DE1798285B2

DE1798285B2 - Neues mittel und verfahren zur lipasebestimmung

Info

Publication number: DE1798285B2
Application number: DE19681798285
Authority: DE
Inventors: Arnold Dr.; Helger Roland Dr.; Lang Hermann Dr.; 6100 Darmstadt Härtel
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1968-09-20
Filing date: 1968-09-20
Publication date: 1976-02-12
Also published as: IL32910A0; BE738960A; DE1943454A1; JPS5542703B1; CH506792A; SE372631B; FR2022180A1; IL32910A; DE1798285A1; GB1247449A; US3689364A; NL6913769A

Description

Lipasen sind Enzyme, die Fette und Öle in Glyceride ■nd Fettsäuren spalten. Sie sind im tierischen Organis-HUS weit verbreitet. Besonders hohe Konzentrationen findei man in der Leber und im Pankreassekret, das im Dünndarm die Nahrungsfette verdaut. Bei Erkrankun-{en des Pankreas tritt Lipase in die Blutbahn über, »eshalb ist die Bestimmung der Lipase im Serum ein nichtiges diagnostisches Hilfsmittel zur Erkennung von (Pankreaserkrankungen.

Nach den bekannten Verfahren wird die Lipase dadurch bestimmt, daß ein Überschuß eines Lipasesub-Itrats vorgelegt und die hieraus durch die Lipase Ireigesetzte Menge Fettsäure durch Titration mit Alkali *nter Verwendung eines Indikators oder durch Extraktion der Kupfersalze gemessen wird. Als Indikatoren herden für die Titrationsbestimmungen nach den fcekannten Verfahren Thymolphthalein bzw. Phenol- |>hthaleir. verwendet (Deutsche Medizinische Wochenlchrift, Bd. 90, S. 1170 [1965], und Analytical Biochemi- »try. Bd. 6, S. 451 [1963]. Als Substrat wird im illgemeinen eine Öl-in-Wasser-Emulsion eingesetzt. Die genaue Bestimmung der Lipase nach diesen Verfahren ist jedoch mit erheblichen Schwierigkeiten Verbunden, die einer breiten Anwendung im Kliniklabotatorium entgegenstehen. Das Substrat läßt sich nicht leicht handhaben und macht eine photometrische Messung im Durchlicht wegen der Trübung unmöglich. Ferner ist sehr nachteilig, daß die zu bestimmende Säuremenge äußerst gering ist. Zum Beispiel erhält man selbst beim Einsatz von 1 ml Serum bei 10 Minuten Inkubation im Normalfall größenordnungsmäßig nur 0,0005 mMol Säure entsprechend einem Verbrauch von 0,005 ml 0,1 N-Natronlauge bei der Titration. Deshalb ist man auf sehr kostspielige Mikrotitrierautomaten angewiesen, mit denen Serienuntersuchungen nicht durchführbar sind. Sofern keine Mikrotitrierautomaten zur Verfugung stehen, muß man bei Verwendung von Farbindikatoren zur Titration sehr lange Inkubationszeiten, relativ große Serummengen und ungenaue Ergebnisse in Kauf nehmen.

Aus der britischen Patentschrift 1116 540 ist ein Test zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivilät bekannt, bei dem ebenfalls eine Esterase mit einem Substrat behandelt wird, wobei eine Fettsäure freigesetzt wird, die mit Hilfe von pH-Indikatoren bestimmt wird, im Vergleich zur Lipasebestimmung wird im Falle eines nichtpathologischen Serums hier etwa, die bOfache Säuremenge freigesetzt. Diese Methode kann jedoch nicht auf die Lipasebestimmung übertragen werden, da die dort angegebenen Indikatoren Bromthymolblau. Phenolrot oder m-Nitrophenol für eine Lipasebesiimmung ungeeignet sind.

