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Reagenzlösung fiir die Analyse von Carbon-
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säureesterhydrolasen und Verfahren zu dessen Durchführun Die Erfindung
bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Carbonsäureesterhydrolasen.
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Es qibt drei bekannte Verfahren zur Bestimmung von Carbonsäureesterhydrolasen.
Sie werden nachstehend erläutert: 1. Turbidimetrische bzw. nepholometrische Methoden.
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Diese Methoden werden zur Messung von Esterasen konzipiert, welche
auf unlösliche Ester einwirken, die in einer emulsierten Form (unterstützt von gewissen
Emulgiermitteln) in ausreichender Verdünnung zum Versuchszeitpunkt vorliegen, so
daß optische Messungen daran gemacht werden können. Das Prinzip der Verfahrensweise
liegt in dem klärenden bzw. aufhellenden Effekt, den die Hydrolyseprodkte, Fettsäuren
und Teilglyceride
auf die Trübung der Versuchslösung haben. Der
bei diesem Verfahrenstyp verwendete gebräuchlichste Ester ist GlF eroltrioleat entweder
in seiner gereinigten Form oder als Olivenöl gewesen. Da der aufhellende Effekt
der Fettsäuren von ihrer Ionisation abhängt, sind diese Verfahren nur im alkalischen
pH Bereich durchführbar. Was ferner wegen der Aufbauunterschiede in den Lichtwegen
von verschiedenen Spektrophotometern eine akzeptable Wellenlänge in einem Instrument
für Trübungsmessungen sedn kann ist nicht notwendigerweise die beste Wellenlänge
in allen Instrumenten (Vogel und Zieve, Clinical Chemistry 9, 168-181 (1963)). Ferner
sind die turbidimetrischen Methoden relativ unempfindlich und zeigen keine gute
Linearität der gemessenen Aktivität mit dem Enzymgehalt, insbesondere bei hohen
Enzymgehalten.
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2. Messung der freigesetzten Fettsäuren. Die nach der Hydrolyse erzeugten
Fettsäuren können durch eine Reihe von Verfahren bestimmt werden. Sie können nach
Extraktion titriert werden oder sie können kontinuierlich während des Hydrolysenverlaufes
titriert werden. Die letztere Methode ermö.glicht eine kinetische Untersuchung einer
Esterhydrolase durchzufUhren, jedoch ist sie auf den alkalischen, pH Bereich begrenzt
und erfordert einen speziellen Aufzeichnungstitrator.
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Farbänderungen eines Säure-Basenindikaors können gemessen werden,
wenn die Hydrolyse fortschreitet, was theoretisch eine sehr empfindliche Untersuchung
liefert. Jedoch wird bei Anwendunq auf eine breite Anzahl von Esterhydrolasen mit
verschiedenen pH Optimas eine Anzahl von Indlkatoren benötigt und es ist notwendig,
ihre pK an die zu bestimmende, besondere Hydrolasen als auch an den pK irgendeines
in der Lösung vorhandenen Puffer. anzupassen, so daß eine Kinetik nullter Ordnung
erhalten wird. Die Empfindlichkeit dieses Verfahrenstyps ist umgekehrt proportional
zur Menge des vorhandenen Puffer.. Die freigesetzten Fettsäuren können ferner durch
eine Esterumsetzung zu ihren Kupfersalzen bestimmt und anschließend kolorimetrisch
gemessen werden. Die empfindlichste Methode
umfaßt die Verwendung
von radioaktiven Estern, die im Säureteil markiert sind. Die freigesetzte Fettsäure
wird nach Abtrennung von dem nicht hydrolisierten Ester in einem geeigneten Szintillationszähler
gemessen. Dieser Verfahrenstyp ist jedoch zeitaufwendig und teuer.
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3. Messung des freigesetzten Alkohols. Gewisse Ester von Phenolen
werden bei dieser Technik verwendet und das freie Phenolhydrolysenprodukt wird colorimetrisch
gemessen. Dieser Verfahrenstyp ermöglicht eine kontinuierliche Bestimmung der Reaktion
nur in dem pH-Bereich, in dem das Phenol gefärbt ist.
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Eine Erweiterung dieser Methode mit einer größeren Empfindlichkeit
besteht in der fluorimetrischen Analyse nach Kupplung des freigesetzten Phenols
mit einem Azofarbstoff. Jedoch ist die Spezifität der Phenolester für bestimmte
Hydrolasen zweifelhaft, insbesondere bei den wasserlöslichen Phenolestern gegenüber
Triglyceridlipase, welche beispielsweise in der Bauchspeicheldrüse gefunden wird.
