DD158202A1 - Verfahren zur gewinnung von immunologisch reinem alpha-fetoprotein - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von immunologisch reinem Alpha-Fetoprotein. Das Ziel der Erfindung ist die oekonomisch vorteilhafte Gewinnung dieser Substanz aus humanem Material. Die Erfindung hat die Aufgabe, Alpha-Fetoprotein in einer Qualitaet zur Verfuegung zu stellen, die fuer die Durchfuehrung von hochempfindlichen immunologischen Messverfahren geeignet ist. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass von humanem Material, insbesondere von Nabelschnurblut und Austauschblut Neugeborener sowie Gewebematerial humaner Feten der Blutkuchen abgetrennt, der Ueberstand einer fraktionierten Salzfaellung und Umpufferung unterworfen sowie das darin befindliche Alpha-Fetoprotein von anderen Proteinen befreit wird. Dies geschieht durch Chromatographie an Cibacronblau F3G-A subsituiertes Sephadex G-100, an dem sich das Alpha-Fetoprotein nicht bindet und durch DEAE-Zellulose, von der das gebundene Alpha-Fetoprotein mittels eines Puffers definierter Ionenstaerke abgeloest wird.
Description
Verfahren zur Gewinnung von immunologisch reinem Alpha-Fetoprotein
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von elektrophoretisch und immunologisch reinem Alpha-Fetoprotein aus humanen Material.«»
Dieses Alpha-Fetoprotein wird verwendet als Antigen.zur Herstellung diagnostischer Meßverfahren auf immunologischer Basis j die für die Diagnose von bestimmten Karzinomen und bei der pränatalen Auffindung fetaler Mißbildungen im Bereic] des Neuralrohres Bedeutung haben*
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Alpha-Fetoprotein ist ein normaler Bestandteil des menschlichen Serums j das allerdings in sehr geringer Konzentration (ca; e 10*"* g/l) vorkommt,,. In der Fetalperiode steigt die Konzentration im Gewebe und im Blut um mehrere Größenordnungen an und liegt bei der Geburt in einer Konzentration um 10 g, im fetalen Blut vor«, Fetale Gewebeproben Cz^B6 Leber) enthalten meistens höhere Konzentrationen dieses Protein* Bei bestimmten Krebserkrankungen steigt die Konzentration im adulten Blut an,. · '
Die Reinigung dieses für analytische Verfahren wichtigen Faktors ist in mehreren Arbeiten beschrieben· So zum Beispiel in J>T:eWu, LeHeWuj AeCeMadsen, BiochemeMed:o 23, 336-349 (198C und in J'eLeIoungs BoA! 0Webb, Anal^Biochem» 88;, 619-623 (1978) Die gegenwärtig benutzten Verfahren bestehen aus 6-8 Präparationsschritten und beruhen vielfach auf der Verwendung von
Anti-Alpha-Fetoprotein für die Iimunadsorbtion als einen für die Reinigung entscheidenden Schnitt neben Ionenaustausch.-' und Gelfiltrationsverfahren und -fraktionierten Salzfällungene Daneben findet die Verwendung von Concanavalin-A-Trägern und von Oibacronblaugelen breite Anwendung· Iminünsorptionstechniken sind sehr kostenaufwendig und er«
• fordern reine Antikörper zur Herstellung von entsprechenden Affinitätsgelen« Ähnliches gilt für den Einsatz immobilisierter Lektine«. ·
Die Nachteile der. beschriebenen Verfahren liegen vor allem in der Verwendung teurer Immunseren und Lektine für die Reinigung und im zeitlichen und apparativen Aufwand bei einer
' oftmals geringen Ausbeute oder nicht genügenden Reinheit . des Proteins« Bei den meisten beschriebenen Methoden ist die Kontrolle der Präparation durch das Messen von Alpha-3?eto~ protein mittels Immunverfahren notwendig, um nach Chromato« graphieschritten die aIpha-fetoproteinhaltigen Proben zu identifizieren«,