Aus der Literatur, z. B. Index Merck, 9. Aufl.. 1961. ist eine Vielzahl von pH-Indikatoren bekannt. Alle diese Indikatoren erfüllen jedoch nicht die speziellen Anforderungen, die für eine direkte Messung der Geschwindigkeit des Farbumschlags in einer Emulsion notwendig sind. So muß z. B. der Umschlagspunkt in der Emulsion im pH-Bereich der Messung liegen, die Indikatorfarbe darf nicht durch die Serumeigenfarbe gestört werden, die Farbdifferenzierung muß trotz des hohen Eiweißanteils der Probe für das Auge gu: wahrnehmbar sein, der Farbumschlagsbereich in der Emulsion muß eng sein und der Proteinfehler des Indikators, der eine Verschiebung und Erweiterung des pH-Umschiagbereichs zur Folge hat, darf die Ablesung nicht stören.

Wegen dieser Schwierigkeiten begnügt man sich in der Praxis häufig mit einer Esterase-Bestimmung, d. h.. man verwendet einen löslichen Ester niederer Keltenlänge als Substrat, der gut definiert ist, jedoch andererseits nicht nur von der Lipase, sondern auch von anderen im Serum enthaltenen listerasen hydrolysiert wird (vgl. Ärztliches Labor, Bd. 13, 157 [1967]" Die Verwendung eines solchen löslichen Esters ist bei der Lipase-Bestimmung in angereicherten Enzym-Präparaten zulässig, nicht aber im Serum, da im Serum die Lipase-Konzentration nur sehr gering ist (Normalbereich bis 0.1 U/ml) und daneben viele andere Esterasen in z.T. hohen Konzentrationen vorliegen. Deshalb mußten bisher für die Bestimmung der sogenannten »echten Lipase« die oben aufgeführten mit großen Nachteilen behafteten Verfahren angewandt werden.

Es wurde nun gefunden, daß bei Verwendung bestimmter pH-Indikatoren die genannten Schwierigkeiten bei der Lipasebestimmung mit Hilfe einer Öl/Wasser-Emulsion weitgehend vermieden werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Mittel zur Bestimmung von Lipase in Körperflüssigkeiten mit wäßrigen Fett- bzw. ölemulsionen und pH-Farbindikatoren, das dadurch charakterisiert ist. daß als Farbindikator m-Kresolpurpur und/oder p-Xylenolsulphophthalein enthalten ist.

Außerdem umfaßt der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Lipasebestimmung in Körperflüssigkeiten mit wäßrigen Fett- bzw. ölemulsionen und pH-Farbindikatoren, das darin besteht, daß m?n der zu untersuchenden Probe das vorstehend definierte und im folgenden an Hand von Ausfühningsbeispielen näher erläuterte Mittel zusetzt und die während der Inkubationszeit eingetretene Farbänderung bestimmt.

Vorteilhafte Weiterbildungen des Mittels nach der Erfindung sind in den Palentansprüchen 2 bis 4 beschrieben.

Besonders vorteilhaft ist, daß in dem neuen Verfahren nur eine sehr geringe Menge der zu bestimmenden Probe (etwa 0,2 ml bei einer Normalbestimmung bzw. 0,02 ml für eine Mikrobestimniung) benötigt wird.

Ferner bietet das neue Mine! bzw. Verfahren den Vorteil, daß — im Gegensatz zu den mit bekannten Mittein und dem Tiirator arbeitenden Verfahren — fceine aufwendigen Apparaturen und kein hierfür geschultes Personal erforderlich sind und dall das neue s Verfahren — im Vergleich zu den bekannten Verfahren, bei denen unter Verwendung von Indikatoren die durch die Lipase freigesetzte Säuremenge durch Titration bestimmt werden muß — erheblich rascher durchgeführt werden kann. Außerdem wird eine mehrfache Pipettierung, wie sie für die bekannten Verfahren erforderlich ist, durch Anwendung des neuen Mittels vermieden. Ein weiterer Vorteil ist die hohe Spezifitäi und Genauigkeit der Lipasebesiimmung mit dem Mittel nach der Erfindung.