Ferner besitzt die Pancreaslipase eine sehr niedrige spezifische Aktivität sogar
für wasserunlösliche Phenolester. Neben Phenolestern nutzen andere fluorimetrische
Methoden Carbonsäureester von Alkoholen, beispielsweiseß Naphthol, Fluorescein oder
4-Methylumbelliferon aus, welche nach der Hydrolyse fluoreszieren. Diese Ester sind
jedoch minderwertige Substrate für Pancreaslipase. Vinylester sind ebenfalls zur
Messung von Hydrolasen verwendet worden (Brockerhoff, H., Biochimica et Biophysica
Acta, 212, 92 (1970) und Brockerhoff, H. et al, Analytical Biochemistry, 37, 26-31
(1970)). Mit diesen Eltern wird nicht der OH-haltige Anteil gemessen'sondern sein
Isomerisierungsprodukt Acetaldehyd. Bei der Brockerhoff-Technik wird der Vinylester
emulgiert, so daß irgendwelche möglichen optischen Messungen bei der ReaktionRausgeschlossen
sind, während sie fortschreitet. Aliquote Anteile der Reaktionsmischungen mit einem
Gehalt an Acetaldehyd werden mit 3-Methyl-2-Benzothiazolonhydrazon gekuppelt, so
daß ein gefärbtes
Produkt gebildet wird, welches bei 666 mm colorimetrisch
bestimmt wird. Jedoch ist das Vinyloleat, welches als Substrat verwendet wird, nur
29,4 % so effektiv wie Glyceroltrioleat unter den qleichen Bedingungen bei Verwendung
von Schweinepancreaslipase für diese Messungen.
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Jedoch ist das Vinyloleat ein weit besseres Substrat als die phenolischen
Ester oder die Ester der Fluoreszensalkohole.
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Brockerhoff weist darauf hin, daß die Kinetik seines Verfahrens über
einer Absorbance bzw. einer Extinktion von etwa 0,6 nicht linear ist. Die Brockerhoff-Methode
ist, obwohl eine Verbesserung über vielen bekannten Verfahrensweisen vorliegt, eine
Methode, die manuell durchgeführt werden muß und sie erfordert die Herstellung von
einigen verschiedenen Lösunqen als auch einen großen Zeitaufwand.
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Beinahealle vorstehend erwähnten Methoden umfassen die Verwendung
von relativ instabilen Reagenzmischunqen, insbesondere solchen, welche irgendeine
Art einer Emulsion eines wasserunlöslichen Substrats erfordern. Die Methoden, welche
wasserlösliche Substrate verwenden, besitzen entweder eine äußerst niedrige spezifische
Aktivität gegenüber Triclycerid,-lipasen oder sie werden von Esterhydrolasen gestört,
welche auf wasserlösliche Substrate einwirken oder weisen beides auf.
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Triglyceridlipasen können ebenfalls Verfahrensweisen stören, die zur
Messung von Esterhydrolasen von wasserlöslichen Substraten konzipiert wurden, da
die Substratspezifitäten von vielen Triglyceridlipasen ebenso wasserlösliche Substrate
einschließen. Ein übliches Beispiel von Multienzymsystemen dieses Typs ist Blutserum
oder Plasma, welches Pancreaslipase aus einer entzündeten Bauchspeicheldrüse als
auch eine Leberesterase enthalten kann. Ein Verfahren, das zur Differenzierung der
Lipasenaktivität von derjenigen der Esterase entwickelt wurde, muß hochspezifisch
für die erstere sein, um ein zuverlässiges Diagnosehandwerk für den Nachweis von
Pancreasentzündungen zu sein. Eine solche Reagenzlösung muß zum Nachweis von niedrigen
Gehalten der Enzymaktivität hochempfindlich sein, für lange Zeitspannen lagerungsstabil
sein, nach Zugabe der Esterhydrolase (vorzugsweise unter Verwendung
von
kontinuierlichen Uberwachungstechniken, um eine kinetische Untersuchung zu liefern)
sehr rasch untersucht werden können, während der Umsetzung frei von Trübungseffekten
sein und wirtschaftlich herstellbar sein. Daher besteht eine Notwendigkeit für eine
Reagenzlösung, welche eine hohe Empfindlichkeit, eine gute Reinheit und Laserunqsstabilität
aufweist und zur raschen Messunq einer besonderen Esterhydrolase, beispielsweise
Triglyceridlipase sogar in Geqenwart von anderen Esterhydrolasetypen in der Lage
ist, welche verschiedene Substratspezifitäten oder andere Eigenschaften besitzen
können.
