DE2619252B2

DE2619252B2 - Verfahren zur messung der aktivitaet von lecithincholesterinacyltransferase und hierfuer verwendbare lecithinsubstratloesung

Info

Publication number: DE2619252B2
Application number: DE19762619252
Authority: DE
Inventors: Toshihide Takarazuka Hyogo; Takayama Masaharu Osaka; Uesugi Akiyoshi Toyonaka; Tanimizu Isao Ibaraki; Kinosnita Heihachiro Hirakata; Shintani Kazuto Toyonaka; Osaka; Nagasaki (Japan)
Original assignee: Nippon Shoji Kaisha Ltd
Current assignee: Azwell Inc
Priority date: 1975-05-02
Filing date: 1976-04-30
Publication date: 1977-08-11
Also published as: DE2619252A1; DE2619252C3; GB1501561A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Aktivität von Lecithincholesterinacyltransferase (nachstehend als »LCAT« bezeichnet) und eine hierfür verwendbare Lecithinsubstratlösung.

LCAT stellt ein Enzym dar, welches in der Leber von Tieren erzeugt wird und freies Cholesterin und Lecithin in einen Cholesterinester und Lysolecithin im Blut umzuwandeln vermag. Die LCAT-Aktivität steht in enger Beziehung mit dem Ausmaß der Verletzungen hepatitischer Zellen. Wenn beispielsweise die Patienten eine akute Hepatitis aufweisen, ist die LCAT-Aktivität verringert, während bei den meisten Patienten, die eine chronische Hepatitis aufweisen, die Aktivität einen Normalwert besitzt. Daneben haben mehr als die Hälfte der Patienten, die eine Hepatozirrhose aufweisen, einen niedrigeren Aktivitätswert, während bei den Patienten mit Obstruktionsgelbsucht die Aktivität im Lauf der Verschlechterung der Krankheit verringert wird. Daher ist die Messung der LCAT-Aktivität für den klinischen Test der Leberfunktion der Patienten verwendbar.

Darüber hinaus steht die LCAT-Aktivität in enger Beziehung mit der Menge an freiem Cholesterin im Blut und weiterhin mit dem Ausmaß an Fettsubstanz (Fettsucht). Daher ist die Messung der LCAT-Aktivität auch für die Diagnose von Krankheiten, wie Lipidose und Diabetes nützlich.

Im allgemeinen kann Aktivität eines Enzyms durch die Reaktionsgeschwindigkeit, d. h. durch die veränderte Menge des Substrates oder des Produktes innerhalb eines festgelegten Zeitraumes, bestimmt werden, wenn eine vorgeschriebene Menge einer Versuchsprobe, die das Enzym enthält, unter festgelegten Bedingungen inkubiert wird. Beispielsweise wird im Fall der Messung der LCAT-Aktivität ein Blutserum oder Plasma bei 37°C inkubiert, welches die optimale Temperatur für die Kultivierung von LCAT darstellt, und sodann die veränderte Menge (/ig oder /<.m) an freiem Cholesterin (Substrat) gemessen. Die Aktivität an LCAT wird durch die veränderte Menge an freiem Cholesterin pro 1 ml (oder 1 1) des Blutserums pro Stunde (/^.g/ml/h oder μηι/l/h) wiedergegeben).

Die Reaktionsgeschwindigkeit nimmt mit der Abnahme der Substratmenge in dem Reaktionssystem, die auf die enzymatische Reaktion zurückzuführen ist, ab. Bei einer enzymatischen Reaktion bildet die Kurve der über der Inkubationszeit aufgezeichneten Subsiratmenge in dem Reaktionssystem üblicherweise nur im ersten Stadium der Reaktion etwa eine lineare Linie, weshalb die Enzymaktivität gewöhnlich durch die Reaktionsgeschwindigkeit im ersten Stadium der Reaktion wiedergegeben wird. Im Fall von LCAT ist die Kurve bei Inkubation einer Versuchsprobe bei 37°C jedoch nur innerhalb einer Stunde nach Beginn der Reaktion etwa linear. Daher sollte die Inkubationszeit kurz gehalten werden, um eine lineare Kurve zu erhalten. Bei einer derartig kurzen Reaktionszeit ist allerdings die veränderte Substratmenge derart gering, daß sie nach einem herkömmlichen Verfahren, in dem das freie Cholesterin durch optische Analyse festgestellt wird, nicht exakt gemessen werden kann.

