DE2619252C3 - Verfahren zur Messung der Aktivität von Lecithincholesterinacyltransferase und hierfür verwendbare Lecithinsubstratlösung - Google Patents
Verfahren zur Messung der Aktivität von Lecithincholesterinacyltransferase und hierfür verwendbare LecithinsubstratlösungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Aktivität von Lecithincholesterinacyltransferase (nachstehend
als »LCAT« bezeichnet) und eine hierfür verwendbare Lecithinsubstratlösung.
LCAT stellt ein Enzym dar, welches in der Leber von Tieren erzeugt wird und freies Cholesterin und Lecithin
in einen Cholesterinester und Lysolecithin im Blut umzuwandeln vermag. Die LCAT-Aktivität steht in
enger Beziehung mit dem Ausmaß der Verletzungen hepatitischer Zellen. Wenn beispielsweise die Patienten
eine akute Hepatitis aufweisen, ist die LCAT-Aktivität verringert, während bei den meisten Patienten, die eine
chronische Hepatitis aufweisen, die Aktivität einen Normalwert besitzt Daneben haben mehr als die Hälfte
der Patienten, die eine Hepatozirrhose aufweisen, einen niedrigeren Aktivitätswert, während bei den Patienten
55
60
65 mit Obstruktionsgelbsucht die Aktivität im Lauf der Verschlechterung der Krankheit verringert wird. Daher
ist die Messung der LCAT-Aktivität für den klinischen Test der Leberfunktion der Patienten verwendbar.
Darüber hinaus steht die LCAT-Aktivität in enger Beziehung mit der Menge an freiem Cholesterin im Elut
und weiterhin mit dem Ausmaß an Fettsubstanz (Fettsucht). Daher ist die Messung der LCAT-Aktivität
auch für die Diagnose von Krankheiten, wie Lipidose und Diabetes nützlich.
Im allgemeinen kann Aktivität eines Enzyms durch die Reaktionsgeschwindigkeit, d. h. durch die veränderte
Menge des Substrates oder des Produktes innerhalb eines festgelegten Zeitraumes, bestimmt werden, wenn
eine vorgeschriebene Menge einer Versuchsprobe, die das Enzym enthält unter festgelegten Bedingungen
inkubiert wird. Beispielsweise wird im Fall der Messung
der LCAT-Aktivität ein Blutserum oder Plasma bei 37°C inkubiert, welches die optimale Temperatur für die
Kultivierung von LCAT darstellt und sodann die veränderte Menge (/ig oder μπι) an freiem Cholesterin
'Substrat* Gemessen Die Aktivität an LCAT wird durch
die veränderte Menge an freiem Cholesterin pro 1 ml (oder 1 1) des Blutserums pro Stunde (/ig/ml/h oder
μΐη/1/h) wiedergegeben).
Die Reaktionsgeschwindigkeit nimmt mit der Abnahme der Substratmenge in dem Reaktionsbystem, die auf
die enzymatische Reaktion zurückzuführen ist, ab. Bei einer enzymatischen Reaktion bildet die Kurve der über
der Inkubationszeit aufgezeichneten Substratmenge in dem Reaktionssysiam üblicherweise nur im ersten
Stadium der Reaktion etwa eine lineare Linie, weshalb die Enzymaktivität gewöhnlich durch die Reaktionsgeschwindigkeit
im ersten Stadium der Reaktion wiedergegeben wird. Im Fall von LCAT ist die Kurve bei
Inkubation einer Versuchsprobe bei 37° C jedoch nur innerhalb einer Stunde nach Beginn der Reaktion etwa
linear. Daher sollte die Inkubationszeit kurz gehalten werden, um eine lineare Kurve zu erhalten. Bei einer
derartig kurzen Reaktionszeit ist allerdings die veränderte Substratmenge derart gering, daß sie nach einem
herkömmlichen Verfahren, in dem das freie Cholesterin durch optische Analyse festgestellt wird, nicht exakt
gemessen werden kann.
Zur Messung der LCAT-Aktivität sind auch die Stokke-Norum-Methodik (K. T. Stokke und K. R.
N ο r u m , Scand. J. Clin. Lab. Invest, Bd. 27, S. 21 [1971])
und eine übliche Substratmethodik (J. A. G1 ο m s e t und J. L Wright, !3iochim. Biophys. Acta, Bd. 89, S.