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Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird die Analyse
der Carbonsäureesterhydrolase durchgeführt, indem man eine unbekannte Lösung, die
vermutlich dieses Enzym enthält, mit einem Reaqenzsystem vermischt, worin zunächst
ein Vinylester einer Carbonsäure durch das Enzym in die Carbonsäure und den instabilen
Vinylalkohol hydrolysiert wird. In zweiter Stufe isomerisiert der Vinylalkohol zum
Acetaldehyd. Diese Folge von Umsetzungen wird schematisch wie folgt dargestellt:
Vinylester Carbonsäure Vinylalkohol R = Alkyl, Alkenyl oder Alkylaryl
Acetaldehyd Der Acetaldehyd der Reaktion (2) kann durch eine Vielzahl von bekannten
Mitteln nachqewiesen werden. 'Beispielsweise sind en:ymatische Verfahren nachstehend
in den Reaktionsgleichungen (3a) und (3b) dargestellt und umfassen die Uberwachung
des Verschwindens (3a) oder des Erscheinens (3b) von NADH, indem man ihre Absorbance
oder Fluorescence bei geeigneten Wellenlängen mißt. Die Geschwindigkeiten der Reaktionen
(3a) oder (3b) können danach mit der
Reaktion (1) gleichgesetzt
werden, wenn die Komponenten der Mischung alle im ausreichenden Überschuß vorliegen,
so daß nur die Esterhydrolasenaktivität begrenzend ist. Chemische Verfahren (3c)
können irgendwelche nichtenzymatischen Mittel für die quantitative Analyse von Acetaldehyd
enthalten.
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Äthanol
Essigsäure (3c) CH3CHO chemisch bestimmt NADH = 13 - Dihydronicotinamid-adenindinucleotid
ADH = Alkoholdehydroqenase NAD+ = Nicotinamidadenindinucleotid AD = Aldehyddehydrogenase
Beispiele von chemischen Nachweismethoden für Acedaldehyd können die Schiff'sche
Basenbildunq von Farbstoffen, beispielsweise basisches Fuchsin umfassen, welche
stark aefärbt sind.
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Die Herstellung des erfindungsgemäßen Reagenzeswird am vorteilhaftesten
durch Vereinigung von zwei getrennten Ansätzen bewirkt, wobei ein Ansatz ein Substrat-Detergentiengemisch
und der andere Ansatz eine Pufferlösung ist, welche gewisse Aktivatoren und Stabilisatoren
enthalten kann.
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Das Substrat-Detergentiengemisch enthält ein Carbonsäurevinylestersubstrat
und einen oder mehrere einer Vielzahl von nichtionischen Detergentien.
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Die Substratauswahl hänat von der Spezifität der zu bestimmenden
Carboxylesterhydrolase ab. Hydrolasen, welche die Hydrolyse von wasserlöslichen
Carbonsäureestern natürlichen Ursprungs rascher katalysieren als längerkettige wasserunlösliche
Carbonsäureester'werden die kurzkettigen Carboxylvinylester rascher hydrolysieren
als die längerkettigen Carboxylvinylester, welche wasserunlöslicher werden, wenn
die Kettenlänge ansteiqt. Hydrolasen, von denen bekannt ist, daß sie langkettige
Carbonsäureester natürlichen Ursprungs, beispielsweise Triglyceride katalysieren,
neigen die Hydrolyse von langkettigen Carboxylvinylestern rascher zu katalysieren
als andere Hydrolasen. Während irgendein Vinylcarbonsäureester als Substrat verwendet
werden kann sind Substrate mit vier bis zwanzig Kohlenstoffatomen bevorzugt. Zu
solchen zählen Vinylacetat, Vinylpropionat, Vinylbutyrat, Vinylcrotonat, Vinylvalerat,
Vinylhexanoat, Vinyloctanoat, Vinylnonanoat, Vinyldecanoat, Vinylneodecanoat, Vinyllaurat,
Vinylmyristat, Vinylpalmitat, Vinyloleat, Vinylstearat, Divinylsuberat und Vinylomega-phenylnonanoat.
Am meisten bevorzugt ist Vinyl-omega-phenyloctanoat, welches durch eine Modifikation
des Verfahrens von Catterjee et al. hergestellt werden kann (P.C. Catterjee, H.
Dakshinamurty, und J.S. Aggarval, Indian J. Technol., 4 , 173-175 (1966). Die Verbindungen
Vinyl-omega-phenyloctanoat und Vinyl-omega-phenylnonanoat wurden zum ersten Mal
synthetisiert. Der brauchbare Bereich der Substratkonzentration liegt bei 5 bis
15mM und der am meisten bevorzugte Bereich bei 7 bis 10 mM. Die bevorzugte Substratkonzentration
hängt teilweise von dem Km'des Enzyms für ein besonderes Substrat ab. Aus kinetischen
Gründen wird eine Substratkonzentration mit etwa zehnfacher Km empfohlen.
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Es wurde gefunden, daß die wirksamsten nichtionischen Detergentien,
die in dem Reagenz der Erfindung verwendbar sind, polyoxyäthylenierte Alkohole oder
polyoxyäthylenierte Alkylphenole und ihre Äther sind (Rosen und Goldsmith, Systematic
Analysis of Surface-Active Agents, 2. Auflaqe, Klasse IA2, Wiley-Interscience, New
York, (1972)). Während irgendeine nichtionische oberflächenaktive Verbindung dieses
Typs, welche keine Carbonsäureesterverbindungen enthält als Deterqentienteil dieses
Detergentien-Substrat-
gemisches verwendet werden kann,sind solche
bevorzugten Detergentien Polyoxyäthylen (23) lauryläther, polyoxyäthyleniertes tert.-Octylphenol
(von 7 bis 40 Mol EO)und deren Mischungen Der bevorzugte Ansatz des in einem besonderen
Versuchssystem zu verwendenden Substrat-Detergentiengemisches hängt von einigen
Faktoren wie folgt ab: 1) Dem hydrophilen-lipophilen Gleichgewicht (HLG) der nichtionischen
Detergentien 2) Der Hydrophobizität des Substrates 3) Den Eigenschaften der zu messenden
Esterhydrolase 4) Den Eigenschaften der Flüssigkeit, in welcher die Esterhydrolase
gefunden wird.
