH4およびLDH5と抗体
との複合体を生成させ； (B) 上記の第１の抗体を製造するのに用いた動物
種とは別の種の動物に免疫原により生成させた
第２の抗体を固体相担体材料上に不溶化したも
ので、工程(A)の免疫反応生成物を処理し、それ
により、工程(A)の生成物と、不溶化された第２
の抗体とのあいだの免疫反応生成物とし； (C) 工程(B)の反応生成物を上清溶液より分け；そ
して (D) 上清溶液のLDH1活性を分析する、これら
(A)，(B)，(C)、および(D)の工程を組合わせること
からなる、血清試料中のLDH1活性の分析方
法。 ２ 第２の抗体が活性化されたKynar上に不溶化
されている、特許請求の範囲１項記載の方法。 ３ 第１の抗体がやぎの抗LDH5抗体である特許
請求の範囲２項記載の方法。 ４ 第２の抗体が、ろばの抗―やぎガンマーグロ
ブリンである、特許請求の範囲３項記載の方法。 ５ 工程(A)の反応混合物を約５分間混合しインキ
ユベートしてから工程(B)に進む、特許請求の範囲
１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| US05/882,013 US4224406A (en) | 1978-02-27 | 1978-02-27 | Immunochemical LDH1 assay |
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|---|---|
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