266 [1964]), in denen ein Radioisotop Verwendung findet, bekannt. Diese Verfahren sind jedoch sehr
kompliziert und erfordern lange Inkubationszeit (5 bis 6 Stunden) sowie die Verwendung eines Radioisotops; sie
werden deshalb für klinische Prüfungen kaum verwendet.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Messung der LCAT-Aktivität
aufzufinden, das für die klinische Prüfung ohne Verwendung eines Radioisotops brauchbar ist, bei dem
das freie Cholesterin vielmehr durch optische Analyse gemessen wird. Es wurde gefunden, daß die Reaktionszeit,
innerhalb der die Kurve der Substratmenge/Irikubationszeit
in einer etwa linearen Linie gehalten werden kann, durch Einbringung eines Lecithins in das
Reaktionsgemisch verlängert werden kann, wobei eine Trübung des Reaktionssystems durch Zugabe eines
nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoffes vermieden werden kann. Dadurch wird es möglich, die herkömmli-
ehe optische Analysenmethodik zur Messung des freien
Cholesterin zuwenden.
Die genannte Aufgabe wird somit dadurch gelöst, daß bei einem Verfahren zur Messung der Aktivität der
Lecithincholesterinacyltransferase eine Versuchsprobe zu einer Lecithinsubstratlösung, die ein Lecithin und ein
nicht-ionisches oberflächenaktives Agens enthält, hinzugegeben, das Gemisch inkubiert und sodann die
veränderte Menge an freiem Cholesterin in dem Reaktionssysteti. durch optische Analyse gemessen
wird.
Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen 'Verfahrens sind in den Patentansprüchen 2 bis 6 und im
Verfahren vorteilhaft verwendbare Lecithinsubstratlösungen sind in den Patentansprüchen 7 bis 10
beschrieben.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnung näher erläutert
Die Erfinder haben angenommen, daß die Linearität der Kurve von Substratmenge/Inkubationszeit in der
enzymatischen Reaktion dadurch verlängert werden kann, daß der Versuchsprobe ein Lecithin zugefügt wird,
welches ein Substrat für LCAT darstellt und haben die Kurve der Substratmenge/Inkubationszeit durch Zufügung
verschiedenartiger Konzentrationen des Lecithins zu der Versuchsprobe aufgezeichnet. Das heißt, es
wurden einige Substratlösungen mit verschiedenartigen Konzentrationen des Lecithins durch Zufügung des
Lecithins zu einer Pufferlösung (pH 7,4) hergestellt, und eine vorgeschriebene Menge an Substratlösunj, wurde
zu einer vorbeschriebenen Menge an Versuchsprobe hinzugefügt und das Gemisch bei 37° C während 4
Stunden inkubiert und sodann das freie Cholesterin in dem Reaktionssystem extrahiert und dessen veränderte
Menge in einem Schema aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der F i g. 1 wiedergegeben.
Wie sich klar aus den Ergebnissen entnehmen läßt, wird in dem Fall, in dem kein Lecithin hinzugefügt
worden ist die Linearität der Kurve innerhalb einer Stunde verloren, während andererseits bei Lecithinzufügung
die Linearität der Kurve während 3 Stunden (Gehalt an Lecithin in der Substratlösung: 2,5 mg/ml)
und während 4 Stunden (Gehalt an Lecithin in der Substratlösung: 5 oder 10 mg/ml) aufrechterhalten
werden kann, wobei die Lecithinzufügung die LCAT-Aktivität nicht beeinflußt. Somit kann die Linearität der
Kurve der Substratmenge/Inkubationszeit während 2 bis 4 Siunden durch Zufügung der Lecithinsubstratlösung,
die 2,5 bis 10 mg/ml Lecithin enthält aufrechterhalten werden und die veränderte Menge an freiem
Cholesterin exakt durch ein herkömmliches optisches Analysenverfahren gemessen werden. Wenn das Lecithin
der Pufferlösung allein hinzugefügt wird, wird das Gemisch trübe, und wenn das Gemisch der hierdurch
erhaltenen Versuchsprobe und Substratlösung inkubiert wird, ist es schwierig, die veränderte Menge des freier
Cholesterins durch optische Analyse zu messen. Es ist daher erforderlich, die Substrarlösung zum Zweck des
Einsatzes der Methodik im klinischen Test transparent zu machen.