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Die spezifische Aktivität von Carbonsäureesterhydrolasen wird teilweise
durch sowohl das HLG als auch durch die Gesamtmenge der in dem Probensystem vorhandenen
nichtionischen Detergentien beeinflusst. Da eine Rolle der nichtionischen Detergentie
in der Erfindung darin besteht, das Löslichmachen des Substrates zu unterstützen,
sollte es für irgendein wasserunlösliches Substrat eine Mindestmenge von nichtionischen
Detergentien geben, die zur Durchführung einer vollständigen Auflösung und zur Verhinderung
einer Trennunq beim Stehen erforderlich sind. Diese Mindestmenge der nichtionischen
Detergentien hängt von der Wasserlöslichkeit des Substrats und dem HLG der nichtionischen
Detergentien ab. Im allgemeinen benötigten hydrophobere Substrate mehr nichtionische
Detergentien für die Auflösung als hydrophilere Substrate. Der Bereich von molaren
Verhältnissen von Detergentie zu Substrat, der in dieser Erfindung verwendbar ist,
liegt bei etw 1:1 bis 10:1 (d.h. 5 bis 150 mM nichtionische Detergentie) jedoch
ist etwa 1,5 bis 5,0:1 bevorzugt. Je niedriger das HLG einer Detergentie ist desto
wirksamer wird es ein hydrophobes Substrat löslich machen.
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Der verwendbare Bereich von HLG liegt bei etwa 13 bis 18, jedoch ist
ein Bereich von 14 bis 16 bevorzugt. Zwei oder mehrere nichtionische Detergentien
können zusammen zur Erzeugung eines gewünschten HLG vermischt werden. Zur Erzielung
der höchsten spezifischen Aktivität einer Esterhydrolase gegenüber einem besonderen
Substrat in der Erfindung, sollte man sich im aLlgemeinen bemühen so weniq nicht
ionische Detergentien und ein so hches HLG wie möglich zu verwenden. Ferner sollte
die Quelle der Carboxylesterhydrolase bei der Bestimmung des bevorzugten Substrat-Detergentiengemisches
beachtet werden. Wenn beispielsweise Blutserum oder Plasma auf Esterhydrolase analysiert
werden soll, kann ein sehr lipemisches Serum zu Trübheitsänderungen von langer Dauer
(> 5 Minuten) führen, daß die spectrophotometrische Analyse verhindert wird,
wenn nicht das geeignete Substrat-Detergentiengemisch verwendet wird. Eine minimale
Störung durch das lipemische Serum bei Verwendung von Vinyl-omegap henyloctanoat
als Substrat wird erreicht, wenn der brauchbare Deterqentienbereich(11LC)bei etwa
14 bis etwa 18 liegt, jedoch ist etwa 15 bis 16 bevorzugt. Der bevorzugte Bereich
kann bei Verwendung von anderen Substraten diffc eren.
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Als zweite Komponente dieser Reagenzlösung wird eine Pufferlösung
hergestellt, welche gewisse Aktivatoren und Stabilisatoren enthalten kann. Bei der
Herstellung der Pufferkomponente müssen folaende Merkmale berücksichtigt werden:
(1) Der pH der Pufferlösung sollte zur Angleichung des pH eingestellt werden, der
für die zu messende Esterhydrolase optimal ist. Dies ist gewöhnlich bei einem pH
von etwa 6 bis 10 der Fall.
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(2) flar verwendete Puffer sollte eine gute Pufferkapazität bei dem
verwendeten pH besitzen. Kaliuftiphosphat wird als Puffer für pH Bereiche von etwa
6 bis 7,5, Kaliumpyrophosphat für pH Bereiche von etwa 6 bis. 9,5 verwendet. Die
Natriumsalze können ebenfalls verwendet werden. Es muß sorgfältig beachtet werden,
daß jeglicher Puffer vermieden wird, welcher eine primäre Amingruppe aufweist, beispielsweise
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan,
welcher mit Acetaldehyd eine
Schiff'sche Base bildet und somit die quantitative Bestimmung von Acetaldehyd stört.
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(3) Die Konzentration des Puffers sollte hoch genug sein, um bei
der Lageruna wirksam zu sein und um jealiche Säure oder Base, die zusammen mit der
Esterhydrolase zuqesetzt werden kann, zu kompensieren. Der Pufferkonzentrationsbereich
kann bei etwa 0,05 klar bis zu den Löslichkeitsqrenzen liegen, jedoch wird eine
Konzentration von 0,05 M bis 0,5 Molar bevorzugt.