Die sehr guten Ergebnisse bei einfacher Handhabung des neuen Mittels waren auf Grund des Standes der Technik nichi vorauszusehen. Da Subsira! und Indikator der Einwirkung der Lipase in einer eiweißhaltigen Lösung ausgesetzt sind, war mit einer Verschiebung des Umschlagbereiches für die nach der Erfindung einzusetzenden Farbindikatoren zu rechnen. Ferner ist bekannt, daß der Umschlagbereich des Indikators sich im allgemeinen in einer eiweißhaltigen Lösung nicht nur verschiebt, sondern meist auch verbreitert, so daß genaue pH-Ablesungen erschwert sind. Außerdem wird eine solche Verbreiterung des Umschlagbereiches auch rlureh Zusatz vom emulsionsstabilisierenden Stoffen. wie z. B. Gummi arabicum, hervorgerufen. Sofern ein Zusatz nicht völlig farblos ist, wie es z. B. bei Gummi arabicum der Fall ist, wird außerdem die Farbablesung erschwert. Auf Grund dieser Unsicherheitsfaktoren sind die guten Meßergebnisse, die mit dem neuen Mittel zu erzielen sind, als überraschend anzusehen.

Im folgenden werden das Mittel und das Verfahren nach der Erfindung an Hand von Beispielen näher erläutert:

Die erfindungsgemäß verwendeten Indikatoren zeigen einen scharfen Farbumschlag, beispielsweise m-Kresolpurpur von Violett nach Gelb und p-Xylenolsulphophthalein von Blau nach Gelb. Bei der Herstellung des Mittels nach der Erfindung wird der pH-Wert der Lösung zweckmäßigerweise so eingestellt, daß der Farbumschlag schon durch Zugabe einer minimalen Menge Säure auftritt. Beispielsweise stellt man bei Verwendung von m-Kresolpurpur auf einen braunstichigen Violett-Ton, bei Verwendung von p-Xylenolsulphophthalein auf einen braunstichigen blauen Farbton ein. Die Einstellung des gewünschten pH-Wertes führt man vorteilhaft durch, indem man eine alkalische Lösung des Indikators, z. B. eine Lösung des m-Kresolpurpur oder p-Xylenolsulphophthalein, in verdünnter, beispielsweise 0,1 N-Natronlauge der Emulsion zufügt und anschließend eine Säure, z. B. verdünnte Salzsäure oder eine andere verdünnte Mineralsäure, zusetzt, bis der gewünschte Farbton erreicht ist. Grundsätzlich kann man den Indikator auch in wäßriger Säure, z. B. als Suspension odei ais Lösung, zusetzen und anschließend durch Zusatz von Alkali, z. B. von verdünnter Natronlauge, den gewünschten Farbton einstellen. Im allgemeinen ist jedoch wegen der besseren Löslichkeit der Zusatz des Indikators in alkalischer Lösung vorzuziehen. Sofern das Mittel über längere Zeit vor der Lipasebestimmung aufbewahrt wird, empfiehlt es sich, zur Erhöhung der Haltbarkeit den Indikator erst kurz vor Gebrauch der Emulsion zuzusetzen. In diesem Fall stellt man die Emulsion mit einem vorzugsweise nputralen bzw. nur schwach alkalischen bzw. schwach sauren pH-Wert zunächst ohne Indikator und gctrenni hiervon eine alkalische Indikatorlösung her. Beide Lösungen sind sehr gut auch über längere Zeit hallbar. Der Indikator ist in der gebrauchsfertigen Emulsion in einer Konzentration von etwa 0.001 bis 1%, vorzugsweise 0.05 bis 0,2%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Emulsion, enthalten. ·

Gegebenenfalls kann der Indikator auch aus einem Gemisch von m-Kresolpurpur und p-Xylenolsulphophthalein bestehen. Insbesondere kann es in manchen Fällen zweckmäßig sein, neben einem dieser Indikatoren einen weiteren Indikator wie z. B. Dibromthymolsulphophthalein, Thymolsuphophthalein oder Λ-Nitph tholphthalein in geringer Konzentration zur genauen Einstellung der für den Umschlagsbereich gewünschten Farbnuance des Mittels nach der Erfindung anzuwenden. Eine solche Einstellung kann z. B. erforderlich sein, wenn zur besseren Vergleichsmöglichkeit mit einer vorgedruckten Farbskala der Farbton des Hauptindikators verschoben werden soll. Beispielsweise kann durch Zusatz einer geringen Menge des im alkalischen Bereich blauen «-Naphtholphthalein zu einer als Hauptbestandteil des Farbindikators verwendeten Verbindung, wie m-Kresolpurpur oder p-Xylenolsulphophthalein. der Farbton des Mittels im alkalischen Bereich insgesamt nach Blau verschoben werden.

