DE1798285A1

DE1798285A1 - Neues Mittel und Verfahren zur Lipasebestimmung

Info

Publication number: DE1798285A1
Application number: DE19681798285
Authority: DE
Inventors: Arnold Dr Haertel; Roland Dr Helger; Hermann Dr Lang
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1968-09-20
Filing date: 1968-09-20
Publication date: 1972-01-20
Also published as: GB1247449A; IL32910A; FR2022180A1; NL6913769A; SE372631B; JPS5542703B1; DE1798285B2; DE1943454A1; BE738960A; CH506792A; US3689364A; IL32910A0

Description

Darmstadt ^1o· August 197ο

Neues Mittel und Verfahren zur LipasebeStimmung

Lipasen sind Enzyme, die Fette und Öle in Glyceride und Fettsäuren spalten. Sie sind im tierischen Organismus weit verbreitet. Besonders hohe Konzentrationen findet man in der Leber und im Pankreassekret, das im Dünndarm die Nahrungsfette verdaut. Bei Erkrankungen des Pankreas tritt Lipase in die Blutbahn über. Deshalb ist die Bestimmung der Lipase im Serum ein wichtiges diagnostisches Hilfsmittel zur Erkennung von Pankreaserkrankungen.

Nach den bekannten Verfahren wird die Lipase dadurch bestimmt, daß ein Überschuß eines Lipasesubstrats vorgelegt und die hieraus durch die Lipase freigesetzte Mettge Fettsäure durch Titration mit Alkali unter Verwendung eines Indikators oder durch Extraktion der Kupfersalze gemessen wird. Als Indikatoren werden für die Titrationsbestimmungen nach den bekannten Verfahren Thymolphthalein bzw. Phenolphthalein verwendet (Deutsche Medizinische Wochenschrift, Band 90, Seite 1170 (1965) und Analytical Biochemistry, Band β, Seite 451 (1963))· Als Substrat wird im allgemeinen eine Öl-in-Wasser-Emulsion eingesetzt. Die genaue Bestimmung der Lipase nach diesen Verfahren ist jedoch mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden, die einer breiten Anwendung im Kliniklaboratorium entgegenstehen. Das Substrat läßt sich nicht leicht handhaben und macht eine photometrische Messung im Durchlicht wegen der Trübung unmöglich. Ferner ist sehr nachteilig, daß die zu bestimmende Säuremenge äußerst gering ist. Zum Beispiel erhält man selbst beim Einsatz von 1 ml Serum bei 10 Minuten Inkubation im Normalfall größenordnungsmäßig nur 0,0005 mMol Säure entsprechend einem Verbrauch von 0,005 ml 0,1 N Natronlauge bei der Titration. Deshalb ist man auf sehr kostspielige Mikrotitrierautomaten angewiesen, mit denen Serienfleue Unterlagen (απ. τ f 1 au. 2 Nr. ι s«b 8 4«Xnd«rung«_e··. v. 4.u.:-»;

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Untersuchungen nicht durchführbar sind. Sofern keine Mikrotitrierautomaten zur Verfügung stehen, muß man bei Verwendung von Farbindikatoren zur Titration sehr lange Inkubationszeiten, relativ große Serummengen und ungenaue Ergebnisse in Kauf nehmen.

Wegen dieser Schwierigkeiten begnügt man sich in der Praxis häufig mit einer Esterase-Bestimmung, d.h. man verwendet einen löslichen Ester niederer Kettenlänge als Substrat, der gut definiert ist, jedoch andererseits nicht nur von der Lipase, sondern auch von anderen im Serum enthaltenen Esterasen hydrolysiert wird. (Vgl. Ärztliches Labor, Band 13, 157 (1967)). Die Verwendung eines solchen löslichen Esters ist bei der Lipase-BeStimmung in angereicherten Enzym-Präparaten zulässig, nicht aber im Serum, da im Serum die Lipase-Konzentration nur sehr gering ist (Normalbereich bis 0,1 U/ml) und daneben viele andere Esterasen in zum Teil hnhen Konzentrationen vorliegen. Deshalb mußten bisher für die Bestimmung der sogenannten "echten Lipase" die oben aligeführten mit großen Nachteilen behafteten Verfahren angewandt werden.