Es ist bekannt, daß sine Ultraschallbehandlung für die
Solubilisierung eines Gemisches nützlich ist Wenn ein Gemisch eines Lecithins in einer Pufferlösung mit
Ultraschall behandelt wird, kann dessen Trübheit etwas verringert werden, es treten jedoch innerhalb weniger
Stunden gewisse Ausfällungen auf. Daher muß die Substratlösung mit Ultraschall immer bei der Verwendung
behandelt Werden, Weshalb dies für klinische Testzwecke nicht geeignet ist Es wurden daher
verschiedenartige andere solubilisierurigsmethodiken
extensiv un'ersucht, wobei gefunden worden ist, daß
nicht-ionische oberflächenaktive Stoffe verwendbar sind, um die Lecithinsubstratlösung transparent zu
machen oder zu solubilisieren, ohne daß unerwünschte Auswirkungen auf die LC AT-Aktivität auftreten.
Beispielsweise ist die Beziehung zwischen der Konzentration an Nonion NS 215 (Warenzeichen eines
to PolyoxyäthylenalkylfCeJ-phenoläthers, hergestellt durch
Nippon Oils and Fats C, Ltd) und die LCAT-Aktivität
(/ig/ml/h) in der F i g. 2 gezeigt
Wie aus F i g. 2 hervorgeht wird die LCAT-Aktivität durch den nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoff in
dessen Konzentration unter 0,5% [GfV) nicht beeinflußt
Darüber hinaus kann der nicht-ionische oberflächenaktive Stoff die Lecithinsubstratlösung bei Zufügung
in einer Menge von 0,01% (G/V) oder mehr transparent gestalten, und wenn die Substratlösung
zuvor mit Ultraschall behandelt worden ist wird diese durch Zufügung des nicht-ionischen ol. <flächenaktiven
Stoffes noch ieicher transparent gestaltet ,der soiubihsiert
Die nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoffe, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen
beliebige herkömmliche nicht-ionische oberflächenaktive Stoffe, die das Lecithinsubstrat transparent gestalten
können, und keine unerwünschten Wirkungen auf die Aktivität des LCAT nehmen, wie beispielsweise
Polyoxyäthylenalkyläther,
Polyoxyäthylenalkylphenoläther,
Polyoxyäthylensorbitanalkylester.
Polyoxyäthylenalkylester,
Polyoxyäthylenalkylamine,
Polyoxyäthylensorbitanalkylester.
Polyoxyäthylenalkylester,
Polyoxyäthylenalkylamine,
Polyoxyäthylenalkyiamide und Sorbitanalkylester.
Unter diesen oberflächenaktiven Stoffen stellen Po!yoxyäthy!ena!ky!äther. Polyoxyäthylenalkylphenoläther
und Polyoxyäthylensorbitanalkylester bevorzugte Materialien dar. Geeignete Beispiele nicht-.onischer
oberflächenaktiver Stoffe sind Triton X-IOO (Warenzeichen füreinen Polyoxyäthylenisooctylphenyläthe:,
hergestellt durch Röhm und Haas Co.), Emuigen 930 (Warenzeichen für einen Polyoxyäthylenalkyläther,
hergestellt durch Kao Soap), Tween 20 und Tween 80 (Warenzeichen für ein Polyoxyäthylensorbit.anmonolaurat
bzw. ein Polyoxyäthylensorbitanmonooleat hergestellt durch Atlas Powder Co.), Nonion NS 215
(Warenzeichen für einen Polyoxyäthylenalkyl(C9)-phenoläther, hergestellt durch Nippon Oils and Fats Co,
Ltd.) od. dgl.
Diese nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoffe werden allein oder in einem Gemisch von zwei oder
mehreren Arten in einer Menge von 0,01% (G/V) oder mehr, »jizugsweise 0,02 bis 0,5% (G/V) auf Basis des
Lecithinsubstrates verwendet Jedoch beeinflußt der nicht-ionische oberflächenaktive Stoff die LCAT-Aktivität
wie in F i g. 2 gezeigt ist wenn diese gering ist weshalb der nicht-ionische oberflächenaktive Stoff
vorzugsweise in einer geringstmöglichen Menge verwendet wird, wobei die am meisten bevorzugte Menge
etwa 0,025% vp/Y) beträgt.