Zur Messung der LCAT-Aktivität sind auch die Stokke-Norum-Methodik (K. T. Stokke und K. R. N ο r u m, Scand. J. Clin. Lab. Invest., Bd. 27, S. 21 [1971]) und eine übliche Substratmethodik (J. A. Glomset und J. L. Wright, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 89, S. 266 [1964]), in denen ein Radioisotop Verwendung findet, bekannt. Diese Verfahren sind jedoch sehr kompliziert und erfordern lange Inkubationszeit (5 bis 6 Stunden) sowie die Verwendung eines Radioisotops; sie werden deshalb für klinische Prüfungen kaum verwendet.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Messung der LCAT-Aktivität aufzufinden, das für die klinische Prüfung ohne Verwendung eines Radioisotops brauchbar ist, bei dem das freie Cholesterin vielmehr durch optische Analyse gemessen wird. Es wurde gefunden, daß die Reaktionszeit, innerhalb der die Kurve der Substratmenge/Inkubationszeit in einer etwa linearen Linie gehalten werden kann, durch Einbringung eines Lecithins in das Reaktionsgemisch verlängert werden kann, wobei eine Trübung des Reaktionssystems durch Zugabe eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoffes vermieden werden kann. Dadurch wird es möglich, die herkömmli-

ehe optische Analysenmethodik zur Messung des freien Cholesterin zuwenden.

Die genannte Aufgabe wird somit dadurch gelöst, daß b'ii einem Verfahren zur Messung der Aktivität der Lecithincholesterinacyltransferase eine Vcrsuchsprobe zu einer Lecithinsubstratlösung, die ein Lecithin und ein nicht-ionisches oberflächenaktives Agtsis enthält, hinzugegeben, das Gemisch inkubiert und sodann die veränderte Menge an freiem Cholesterin in dem Reaktionssystem durch optische Analyse gemessen wird.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Patentansprüchen 2 bis 6 und im Verfahren vorteilhaft verwendbare Lecithinsubstratlösungen sind in den Patentansprüchen 7 bis 10 beschrieben.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnung näher erläutert.

Die Erfinder haben angenommen, daß die Linearität der Kurve von Substratmenge/Inkubatioiiszeit in der enzymatischen Reaktion dadurch verlängert werden kann, daß der Versuchsprobe ein Lecithin zugefügt wird, welches ein Substrat für LCAT darstellt und haben die Kurve der Substratmenge/Inkubationszeit durch Zufügung verschiedenartiger Konzentrationen des Lecithins zu der Versuchsprobe aufgezeichnet. Das heißt, es wurden einige Substratlösungen mit verschiedenartigen Konzentrationen des Lecithins durch Zufügung des Lecithins zu einer Pufferlösung (pH 7,4) hergestellt, und eine vorgeschriebene Menge an Substrallösung wurde zu einer vorbeschriebenen Menge an Versuchsprobe hinzugefügt und das Gemisch bei 37°C während 4 Stunden inkubiert und sodann das freie Cholesterin in dem Reaktionssystem extrahiert und dessen veränderte Menge in einem Schema aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der F i g. 1 wiedergegeben.

Wie sich klar aus den Ergebnissen entnehmen läßt, wird in dem Fall, in dem kein Lecithin hinzugefügt worden ist, die Linearität der Kurve innerhalb einer Stunde verloren, während andererseits bei Lecithinzufügung die Linearität der Kurve während 3 Stunden (Gehalt an Lecithin in der Substratlösung: 2,5 mg/ml) und während 4 Stunden (Gehalt an Lecithin in der Substratlösung: 5 oder 10 mg/ml) aufrechterhalten werden kann, wobei die Lecithinzufügung die LCAT-Aktivität nicht beeinflußt. Somit kann die Linearität der Kurve der Substratmenge/Inkubationszeit während 2 bis 4 Stunden durch Zufügung der Lecithinsubstratlösung, die 2,5 bis 10 mg/ml Lecithin enthält, aufrechterhalten werden und die veränderte Menge an freiem Cholesterin exakt durch ein herkömmliches optisches Analysenverfahren gemessen werden. Wenn das Lecithin der Pufferlösung allein hinzugefügt wird, wird das Gemisch trübe, und wenn das Gemisch der hierdurch erhaltenen Versuchsprobe und Substratlösung inkubiert wird, ist es schwierig, die veränderte Menge des freien Cholesterin durch optische Analyse zu messen. Es ist daher erforderlich, die Substratlösung zum Zweck des Einsatzes der Methodik im klinischen Test transparent zu machen.