Es wurde nun gefunden, daß bei Verwendung bestimmter pH-Indikatoren die genannten Schwierigkeiten bei der Lipasebestimmung mit Hilfe einer Öl/Wasser-Emulsion weitgehend vermieden werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Mittel zur Bestimmung von Lipase in Körperflüssigkeiten mit wäßrigen Fett- bzw. Ölemulsionen und pH-Farbindikatoren, das dadurch charakterisiert ist, daß als Farbindikator m-Kresolpurpur und/ oder p-Xylenolsulphophthalein und/oder Dibromthymolsulphophthalein und/oder Thymolsulphophthalein und/oder ot-Naphtholphthalein enthalten ist.

Außerdem umfaßt der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Lipasebestimmung in Körperflüseigkeiten mit wäßrigen Fett- bzw. Ölemulsionen und pH-Farbindikatoren, das darin besteht, daß man der zu untersuchenden Probe das vorstehend definierte und im folgenden näher beschriebene Mittel zusetzt und die während der Inkubationszeit eingetretene Farbänderung bestimmt.

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Besonders vorteilhaft ist, daß in dem neuen Verfahren nur eine sehr geringe Menge der zu bestimmenden Probe (ca. 0,2 ml bei einer liormalbe Stimmung bzw. 0,02 ml für eine Mikrobe Stimmung) benötigt wird. Ferner bietet das neue Mittel bzw. Verfahren den Vorteil, daß - im Gegensatz zu den mit bekannten Mitteln und itn Titrator arbeitenden Verfahren - keine aufwendigen Apparaturen und kein hierfür geschultes Personal erforderlich sind und daß das neue Verfahren - im Vergleich zu den bekannten Verfahren, bei denen unter Verwendung von Indikatoren die durch die Lipase freigesetzte Säuremenge durch Titration bestimmt werden muß erheblich rascher durchgeführt werden kann. Außerdem wird eine inelirfaohe Pipettierung, wie sie für die bekannten Verfahren erforderlich ist, durch Anwendung des neuen Mittels vermieden. Ein weiterer Vorteil ist die hohe Spezifität und Genauigkeit der LipasebeStimmung mit dem Mittel nach der Erfindung,

Lie s- ir guten Ergebnisse bei einfacher Handhabung des neuen Xituel.j waren aufgrund des Standes der^vTechnik nicht vorauszu-3iI'.5E-Da Substrat und Indikator der Einwirkung der Lipase in -iner .--iweißhaltigen Lösung ausgesetzt sind, war mit einer Ver-L-.;nie": ',ing des Umschlagbereiches für die nach der Erfindung ein- ;.M;iet\: bz^cn Farbindikatoren zu rechnen. Ferner ist bekannt, daß ■l-y.: Γ;·. ;:.hlagbereich des Indikators sich im allgemeinen in einer ?:vsii;.altigen Lösung nicht nur verschiebt, sondern meist auch verbreitert, so daß genaue pH-Ablesungen erschwert sind. Außeririu \v .'d eine solche Verbreiterung des Umschlagbereiches auch Uroi: :usatz von emulsionsstabilisierenden Stoffen, wie z.B. j-mioii .-.rabicum, hervorgerufen. Sofern ein Zusatz nicht völlig fircl:. .ist, wie es z.B. bei Gummi arabicum der Fall ist, wird a ;^ = i ^: :.. die Farbablesung erschwert. Aufgrund dieser Unsicherh\;i tsfaktoren sind die guten Meßergebnisse, die mit dem neuen 'Mittel au erzielen sind, als überraschend anzusehen.