Das Lecithin wird in einer Menge von 2,5 bis 10 mg/ml, Vorzugsweise 2,5 bis 5 mg/ml, verwendet
Die gemäß der Erfindung verwendete Pufferlösung
Die gemäß der Erfindung verwendete Pufferlösung
kann eine wäßrige Pufferlösung darstellen, die das Lecithinsubstrat bei einem optimalen pH-Wert (Qr
LCAT (d. h. einen pH-Wert von etwa 7,4) halten kamn
und umfaßt TEN-Pufferlösungen (Tris, d. h. Tris(hydro-
xymethyl)aminomethan: O1Ol-m, EDTA, d. h. Dinatriumäthylendiamintetraacetat:
0,001-m, und Natriumchlorid; 0,14-m), TE-Pufferlösung (Tris: 0,02-m, und EDTA:
0,001-m), 0,1-m Phosphat-Pufferlösung und 0,02-m
Tris-Pufferlösung. Wenn der nicht-ionische oberflächenaktive
Stoff in einer kleineren Menge verwendet wird, ist die Verwendung von TE-Pufferlösung bevorzugt.
Das Lecithinsubstrat kann durch ZufügUrig von 2,5 bis
JO mg/rnl eines Lecithins zu einer Pufferlösung und vorzugsweise Behandlung des resultierenden Gemisches
mit t lltraschall, und sodann Zufügung hierzu eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoffes in einer
Menge von 0,01% (G/V) oder mehr, vorzugsweise 0,02 bis 0,5% (G/V) auf Basis der Lecithinsubstratlösung,
hergestellt werden.
Die Menge an freiem Cholesterin in dem Reaktionssystem vor und nach der Inkubation kann durch
herkömmliche optische Analysenmethodiken gemessen werden. So kann z. B. eine Kombination von Digitonin
mit einem Reagens, das unter dem Liebermann-Burchard-Reagens (cf. W. M. S ρ e r r y und M. W e b b, J.
Bio!. Chem., Bd. 187, S. 97 [1950]), dem Zak-Henly-Reagens
(cf. B. Zak und R. C. Dickenman, Am. J. Clin.
Path., Bd. 24, S. 1307 [1954]) oder einem o-Phthalaldehyd-Reagens
(cf. A. Zlatkis und B. Zak, Anal. Biochim. Bd. 29, S. 143 [1969]) ausgewählt worden ist,
verwendet werden. Oder es kann die Chnlesierinoxidasemethodik
(cf. W. R i c h m ο η d et al, Clin. Chem, Bd.
19, S. 1350 [1973]) angewandt werden. Aus der Differenz der Mengen an freiem Cholesterin vor und nach der
Inkubation dividiert durch die Inkubationszeit ergibt sich der Wert für die LCAT-Aktivität.
Beispielsweise wird eine Versuchsprobe (ein Blutserum oder Plasma, jeweils 0,5 ml) zu 2 Teströhrchen A
und B hinzugegeben und hierzu wird ein Lecithir.substrat
(jeweils 0,1 ml) hinzugefügt Das Versuchsröhrchen A wird in einem Kühlschrank gehalten, oder nachdem
ein LCAT-Inhibitor (z. B. Cholsäure oder ein Alkalimetallsalz hiervon) hinzugefügt worden ist, wird das
Versuchsröhrchen A bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Versuchsröhrchen B wird bei 37°C
während 3 Stunden inkubiert Der Gehalt (jeweils 0,1 ml) der Versuchsröhrchen A und B wird hieraus
genommen und hierzu wird ein Reagens zur Messung des freien Cholesterins (3 ml. Gehalt: Cholesterinoxidase,
Peroxidase, Phenol und 4-Aminoantipyrin) (cf. W. Richmond, Clin. Chem. Bd. 20, S. 470 [1974])
hinzugegeben. Das Gemisch wird auf 37° C während 30 Minuten erhitzt und es wird die optische Dichte des
resultierenden Gemisches bei 500 nm gemessen. In getrennter Weise wird die optische Dichte der
Standardlösung, die eine konstante Konzentration an freiem Cholesterin enthält, in gleicher Weise gemessen.
Auf Grundlage der hierdurch gemessenen Werte wird die LCAT-Aktivität gemäß der nachfolgenden Gleichung
berechnet:
D Konzentration an freiem Cholesterin der Standardlösung (mg/100 ml),
T Inkubationszeit,
1.2 Körröktürwert, bezogen auf die Differenz der
Verdünnung der Versuchsprobe und der Standardlösung.