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Zur Verbesserung der Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen stabilen,
klaren Reagenzlösung können Enzymaktivatoren eingeschlossen werden. Callensalze
(oder die entsprechenden Gallensuren) die als Aktivatoren für Pancreaslipase bekannt
sind, können als Aktivatoren in den erfindungsgemäßen Systemen verwendet werden.
Unter diesen Gallensalzen, die als Aktivatoren in der Erfindung verwendbar sind,
sind Natriumtaurodesoxycholat, Natriumcholat, Natriumchenodesoxycholat und Natriumdesoxycholat
bevorzugt. Von diesen ist Natriumdesoxycholat das am meisten bevorzugte Gallensalz.
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Der Xonzentrationsbereich des Natriumdesoxycholats (oder seiner freien
Säure) liegt bei 0 bis etwa 25 mM, jedoch liegt der bevorzugte Bereich bei etwa
15 bis 21 mM für Schweinepancreaslipase, rohem Menschenpancreasextrakt und Lipase
im menschlichen Blutserum. Schweineleberesterlipase wird nur leicht durch Natriumdesoxycholatkonzentrationen
bis zu etwa 25 mM aktiviert. Natriumtaurodesoxycholat von 0 bis 25 mM, Natriumcholat
von 0 bis 10 mM und Natriumchenodesoxycholat von 0 bis 15 mM aktivieren alle leicht
Schweinepancreaslipase und Schweineleberesterase bei Verwendung von Vinyl-omega-phenyloctanoat
als Substrat in diesem System zu etwa dem gleichen Ausmaß, jedoch sind die bevorzugten
Konzentrationen in jedem Fall annähernd die obere Grenze jedes getesteten Bereiches.
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Die Aktivierung von Schweinepancreaslipase und rohem Menschenpancreasextrakt
kann ferner mit verschiedenen kationischen, quarternären Alky- und Alkyarylammoniumverbindungen,
beispielsweise Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) und Cetyldimethylbenzylammoniumchlorid
(CDMBAC) in Abwesenheit von Gallensalzen vollendet werden. Der brauchbare Bereich
von CTAB-Konzentrationen für die Aktivierung von Schweinepancreaslipase liegt bei
etwa 4 bis 12 mM, jedoch ist ein Bereich von 7 bis 9 mM bevorzugt. Der geeignete
Bereich von CDMBAC-Konzentrationen für die Aktivierung von Schweinepancreaslipase
liegt bei etwa 2 bis 9 mM,jedoch ist der Bereich von etwa 5 bis 9 mM bevorzugt.
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Wenn sie zusammen verwendet werden, aktivieren Natriumdesoxycholat
(oder ihre Säure) und entweder CTAT oder CDMBAC Schweinepancreaslipase um etwa das
zehnfache über der Aktivität ohne diese Komponenten zusammen. Natriumdesoxycholat
und CTAB sind bei gemeinsamer Verwendung in Bereichen von 0 bis 25 mM bzw.
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O bis 15 mM brauchbar, jedoch liegen die bevorzugten Konzentrationen
bei 10 mM bis 20 mm Natriumdesoxycholat und 4 mM bis 10 mM CTAB. Wenn Desoxycholat
und CDMBAC für die Aktivierung von Schweinepancreaslipase zusammen verwendet werden,
liegen die brauchbaren Konzentrationen von Desoxycholat bei O bis etwa 20 mM jedoch
liegen die bevorzugten Konzentrationen bei 10 mM bis 20 mM Desoxycholat und 10 mM
bis 15 mfi CDMBAC. Roher Menschenpancreasextrakt zeigt ferner einen Aktivierung
bei einer Kombination von Desoxycholat und CDMBAC im Konzentrationsbereich von 0
bis 16 mM CDMBAC und 0 bis etwa 4 mM Desoxycholat. Wenn die Desoxycholatkonzentration
über etwa 4 m?4 liest, wird Menschenlipase zu einem sehr viel größeren Ausmaß in
Abwesenheit von CDMBAC aktiviert.
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Gewisse Proteinstabilisatoren können zu der Pufferlösung zugesetzt
werden. Zu diesen zählen Dithioerythritol, Dithiothreitol, Serumalbumin, Athylendiamintetraessigsäure
und Mercaptoäthanol. Sulfhydralverbindungen sind zur Stabilisierung der Aktivität
besonders verwendbar. Bevorzuqte Stabilisatoren sind Dithioerythritol, Dithiothreitol
und Rinderserumalbumin. Für Dithioerythritol oder Dithiothreitol lieat die erfindungsgemäß
verwendbarebevorzugte Konzentration bei etwa 1x10 3 M. Diese beiden Stabilisatoren
sind ganz ähnlich und können austauschbar verwendet
werden. Für
Serumalbuminstabilisatoren liegt die bevorzugte Konzentration bei etwa 0,1 s (Gewicht/Volumen)bis
etwa 1,0 % (Gewicht/Volumen). Falls zu viel Serumalbumin verwendet wird und falls
die Ionenstärke der Lösung sehr hoch ist, kann ein Aussalzen des Proteins erfolgen.