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«AbORiÖirNAL

Im folgenden wird die Zusammensetzung des Mittels nach der Erfindung im einzelnen beschrieben:

Unter den oben aufgeführten Farbindikatoren, die in dem Mittel nach der Erfindung enthalten sind, ist das m-Kresolpurpur bzw. das p-Xylenolsulphophthalein bevorzugt. Die Indikatoren zeigen einen scharfen Farbumschlag, beispielsweise m-Kresolpurpur von violett nach gelb und p-Xylenolsulphophthalein von blau nach gelb. Bei der Herstellung des Mittels nach der Erfindung wird das pH der Lösung zweckmäßigerweise so eingestellt, daß der Farbumschlag schon durch Zugabe einer minimalen Menge Säure auftritt. Beispielsweise stellt man bei Verwendung von m-Kresolpurpur auf einen braunstichigen Violett-Ton, bei Verwendung von p-Xylenolsulphophthalein auf einen braunstichigen blauen Farbton ein. Die Einstellung des gewünschten pH führt man vorteilhaft durch, indem man eine alkalische Lösung des Indikators, s.B. eine Lösung des m-Kresolpurpur 'oder p-Xylenolsulphophthalein, in verdünnter, beispielsweise 0,1 N,Natronlauge der Emulsion zufügt und anschließend eine Säure, z.B. verdünnte Salzsäure oder eine andere verdünnte Mineralsäure, zusetzt, bis der gewünschte Farbton erreicht ist. Grundsätzlich kann man den Indikator auch in wäßriger Säure, z.B. als Suspension oder als Lösung, zusetzen und anschließend durch Zusatz von Alkali, z.B. von verdünnter Natronlauge, den gewünschten Farbton einstellen. Im allgemeinen ist jedoch wegen der besseren Löslichkeit der Zusatz des Indikators in alkalischer Lösung vorzuziehen. Sofern das Mittel über längere Zeit vor der Lipasebestimmung aufbewahrt wird, empfiehlt es sich, zur Erhöhung der Haltbarkeit den Indikator erst kurz vor Gebrauch der Emulsion zuzusetzen. In diesem Fall stellt man die Emulsion mit einem vorzugweise neutralen bzw. nur schwach alkalischen bzw. schwach sauren pH zunächst ohne Indikator und getrennt hiervon eine alkalische Indikatorlösung her. Beide Lösungen sind sehr gut auch über längere Zeit haltbar. Der Indikator ist in der gebrauchsfertigen Emulsion in einer Konzentration von etwa 0,001 bis 1 #, vorzugsweise 0,05 "bis 0,2 %, bezogen auf das Gewicht der gesamten Emulsion, enthalten.

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Vorzugsweise enthält der Farbindikator im Mittel nach der Erfindung eine der o"ben aufgeführten Verbindungen (m-Kresolpurpur, p-Xylenolsulphophthalein, Mbromthymolsulphophthalein, Thyiftol sulpho phthalein oder o(-Naphtholphthal ein). Gegebenenfalls kann der Indikator jedoch auch aus einem Gemisch von 2 oder mehreren dieser Verbindungen bestehen. Insbesondere kann es in manchen Fällen zwedmäßig sein, neben einem Hauptindikäor, z.B. m-Kresolpurpur oder p-Xylenolblau, einen weiteren der vorstehend genannten Indikatoren in geringer Konzentration zur genauen Einstellung der für den Umschlagsbereich gewünschten Farbnuance des Mittels nach der Erfindung anzuwenden. Eine solche Einstellung kann z.B. erforderlich sein, wenn zur besseren Vergleichsmöglichkeit mit einer vorgedruckten Farbskala der Farbton des Hauptindikators verschoben werden soll. Beispielsweise kann durch Zusatz einer geringen Menge des' im alkalischen Bereich blauen öl-Naphtholphthalein zu einer als ^Hauptbestandteil des Farbindikators verwendeten Verbindung, wie m-Kresolpurpur oder p-Xylenolsulphophthalein, der Farbton des Mittels im alkalischen Bereich insgesamt nach blau verschoben werden.

Gegebenenfalls können auch derartige Farbverschiebungen in dem Mittel nach der Erfindung durch Zusatz von geringen Mengen anderer als der oben aufgeführten Farbindikatoren, z.B./l)iphenolpurpur (Rotverschiebung besonders im neutralen Bereich bei Verwendung von m-Kresolpurpur als Hauptbestandteil des Farbindikators) oder in manchen Fällen auch durch Zusatz geringer Mengen einer anderen farbigen Verbindung, wie Carotin, mit dem ein gelber Farbton erhalten wird, erzielt werden. Diese Verbindungen werden z.B. in einer Konzentration bis zu 0,05 i° (bezogen auf die Emulsion) zugesetzt.

