DE2512605B2 - Verfahren zur bestimmung des gesamt- cholesteringehaltes waessriger fluessigkeiten - Google Patents

Verfahren zur bestimmung des gesamt- cholesteringehaltes waessriger fluessigkeiten

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DE2512605B2 DE19752512605 DE2512605A DE2512605B2 DE 2512605 B2 DE2512605 B2 DE 2512605B2 DE 19752512605 DE19752512605 DE 19752512605 DE 2512605 A DE2512605 A DE 2512605A DE 2512605 B2 DE2512605 B2 DE 2512605B2
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Description

)ie Erfindung betriff! ein Verfahren zur Bestimmung Gcsami-Cholestcringchaltcs wäßriger. Choleste- :ster enthaltender Flüssigkeiten, insbesondere Blutum. bei dem vor der quantitativen Bestimmung des sami-CholcMcnnjrchahcs der !'■■ vsickcnen die Choerincstcr itü-.-.cIs einer l.ipasi mn Cholesterinerase-Aktiv iiat um ei Fre^etzen des CholcMi-nns Irolyiiert werden.
In den meisten bekannten klinischen Bestimmung*- ihivicn zur l:.rmmlung des Cholc.Merinpchalic«. im tscrum wird der »Gesarni-CholcMenngchah« beimt. De; ermittelte Wm ist ein Maß für die Menge im Sri-iim vorhandener Cholesterin?., der vorhandenen Cholesterinester und anderer Cholesterin-Abkömmlinge, beispielsweise Cholesterin-Vorläuferverbir-dungen, die auf die üblichen Testmethoden ansprechen, welche auf Reaktionen des »freien« Cholesterins beruhen und zunächst eine Überführung der Cholesterinester in »freies« Cholesterin erfordern.
So ist es beispielsweise bekannt, Blutserum zunächst mit einem organischen Lösungsmittel zu extrahieren, den Extrakt mit alkoholischer Kalilauge zu verseifen, das freigesetzte Cholesterin zu isolieren und zu bestimmen. Nachteilig an diesem Bestimmungsverfahren ist, daß zu seiner Durchführung korrosiv wirkende Chemikalien erforderlich sind, daß es zeitraubend ist und sich nicht leicht automatisieren läßt.
Aus der DT-OS 22 46 695 ist des weiteren eine enzymatische Bestimmungsmethode von freiem Cholesterin unter Verwendung einer Cholesterinoxidase bekannt. Dieses Verfahren erfordert jedoch die Hydrolyse der im Blutserum vorhandenen Cholesterinester in vergleichsweise umständlicher Weise, bevor die enzymatiscke Bestimmung erfolgen kann.
Aus der Zeitschrift »Clin. Chem.«. 19 (197J), Seite 476. ist ferner ein Lipase-Protease-System für dl·· Hydrolyse von Serum-Triglyzeriden bekannt. In der Arbeit wird jedoch ausdrücklich darauf hingewiesen, daß Choleste rinester in diesem System nicht hydrolysiert werden.
Aus der DT-AS 22 24 132 ist schließlich ein Verfahren. zur Bestimmung von Cholesterin bekannt, bei dem Cholesterin in wäßrigem Medium mit Cholesterinoxydase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes H2O2 bzw. Cholestenon bestimmt wird. Aus der DT-AS 22 24 132 ist es auch bekannt, vor der Bestimmung gebundenes Cholesterin durch enzymatische Verseifung mit Esterase, vorzugsweise mit Cholesterinesterase aus Leber oder Pankreas, in freies Cholesterin zu überführen.
Es bat sich jedoch gezeigt, daß die meisten im Serum enthaltenen Cholesterinester an Lipoproteine gebunden vorliegen und daß sich diese Cholesterinester-Lipoproteinkomplexe mit einer Esterase allein nur schwierig oder sehr langsam verseifen lassen.