Es ist bekannt, daß eine Ultraschallbehandlung für die: Solubilisierung eines Gemisches nützlich ist. Wenn ein Gemisch eines Lecithins in einer Pufferlösung mit Ultraschall behandelt wird, kann dessen Trübheit etwas verringert werden, es treten jedoch innerhalb weniger Stunden gewisse Ausfällungen auf. Daher muß die Substratlösung mit Ultraschall immer bei der Verwendung behandelt werden, weshalb dies für klinische Testzwecke nicht geeignet ist. Es wurden daher verschiedenartige andere solubilisierungsmethodiken extensiv untersucht, wobei gefunden worden ist, daß nicht-ionische oberflächenaktive Stoffe verwendbar s sind, um die Lecithinsubstratlösung transparent zu machen oder zu solubilisieren, ohne daß unerwünschte Auswirkungen auf die LCAT-Aktivität auftreten.

Beispielsweise ist die Beziehung zwischen der Konzentration an Nonion NS 215 (Warenzeichen eines

ίο Polyoxyäthylenalkyl(C₉)-phenolätheis, hergestellt durch Nippon Oils and Fats C₁ Ltd.) und die LCAT-Aktivität (jug/ml/h) in der F i g. 2 gezeigt.

Wie aus F i g. 2 hervorgeht, wird die LCAT-Aktivität durch den nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoff in dessen Konzentration unter 0,5% (G/V) nicht beeinflußt. Darüber hinaus kann der nicht-ionische oberflächenaktive Stoff die Lecithinsubstratlösung bei Zufügung in einer Menge von 0,01% (G/V) oder mehr transparent gestalten, und wenn die Substratlösurig zuvor mit Ultraschall behandelt worden ist, wird diese durch Zufügung des nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoffes noch leicher transparent gestaltet oder solubilisiert.

Die nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoffe, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen beliebige herkömmliche nicht-ionische oberflächenaktive Stoffe, die das Lecithinsubstrat transparent gestalten können, und keine unerwünschten Wirkungen auf die Aktivität des LCAT nehmen, wie beispielsweise

.10 Polyoxyäthylenalkyläther,

Polyoxyäthylenalkylphenoläther,
Polyoxyäthylensorbitanalkylester,
Polyoxyäthylenalkylester,
Polyoxyäthylenalkylamine,

.15 Polyoxyäthylenalkylamide und Sorbitanalkylester.
Unter diesen oberflächenaktiven Stoffen stellen Polyoxyäthylenalkyläther, Polyoxyäthylenalkylphenoläther und Polyoxyäthylensorbitanalkylester bevorzugte Materialien dar. Geeignete Beispiele nicht-ionischer oberflächenaktiver Stoffe sind Triton X-100 (Warenzeichen füreinen Polyoxyäthylenisooclylphenyläther, hergestellt durch Röhm und Haas Co.), Emuigen 930 (Warenzeichen für einen Polyoxyäthylenalkyläther, hergestellt durch Kao Soap), Tween 20 und Tween 80 (Warenzeichen für ein Polyoxyäthylensorbitanrnonolaurat bzw. ein Polyoxyäthylensorbitanmonooleat, hergestellt durch Atlas Powder Co.), Nonion NS 215 (Warenzeichen für einen Polyoxyäthylenalkyl!(C.))-phenoläther, hergestellt durch Nippon Oils and Fats Co., Ltd.) od. dgl.

Diese nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoffe werden allein oder in einem Gemisch von zwei oder mehreren Arten in einer Menge von 0,01% (G/V) oder mehr, vorzugsweise 0,02 bis 0,5% (G/V) auf Basis des Lecithinsubstrates verwendet. Jedoch beeinflußt der nicht-ionische oberflächenaktive Stoff die LCAT-Aktivität, wie in F i g. 2 gezeigt ist, wenn diese gering ist, weshalb der nicht-ionische oberflächenaktive Stoff vorzugsweise in einer geringstmöglichen Menge ver-

fto wendet wird, wobei die am meisten bevorzugte Menge eiwa 0,025% (G/V) beträgt.