Gegebenenfalls können auch derartige Farbverschiebungen in dem Mittel nach der Erfindung durch Zusatz von geringen Mengen anderer als der oben aufgeführten Farbindikatoren, z. B. durch Zusatz von Diphenolpurpur (Rotverschiebung besonders im neutralen Bereich bei Verwendung von m-Kresolpurpur als Hauptbestandteil des Farbindikators) oder in manchen Fällen auch durch Zusatz geringer Mengen einer anderen farbigen Verbindung, wie Carotin, mit dem ein gelber Farbton erhalten wird, erzielt werden Diese Verbindungen werden z. B. in einer Konzentration bis zu 0,05% (bezogen auf die Emulsion) zugesetzt.

Als Lipasesubstrat enthält das Mittel nach der Erfindung natürliche oder synthetische Ester von Fettsäuren, insbesondere Fettsäureglycerinesier. Allgemein sind Triglyceride oder gegebenenfalls auch Diglyceride von Fettsäuren, wie Palmitin-, Stearin-, Öl-, Linol- oder Laurylsäure, zu verwenden. So sind natürliche öle und Fette, z. B. auch Cocosfett. als Lipasesubstrat für das Mittel nach der Erfindung geeignet. Besonders bevorzugt ist Olivenöl. Es empfiehlt sich, aus den Ölen und Fetten vor der Verwendung als Lipasesubstrat die freien Fettsäuren, beispielsweise durch chromatographische Reinigung des Öles oder Fetts über einem basischen Adsorptionsmittel wie Aluminiumoxid, zu entfernen. Gegebenenfalls können die öle und Fette auch anderweitig gereinigt oder auch hydriert werden. Beispielsweise ist hydriertes Rapsöl als Lipasesubstrat ebenfalls geeignet.

Zur Erhöhung der Haltbarkeit der Emulsion enthält das Mittel der Erfindung zweckmäßig einen emulsionsstabiiisierenden Zusatz. Dieser Zusatz kann aus einer oder mehreren Verbindungen der im folgenden beschriebenen Stoffgruppen bestehen.

Als emulsionsstabilisierender Zusatz haben sich vor altem Verbindungen mit Schutzkolloidwirkung, insbesondere Gummi arabicum, bewährt. Gegebenenfalls kann auch Polyvinylpyrrolidon als Schulzkolloid eingesetzt werden. Die Emulsionsstabilisaloren mit Schutzkolloidwirkung, insbesondere das Gummi arabicum, sind in der Emulsion in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 30%, vorzugsweise 10 bis 25%, enthalten. Neben

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der Schutzkolloidwirkung übt das Gummi arabicum finen aktivierenden Einfluß auf die Lipase aus.

Ferner können im Mittel nach cer Erfindung auch die Üblicher, Emulgatoren für Öl- bzw. Fett/Wasser-Emulsionen, wie z. B. Polyäthylenglykol-Fettalkoholäther. Polyäthylenglykolalkylphenoläther, Sulfonsäuresalze ©der Schwefelsäureester, z. B. Isopropylnaphlhalinsullonsäuresalze, oder Cetyl-stearylschwefelsäureester. zur Stabilisierung der Emulsion enthalten sein. Die Konzentration dieser Emulgatoren liegt beispielsweise bei bis lu 20%, vorzugsweise bis zu 1 %.

Als weiterer Zusatz, der die Emulsion stabilisiert und gleichzeitig aktivierend auf die zu messende Lipase im Fall einer Pankreaslipasebestimmung wirkt, könnea Salze von Gallensäuren, z. B. Alkalicholate, -desoxycho-Inte, -taurocholate, -glykocholate u.a. Gallensäuresalze. im Mittel der Erfindung enthalten sein. Diese Salze werden in einer Konzentration bis zu etwa 2%, insbesondere bis zu 0,5%, angewandt.