/durch Zusatz von

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Als Iipasesubstrat enthält das Mittel nach der Erfindung natürliche oder synthetische Ester von Fettsäuren, insbesondere Fe ttsäureglycerinester. Allgemein sind Triglyceride oder gegebenenfalls auch Diglyceride von Fettsäuren, wie Palmitin-, Stearin-, Öl-, Linol- oder Laurylsäure, zu verwenden. So sind natürliche Öle und Fette, z.B. auch Cocosfett, als Lipasesubstrat für das Mittel nach der Erfindung geeignet. Besonders bevorzugt ist Olivenöl. Es empfiehlt sich, aus den Ölen und Fetten vor der Verwendung als Lipasesubstrat die freien Fettsäuren, beispielsweise durch chromatographische Reinigung des Öles oder Fetts über einem basischen Adsorptionsmittel wie Aluminiumoxid, zu entfernen. Gegebenenfalls können die Öle und Fette auch anderweitig gereinigt oder auch hydriert werden. Beispielsweise ist hydriertes Rapsöl als Lipasesubstrat ebenfalls geeignet.

Zur Erhöhung der Haltbarkeit der Emulsion enthält das Mittel der Erfindung einen emulsionsstabilisierenden Zusatz. Dieser Zusatz kann aus einer oder mehreren Verbindungen der im folgenden beschriebenen Stoffgruppen bestehen.

Als emulsionsstabilisierender Zusatz haben sich vor allem Verbindungen mit Schutzkolloidwirkung, insbesondere Gummi arabicum, bewährt. Gegebenenfalls kann auch Polyvinylpyrrolidon als Schutzkolloid eingesetzt werden. Die Emulsionsstabilisatoren mit Schutzkolloidwirkung, insbesondere das Gummi arabicum, sind in der Emulsion in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 30 %, vorzugsweise 10 - 25 %, enthalten. Neben der Schutzkolloidwirkung übt das Gummi arabicum einen aktivierenden Einfluß auf die Lipase aus.

Ferner können im Mittel nach der Erfindung auch die üblichen Emulgatoren für Öl- bzw. Fett/Wasser-Emulsionen, wie z.B. PoIyäthylenglykol-Fettalkoholäther, Polyäthylenglykolalkylphenoläther, Sulfonsäuresalze/"^ z.B. Isopropylnaphthalinsulfonsäuresalze, oder Cetyl-stearylschwefelsäureester, zur Stabilisierung der Emulsion enthalten sein. Die Konzentration dieser Emulgatoren liegt beispielsweise bei bis zu 20 #, vorzugsweise bis zu 1 fo.
/oder Schwefelsäureester

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Als weiterer Zusatz, der die Emulsion stabilisiert und gleichseitig aktivierend auf die zu messende Lipase im Fall einer PankreaslipasebeStimmung wirkt, können Salze von Gallensäuren, 2,3. Alkalicholate, -desoxycholate, -taurocholate, -glykocholate u.a. Gallensäurensalze, im Mittel der Erfindung enthalten sein. Diese Salze werden in einer Konzentration bis zu etwa 2 $, insbesondere bis zu 0,5 io angewandt.

Als weiterer geeigneter Zusatz kann die Emulsion zur Stabilisierung Stoffe enthalten, die das Absetzen verhindern, beispielsweise die Geliermittel auf Montmorillonit-Basis, insbesondere Erdallali- oder quartäre Ammoniumsalze von Montmorillonit-Fettsaurer*. Z.B. können insbesondere die üblicherweise als Emulsionsstabilisatoren für Öl-in-Wasser-Systeme angewandten feinstverteiltf-n Magnesium-montmorillonite von einer Dichte von 2,4 g/cm und einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 6 fo oder ein Dimethylaloctadecyl-ammonium-Montmorillonit voi\ einer Dichte von ■■ ,30 e/cm und einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 3 % als Z-isa.t,z für die Emulsion nach der Erfindung verwendet werden. Diese Antiabsetzmittel werden in einer Konzentration bis zu etwa 3 tfo, insbesondere bis zu 1 $, angewandt.