In alternativer Weise wird das Lecithinsubstrat (03
ml) zu einem Versuchsröhrchen A hinzugegeben und hierzu wird eine Vefsuchsprobe (ein Blutserum oder ein
Plasma, 0.5 ml) hinzugegeben und sie werden gut vermischt. In getrennter Weise wird zu Versuchsröhrchen
B und C 20 mMol Natriumcholat (jeweils etwa 0,05 ml) hinzugegeben. Der Gehalt (0,2 ml) des Versuchv
röhrchens A wird zu dem Versuchsröhrchen B gegeben, und es wird bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Daneben wird Versuchsröhrchen A bei 37° C während 2 Stunden inkubiert und sodann der Gehalt (0,2 ml) des
Versuchsröhrchens A zu Versuchsröhrchen C hinzugegeben. Zu den Versuchsröhrchen B und C wird das
gleiche Reagens zur Messung des freien Cholesterins, wie dies vorstehend erwähnt worden ist (jeweils 3 ml)
hinzugegeben, und sie werden sodann bei 37° C während 20 Minuten inkubiert Hiernach wird die optische Dichte
des resultierenden Gemisches bei 500 nm gemessen. In getrennter Weise wird die optische Dichte der
Standardlösung, die eine konstante Konzentration an freiem Cholesterin enthält, gemessen. Auf Grundlage
der hierdurch ermittelten Werte wird die LCAT-Aktivität gemäß der folgenden Gleichung berechnet:
U =
worin bedeutet:
D-I
(Π)
U= -D--L-10-1,2 (I)
E5
T
worin bedeutet:
U Einheit der LCAT-Aktivität Gttg/ml/h),
Ea optische Dichte der Versuchsprobe in Versuchsröhrchen
A,
Eb optische Dichte der Versuchsprobe in Versuchsröhrchen
B,
Es optische Dichte der Standardlösung,
U Einheit der LCAT-Aktivität (jim/l/h),
Eg optische Dichte der Versuchsprobe in Versuchsröhrchen
B,
Ec optische Dichte der Versuchsprobe in Versuchsröhrchen C,
Es optische Dichte der Standardlösung,
D Konzentration an freiem Cholesterin der Standardlösung (μ m/I),
T Inkubationszeit,
1,6 Korrekturwert, bezogen auf die Differenz der Verdünnung der Versuchsprobe und der Standardlösung.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele noch näher erläutert:
Beispiel 1
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
Zu Dipalmitoyl-lecithin (0,25 bis 0,5 g) wird TEN-PuF-ferlösung
(pH 7,4, 50 ml) und Nonion NS 215 (0,1 bis 0,5 g) hinzugegeben und dies wird gut vermischt Das
Gemisch wird auf etwa 500C während 5 bis 20 Minuten
zu dessen Auflösung erhitzt Nach Abkühlung wird zu dem Gemisch TEN-Pufferlösung bis zur Auffüllung zu
insgesamt 100 ml hinzugefügt
(B) Herstellung eines Färbemittels
Peroxidass (100 Einheiten), Phenol (200 mg), and
4-Aminoantipyrin (20 mg) werden in einer 0,1-m Phosphat-Pufferlösung (pH 6,7), die 0,05% (G/V) Triton
X-100 enthält, bis zu insgesamt 100 ml aufgelöst
(C) Herstellung der Enzymlösung
Cholesterinoxidase (50 bis 100 Einheiten) wird in einer O1Wm Phosphat-Pufferlösung (pH 6,7), die 0,1%
(G/V) Triton X-iÖÖ enthält, derart aufgelöst, daß sich
insgesamt 100 ml ergeben.
(D) Herstellung des Reagens zur Messung
des freien Cholesterins
des freien Cholesterins
Das Färbemittel und die Ehzymlösung werden im
Verhältnis 2 : 1 in Volumina vermischt.
(E) Messung der LCAT-Aktivität
Ein Blutserum (jeweils 0,5 ml) wird zu zwei !5
Versuchsröhrchen A und B hinzugegeben, und hierzu wird das Lecithinsubstrat (jeweils 0,1 ml) hinzugefügt.
Das Versuchsröhrchen A wird in einem Kühlschrank
'vi\T\i uüi
(B) Herstellung des Reagens zur Messung
des freien Cholesterins
des freien Cholesterins
Cholesterinoxidase (50 bis 100 Einheiten), Peroxidase (200 Einheiten), Phenol (4ÖÖ mg) und 4-Aminoantipyrin
(40 mg) werden in einer 0,1-m Phosphat-Pufferlösung
(pH 6,7) aufgelöst, die 0,10/0 (G/V) Triton X-100 enthält,
so daß sich insgesamt 300 ml ergeben.