Als weiterer geeigneter Zusatz kann die Emulsion zur Stabilisierung Stoffe enthalten, die das Absetzen verhindern, beispielsweise die Geliermittel auf Montrnorillonit-Basis, insbesondere Erdalkali- oder quartäre Ammoniumsalze von Montmorillonit-Fettsäuren. Zum Beispiel können insbesondere die üblicherweise als Emulsionsstabilisatoren für Öl-in-Wasser-Systeme angewandten feinstverteilten Magnesium-montmorillonile von einer Dichte von 2,4 g/cm³ und einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 6% oder ein Dimethyldioctadecyl-ammonium-Montniorillonit von einer Dichle von 1,80 g/cm³ und einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 3% als Zusatz für die Emulsion nach der Erfindung verwendet werden. Diese Antiabsetzmittel werden in einer Konzentration bis zu etwa 3%. insbesondere bis zu I %, angewandt.

Ferner kann das Mittel der Erfindung emulsionsstabilisierende Stoffe enthalten, die die Viskosität von Emulsionen bei niedrigen Temperaturen erhöhen. Hierfür kommen z. B. gelbildende, höhermolekulare Verbindungen, die von Esterasen nicht gespalten werden, in Frage. Insbesondere Agar hat sich als Zusatz zur Erhöhung der Viskosität und damit zur Stabilisierung der Emulsion bewährt.

Außerdem kann das Mittel der vorliegenden Erfindung zur Verhinderung einer Autoxydation und der hierdurch bedingten Entmischung der Emulsion reduzierende Verbindungen, insbesondere Mercaptoäthanol bzw. Cystein, in Konzentrationen bis zu etwa 1%, vorzugsweise bis zu 0,05%, enthalten.

Das Mittel nach der Erfindung kann zur Stabilisierung der Emulsion auch biostatische Stoffe enthalten, die die Einwirkung von Mikroorganismen auf das verwendete Substrat verhindern. Hierfür kommen beispielsweise quecksilberorganische Verbindungen, wie p-Chlormercuribenzoat, Phenylquecksilberacetat, Äthylmercurithiobenz-3,4-oxazol-l-carbonsäure bzw. deren Natriumsalz, Äthylquecksilberthiosalicylate, Äthylquecksilberthiophenolsulfonsäuren. Jodacetate und/oder Azide in Frage. Bevorzugt werden hierfür Natrium-Jodacetat und Natriumäthylmercurithiosalicylat eingesetzt. Die biostatischen Stoffe sind vorzugsweise in einer Konzentration bis zu etwa 1%, insbesondere in einer Konzentration bis zu etwa 0,1%, enthalten.

Biostatische Stoffe können gegebenenfalls zusammen mit Gummi arabicum als emulsionsstabilisierende Zusätze enthalten sein. Allgemein sind Emulsionsstabilisatoren besonders geeignet, die durch Esterasen, insbesondere durch andere Esterasen als LiDase. im schwach alkalischen Bereich nicht verändert werden.

Bei der Zubereitung des Mittels nach der Erfindung wird im allgemeinen eine Lösung mindestens einer emulsionssiabilisierenden Verbindung, z. B. von Gummi arabicum, in Wasser vorgelegt. In manchen Fällen ist es zweckmäßig, diese Lösung vor der Zubereitung der Emulsion zu filtrieren oder zu zentrifugieren, um Rückstände aus den Zusätzen, /.. B. aus dem Gummi arabicum, zu entfernen. Anschließend wird durch Zugabe des Substrats, z. B. des Olivenöls, unter Turbinieren die Emulsion gebildet. Die weiteren für das Mittel verwendeten Zusätze, z. B. weitere emulsionssiabilisierende. insbesondere biostatische Stoffe, können der Mischung vor oder nach Zugabe des Substrats beigemengt werden.