Das Lecithin wird in einer Menge von 2,5 bis 10 mg/ml, vorzugsweise 2,5 bis 5 mg/ml, verwendet.
Die gemäß der Erfindung verwendete Pufferlösung kann eine wäßrige Pufferlösung darstellen,, die das Lecithinsubstrat bei einem optimalen pH-Wert für LCAT (d. h. einen pH-Wert von etwa 7,4) halten kann und umfaßt TEN-Pufferlösungen (Tris, d. h. Tris(hydro-

xymethyl)aminomethan: 0,01-m, EDTA, d. h. Dinatriumäthylendiamintetraacetat: 0,001-m, und Natriumchlorid: 0,14-m), TE-Pufferlösung (Tris: 0,02-m, und EDTA: 0,001-m), 0,1-m Phosphat-Pufferlösung und 0,02-m Tris-Pufferlösung. Wenn der nicht-ionische oberflächenaktive Stoff in einer kleineren Menge verwendet wird, ist die Verwendung von TE-Pufferlösung bevorzugt.

Das Lecithinsubstrat kann durch Zufügung von 2,5 bis 10 mg/ml eines Lecithins zu einer Pufferlösung und vorzugsweise Behandlung des resultierenden Gemisches mit Ultraschall, und sodann Zufügung hierzu eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoffes in einer Menge von 0,01% (G/V) oder mehr, vorzugsweise 0,02 bis 0,5% (G/V) auf Basis der Lecithinsubstratlösung, hergestellt werden.

Die Menge an freiem Cholesterin in dem Reaktionssyslem vor und nach der Inkubation kann durch herkömmliche optische Analysenmethodiken gemessen werden. So kann z. B. eine Kombination von Digitonin mit einem Reagens, das unter dem Liebermann-Burchard-Reagens (cf. W. M. S ρ e r r y und M. W e b b, J. ßiol. Chem., Bd. 187, S. 97 [1950]), dem Zak-Henly-Reagens (et B. Z a k und R. C. Dickenman, Am. J. Clin. Path., Bd. 24, S. 1307 [1954]) oder einem o-Phthalaldehyd-Reagens (cf. A. Zlatkis und B. Zak, Anal. Biochim. Bd. 29, S. 143 [1969]) ausgewählt worden ist, verwendet werden. Oder es kann die Cholestcrinoxidasemethodik (cf. W. Richmond et al., Clin.Chem., Bd. 19, S. 1350[1973]) angewandt werden. Aus der Differenz der Mengen an freiem Cholesterin vor und nach der Inkubation dividiert durch die Inkubationszeit ergibt sich der Wert für die LCAT-Aktivität.

Beispielsweise wird eine Versuchsprobe (ein Blutserum oder Plasma, jeweils 0,5 ml) zu 2 Tcslröhrchen A und B hinzugegeben und hierzu wird ein Lecithinsubstrat (jeweils 0,1 ml) hinzugefügt, Das Vcrsuchsröhrchcn A wird in einem Kühlschrank gehalten, oder nachdem ein LCAT-Inhibitor (z. B. Cholsäure oder ein Alkulimetallsalz hiervon) hinzugefügt worden ist, wird das Vcrsuchsröhrchen A bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Vcrsuchsröhrchen B wird bei 37"C wahrend 3 Stunden inkubiert. Der Gehalt (jeweils 0,1 ml) der Vcrsuchsröhrchcn A und B wird hieraus genommen und hierzu wird ein Reagens zur Messung des freien Cholcsterins (3 ml, Gehalt: Cholcsterinoxidase, Peroxidnsc, Phenol und 4-Aminoantipyrin) (cf, W. Richmond, Clin. Chem., Bd. 20, S. 470 [1974]) hinzugegeben. Das Gemisch wird auf 37⁰C wtthrend 30 Minuten erhitzt und es wird die optische Dichte des resultierenden Gemisches bei 500 nm gemessen. In getrennter Welse wird die optische Dichte dor Standardlösung, die dnc konstante Konzentration an freiem Cholesterin enthält, in gleicher Weise gemessen. Auf Grundlage der hierdurch gemessenen Werte wird die LCAT-Aktivitöt gemäß der nachfolgenden Gleichung berechnet:

worin bedeutet!