Ziel der Erfindung
Das Ziel der Erfindung ist die ökonomisch vorteilhafte Gewinnung von immunologisch reinem Alpha~Petoprotein aus humanen Material·«,·
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, humanes Alpha-Petoprotein in einer solchen Qualität zu gewinnen 9 welches für die Durchführung hochempfindlicher immunologischer Meßverfahren zur quantitativen Bestimmung dieses Parameters in biologischen Flüssigkeiten benötigt wird» Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst , daß von humanem Material·, wie z>B> Nabelschnurblut'j Austauschblut von Neugeborenen sowie fetales Gewebematerial·, ausgegangen wird» ' '
. Nach Abtrennung des Blutkuchens durch Zentrifugetion erfolgt im Überstand eine fraktionierte Salzfällung, die so gestal·- tet' wird 5 das sich das Alpha-Petoprotein im. tiberstand des
UV* F-ftg» g-ffg' ftiinni*
Ansatzes nach der Zentrifugation befindet;β Eine Umpüff erung des Ansatzes auf niedrige·Ionenstärken gelingt durch Gelfiltration an S.ephadex G-25;» Anschließend wird die das Alpha-Fetoprotein enthaltende Fraktion durch drei direkt hintereinander geschaltete Säulen gepumpt, die Cibacronblau F3G-A substituiertes Sephadex G-100 (Beladungsdichte 1O,ug Farbstoff/ mg Trockensubstanz) und DSAE-Zeilulose enthalten« Während das Alpha-Fetoprotein an Cibacronblau F3G-A Sephadex nicht gebunden wird, erfolgt eine Absorption an DEAB-Zellulose«, Die Ablösung wird durch einen Puffer definierter lonenstärke durchgeführt» Eine zusätzliche. Feinreinigung kann durch eine zweite DEAE-ZeIlulose Chromatographie er~ reicht werdend
Die Erfindung soll nachstehend an zwei Ausführungsbeispielen' naher erläutert werden«
Beispiel 1 : .
700 ml Nabelschnurblut oder Austauschblut von Neugeborenen werden nach dem Gerinnungsvorgang bei 5000 Üpm 1 Stunde zentrifugiert. Der Überstand (ca, 300 ml) wird mit 90 g festem Ammoniums, Ulf at portionsweise unter Rühren versetzt, 1-2 Stunden bei Raumtemperatur gelinde nachgerührt und bei 12000 Upm in der Kälte zentrifugiert:. Alle weiteren Operationen werden im Kühlraum bei 4° C ausgeführt. Der tiberstand wird auf eine Sephadex G-25 Säule (0 3»5 cm χ 150 cm) aufgetragen ä±e mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert ist, und gelfiltrierto Die Protein enthaltenen Fraktionen werden,gesammelto Ί00 ml umgepufferte Proteinlösung v/erden auf eine Säule (0 5 cm χ 50 cm)', die Cibacronblau F3G-A substituiertes Sepha ;dex G-IOO Gel (Beladungsdichte ca:» 10 Ug Farbstoff/mg Trockensubstanz) enthält, aufgetragen und mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7jO) eluiert» Alpha-Fetoprotein wird nicht gebunden und passiert die Säule· Die Alpha-Fetoprotein enthaltenen Fraktionen werden gesammelt und auf eine zweite Cibacronblau-Sephadex G-100 Säule (0 5 cmx.20 cm) gleicher Charge aufgetragen, dessen Eluat direkt auf eine
dritte Säule .(0 2 cm χ 10 cm) , die mit DBAS~Zellulose gefüllt ist, aufgetragen wird;« Die Gesamtmenge der alpha-proteinhaltigen Fraktionen, die auf diese kombinierten Säulen aufgetragen v/erden kann, beträgt ca« 1000 ml·« Die beiden Säulen werden mit 300 ml 20 -rnM Phosphatpuffer (pH 7jO) gespült ο Anschließend wird die DEAE«"Zellulose Säule mit 100 ml 20 mM Phosphatpuff er (pH 6,5) gespült und das Alpha-Fetoprotein mit 100 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,0) abgelöst, . . ν