Der Indikator kann zweckmäßigerweise in Form einer Lösung der Emulsion zugefügt werden. Man erhält so die gebrauchsfertige Emulsion. Man kann auch den Indikator getrennt von der Emulsion in Form einer Lösung aufbewahren und erst vor der jeweiligen Lipasebestimmung der Emulsion zufügen. Diese Ausführungsform des Mittels nach der Erfindung isi bevorzugt, wenn eine lange Haltbarkeit erforderlich ist.

Insbesondere günstig ist es. die Öi/Wasser-Emulsion in der jeweils für eine Lipasebestimmung erforderlichen Menge in einem geeigneten Behälter, vorzugsweise in einer Kunststoffküvette mit insbesondere rechteckiger Grundfläche, abzufüllen. Gegebenenfalls kann auch hierbei der erforderliche Indikator getrennt von der Emulsion in einer gesonderten Lösung bereitgestellt werden. Die abgefüllte Menge der Emulsion wird hierbei so bemessen, daß sie für eine Lipasebestimmung ausreicht. Zum Beispiel werden in dieser Ausführungsform jeweils 1 oder 2 ml Emulsion in die Küvette abgefüllt. In der gegebenenfalls von der Emulsion getrennten Indikatorlösung wird die Konzentration des Indikators zweckmäßigerweise so eingestellt, daß ein einfach abzumessender aliquoter Teil, beispielsweise ein Tropfen, der indikatorlösung der vorab bereitgestellten Öl/Wasser-Emulsion, z. B. in der Kunststoffküvette, für eine Bestimmung zugefügt wird. Eine Öl/Wasser- Emulsion, die den Indikator enthält. .' ' etwa 4 Wochen hallbar, wobei sich ein Umschütteln der Emulsion vor dem Gebrauch empfiehlt.

Das Verfahren zur Lipasebestimmung mit dem Mittel nach der Erfindung wird durchgeführt, indem das vorstehend beschriebene Mittel mit der zu untersuchenden lipasehaltigen Probe vereinigt wird und die während der Inkubationszeil eingetretene Farbänderung des Indikators bestimmt wird. Man gibt hierzu ein kleines abgemessenes Volumen, vorzugsweise 0,1 ml, der zu untersuchenden Körperflüssigkeit, z. B. des Serums bzw. Plasmas, in ein abgemessenes Volumen, z. B. 1 ml, der gebrauchsfertigen Emulsion. Hierauf wird wie üblich durchgemischt und die Farbänderung gemessen. Die Farbänderung kann durch Vergleich des jeweiligen Farbtons der Mischung mit dem entsprechenden Farbton auf einer geeichten Farbskala oder einem geeichten Farbband gemessen werden. Hierzu wird z. B. die auf der Farbskala bzw. dem Farbband abgelesene Eichzahl für den Farbton, der unmittelbar nach Zugabe der Probe zu der Emulsion vorliegt, aufgezeichnet. Anschließend läßt man den Ansatz für eine bestimmte Inkubationszeit, z. B. 1 Stunde lang, vorzugsweise bei einer Standardtemperatur, z. B. Zimmertemperatur oder 37°C, stehen und liest erneut die dem jetzt entstandenden Farbton zugeordnete Zahl auf der geeichten Farbskala bzw. dem geeichten

Farbband ab. Die Differenz ergibt den Lipascgehah in den der Farbskala- bzw. Farbbandeichung zugrunde liegenden Einheilen.

Eine bei der Messung verwendete geeichte Farbskala bzw. ein geeichtes Farbband kann, wie im französischen Patent 15 16 492 beschrieben, hergestellt werden. Für die Eichung der Skala bzw. des Bandes wird der Zeitabschnitt zugrunde gelegt, der bei der nachfolgenden Lipasebestimmung für die Inkubation angewandt wird, z. B. 1 Stunde.