D Konzentration an freiem Cholesterin der Standardlösung (mg/100 ml),

T Inkubationszeit,

1,2 Korrekturwert, bezogen auf die Differenz der Verdünnung der Versuchsprobe und der Standardlösung.

In alternativer Weise wird das Lecithinsubstrat (0,3 ml) zu einem Versuchsröhrchen A hinzugegeben und

ίο hierzu wird eine Versuchsprobe (ein Blutserum oder ein Plasma, 0,5 ml) hinzugegeben und sie werden gut vermischt. In getrennter Weise wird zu Versuchsröhrchen B und C 20 mMol Natriumcholat (jeweils etwa 0,05 ml) hinzugegeben. Der Gehalt (0,2 ml) des Versuchs-

is röhrchens A wird zu dem Versuchsröhrchen B gegeben, und es wird bei Raumtemperatur stehen gelassen. Daneben wird Versuchsröhrchen A bei 37°C während 2 Stunden inkubiert und sodann der Gehalt (0,2 ml) des Versuchsröhrchens A zu Versuchsröhrchen C hinzugegeben. Zu den Versuchsröhrchen B und C wird das gleiche Reagens zur Messung des freien Cholesterins, wie dies vorstehend erwähnt worden ist (jeweils 3 ml) hinzugegeben, und sie werden sodann bei 37°C während 20 Minuten inkubiert. Hiernach wird die optische Dichte

2s des resultierenden Gemisches bei 500 nm gemessen. In getrennter Weise wird die optische Dichte der Standardlösung, die eine konstante Konzentration an freiem Cholesterin enthält, gemessen. Auf Grundlage der hierdurch ermittelten Werte wird die LCAT-Aktivi-

.1" tat gemäß der folgenden Gleichung berechnet:

1,6

is worin bedeutet:

U Einheit der LCAT-Aktivität O)

En optische Dichte der Vcrsuchsprobc in Versuchsröhrchen B,

Ec optische Dichte der Vcrsuchsprobc in Versuchsröhrchen C,

Cv optische Dichte der Stnndardlösung, D Konzentration an freiem Cholesterin der Standard-

lösung (μ m/l),
•is T Inkubationszeit,

1,6 Korrekturwert, bezogen auf die Differenz Ία Verdünnung der Vcrsuchsprobc und der Standard lösung.

so Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele noch näher erläutert:

Beispiel 1 (A) Herstellung des Lcdlhlnsubslrnlcs

(I)

Ea optische Dichte der Vcrsuchsprobc in Versuchsröhrchen A,

En optische Dichte der Vcrsuchsprobc in Versuchsröhrchen B,

Es optische Dichte dor Standnrdlösung, Zu Dipalmitoyl-Iecithin (0,25 bis 0,5 g) wird TEN-Puf Erlösung (pH 7,4, 50 ml) und Nonion NS 215 (0,1 bli 0,5 g) hinzugegeben und dies wird gut vermischt. Dm Gemisch wird auf etwa 5O⁰C wtthrend 5 bis 20 Minuter (.0 zu dessen Auflösung erhitzt. Nach Abkühlung wird zi dem Gemisch TEN-Pufferlösung bis zur Auffüllung η amt loo!tjl.hlnzugefüj!t.

(B) Herstellung eines Färbemittels

(»5 Peroxldase (100 Einheiten), Phenol (200 mg), unc 4-Aminoantipyrln (20 mg) werden in einer 0,1-tt Phosphat-Pufferlösung (pH 6,7), die 0,03% (G/V) Trltor X-100 enthält, bis zu Insgesamt 100 ml aufgelöst,

(C) Herstellung der Enzymlösung

Cholesterinoxidase (50 bis 100 Einheiten) wird in liner 0,1 -m Phosphat-Pufferlösung (pH 6,7), die 0,1% G/V) Triton X-100 enthält, derart aufgelöst, daß sich nsgesaml 100 ml ergeben.

(D) Herstellung des Reagens zur Messung des freien Cholesterins

Das Färbemittel und die Enzymlösung werden im Verhältnis 2 :1 in Volumina vermischt.