(C) Messung der LCAT-Aktivität
In gleicher Weise, wie dies im Beispiel 1 beschrieben
worden ist, wird die LCAT-Aktivität unter Verwendung eines Blutserums (0,5 ml) und des Lecithinsubstrates (0,1
ml) gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die optische Dichte der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens A zu
0,261, diejenige der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens B zu 0,223 und diejenige der Standardlösung
(Gehalt an freiem Cholesterin: 50 mg/100 ml) zu 0,316,
während 3 Stunden inkubiert. Die Versuchsprobe (jeweils 0.1 ml) der Versuchsröhrchen A und B wird hier
herausgenommen, und hierzu wird das Reagens zur Messung des freien Cholesterins (jeweils 3 ml)
hinzugefügt. Das resultierende Gemisch wird bei 37° C während 30 Minuten gehalten. Die optische Dichte der
Gemische wird gegenüber einem Blindreagens gemessen. Als Ergebnis wird festgestellt, daß die Versuchsprobe
des Versuchsröhrchens A eine optische Dichte von 0,287 und die des Versuchsröhrchens B eine optische
Dichte von 0,243 aufweist.
Li gleicher Weise wird die optische Dichte der
Standardlösung (Gehalt an freiem Cholesterin: 50 mg/100 ml) gemessen. Als Ergebnis ergibt sich eine
optische Dichte von 0312.
Durch vorstehende Gleichung (I) wird die LCAT-Aktivität zu 28 Einheiten (/ig/ml/h) errechnet.
Beispiel 2
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
Dimyristoyl-lecithin (0,25 bis 0,5 g), 0,1-m Phosphat-Pufferlösung
(pH 7,4, 50 ml) und Emuigen 930 (0,2 bis 03 g) werden gut vermischt Das Gemisch wird während
5 bis 20 Minuten auf etwa 5O0C zu dessen Auflösung erhitzt Nach Abkühlung wird zur Auffüllung auf
insgesamt 100 ml 0,1-m Phosptet-Pufferlösung hinzugegeben.
(B) Messung der LCAT-Aktivität
In gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben worden ist wird die LCAT-Aktivität unter Verwendung
eines Blutserums (0,5 ml) und des Lecithinsubstrates (0,1 ml) gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die optische
Dichte der Versuchsprcbe des Versuchsröhrchens A zu 0,251, die der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens B
zu 0,221 und diejenige der Standardlösung (Gehalt an freiem Cholesterin: 50 mg/100 ml) zu O3I6 und die
LCAT-Aktivität beträgt 19 Einheiten.
40
55
Beispiel 3
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
Distearyl-lecithin (0,25 bis 0,5 g), 0,02-m Tris-Pufferlösung
(pH 7,4, 50 ml) und Tween 80 (etwa 0,5 g) werden gut vermischt Das Gemisch wird auf etwa 500C
während 5 bis 20 Minuten zu dessen Auflösung erhitzt Nach Abkühlung werden 0,02-m Tris-Pufferlösung bis
zur Auffüllung auf insgesamt 100 ml hinzugegeben.
60
65 Beispiel 4
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
Dipalmitoyl-lecithin (0,5 bis 1 g), TEN-Pufferlösung
(pH 7,4,50 ml) und Triton X-100 (etwa 0,2 g) werden gut
vermischt. Das Gemisch wird auf etwa 500C während 5 bis 20 Minuten zu dessen Auflösung erhitzt Nach
Abkühlung werden zu dem Gemisch TEN-Pufferlösung zu dessen Auffüllung bis zu insgesamt 100 ml
hinzugegeben.
(B) Herstellung des Reagens zur Messung
des freien Cholesterins
des freien Cholesterins
Cholesterinoxidase (50 bis 100 Einheiten), Peroxidase (200 Einheiten), Phenol (400 mg) und 4-Amino-antipyrin
(40 mg) werden in einer 0,1-m Phosphat-Pufferlösung
(pH 6,7) aufgelöst, die 0,1% (G/V) Triton X-IOO enthält,
so daß sich insgesamt 300 ml ergeben. Das Gemisch wird lyophilisiert Das lyophilisierte Produkt wird mit
destilliertem Wasser bis zu insgesamt 300 ml, wenn es verwendet wird, aufgefüllt
(C) Messung der LCAT-Aktivität
In gleicher Weise, wie dies im Beispiel 1 beschrieben worden ist wird die LCAT-Aktivität unter Verwendung
eines Blutserums (0,5 ml) und des Lecithinsubstrates (0,1 ml) gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die optische
Dichte der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens A zu 0,245, die der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens B
zu 0,217 und diejenige der Standardlösung (Gehalt an freiem Cholesterin: 50 mg/100 ml) zu 0314, während die
LCAT-Aktivität 18 Einheiten beträgt
Beispiel 5
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
Zu Dimyristoyl-lecithin (0,25 bis 0,5 g) wird TEN-Pufferlösung
(pH 7,4, 50 ml) hinzugegeben, und das Gemisch wird mit Ultraschall behandelt und es wird
Nonion NS 215 (0,1 bis 0,5 g) hinzugefügt und zur guten Auflösung gut durchmischt Zu dem Gemisch wird
sodann TEN-Pufferlösung zur Auffüllung auf insgesamt 100 ml hinzugegeben.