Aufgabe der Erfindung ist es. ein gegenüber den bekannten Bestimmungsverfahren wirksameres Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes wäßriger. Cholesterinester enthaltender Flüssigkeiten. beispielsweise Blutserum, anzugeben, bei dem auch die an Lipoproteine gebundenen Cholesterinester zuverlässig erfaßt werden.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung des Gesami-Cholesteringehaltes wäßriger. Cholesterinester enthaltender Flüssigkeiten, beispielsweise Blutserum, bei dem vor der quantitativen Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes der Flüssigkeiten die Cholesterinester mittels einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität unter Freisetzen des Cholesterin* hydrolysiert werden, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man die Hydrolyse der Cholestennesier mr. einer Kombination aus einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität und einer Protease bett irki.
Nach erfolgter HydroKse der Cholesterinester karr, das freie Cholesterin der zu untersuchenden Flüssigkeiten in üblicher bekannter Weise quantitativ erfaßt werden, beispielsweise durch Gasflüssigkeits-ChrorTiciographie od»;r durch Bestimmung mit einer Cholesterin-Oxidase oder pach irgendeiner der anderen bekannten Methoden, die eine Bestimmung vor »freiem« Cholesterin ermöglichen.
Durch die Erfindung wird somit ein verbessertes, licheres, enzymatisches Verfahren für die Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes wäßriger, Cholesterinester enthaltender Flüssigkeiten geschaffen, bei dem eine quantitative Hydrolyse der Cholesterinester auf enzymatischem Wege erfolgt
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Hydrolyse der Cholesterinester komplexer wäßriger Lösungen, beispielsweise Blutserum, durch Behandlung der Flüssigkeiten mit einer Mischung, die pro Milliliter zu testende Flüssigkeit, z. B. Serum enthält:
etwa 600 bis etwa 1500 Einheiten einer Lipase mit Cholesterin-E'jterase-Aktivität und
etwa 50 bis etwa 500 Einheiten einer Protease.
Vorzugsweise wird beim Verfahren der Erfindung bei einer Temperatur von etwa 25 bis etwa 55°C gearbeitet. Der pH-Wert liegt vorzugsweise bei etwa 6,5 bis etwa 9,5.
Die Hydrolysedauer liegt in der Regel bei etwa 5 bis etwa 15 Minuten. Vorzugsweise erfolgt die Hydrolyse unter Bewegung der zu hydrolysierenden Flüssigkeit »owie in einer inerten Atmosphäre.
Bei den für die Enzymkombination als vorteilhaft angegebenen Lipase- und Proieaseakiivitäten enthält die Mischung etwa 20 bis 50 mg Lipase und etwa 5 his 50 mg Protease.
Eine Lipasen-Einheit ist dabei definiert als die Enzymmenge, welche in einer bestimmten Zeitspanne bei einem bestimmten pH-Wert und einer bestimmten Temperatur ein Mikromol Fettsäure ausgehend von einem Substrat mit veresteter Fettsäure freisetzt. Im Falle der vorzugsweise verwendeten Lipasen liegen die bevorzugten Bedingungen bei einer Minute bei einem pH-Wert von 7 und einer Temperatur von 37 C bei Verwendung von Olivenöl als Substrat.
Eine Proteasen-Einheit hydrolysiert Casein unter Erzeugung eines Farbäquivalentes zu einem Mikromol (181 μg) Tyrosin pro Minute bei einem pH-Wert von 7,5 und einer Temperatur von 370C (Farbe pro Folin-Ciocalteu Reagent).
Zu beachten ist dabei, daß, wenn der Grad der Enzym-Aktivität pro Gew.-Einheit Präparat ansteigt oder abnimmt, sich auch die Menge an zugesetztem Enzym-Präparat ändert.