Έirn.e-.-j kann das Mittel der Erfindung emulsionsstabilisierende Stoffe- enthalten, die die Viskosität von Emulsionen bei niedrigen Temperaturen erhöhen. Hierfür kommen z.B. gelbildende, höherrDölex.iare Verbindungen, die von Esterasen nicht gespalten werden, 1": Irr.ν£Θ. Insbesondere Agar hat sich als Zusatz zur Erhöhung der v,.^kc-Jität und damit zur Stabilisierung der Emulsion bewährt.

Au,is~:λ&Ιι! kann das Mittel der vorliegenden Erfindung zur Verhinüorur._e; einer Autoxydation und der hierdurch bedingten Entmischung der .Emulsion, reduzierende Verbindungen, insbesondere Mercaptoä:-.iar_;l taw. Cystein, in Konzentrationen bis zu etwa 1 #, vor- ζν..ρ:%:..■ iss bis zu 0,05 %_t enthalten.

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Das Mittel nach der Erfindung kann zur Stabilisierung der Emulsion auch Mostatische Stoffe enthalten, die die Einwirkung von. Mikroorganismen auf das verwendete Substrat verhindern. Hierfür kommen beispielsweise quecksilberorganische Verbindungen, wie p-Chlormercuribenzoat, Phenylquecksilberacetat, Äthylmercuri-· thiobenz-3>4-oxazol-1-carbonsäure bzw. deren Natriumsalz, Äthylquecksilberthiosalicylate, Äthylquecksilberthiophenolsulfonsauren, Jodacetate und/oder Azide in Präge. Bevorzugt werden hierfür Natrium-Jodacetat und Natriumäthylmercurithiosalicylat eingesetzt. Die biostatischen Stoffe sind vorzugsweise in einer Konzentration bis zu etwa 1 $, insbesondere in einer Konzentration bis zu etwa 0,1 %, enthalten.

In dem Mittel nach der Erfindung ist als emulsionsstabilisierender Zusatz mindestens eine Verbindung aus den vorstehend aufgeführten Stoffklassen enthalten. Vorzugsweise ist als Emulsionsstabilisator Gummi arabicum enthalten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind biostatische Stoffe, gegebenenfalls zusammen mit Gummi arabicum, als emulsionsstabilisierende Zusätze enthalten. Allgemein sind Emulsionsstabilisatoren besonders geeignet, die durch Esterasen, insbesondere durch andere Esterasen als Lipase, im schwach alkalischen Bereich nicht verändert werden.

Bei der Zubereitung des Mittels nach der Erfindung wird im allgemeinen eine Lösung mindestens einer emulsionsstabilisierenden Verbindung, z.B. von Gummi arabicum, in Wasser vorgelegt. In manchen Fällen ist es zweckmäßig, diese Lösung vor der Zubereitung der Emulsion zu filtrieren oder zu zentrifugieren, um Rückstände aus den Zusätzen, z.B. aus dem Gummi arabicum, zu entfernen. Anschließend wird durch Zugabe des Substrats, z.B. des Olivenöls, unter Turbinieren die Emulsion gebildet. Die weiteren für das Mittel verwendeten Zusätze, z.B. weitere emulsionsstabilisierende, insbesondere biostatische Stoffe, können der Mischung vor oder nach Zugabe des Substrats beigemengt werden.

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Der Indikator kann zweckmäßigerweise in Form einer Lösung der Emulsion zugefügt werden. Man erhält so die gebrauchsfertige Emulsion. Man kann auch den Indikator getrennt von der Emulsion in Form einer Lösung aufbewahren und erst vor der jeweiligen Lipasebestimmung der Emulsion zufügen. Diese Ausführungsform des Mittels nach der Erfindung ist bevorzugt, wenn eine lange Haltbarkeit erforderlich ist.