Das Verfahren nach der Erfindung kann auch so ausgeführt werden, daß die Farbänderung durch Vergleich der untersuchten Proben untereinander nach der Inkubationszeit von z. B. einer Stunde bestimmt wird. Bei dieser Methode wird der — nach der Inkubationszeit nahezu unveränderte — Farbton von Proben mit normalem Lipasegehalt als Standard benutzt. Diese Durchführung der Lipasebestimmung nach der Erfindung ist insbesondere für Serienanalyscn geeignet, da meist über 90% der in den Kliniken untersuchten Blutseren normalen Lipasegehalt aufweisen und damit als Standard dienen können. Die wenigen Proben mit pathologisch erhöhtem Lipasegehalt erkennt man dann an einem nach der Inkubationszeit von der nahezu unveränderten Farbe der Mehrzahl der untersuchten Proben abweichenden Farbton. Bei Verwendung der Indikatoren m-Kresolpurpur oder p-Xylenolsulphophthalein zeigen die pathologischen Proben eine hellbraune bis hellgelbe Farbe. Sofern eine genauere Bestimmung erforderlich ist. können die als pathologisch erkannten Probon nochmals durch Vergleich mit dem geeichten Farbband bzw. der geeichten Farbskala genauer gemessen werden.

Im folgenden werden weitere Beispiele fur das Mittel nach der vorliegenden Erfindung gegeben.

Beispiel 1

Zu 480 ml Wasser werden im Mischgerät bei hoher Drehzahl 30 mg Äthylquccksilberthiosalicylat und 90 mg Gummi arabicum zugefügt.

Anschließend wird die Mischung durch Zusatz von 2 N-wäßriger Natronlauge auf pH 10 eingestellt. Hierauf wird zentrifugiert und der Überstand zur Entfernung von Verunreinigungen durch einen Wattebausch filtriert. Das Filtrat wird danach im Mischgerät bei hoher Drehzahl mit 120 ml Olivenöl (gereinigt über basischem Aluminiumoxid) versetzt.

Anschließend wird erncm 5 Minuten gemischt und mit 600 mg m-Kresolpurpur. gelöst in b0 ml 0.1 N-Natronlauge. versetzt.

Durch Zusatz verdünnter Säure, z. B. verdünnter Salzsäure, wird das pH der Mischung auf 8.8 (Farbe: braunstichiges Violett) eingestellt.

Die so hergestellte Emulsion wird entweder direkt zur Lipasebestimmung eingesetzt oder vorteilhafterweise maschinell zu je 1 ml in verschließbare Kunststoffküvetten abgefüllt. Der Inhalt einer Kunstsioffküvette wird dann jeweils für eine Lipasebestimmung verwendet.

Beispiel 2

Eine Emulsion wird analog der Vorschrift im Beispiel 1 hergestellt, jedoch wird kein indikator zugesetzt und das pH auf 7,0 eingestellt. Getrennt von der in Küvettcn zu je 2 ml abgefüllten Emulsion werden eine l"/oige Lösung von m-Krcsolpurpur in 0.055 N-Natronlauge, eine 0.02 N-Natronlauge und cmc 0.02 N-Salzsäurelosunn bereitgestellt. Die 0.02 N-Naironlaugc bzw. SaIzsäure kann zur Regulierung eines nach längerer Lagerzeil veränderten pH der Emulsion verwendet werden.

B e i s pi eI 3

In Analogie zu Beispiel 1 wird aus folgenden Komponenten eine gebrauchsfertige Emulsion hergestellt:

80 ml Wasser

ίο 20 mg Natriumjodaeetat
10 g Gummi arabicum
0,2 g Agar
15 ml Olivenöl

80 mg p-Xylenolsulphophthalein Die Farbe der Emulsion wird auf ein braunstichiges Blau durch Zugabe von verdünnter Natronlauge bzw. Salzsäure eingestellt.

Das so hergestellte Mittel kann, wie in Beispiel A beschrieben, zur Lipasebestimmung eingesetzt werden.

Beispiel 4

Analog Beispiel 3 wird eine E^:.mulsion. jedoch ohne Indikator, hergestellt, deren pH auf 7,0 eingestellt wird. Getrennt von der Emulsion stellt man eine l%ige Lösung von p-Xylenolsulphophlhalein in 0,055 N-Natronlauge bereit sowie eine 0.02 N-Lösung von Natronlauge und eine 0.02 N-Salzsäurelösung.