In besonders vorteilhafter Weise liegt das Verhältnis von Lipase zu Protease auf Aktivitätsbasis bei etwa 3 bis etwa 10, wobei mindestens etwa 1000 Einheiten Lipase pro Milliliter Flüssigkeit, beispielsweise Blutserum verwendet werden. Die relative Lipasen-Aklivität zur Ester-Aktivität liegt normalerweise bei ?twa 10 bis etwa 50.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in vorteilhafter Weise derart durchgeführt, daß ein wäßriges Medium mit Cholesterinester, beispielsweise Blutserum, welches sowohl verestertes Cholesterin als auch freies Cholesterin enthält, mit einer Mischung einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität und einer Protease in Kontakt gebracht wird.
Die zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendete Lipase kann pflanzlichen oder tierischen Ursprunges sein.
Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden mit Lipasen erhalten, die von Mikroorganismen stammen. /.. B. der Lipase von Candida cylindracca.
Lipasen vom Chromobacterium viscosum. Variant paralipolyticum, roh oder gereinigt, die Lipase von Rhizopus delemar, gereinigt, beispielsweise wie von Fukumoto und Mitarbeitern in »J. Gen. Appii. Microbiol«, 10 (1964), Seiten 257 bis 265, beschrieben und Lipasen mit ähnlicher Aktivität, die von G. Bucolo und H. Davis in >>Clin. Chem.«, 19 (1973), Seite 476, beschrieben werden, zeigen nicht die erforderliche Cholesterin-Esterase-Aktivität.
Lipasen, die in vorteilhafter Weise zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendet werden können, sind im Handel erhältlich. Beispiele für
ίο handelsübliche, zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung geeignete Lipasen sind beispielsweise Weizenkeimlipasen (Hersteller Miles Laboratories of Elkhart, Indiana), ferner die Lipase 3000 (Hersteller Wilson Laboratories, Chicago, Illinois), Steapsin (Her steller Sigma Chemical Co., St. Louis. Missouri) — bei den beiden zuletzt genannten Enzymen handelt es sich um pancreatische Enzyme — sowie die Lipase M von Candida cylindracca (Hersteller Enzyme Development Corporation, New York, New York).
Die Auswahl einer fi.··- die Durchführung des Verfahrens geeigneten Lipase. d. h. die Bestimmung der Cholesterin-Esierase-Aktivitäi kann nach der im Anspruch 2 angegebenen Methode erfolgen, die später noch näher erläutert wird.
Zur Durchführung des Verlahrens der Erfindung können des weiteren übliche bekannte Proteasen verwendet werden, beispielsweise Chv motrypsin. Streptomyees griseus-Protease (im Handel erhältlich unter der Handelsbezeichnung »Pronase«). Aspergillus oryzae-Protease, Bacillus subtilis-Protease. Elastase. Papain und Bromelain. Auch können Mischungen derartiger Enzyme verwendet werden.
Einer der bedeutensten Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß erl'indungsgemäß beispielsweise unverdünntes Blutserum verwendet werden kann, da unverdünntes Serum genauso schnell hydrolysiert wird wie ein verdünntes Serum. Diese Tatsache ist insbesondere deshalb überraschend, weil bei den bisher bekannten üblichen Verfahren zur Bestimmung des Cholesteringehaltes von Blutserum stets eine Verdünnung des Blutserums erforderlich war
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Versuchen und Beispielen näher erläutert.
Bei den nachfolgend beschriebenen Versuchen wurde
4S ein handelsübliches Standardserum verwendet, und /war das Standardserum der Firma Warner Lambert Company »Validate«. Der Gesami-Cholcsteringehalt des Standardserums (Validate, Präparat 2560121) wurde dadurch überprüft, daß ein Anteil des Serums nach dem
so in »Anal. Chem.«, 43 (1971). Seite Ί96, beschriebenen Verfahren verseift wurde, worauf der Heptanextrakt durch Gasflüssigkeits-Chromatographie und nach der Licbermann-Burchard-Methode bestimmt wurde. Es wurden Werte von 160 bzw. 162 mg 100 ml erhallen.
ns Diese Werte stimmten mit den vom Hersteller angegebenen Werten von 148 bis 192 mg/100 ml überein.