Zur Feinreinigung wird die alpha-fetoproteinhaltige Fraktion mit der doppelten Menge aq.ua bidest« verdünnt und auf eine DEAE-Zellulose Säule (0 1 cm χ 10 cm) aufgetragen^ Die Säule wird anschließend mit 50 mlvl Phosphatpuff er (pH 6,5) gewaschen» Anschließend wird das Alpha-Fetoprotein mit Hilfe eines Salzgradienten (50 mM - 200 mM Phosphatpuffer, pH" 7,0) abgelöst:«
Die alpha-f et oprot einhaltigen Fraktionen werden durch Ultrafiltration eingeengte "
Beispiel 2 :
Etwa 800 ml Gewebsflüssigkeit einer Interruptio v/ird nach dem Gerinnungsvorgang des in ihr enthaltenen Blutes bei 5000 Upm 1 Stunde zentrifugierte Der Überstand wird gemäß Beispiel Λ weiterverarbeiten«,
Claims (1)
- Er f indungs a nspr üc he ·% Verfahren zur Gewinnung von immunologisch reinem Alpha-F-etoprotein aas humanen Material, dadurch gekennzeichnet d*aß nach Abtrennung des Blutkuchens durch Zentrifugation der Überstand, welcher das Alpha-Fetoprotein enthält, einer fraktionierten Salzfällung bei einer Einwirkungszeit von 1-2 Stunden unterworfen wird, daß sich das danach im Überstand befindliche Alpha-Fetoprotein an äquilibrierten Sephadex G-25 auf niedrige Ionenstärken umgepuffert wird, daß das Alpha-Fetoprotein enthaltene Serum über drei direkt hintereinander geschalbene Säulen, die Cibacronblau P3G-A substituiertes Sephadex G-100 und DSA' "' zellulöse enthalten, gegeben wird und daß Alpha-Fetoprotein an DEAE-ZeIlulose adsorbiert und mittels eines Puffers definierter Ionenstärke wieder abgelöst wird,2· Verfahren nach Punkt I5 dadurch gekennzeichnet, daß als . humanes Material Nabelschnurblut und Austauschblut von ikterischen Neugeborenen sowie fetales Gewebematerial dient,e Verfahren nach Punkt Λ und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Cibacronblau F3G-A substituiertes Sephadex G-100 .Gel verwendet wird, welches eine Beladungsdichte von caie 10 /Ug Farbstoff/mg Trockensubstanz besitzt und an dem Alpha-Petoprotein nicht gebunden wird»4;· Verfahren nach Punkt 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Vorreinigung des Alpha-Fetoprotein enthaltenen Materials durch eine fraktionierte Salzfällung mit Ammoniumsulfat erfolgt;»
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD22924581A DD158202A1 (de) | 1981-04-15 | 1981-04-15 | Verfahren zur gewinnung von immunologisch reinem alpha-fetoprotein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD22924581A DD158202A1 (de) | 1981-04-15 | 1981-04-15 | Verfahren zur gewinnung von immunologisch reinem alpha-fetoprotein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD158202A1 true DD158202A1 (de) | 1983-01-05 |
Family
ID=5530366
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD22924581A DD158202A1 (de) | 1981-04-15 | 1981-04-15 | Verfahren zur gewinnung von immunologisch reinem alpha-fetoprotein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD158202A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4656025A (en) * | 1985-04-19 | 1987-04-07 | Emmanuel Deutsch | Quantitative screening assay of tumor globulin from gastric juice |
-
1981
- 1981-04-15 DD DD22924581A patent/DD158202A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4656025A (en) * | 1985-04-19 | 1987-04-07 | Emmanuel Deutsch | Quantitative screening assay of tumor globulin from gastric juice |
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