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Die Ionenstärke des Analysensystems ist für eine optimale spezifische
Aktivität wichtiq. Viele Triglyceridhydrolasen besitzen eine gesteigerte spezifische
Aktivität wenn die Ionenstärke zunimmt. Andere hydrolasen werden durch eine erhöhte
Ionenstärke inhibiert. Dieser Parameter kann eingestellt werden, um die höchste
Spezifität der Probe für eine besondere Hydrolase zu erzielen. Obwohl eine Vielzahl
von neutralen Salzen vermutlich zur Steigerung der Ionenstärke des Reagenz verwendet
werden können, sind KCl und NaCl bevorzugt. Diese Verbindungen sollten in einer
Konzentration von 0 bis etwa 3 M in Abhängigkeit von der zu messenden Esterhydrolase
verwendet werden. Der bevorzugte Konzentrationsbereich in dem Reagenz für die Bestimmung
von sowohl Schweinepancreaslipase und Menschenpancreaslipase liegt bei etwa 2,5
M bis etwa 3,0 M. Schweineleberesterase wird durch zunehmende Ionenstärke inhibiert;
daher ist es bevorzugt, keine neutralen Salze zu dem Reagenz bei der Messung dieses
Enzyms hinzuzusetzen.
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Zur Überwachung der Bildung des durch die Hydrolyse des Vinylesters
erzeugten Acetaldehyds kann eine Vielzahl von analytischen Verfahrensweisen verwendet
werden. Enzymatische Kupplungssysteme, bestehend aus einem Enzym und seinem Kofaktor
können für eine kontinuierliche Kontrolle der Wirkung der Carbonsäureesterhydrolase
leicht verwendet werden. Solche Enzym- Kofaktorpaare können Alkoholdehydrogenase
und (-Dihydronicotinamidadenindinucleotid (NADH), ) , Aldehyddehydroqenase und 5-Nicotinamidadenindinucleotid
(NAD+) oder Nicotinamiddinucleotidphosphat (NADP +) und Aldehydoxidase und einen
der beiden künstlichen Elektronenakzeptoren 2, 6 Dichlorphenolindophenol und Cytochrom
C umfassen. Alle diese Aldehydnachweisverfahren sind bekannt. Das am meisten bevorzugte
Enzym-Kofaktorpaar
ist Alkooldehydroqenase und NADH. Ein Vorteil des Nachweises von Acetaldehyd durch
dieses Mittel besteht darin, daß es keine reine pH Änderung in der Gesamtreaktion
gibt. Die Alkoholdehydroqenase ist in krisallisierter Form im Handel erhältlich
und ist relativ preiswert. Das aus der Hefe erzielte Enzym ist routinemäßig in den
erfindungsaemäßen Systemen verwendet worden und ist bevorzugt, da es von den im
Handel erhältlichen Formen am wenigsten teuer ist. Alkoholdehydrogenase aus anderen
Ouellen kann ebenfalls verwendet werden. Die Aktivität der Alkoholdehydrogenase
oder irgendeines anderen ,verwendbaren Supplungsenzyms sollte wenigstens zehnmal
so hoch wie die höchste Aktivität der Esterhydrolase sein, die zu dem Probensystem
zugesetzt wird, um sicherzustellen, daß die gemessene Aktivität tatsächlich zu der
Esterhydrolasenaktivität und nicht zu dem Kupplungsenzym qehört. Der Konzentrationsbereich
der Alkoholdehydrogenase, die fiir die Analyse von etwa 50 ul Blutserum verwendet
wird,liegt bei etwa 1 bis 5 Einheiten je Mililiter Reagenz.
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Die Konzentration von NADII muß hoch genug sein, um die ADH zu sättigen
und um eine Probe mit ausreichender Stabilität zur Erzielung einer tatsächlichen
Messung der Esterhydrolasenaktivität zu liefern. Der brauchbare Bereich von NADH-Konzentrationen
liegt bei etwa 0,08 mg/ml bis etwa 0,4 mg/ml. Falls die Konzentration sehr viel
höher als 0,4 mg/ml ist, kann die Anfangsabsorbance bei 340 nm die Grenzen von einigen
Spectrophotometern überschreiten. Falls die Konzentration viel niedriger als etwa
0,08 mg/ml beträqt, kann die Alkoholdehydroqenase nicht genug mit NADH gesättigt
werden, um maximale Aktivität zu ergeben. Typischerweise wird die Absorbance des
Reagenzes bei 340 nm nach Zugabe von NADH abgelesen, um sicherzustellen, daß eine
genügende Menge der Verbindung in der reduzierten Form vorliegt. Der brauchbare
Bereich der Anfanqsabsorbance nach Zugabe von NADH liegt bei etwa 0,6 bt.