Hydrolyse der Cholesterinester im Serum
<< Eine Mischung von 1 ml Cholestcrin-Standardserum mit 148 bis 192 mg Cholesterin/100 ml, 40 mg Lipase M, 40 mg Papain, 8 mg ^-Chymotrypsin und soviel einer 0,1 molaren Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung zur Erzielung eines Gesamtvolumens von 3 ml (mit
<<s einem pH-Wert von 7,2) wurde in einem 25 ml fassenden Kolben unter Stickstoff bei 50 C 10 Minuten lang unter Schütteln bei 250 Umdrehungen pro Minute inkubiert.
Die Hydrolyse erfolgte in einer Stickstoffatmosphäre, um die Gefahr der Einschleppung von Auto-Oxidationsprodukten des Cholesterins und seiner Ester auf ein Minimum herabzudrücken. Eine geeignete Korrektur derartiger Auto-Oxidationsfaktoren ermöglicht es jedoch auch, daß die Hydrolyse in normaler Atmosphäre durchgeführt wird.
Quantitative Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes durch Gasflüssigkeits-Chromatographie
1 ml Proben handelsübliches Standardserum mit bis zu 150 mg Cholesterin/100 ml wurden mit 5 ml Äthanol vermischt und 3 Minuten lang mit 1 ml Heptan, enthaltend 50 mg Octacosan/100 ml, geschüttelt.
Daraufhin wurden 5 ml Wasser zugesetzt, worauf die Mischung von neuem 3 Minuten lang geschüttelt wurde. Nach Trennung der Schichten wurden gleiche Anteile der Heptanschicht und N,O-Bis(trimethylsilyl)lrinuoracetatamid mit 1% Trimethylchlorsilan vermischt. Nach einer Reaktionsdauer von 5 Minuten wurden 1 μΐ Proben in einen Chromatographen (vom Typ Hewlett Packard F und M 810) mit einer einzigen Kolonne aus rostfreiem Stahl (0,3 cm χ 1,2 cm), gefüllt mit 3% Methylsilicon-Polymer, adsorbiert auf einem porösen Kieselsäurematerial (Chromasorb W, Hersteller Johns Manville Company, USA) injiziert.
Im übrigen wurden folgende Bedingungen cingehalxylaminmethode von J. Vonhoeffmayr und R F r i e d, Z. KHn. Chem. u. Klin, Biochem, 8 (1970), Seiu 134, bestimmt, die auf der quantitativen Uberführunj von Estern in Hydroxamsäuren beruht. Die erzielter Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammenge stellt.
Tabelle I
Hydroxylaminmethode mit
Cholesteryllinoleat-Suspension
Gas-Strömungsgeschwindigkeit
Ofentemperatur
Temperatur an der
Einspritzöffnung
Flammendetektor
Bereich
Dämpfung χ 1
Kartengeschwindigkeit
20 ml/Minute 2500C
2600C 265° C
1.23 cm/Minute
40
Enzym Freigesetztes
Cholesterin
in mg/100 ml
Lipase (Miles) 30
Lipase 3000 (Wilson) 42
Weizenkeim-Lipase (Miles) 59
Steapsin (Sigma) 59
Lipase M
(Enzyme Development Corp.) 68
Die Octacosan-Verweilzeit lag bei etwa 1 Minute. Die Cholesterin-Verweilzeit lag bei etwa 2"/2 Minuten. Die Testdauer lag bei etwa 4 Minuten. Unter den angegebenen Bedingungen war die Cholesterinmenge in der Probe proportional dem Spitzengewichtsverhähnis von Cholesterin zu Octacosan. Die angewandte Methode entsprach der Methode gemäß »Anal. Chem.«. 43 (1971), Seite 1196.