(B) Messung der LCAT-Aktivität
In gleicher Weise, wie dies im Beispiel 1 beschrieben
worden ist, wird die LCAT-Aktivität unter Verwendung eines Blutserums (0,5 ml) und des Lecithinsubstrates (0,1
ml) gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die optische Dichte der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens A zu
0,241, diejenige der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens B zu 0,219 Und diejenige der Standardlösung
(Gehalt an Cholesterin: 50 mg/100 ml) zu 0,313, während
die LCAT-Aktivität 14 Einheiten beträgt.
Ein Blutserum (jeweils 0,5 ml) wird zu zwei Versuchsröhrchen A und B hinzugegeben, und hierzu
wird ein beliebiges der Lecithinsubstrate, die in den Beispielen 1 bis 5 erzeugt worden sind (jeweils 0,1 ml)
hinzugegeben. Zu dem Versuchsröhrchen A werden 20-m Mol Natriumcholat (0,05 ml) hinzugefügt und bei
Raumtemperatur stehen gelassen. Das Versuchsröhrchen B wird bei 37°C während 3 Stunden inkubiert. Die
Versuchsprobe (jeweils 0,1 ml) der Versuchsröhrchen A und B wird herausgenommen, und es wird das Reagens
zur Messung des freien Cholesterins (jeweils 3 ml) hinzugefügt und das Gemisch bei 37°C während 30
Minuten erhitzt. Die optische Dichte des Gemisches wird gegenüber einer Blindlösung gemessen. Als
Ergebnis ergibt sich die optische Dichte der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens A zu 0,263, diejenige der
Versuchsprobe des Versuchsröhrchens B zu 0,230 und diejenige der Standardlösung (Gehalt an freiem
.Cholesterin: 50 mg/100 ml) zu 0,319, während die LCAT-Aktivität 21 Einheiten beträgt
Beispiel 7
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
Zu Distearyl-lecithin (0,25 g) wird TE-Pufferlösung (Tris: 0,02-m, EDTA: 0,001-m, pH 7,4, 30 ml)
hinzugegeben, und das Gemisch wird mit Ultraschall behandelt und hierzu Tween 20 (0,025 g) hinzugegeben.
Nach guter Durchmischung wird zu dem Gemisch TE-Pufferlösung bis zur Auffüllung auf insgesamt 100 ml
hinzugegeben.
(B) Messung der LCAT-Aktivität
Das Lecithinsubstrat (0,3 ml) wird zu Versuchsröhrchen A hinzugegeben, und hierzu wird ein Blutserum
(0,5 ml) hinzugefügt und gut durehmiseht. In getrennter Weise wird 20 mMvi Natriumcholat (jeweils etwa 0,05
ml) zu zwei Versuchsröhrchen B und C hinzugegeben. Zu Versuchsröhrchen B wird der Gehalt (0,2 ml) des
Versuchsröhrchens A hinzugegeben und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Gemisch des Versuchsröhrchens
A wird bei 37°C während 2 Stunden inkubiert Und sodann dessen Gehalt (0,2 ml) zu Versuchsröhrchen
C hinzugefügt. Zu den Versuchsröhrchen B und C wird das Reagens zur Messung des freien Cholesterins
(jeweils 3 ml) hinzugefügt und diese werden bei 37° C während 20 Minuten inkubiert. Die optische Dichte
dieser Versuchsproben bei 500 nm wird gegenüber einer Blindlösung gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die
optische Dichte der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens B zu 0,384 und die der Versuchsprobe des
Versuchsröhrchens C zu 0,352.
In gleicher Weise wird die optische Dichte der Standardlösung (Gehalt an freiem Cholesterin: 1000
μητι/l) gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die optische
Dichte der Standardlösung zu 0,377.
Durch die vorstehend erwähnte Gleichung (II) wird die LCAT-Aktivität als 68 Einheiten (μπι/1/h) ermittelt.