Insbesondere günstig ist es, die Öl/Wasser-Emulsion in der jeweils für eine Lipasebestimmung erforderlichen Menge in einem geeigneten Behälter, vorzugsweise in einer Kunststoffküvette mit insbesondere rechteckiger Grundfläche, abzufüllen. Gegebenenfalls kann auch hierbei der erforderliche Indikator getrennt von der Emulsion in einer gesonderten Lösung bereitgestellt werden. Die abgefüllte Menge der Emulsion wird hierbei so bemessen, daß sie für eine Lipasebestimmung ausreicht. Z.B. werden in dieser Ausführungsform jeweils 1 oder 2 ml Emulsion in die Küvette abgefüllt. In der gegebenenfalls von der Emulsion getrennten Indikatorlösung wird die Konzentration des Indikators zweckmäßigerweise so eingestellt, daß ein einfach abzumessender aliquoter Teil, beispielsweise ein Tropfen, der Indikatorlösung der vorab bereitgestellten Öl/Wasser-Emulsion, z.B. in der Kunststoff küvette , für eine Bestimmung zugefügt wird. Eine Öl/Wasser-Emulsion, die den Indikator enthält, ist etwa 4 Wochen haltbar, wobei sich ein Umschütteln der Emulsion vor dem Gebrauch empfiehlt.

Das Verfahren zur Lipasebestimmung mit dem Mittel nach der Erfindung wird durchgeführt, indem das vorstehend beschriebene Mittel mit der zu untersuchenden Lipase-haltigen Probe vereinigt wird und die während der Inkubationszeit eingetretene Farbänderung des Indikators bestimmt wird. Man gibt hiarzu ein kleines abgemessenes Volumen, vorzugsweise 0,1 ml, der zu untersuchenden Körperflüssigkeit, z.B. des Serums bzw. Plasmas, in ein abgemessenes Volumen, z.B. 1 ml, der gebrauchsfertigen Emulsion. Hierauf wird wie üblich durchgemischt und die Farbänderung ge-

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messen. Die Farbänderung kann durch Vergleich des jeweiligen Farbtons der Mischung mit dem entsprechenden Farbton auf einer geeichten Farbskala oder einem geeichten Farbband gemessen werden. Hierzu wird z.B. die auf der Farbskala bzw. dem Farbband abgelesene Eichzahl für den F_arbton, der unmittelbar nach Zugabe der Probe zu der Emulsion vorliegt, aufgezeichnet. Anschließend läßt man den Ansatz für eine bestimmte Inkubationszeit, z.B. 1 Stunde lang, vorzugsweise bei einer Standardtemperatur, z.B. Zimmertemperatur oder 37 C, stehen und liest erneut die dem jetzt entstandenen Farbton zugeordnete Zahl auf der geeichten Farbskala bzw. dem geeichten Farbband ab. Die Differenz ergibt den Lipasegehalt in den der Farbskala- bzw. Farbband- w eichung zugrundeliegenden Einheiten.

Eine bei der Messung verwendete geeichte Farbskala bzw. ein geeichtes Farbband kann, wie im französischen Patent 1 516 492 beschrieben, hergestellt werden. Für die Eichung der Skala bzw. des Bandes wird der Zeitabschnitt zugrundegelegt, der bei der nachfolgenden LipasebeStimmung für die Inkubation angewandt wird, z.B. 1 Stunde.

In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung wird die Farbänderung durch Vergleich der untersuchten Proben untereinander nach der Inkubationszeit von z.B. einer ^ Stunde bestimmt. Bei dieser Methode wird der - nach der Inkubationszeit nahezu unveränderte - Farbton von Proben mit normalem Lipasegehalt als Standard benutzt. Diese Durchführung der Lipasebestimmung nach der Erfindung ist insbesondere für Serienanalysen geeignet,' da meist über 90 % der in den Kliniken untersuchten Blutseren normalen Lipasegehalt aufweisen und damit als Standard dienen können. Die wenigen Proben mit pathologisch erhöhtem Lipasegehalt erkennt man dann an einem nach der Inkubationszeit von der nahezu unveränderten Farbe der Mehrzahl der untersuchten Proben abweichenden Farbton. Bei Verwendung der Indikatoren m-Kresolpurpur oder p-Xylenolsulphophthalein zeigen die pathologischen Proben eine hellbraune bis hellgelbe Farbe. Sofern eine genauere Bestimmung erforderlich ist, können die als pathologisch erkannten Proben nochmals durch Vergleich mit dem geeichten Farbband bzw. der geeichten Farbskala genauer gemessen werden.