(E) Messung der LCAT-Aktivität

Ein Blutserum (jeweils 0,5 ml) wird zu zwei Versuchsröhrchen A und B hinzugegeben, und hierzu wird das Lecithinsubstrat (jeweils 0,1 ml) hinzugefügt. Das Versuchsröhrchen A wird in einem Kühlschrank gehalten. Das Versuchsröhrchen B wird bei 37° C während 3 Stunden inkubiert. Die Versuchsprobe (jeweils 0,1 ml) der Versuchsröhrchen A und B wird hier herausgenommen, und hierzu wird das Reagens zur Messung des freien Cholesterins (jeweils 3 ml) hinzugefügt. Das resultierende Gemisch wird bei 37°C während 30 Minuten gehalten. Die optische Dichte der Gemische wird gegenüber einem Blindreagens gemessen. Als Ergebnis wird festgestellt, daß die Versuchsprobe des Versuchsröhrchens A eine optische Dichte von 0,287 und die des Versuchsröhrchens B eine optische Dichte von 0,243 aufweist.

In gleicher Weise wird die optische Dichte der Standardlösung (Gehalt an freiem Cholesterin: 50 mg/100 ml) gemessen. Als Ergebnis ergibt sich eine optische Dichte von 0,312.

Durch vorstehende Gleichung (I) wird die LCAT-Aktivität zu 28 Einheiten (^,g/ml/h) errechnet.

Beispiel 2 (A) Herstellung des Lccithinsubsirates

Dimyristoyl-Iccithin (0,25 bis 0,5 g), 0,1-m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4, 50 ml) und Emulgcn 930 (0,2 bis 0,3 g) werden gut vermischt. Das Gemisch wird während 5 bis 20 Minuten auf etwa 5O⁰C zu dessen Auflösung erhitzt. Nach Abkühlung wird zur Auffüllung auf insgesamt 100 ml 0,1-m Phosphat-Pufferlösung hinzugegeben.

(B) Messung der LCAT-Aktivitlit

In gleicher Weise wie in Beispiel \ beschrieben worden ist, wird die LCAT-Aktivitüt unter Verwendung eines Blutserums (0,5 ml) und des Lecithinsubstrates (0,1 ml) gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die optische Dichte der Versuchsprobe des Vorsuchsröhrchcns A zu 0,251, die der Versuchsprobe des Vorsuchsröhrchens B zu 0,221 und diejenige der Standardlösung (Gehalt an freiem Cholesterin! 50 mg/100 ml) au 0,316 und die LCAT-Aktlvltat betrugt 19 Einheiten,

Beispiel 3 (A) Herj^eHuji? des Lecithinsubstrates

Dis'tearyTiecithln (0,23ΪΐΓθ,3 g), Ö.O&ii TrÄfrerlö--¹ sung (pH 7,4,50 ml) und Twoen 80 (etwa 0,5 g) werden gut vermischt. Das Gemisch wird auf otwu 3O⁸C während 3 bis 20 Minuten zu dessen Auflösung erhitzt. Nach Abkühlung werden 0,0?>m Trls-Pufferlösung bis zur Auffüllung auf Insgesamt 100 ml hinzugegeben.

(B) Herstellung des Reagens zur Messung des freien Cholesterins

Cholesterinoxidase (50 bis 100 Einheiten), Peroxidase (200 Einheiten), Phenol (400 mg) und 4-Aminoantipyrin (40 mg) werden in einer 0,1-m Phosphat-Pufferlösung (pH 6,7) aufgelöst, die 0,1% (G/V) Triton X-100 enthält,

so daß sich insgesamt 300 ml ergeben.

(C) Messung der LCAT-Aktivität

In gleicher Weise, wie dies im Beispiel 1 beschrieben worden ist, wird die LCAT-Aktivität unter Verwendung eines Blutserums (0,5 ml) und des Lecithinsubstrates (0,1 ml) gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die optische Dichte der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens A zu 0,261, diejenige der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens B zu 0,223 und diejenige der Standardlösung (Gehalt an freiem Cholesterin: 50 mg/100 ml) zu 0,316, während die LCAT-Aktivität 24 Einheiten beträgt.

Beispiel 4 (A) Herstellung des Lecithinsubstrates

Dipalmitoyl-Iecithin (0,5 bis 1 g), TEN-Pufferlösung (pH 7,4,50 ml) und Triton X-100 (etwa 0,2 g) werden gut

vermischt. Das Gemisch wird auf etwa 5O⁰C während 5 bis 20 Minuten zu dessen Auflösung erhitzt. Nach Abkühlung werden zu dem Gemisch TEN-Pufferlösung zu dessen Auffüllung bis zu insgesamt 100 ml

jo hinzugegeben.