Beispiel 8
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates
Zu Dipalmitoyl-lecithin (0,25 g) wird TE-Pufferlösung
(30 ml) hinzugegeben und das Gemisch mit Ultraschall behandelt und hierzu Triton X-100 (0,025 g) hinzugegeben
und zu deren Auflösung gut durchmischt. Zu dem Gemisch wird TE-Pufferlösung bis zu einem Gesamtvolumen
von 100 ml hinzugegeben.
(B) Messung der LCAT-Aktivität
In gleicher Weise, wie dies in Beispiel 7 beschrieben worden ist, wird die LCAT-Aktivität unter Verwendung
eines Blutserums (0,5 ml) und des Lecithinsubstrates (0,3 ml) gemessen. Als Ergebnis wird die optische Dichte der
Versuchsprobe des Versuchsröhrchens B zu 0350, diejenige der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens C
zu 0308 und diejenige der Standardlösung (Gehalt an
freiem Cholesterin: 1000μΐη/1) zu 0,379 ermittelt,
während die LCAT-Aktivität 89 Einheiten beträgt
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (10)
1. Verfahren zur Messung der Aktivität von Lecithincholesterinacyltransferase, dadurch gekennzeichnet,
daß eine Versuchsprobe zu einer Lecithinsubslratlösung, die ein Lecithin und ein
nicht-ionisches oberflächenaktives Agens enthält hinzugegeben, das Gemisch inkubiert und sodann
die veränderte Menge an freiem Cholesterin in dem Reaktionssystem durch optische Analyse gemessen
wird.
Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lecithinsubstratlösung 2^j bis 10
mg/ml eines Lecithins und mindestens 0,01% (G/V) eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Agens in
einer Pufferlösung umfaßt
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß das nicht-ionische oberflächenaktive
Agens in einer Menge von 0,02 bis 0,5% (G/V) auf Basis der Leetthinsubstratlösung enthalten ist
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß das Lecithin in einer Menge von Z5 bis
5 mg/ml enthalten ist
5. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet daß die Inkubation bei etwa 37° C während
2 bis 4 Stunden durchgeführt wird
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß die Messung der optischen Dichte bei
500 nm durchgeführt wird.
7. Lecithinsubstratlösung zur Messung der Aktivität von LecitLnchoIesterinacyltransferase, gekennzeichnet
durch 2.5 bis IP mg/m! eines Lecithins und
mindestens 0,01% (G/v) eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Agens in einer Pufferlösung.
8. Lecithinsubstratlösung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-ionische oberflächenaktive
Agens in einer Menge von 0,02 bis 0,5% (G/V) auf Basis der Lecithinsubstratlösung
enthalten ist
9. Lecithinsubstratlösung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet daß das Lecithin in einer
Menge von 2,5 bis 5 mg/ml enthalten ist
10. Lecithinsubstratlösung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung unter
TEN-Pufferlösung, TE-Pufferlösung, 0,1-m Phosphat-Puffer-
und 0,02-m Tris-Pufferlösung ausgewählt ist
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| JP50053655A JPS51129293A (en) | 1975-05-02 | 1975-05-02 | Measurement method of activity of lecithin cholesteral acyl transferas e |
| JP641676A JPS5289994A (en) | 1976-01-22 | 1976-01-22 | Liquidous lecithin substrate for measurements of activity of lecithin cholesterol acyl trnsferase |
Publications (3)
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|---|---|
| DE2619252A1 DE2619252A1 (de) | 1976-11-04 |
| DE2619252B2 DE2619252B2 (de) | 1977-08-11 |
| DE2619252C3 true DE2619252C3 (de) | 1979-06-13 |
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ID=26340551
Family Applications (1)
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| DE19762619252 Expired DE2619252C3 (de) | 1975-05-02 | 1976-04-30 | Verfahren zur Messung der Aktivität von Lecithincholesterinacyltransferase und hierfür verwendbare Lecithinsubstratlösung |
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| GB (1) | GB1501561A (de) |
Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| US4499184A (en) * | 1982-06-01 | 1985-02-12 | Eastman Kodak Company | Analysis for total cholesterol using lecithin:cholesterol acyl transferase (LCAT) |
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1976
- 1976-04-30 GB GB1773376A patent/GB1501561A/en not_active Expired
- 1976-04-30 DE DE19762619252 patent/DE2619252C3/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2619252B2 (de) | 1977-08-11 |
| GB1501561A (en) | 1978-02-15 |
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