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Im folgenden werden zur Erläuterung einige Beispiele fur das Mittel nach, der vorliegenden Erfindung gegeben:

Beispiel 1

Zu 480 ml Wasser werden im Mischgerät bei hoher Drehzahl 30 mg Äthylquecksilberthiosalicylat und 90 mg Gummi arabicum zugefügt.

Anschließend wird die Mischung durch Zusatz von 2 N wäßriger Natronlauge auf pH 10 eingestellt. Hierauf wird zentrifugiert und der Überstand zur Entfernung von Verunreinigungen durch einen. Wattebausch filtriert. Das Piltrat wird danach im Mischgerät bei hoher Drehzahl mit 120 ml Olivenöl (gereinigt über bast Rf^ ein Aluminiumoxid) versetzt.

Anschließend wird erneut 5 Minuten gemischt und mit 600 mg m-Kresolpurpur, gelöst in 60 ml 0,1 N Natronlauge, versetzt.

Durch. Susatz verdünnter Säure, z.B. verdünnter Salzsäure, wird das pH der Mischung auf 8,8 (Farbe: braunstichiges Violett) eingestellt.

Uie so hergestellte Emulsion wird entweder direkt zur Lipasebe~ Stimmung eingesetzt oder vorteilhafterweise maschinell zu je 1 ml in verschließbare Kunststoffküvetten abgefüllt. Der Inhalt einer Kunststoffküvette wird dann jeweils für eine lipasebeverwendet.

I;j.Ue raulsion wird analog der Vorschrift in Beispiel 1 herge- ·?-*:■« 11 ~, jedoch wird kein Indikator zugesetzt und das pH auf 7;0 eingestellt. Getrennt von der^Cüvetten zu je 2 ml abgefüllten Smtilfc.--3ϊΐ werden eine 1 folge Lösung von m-Kresolpurpur in 0,055 ?? ?3/ir;nlauge, eine 0,02 N Natronlauge und eine 0,02 N Salzsäure-Icsui-i "bereitgestellt. Die 0,02 N Natronlauge bzw. Salzsäure j.rirai , .ir Regulierung eines nach längerer Lagerzeit veränderten -yÄ d-... l-alsion verwendet werden.

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Beispiel 3

In Analogie zu Beispiel 1 wird aus folgenden Komponenten eine gebrauchsfertige Emulsion hergestellt:

80 ml Wasser
20 mg Natriumjodacetat
10 g Gummi arabicum
0,2 g Agar
15 ml Olivenöl
80 mg p-Xylenolblau

A Die Farbe der Emulsion wird auf ein braunstichiges Blau durch Zugabe von verdünnter Natronlauge bzw. Salzsäure eingestellt.

Das so hergestellte Mittel kann, wie in Beispiel A beschrieben, zur LipasebeStimmung eingesetzt werden.

Beispiel 4

Analog Beispiel 3 wird eine Emulsion, jedoch ohne Indikator, hergestellt, deren pH auf 7,0 eingestellt wird. Getrennt von der Emulsion stellt man eine 1 %ige Lösung von p-Xylenolblau in 0,055 N Natronlauge bereit, sowie eine 0,02 N Lösung von Natronlauge und eine 0,02 N Salzsäurelösung.

Die folgenden Beispiele beschreiben die nähere Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung.

Beispiel A

Man gibt 0,1 ml Serum in die mit 1 ml der nach Beispiel 1 hergestellten Emulsion gefüllte Küvette. Die Mischung wird geschüttelt. Anschließend wird der entstandene Farbton mit einer geeichten Farbskala verglichen. Die auf der Skala dem Farbton zugeordnete Zahl, z.B. 150, wird abgelesen. Anschließend läßt man die Probe 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen und erhält durch Vergleich des entstandenen Farbtons mit demselben Farbton

auf der geeichten Farbskala die Zahl 350. Der Lipasegehalt der gemessenen Probe ist dann 200 mU/ml.-j 09884/ 0 553

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Dasselbe Ergebnis erhält man, wenn die gebrauchsfertige Emulsion nach dem Beispiel 3 eingesetzt wird.