Bestimmung der
ChoitSterin-Esterasen-Aktivität von Lipasen
Bei den durchgeführten Versuchen wurde Cholesteryllinoleat als Substrat verwendet, da das Cholesteryllinoleat die Hauptesterkomponente menschlichen Blutserums darstellt und weil bei Verwendung von Cholesteryilinoleat vergleichsweise stabile Emulsionen erhalten werden können, im Vergleich zu gesättigten Estern, wie beispielsweise Palmitat
Eine Lösung von 200 mg redestilliertem Cholesteryllinoleat in 5 ml Äthyläther wurde unter kräftigem Rühren in 100 ml siedendes Wasser mit 430 mg Natriumcholat eingemischt 5 ml dieser Suspension wurden dann zu einer Lösung von 50 mg Lipasepräparat in 5 ml eines 0.1 molaren Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,0 zugegeben. Die Mischung wurde dann 2 Stunden lang bei 37°C unter Stickstoff und 400 Umdrehungen pro Minuten mktibiert. Die nach dieser Behandlung verbliebenen Cholesterinester wurden nach der Hydro-Sämtliche der getesteten Enzyme zeigen Esterase Aktivität. Die bevorzugte Lipase ist jedoch die Lipase W. aufgrund ihrer beträchtlich größeren Esterase-Aktivität wobei hinzukommt, daß es sich bei diesem Enzym un ein vergleichsweise billiges handelsübliches Enzyrr handelt. Bei Erhalt enthielt das Präparat etwa 800A Lactose, so daß auf Proteinbasis die Aktivität de Präparates etwa 5mal seiner Aktivität auf Gewichtsbasis entspricht.
Aktivität von Lipasen mit Serum-Cholesterinestern
Mischungen mit 40 mg Lipase in 1 ml Serum-Siandardlösung wurden 10 Minuten lang bei 50"C untci Stickstoff in 25 ml fassenden Kolben bei 250 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Die Mischungen wurden danr extrahiert, worauf der Cholesteringehalt in der be schriebenen Weise ermittelt wurde. Die getesteter Enzyme und die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in de: folgenden Tabelle Il zusammengestellt.
Tabelle!!
Esterase-Aktivität mit Sjrum als Substrat
Enzym
Cholesterin (mg/100 ml)
Ohne
Lipase 3000
Lipase M
23 26 36
Aus den Ergebnissen ergibt sich, daß die Lipase N und die Lipase 3000, d. h. zwei handelsübliche Lipaser zwar eine beträchtliche Esterase-Aktivität im Falle voi Cholesteryllinoleat-Emulsionen zeigen, jedoch eine seh geringe Aktivität im FaDe von Seramestern.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weite veranschaulichen.
Beispiel 1
Esterase-Aktivität von
Lipasen-Protease-Kombinationen auf
Serum-Cholesterinester
In der beschriebenen Weise wurden Kombinationei von Lipase M und verschiedenen Proteasen geteste
k>
Proteasen, mit Ausnahme von ^.-Chymotrypsin, wurden direkt dem zu testenden Serum zugesetzt, und zwar in Konzentrationen von 40 mg/ml. Das ix-Chymotrypsin wurde in einer Konzentralion von 8 mg/ml verwendet. Die Mengen von Cholesterin (mg/100 ml), die durch die verwendeten Kombinationen freigesetzt wurden, ergeben sich aus der folgenden Tabelle III.