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etwa 3,0. Die obere Grenze hängt gewöhnlich von den Aufbaugrenzen
des Spektrophotometers ab. Der bevorzugte Bereich der Absorbance bei 340 nm mit
einem 1 cm Lichten liest bei etwa 1,0 bis 2,0.
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Eine Reagenzlösung mit einem Gesamtvolumen von 1,15 ml (einschließlich
50 ul Serum) und einer Anfangsabsorbance von 2,0 bei 340 nm kann eine Esterhydrolasenaktivität
von etwa 3,7 bis 1200 Milieinheiten/ml Serum mit einer Vorincubationszeit von 3
Minuten und einer Incubationszeit von 2 Minuten feststellen, währenddessen die Absorbance
kontrolliert wird. Die untere Grenze von 3,7 Milieinheiten/ml Serum beruht auf der
Empfindlichkeitsgrenze von 0,001 A je Minute in dem Spektrophotometer.
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Falls höhere Aktivitäten bestimmt werden kann dann weniger Serum oder
ein verdünntes Serum verwendet werden.
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Chemische Verfahren zur Verfolgung der Bildung von Acetaldehyd können
anstelle des oben erwähnten enzymatischen Kupplungssystems verwendet werden. Als
bevorzugte Methode kann Acetaldehyd mit einem Amin zur Bildung einer Schiff-Base
gekuppelt werden: diese kann dann durch einen Standartspektrophotometer oder fluorimetrische
Techniken bestimmt werden.
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Die Temperatur, bei welcher das Reaqenz verwendet wird, kann über
einen weiten Bereich variieren, so lanqe wie sie während der Messung konstant ist.
Temperaturen von etwa OOC bis etwa 50°C können bei der erfindungsgemäßen Analyse
verwendet werden. Ezymatische Proben werden normalerweise bei 250C, 300C oder 37
0C gemessen. Während irgendeine dieser Temperaturen vorzugsweise für dieses Reagenz
verwendet werden kann, wird eine Temperatur von 300C zur Standartisierung von enzynatischen
Untersuchungen durch die "International Union of Pure and Applied Biochemistry"
empfohlen. Wenn das Reagenz in flüssiger Form gelagert wirdJhängt die Rate der spontanen
Hydrolyse des Vinylesters und daher die NADH Oxidation, wenn das Kupplungssystem
vorhanden ist, von der Lagerungstemperatur ab. Die Geschwindigkeiten der NADH Oxidation
bei der Lagerung bei 300C, Zimmertemperatur (23 0C) und Eistemperatur (4 0C) in
einem Reagenz mit Vinyl-omega-phenyloctanoat als Substrat in einem Versuch betrugen
0,0262 ,umol/Stunde, 0,0165 »mol/Stunde bzw. 0.0038 pmol/Stunde. Im Fall eines Reagenzes,
dessen Ab-
sorbance bei 340 nm anfänglich bei etwa 1,3 liegt, liegt
die brauchbare Lebensdauer des Peagenzes, d.h. bis die Absorbance unter 0,6 fällt,
bei 300, 230 und 40 C daher bei 4,9;7,8 bzw.
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33,9 Stunden. Der pH des Reaqenzes betrug 7,2. Die Brauchbarkeit des
Reagenz kann einfach durch Zugabe von mehr NADH wdeder hergestellt werden.
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Es ist zu bemerken, das während das erfindungsgemäße Reagenz manuell
in Form einer wässrigen Lösung hergestellt werden kann, es möglich ist, den wässrigen
Ansatz einer Gefriertrocknung zu unterwerfen und hierdurch ein trockenes Pulverreagenz
zu bilden. Dieses Pulverreagenz kann durch Zugabe der erforderlichen Wassermenqe
aktiviert werden.
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Die Erfindung wird nachstehend durch ein Ausführungsbeispiel näher
erläutert.
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BEISPIEL Für die Herstellung eines Liters des Reagenzsystemes für
die Hydrolasenaktivitätsbestimmunq wurden die folgenden Mischungen angesetzt: (1)
Substrat - Detergentiengemisch: Das Verfahren zur Mischung des Substrat-Detergentiengemisches
ist nicht kritisch. Ein Weg zur Herstellung besteht darin, daß man 1,985 g Vinyl-omega-Phenyloctanoat
mit 9,081 g 1,1,3,3-Tetramethyl-1-phenoxy-(polyäthoxy) nbutan (n= polydispers, durchschnittlich
9) und 9,133 g einer 70 % wässrigen Mischung einer gleichen Verbindung, bei der
n=Polydispers, durchschnittlich 30 ist6 vermischt. Die resultierende viskose mischung
wird vermischt, bis sie homogen ist. Eine große Menge dieser Mischung kann gewünschtenfalls
hergestellt werden und in einem zugestöpselten Behälter unbegrenzt bei Zimmertemperatur
gelagert werden.