Die folgenden Beispiele beschreiben die nähere Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung.

Beispiel A

Man gibt 0.1 ml Serum in die mit 1 ml der nach Beispiel 1 hergestellten Emulsion gefüllte Küvette. DK-Mischung wird geschüttelt. Anschließend wird der entstandene Farbton mit einer geeichten Farbskala verglichen. Die auf der Skala dem Farbton zugeordnete Zahl. z.B. 150. wird abgelesen. Anschließend läßt man die Probe 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen und erhält durch Vergleich des entstandenen Farbtons mit demselben Farbton auf der geeichten Farbskala die Zahl 350. Der Lipasegehali der gemessenen Probe ist dann 200 mlJ/ml.

Dasselbe Ergebnis erhält man. wenn die gebrauchsfertige Emulsion nach dem Beispiel 3 eingesetzt wird.

In einer Wiederholung der vorstehend beschriebenen Messungen werden die Proben nach Bestimmung de*· Ausgangsfarbtons 20 Minuten bei 37^rC stehengelassen Der hierbei bestimmte Lipasegehalt ist derselbe wie dei oben erhaltene.

Beispiel B

In einer Scrienuntersuchung werden jeweils 0.1 m Serum mn 1 ml der nach den Beispielen 1 und hergestellten Emulsionen gemischt und anschließend Stunde stehengelassen. In der Mehrzahl der Proben is der bräunlich-violette bzw. bräunlich-blaue Farbio gegenüber dem Ausgangsfarbton kaum verändert. Di Seren mit pathologisch erhöhtem Lipasegehalt zeige eine braune bis gelbe bzw. eine schmutzig-grüne bi

(,o gelbe Farbe. Der genaue Lipasegehali kann in diese pathologischen Seren entsprechend Beispiel A evil· bestimmt werden.

Beispiel C

(,s 0.2 ml der nach Beispiel 2 vorbereiteten InilikalorU sung werden /u 2 ml der Emulsion von Beispiel gegeben. Anschließend wird gemischt, wobei normale weise der pH-Indikator die jcw mischte Farbe (brauns'

chigcs Violett) zeigt. Wenn das pH der Emulsion, /.. B. infolge langer Lagerzeiten, nicht mehr den gewünschten Wert hat, gibt man einige Tropfen 0,02 N-Natronlaugc bzw. Salzsäure hinzu, bis der gewünschte braunstichige violette Farbton erreicht ist.

Analog bereilet man eine gebrauchsfertige Emulsion mit dem Indikator von Beispiel 4. Die gegebenenfalls

erforderliche Korrektor des pH einer länger gelagerter Emulsion erfolgt durch Zugabe der 0.02 N-Natronlauge bzw. Salzsäure, bis ein blauer Farbton erreicht ist.

Zu den gebrauchsfertigen Emulsionen gibt man jeweils 0.2 ml Serum hinzu, schüttelt um und mißt der Upascgehall. wie in den Beispielen Λ und B beschrieber ist.

Claims

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Patemansprüche:

!. Mitte! zur Lipasebesiimmung in Körperfüissigkeiten mit wäßrigen Fett- bzw. Ölemulsionen und pH-Farbindikatoren, dadurch gekennzeichnet, daß als Farbindikator m-Kresolpurpur und/oder p-Xylenolsulphophthalein enthalten ist.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß neben einem der genannten Indikatoren ein weiterer Indikator enthalten ist.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß ein emulsionsstabilisierender Zusatz, insbesondere Gummi arabicum, enthalten ist.

4. Mittel nach einem der Ansprüche i bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als emulsionsstabilisierender Zusatz quecksilberorganische Verbindungen emballen sind.

5. Verfahren zur Lipasebestimmung mit wäßrigen Fett- bzw. Ölemulsionen und pH-Farbindikatoren. dadurch gekennzeichnet, daß man der zu untersuchenden Probe das Mitte! nach den Ansprüchen 1 bis 3 zusetzt und die während der Inkubationszeit eingetretene Farbänderung bestimmt.

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