(B) Herstellung des Reagens zur Messung des freien Gholesterins

Cholcstcnnoxidasc (50 bis 100 Einheiten), Peroxidase

j5 (200 Einheiten), Phenol (400 mg) und 4-Amino-antipyrin (40 mg) werden in einer 0,1-m Phosphat-Pufferlösung (pH 6,7) aufgelöst, die 0,1% (G/V) Triton X-100 enthält, so daß sich insgesamt 300 ml ergeben. Das Gemisch wird lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wird mit

i|o destilliertem Wasser bis zu insgesamt 300 ml, wenn es verwendet wird, aufgefüllt.

(C) Messung der LCAT-Aktivität

In gleicher Weise, wie dies im Beispiel I beschrieben

,15 worden ist, wird die LCAT-Aktivität unter Verwendung

eines Blutserums (0,5 ml) und des Lecithinsubstrates (0,1 ml) gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die optische Dichte der Vnrsuchsprobc des Versuchsröhrchens A zu 0,245, die der Vcrsuchsprobc des Versuchsröhrchens B

5« zu 0,217 und diejenige der Standardizing (Gehalt nn

freiem Cholesterin: 50 mg/100 ml) zu 0,314, wahrend die LCAT-Aktivitat 18 Einheiten betragt.

Beispiel 5 ^ (A) Herstellung des Lecithinsubstrates

Zu Dlmyrlstoyl-lecHhln (0,25 bis 0,3 g) wird TEN-Puf· ferlösung (pH 7,4, 50 ml) hinzugegeben, und da; Gemisch wird mit Ultraschall behandelt, und es wire to Nonlon NS 215 (0,1 bis 0,3 g) hinzugefügt und zur guter Auflösung gut durchmischt. Zu dem Gemisch wire TEN-Pufferlösung zur_t Auffüllung auf insgesam hinzugegeben. * " *·

(B) Messung der LCAT-AktivlUÜ

In gleicher Welse, wie dies im Beispiel 1 beschriebet worden 1st, wird die LCAT-Aktivität unter Verwonduni eines Blutserums (0,5 ml) und des Lecithinsubstrates (0,

709832/41

ίο

ml) gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die optische Dichte der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens A zu 0,241, diejenige der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens B zu 0,219 und diejenige der Standardlösung (Gehalt an Cholesterin: 50 mg/100 ml) zu 0,313, während die LCAT-Aktivität 14 Einheiten beträgt.

Beispiel 6

Ein Blutserum (jeweils 0,5 ml) wird zu zwei ι ο Versuchsröhrchen A und B hinzugegeben, und hierzu wird ein beliebiges der Lecithinsubstrate, die in den Beispielen 1 bis 5 erzeugt worden sind (jeweils 0,1 ml) hinzugegeben. Zu dem Versuchsröhrchen A werden 20-m Mol Natriumcholat (0,05 ml) hinzugefügt und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Versuchsröhrchen B wird bei 37°C während 3 Stunden inkubiert. Die Versuchsprobe (jeweils 0,1 ml) der Versuchsröhrchen A und B wird herausgenommen, und es wird das Reagens zur Messung des freien Cholesterins (jeweils 3 ml) hinzugefügt und das Gemisch bei 37°C während 30 Minuten erhitzt. Die optische Dichte des Gemisches wird gegenüber einer Blindlösung gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die optische Dichte der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens A zu 0,263, diejenige der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens B zu 0,230 und diejenige der Standardlösung (Gehalt an freiem Cholesterin: 50 mg/100 rnl) zu 0,319, während die LCAT-Aktivität 21 Einheiten beträgt.

Beispiel 7
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates

Zu Dislearyl-Iecithin (0,25 g) wird TE-Puffcrlösung (Tris: 0,02-m, EDTA: O.OOi-m, pH 7,4, 30 ml) hinzugegeben, und das Gemisch wird mit Ultraschall bohandelt und hierzu Tween 20 (0,025 g) hinzugegeben. Nach guter Durchmischung wird zu dem Gemisch TE-Pufferlösung bis zur Auffüllung auf insgesamt 100 ml hinzugegeben.