Tabelle 111 L holcsterin
Ln/.γ mc (mjj/100 mi)
23
Ohne 3b
Lipasc M
Λ-Chymoiry psin (Sigma. 1 \pe 1 i. 37
3 λ kristallisiert)
Lipasc M + \-Chvnioir\psin
Papain (Sigiiut. rnhes Produkt. 29
i\pe 11) ί i-i
l.ipase M + Papain ι 14
LiIi1IM.' M -i \-C. Inmutrvpsiu -t l'apain
Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß in Gegenvwii'i von Proteasen, wie beispielsweise .vCnynuurypsin oder i'apain die'Cholesierin-Lsterasen-Aktivu.ii del U(MSC M um vLis piaMisen 4laene gesteiL·.·; wurde. Die Proteasen können scib.t e;;ie geriiiwi r.stei äsen- Aktiv itai aiii weisen, ihr n.uipis.iciiiicher L; icK.t ir-t jedoch zu sehen in Jem Anstieg der Zugangiichkeit der <L hoiesicnnester für die l.ipase durch Aufbrechen der Esier-Ltpoproicinkoiuplexe im Serum. Die meisten C holestei incsier des Serums sind bekanntlich an Lipoproteine gcouiiden. Damit somit beispielsweise die Lipasc M bezugücn Serum-Cholestcrinester optimal eiiekm und. muli eine Protease vorhanden sein.
B e ι s ρ ! c ι 2
Line Kviiie \on handelsüblichen Proteasen wurde aul inre KinigM--u /ur .steigerung der Lsteraseu-Akt:\ Hai .011 Lip^c M im Serum getestet.
ιJic Pioieascn wurden dem Serum direkt in den in der folgenden Tabelle IV angegebenen Mengen zugesetzt. Die Konzentration der Lipase M lag bei 40 mg/m! Serum. Die erhaltenen Ergebnisse sind in eier lulgenden Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IV
Protease Zugesetzte
Menge
(mg/ml) 		Cholesterin
20 (mg/100 ml)
1. Aspergillus oryzae 40 118
(Sigma Type II) 80 123
5 145
2. Streptomyces griseus 10 147
{Sigma Type VI) 20 144
5 140
3. Bacillus subtilis 10 140
(Sigma Type VIII) 20 118
5 135
4. Btomelain 10 114
(Sigma Grade II) 20 127
132
Protease 30 /nyesei/tc { liiilesicni
(Hersteller: Rohm and Menae
Haas. Co.. USA) (mg ml) (πιμ. Η«) πι!
■). Pronasc 20 80
(Calbiochem. Grade Λ) 40 127
Subtilisin BPN 80 161
b. (Sigma Type VlI) ö 133
Protease. Bakieriel
7. (Calbiochem. Grade B) 5 87
Lipase M
8. 10 142
9. — 3b
Samtliche der getesteten Proteasen steigern ganz offensichtlich die Aktivität der Lipase M etwas mehr als Λ-Chymotrypsir und l'apain. Ls ist jedoch schwierig, die Aktivitäten die>er Proteasen auf der Basis der von den Herstellern angegebenen Linheiten miteinander zu vergleichen, da verschiedene Bestimniungsmethodcii angewandt wurden. Im allgemeinen wurden die ah weniger rein beurteilten Knz.yme in höheren Konzentrationen verw endet.
Der Effekt des pH-Wertes aiii die Esicra<-e -\kti\ita: wurde mit verschiedenen Puffern und Enzymen, wie in den folgenden Beispielen 3 und 4 beschrieben, getestet.
Beispiel 3
Es wurden vier verschiedene Puffer in einem System mit drei Enzymen getestet. Jede getestete Probe bestand aus 1 ml Standard-Serum (»Validate«), 40 mg Lipase M, 40 mg Papain. 8 mg .x-ChviitOtrypsin und soviel einer 0,1 molaren Pufferlösung, daß das Gesamtvolumen der Probe 3 ml betrug.
Die Proben wurden in der beschriebenen Weise inkubiert und getestet. Die erhaltenen Ergebnisse ergeben sich aus der Zeichnung.
Die Messung des pH-Optimums bei diesen Bestimmungen mit Serum als Substrat können etwa zweideutig sein, da zwei verschiedene Enzyme (Lipase und Protease) erforderlich sind. Bei den durchgeführten Versuchen erwies sich Tns(hydroxymeihyl)aminomethan bei einem pH-Wert von 7.2 als besonders vorteilhaft.