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(2) Pufferlösung. Während das Verfahren zur Herstellung der Pufferlösung
nicht kritisch ist, ist ein Verfahren zu seiner Bildung wie folgt: Man wiegt in
einem ein-Liter Becherglas 3,134 g t, 1 ,3,3-Tetramethyl-1-phenoxy- (polyäthoxy)-butan
(n=polydispers, durchschnittlich 9) und 12,912 g 1,1 ,3,3-Tetramethyl-1-phenoxy
(polyäthoxy)n -butan, 70 % (n=polydispers, durchschnittlich 30) ab. Etwa 800 ml
entionisiertes oder destilliertes Wasser werden hinzugesetzt und man rührt mit einem
Magnetrührstab bis die Detergentien aufgelöst sind. Man fügt 9,534 g Natriumdesoxycholat
hinzu und setzt das Rühren fort, bis es sich gelöst hat. Danach fügt man 25,652
g Tetranatriumpyrophosphat (Na4P2O7 . 10 H20) zu und rührt bis sich die Kristalle
auflösen. Unter Rühren werden annähernd fünf gleiche Teile einer Gesamtmenge von
231,51 g Kaliumchlorid hinzugesetzt, wobei jeder Teil beinah vollständig auflösen
gelassen wird, bevor der nächste Teil hinzugesetzt wird. Wenn alles KCl gelöst ist,
wird das Rühren beendet. Man fügt 1,15 g Rinderserumalbumin durch Besprühen auf
die Flüssigkeitsoberfläche hinzu. Wenn alles RSA gelöst ist, wird das Rühren wieder
begonnen und weiteres Wasser hinzugesetzt, um das Volumen auf etwa 950 ml zu bringen.
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Man stellt den pH auf 9,1 mit verdünnter HCl Lösung ein. Die Temperaturkompensation
an dem pH Meter wird auf diejenige Temperatur gestellt, bei welcher die Untersuchungen
durchgeführt werden soll (30°C in diesem Beispiel). Nach Entfernung der pH Elektroden
aus der Lösung fügt man 0,1775 g Dithioerythritol unter Rühren hinzu.
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Man überführt die Lösung quantitativ in einen ein-Liter Messkolben,
fügt Wasser bis zur Marke hinzu und vermischt gründlich. In einem ein-Liter Becherglas
wird das Substrat-Detergentiengemisch und der Puffer unter Rühren vereinigt bis
sie gründlich gemischt sind. Dann werden unter Rühren sehr langsam ein Milliliter
einer Hefealkoholdehydrogenaselösung mit einem Gehalt von 40 mg ADH/Milliliter eines
Puffers mit einer ähnlichen Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben hinzugesetzt.
Das Reagenz wird durch ein Filterpapier Nr. 402 (Carl Schleicher und Schuell Co.)
zur Entfernung von jeglichem unlöslichen fremdem Material filtriert. Das Reagenz
kann in einem nicht zugestöpselten Behälter gekühlt werden und aliquote Anteile
können entnommen werden, wie sie für die Analysen benötigt werden.
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Beispielsweise entnimmt man zur Analyse von 100 Serumproben auf Pancreaslipaseaktivität
einen 100 ml Anteil des Reagenzes. Max fügt 30 mg NADH hinzu und rührt
bis
es sich aufgelöst hat. Nachdem jegliches endogenes Acetaldehyd im Reagenz reduziert
worden ist und die entsprechende Oxidation von NADEL sich auf den normalen Blindwert
verlangsamt hat wird die Absorbance bei 340 nm in einem 1 cm Lichtweg annähern 1,5
sein. Ein Milliliter des Reagenzes und 0,1 ml Wasser werden in eine geeignete Spektrophotometerzelle
pipettiert und etwa zehn Minuten lang bei 30°C incubiert. Danach wir die Zelle in
eine Zellenkammer mit konstanter Temperatur (3O0C) in ein Spektrophotometer eingesetzt
und die Änderung in der Absorbance bei 340 nm wird auf einem kalibrierten Diagrammschreiber
zur Erzielung einer Blindrate aufgezeichnet. Fünfzig >11 eines Serums werden
danach zu dem Reagenz hinzuqefüqtwdurch mehrmaliges Umwenden gemischt und die Zelle
in der Zellenkammer zurückgestellt. Die Änderung der Absorbance wird wieder auf
einen Diagrammschreiber aufgezeichnet. Die Rate wird gewöhnlich in weniger als drei
Minuten nach der Serumzugabe linear werden. Nach einer ausreichenden Zeit zur Erzielunq
einer geraden Linie der Absorbanceänderung berechnet man das reine m A/Min., indem
man die Blindrate von der Rate nach Serumzugabe abzieht. Die Lipasenaktivität in
dem Serum wird wie folgt berechnet unter Verwendung von 6,22 A/cm pmol als Extinktionskoeffizient
von NADH: =S A/Min. x 3698 = Internationale Einheiten Lipase/Liter Eine internationale
Einheit ist definiert als Umsatz einesßumol-Substrats je Minute je Liter Lösung.