In einer Wiederholung der vorstehend beschriebenen Messungen werden die Proben nach Bestimmung des Ausgangsfarbtons 20 Minuten bei 37⁰O stehengelassen. Der hie:
ist derselbe wie der oben erhaltene.

ten bei 37⁰O stehengelassen. Der hierbei bestimmte Lipasegehalt

Beispiel B

In einer Serienuntersuchung werden jeweils 0,1 ml Serum mit 1 ml der nach den Beispielen 1 und 3 hergestellten Emulsionen gemischt und anschließend 1 Stunde stehengelassen. In der Mehrzahl der Proben ist der bräunlich-violette bzw. bräunlich-blaue Farbton gegenüber dem Ausgangsfarbton kaum verändert. Die Seren mit pathologisch erhöhtem Lipasegehalt zeigen eine braune bis gelbe bzw. eine schmutzig-grüne bis gelbe Parbe. Der genaue Lipasegehalt kann in diesen pathologischen Seren entsprechend Beispiel A exakt bestimmt werden.

Beispiel C

0,2 ml der nach Beispiel 2 vorbereiteten Indikatorlösung werden zu 2 ml der Emulsion von Beispiel 2 gegeben. Anschließend wird gemischt, wobei normalerweise der pH-Indikator die gewünschte Parbe (braunstichiges Violett) zeigt. Wenn das pH der Emulsion, z.B. infolge langer Lagerzeiten, nicht mehr den gewünschten Wert hat, gibt man einige Tropfen 0,02 N Natronlauge bzw. Salzsäure hinzu, bis der gewünschte braunstichige violette Parbton erreicht ist.

Analog bereitet man eine gebrauchsfertige Emulsion mit dem Indikator von Beispiel 4. Die gegebenenfalls erforderliche Korrektur des pH einer langer gelagerten Emulsion erfolgt durch Zugabe der 0,02 N Natronlauge bzw. Salzsäure bis ein blauer Parbton erreicht ist.

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Zu den gebrauchsfertigen Emulsionen gibt man jeweils 0,2 ml Serum hinzu, schüttelt um und mißt den Lipasegehalt wie in den Beispielen A und B beschrieben iBt.

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Claims

Patentansprüche

1« Mittel zur Lipasebestimmung in Körperflüssigkeiten mit wäiBrigen Fett- "bzw. Ölemulsionen und pH-Farbindikatoren, dadurch gekennzeichnet, daß als Farbindikator m-Kresolpurpur und/oder p-Xylenolsulphophthalein und/oder Dibromthymolsulphophthalein und/oder Thymolsulphophthalein und/oderÄ-Naphtholphthalein enthalten ist.

Mi+■te! nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Indikator m-Kresolpurpur oder p-Xylenolsulphophthalein enthalten

5, Mittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator in einer Konzentration von ungefähr 0,001 bis 1 ti, voisugsweise 0,05 bis 0,2 %, enthalten ist.

4, >Iit:;el nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein emulsionsstabilisierender Zusatz, insbesondere Gummi arabicum, sn"::alt;eri ist.

;, AL'-:',el nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als süiu-lisionsatabilisierender Zusatz biostatische Stoffe ent-"aalt-en sind.

.>. 7e.:. .alireri zur Lipasebestimmung mit wäßrigen Fett- bzw. 01- ^:JiiV: sinnen und pH-Parbindikatoren, dadurch gekennzeichnet, ia- Z'.'^x. der zu untersuchenden Probe das Mittel nach Anspruch 1 'il,: 'j zusetzt und die während der Inkubationszeit eingetre-"be·.·-.-farbänderung bestimmt.

Unterlagen (Art. τ § ι Ab». 2 Nr. ι 3iu 3 de« Xnderungsges. v. 4.S, ;;*;

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7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die lipasebeStimmung in einer Kunststoffküvette angewandt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbänderung durch Vergleich mit einer geeichten Färb-* skala oder mit einem geeichten Farbband gemessen wird.

9· Verfahren nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbänderung durch Vergleich der untersuchten Proben untereinander bestimmt wird.

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