(B) Messung der LCAT-Aktivitilt

Das Lecithinsubstrat (0,3 ml) wird zu Versuchsröhrchen A hinzugegeben, und hierzu wird ein Blutserum

.1°

(0,5 ml) hinzugefügt und gut durchmischt. In getrennter Weise wird 20 mMol Natriumcholat (jeweils etwa 0,05 ml) zu zwei Versuchsröhrchen B und C hinzugegeben. Zu Versuchsröhrchen B wird der Gehalt (0,2 ml) des Versuchsröhrchens A hinzugegeben und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Gemisch des Versuchsröhrchens A wird bei 37°C während 2 Stunden inkubiert und sodann dessen Gehalt (0,2 ml) zu Versuchsröhrchen C hinzugefügt. Zu den Versuchsröhrchen B und C wird das Reagens zur Messung des freien Cholesterins (jeweils 3 ml) hinzugefügt und diese werden bei 37°C während 20 Minuten inkubiert. Die optische Dichte dieser Versuchsproben bei 500 nm wird gegenüber einer Blindlösung gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die optische Dichte der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens B zu 0,384 und die der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens C zu 0,352.

In gleicher Weise wird die optische Dichte der Standardlösung (Gehalt an freiem Cholesterin: 1000 μπι/l) gemessen. Als Ergebnis ergibt sich die optische Dichte der Standardlösung zu 0,377.

Durch die vorstehend erwähnte Gleichung (II) wird die LCAT-Aklivität als 68 Einheiten (μΐτι/1/h) ermittelt.

Beispiel 8
(A) Herstellung des Lecithinsubstrates

Zu Dipalmitoyl-lecithin (0,25 g) wird TE-Pufferlösung (30 ml) hinzugegeben und das Gemisch mit Ultraschal! behandelt und hierzu Triton X-100 (0,025 g) hinzugegeben und zu deren Auflösung gut durchmischt. Zu derr Gemisch wird TE-Pufferlösung bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml hinzugegeben.

(B) Messung der LCAT-Aktivität

In gleicher Weise, wie dies in Beispiel 7 beschrieben worden ist, wird die LCAT-Aktivität unter Verwendung eines Blutserums (0,5 ml) und des Lecithinsubstrates (0,3 ml) gemessen. Als Ergebnis wird die optische Dichte der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens B zu 0,350 diejenige der Versuchsprobe des Versuchsröhrchens C zu 0,308 und diejenige der Standardlösung (Gehalt an freiem Cholesterin: ΙΟΟΟμηι/Ι) zu 0,379 ermittelt während die LCAT-Aktivität 89 Einheiten beträgt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Messung der Aktivität von Lecithincholesterinacyltransferase, dadurch ge- .s kennzeichnet, daß eine Versuchsprobe zu einer Lecithinsubstratlösung, die ein Lecithin und ein nichi-ionisches oberflächenaktives Agens enthält, hinzugegeben, das Gemisch inkubiert und sodann die veränderte Menge an freiem Cholesterin in dem Reaktionssystem durch optische Analyse gemessen wird.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Lecithinsubstratlösung 2,5 bis 10 mg/ml eines Lecithins und mindestens 0,01% (G/V) eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Agens in einer Pufferlösung umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch ?, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-ionische oberflächenaktive Agens in einer Menge von 0,02 bis 0,5% (G/V) auf Basis der Lecithinsubstratlösung enthalten ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Lecithin in einer Menge von 2,5 bis 5 mg/ml enthalten ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation bei etwa 37°C während 2 bis 4 Stunden durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der optischen Dichte bei 500 nm durchgeführt wird.

7. Lecithinsubstratlösung zur Messung der Aktivität von Lecithincholesterinacyltransferase, gekennzeichnet durch 2,5 bis 10 mg/ml eines Lecithins und mindestens 0,01% (G/V) eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Agens in einer Pufferlösung.

8. Lecithinsubstratlösung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-ionische oberflächenaktive Agens in einer Menge von 0,02 bis 0,5% (G/V) auf Basis der Lecithinsubstratlösung enthalten ist.

9. Lecithinsubstratlösung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Lecithin in einer Menge von 2,5 bis 5 mg/ml enthalten ist.

10. Lecithinsubstratlösung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung unter TEN-Pufferlösung, TE-Pufferlösung, 0,1-m Phosphat-Puffer- und 0,02-m Tris-Pufferlösung ausgewählt ist.