Beispiel 4
Es wurden Versuche mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan als Puffersubstanz mit Kombinationen von Lipase M mit einer Reihe von Proteasen, wie beschrieben, durchgeführt. Die Menge einer jeden Protease, die verwendet wurde, entsprach der Menge, die die besten Ergebnisse der Versuche ergab, die in Tabelle IV niedergelegt sind. Es wurden drei pH-Werte zwischen 7 und 9 getestet. Die Bestimmungsmethode entsprach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode, mit der Ausnahme jedoch, daß die Zeit auf 5 Minuten vermindert wurde, so daß Cholesterinwerte erwartet werden konnten, die unter 160 mg/100 ml liegen, d.h.
dem maximalen Wert, der im Falle des Standard-Serum-Substrates (Validate) erreichbar ist.
|ede Inkubationsmischung enthielt 0.5 ml Standard-Serum (Validate). 0.5 ml einer 0.2 molaren Pufferlösung
609 547/441
ίο
von Tris(hydiOxymethyl)aminomeihan bei dem angegebenen pH-Wert, 40 mg Lipase M und der Protease in den angegebenen Mengen. Die Inkubationsdauer lag bei 5 Minuten bei 5O0C, 250 Umdrehungen pro Minute
Tabelle V
sowie unter Stickstoff. Die Proben wurden durch Gasflüssigkeits-Chromatographie in der beschriebenen Weise analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt.
Protease Menge Cholesterin (mg/100 ml) pH = 9,0
(mg) pH = 7,2 pH = 8.1 72
1. A. oryzae 80 66 86 52
2. Thermolysin 10 58 74
(Calbiochem. Grade A) 72
3. Bromelain 20 66 100 70
4. B. subtilis 5 54 65 30
5. S. griseus 5 56 58 40
6. Pronase 5 67 74 56
7. Subtilisin 5 56 66 22
8. Λ-Chymotrypsin 8 84 56 102
9. Protease, Bacteriel 10 86 100
(Calbiochem)
Die meisten dieser Proteasen zeigen ein Optimum pH-Wert von 8 bis 9 und A. oryzae-Protease bei einem
innerhalb der drei getesteten Werte. Die besten 25 pH-Wert von 8.1 sowie ,x-Chymotrypsin bei einem
Ergebnisse wurden mit Bromelain bei einem pH-Wert pH-Wert von 7.2 erhalten,
von 8.1. Calbiochem-Bacterial-Protease bei einem
Beispiel 5
1 ml unverdünntes Serum (1 ml »Validate«) wurde mit 50 mg Lipase M, Prouase in in der folgenden Tabelle Vl angegebenen Mengen und 12,1 mg Puffersubstanz (vgl. die Angaben in der folgenden Tabelle Vl) bei einem pH-Wert von 7,2 inkubiert. Inkubiert wurde 10 Minuten
lang bei 50° C unter Stickstoff bei 250 Umdrehungen pro Minute. Der Cholesteringehalt der Proben wurde durch Gasflüssigkeits-Chromatographie analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle Vl zusammengestellt.
Tabelle Vl
Hydrolyse von Cholesterinestern in unverdünntem Serum mit Lipase M und verschiedenen Proteasen
Prolease Menge Keine Zugaben Cholesterin Puffer*) Cholesterin Puffer**) Cholesterin
pH-Bereich (mg/100 ml) pH-Bereich (mg/100 ml) pH-Bereich (mg/100 ml)
(mg) 104 84 203****)
1. B. subtilis 5 7,10-6,89***) 116 8.61-7,85 100 6.98-6,64 205
2. Protease 5 7.03-6,52 8.52-7,71 7.01-6.82
(Calbiochem) 90 103 174
3. A. oryzae 80 6,90-6,27 119 7,60-7,25 52 6,72-6.70 165
4. Bromelain 20 6,78-6,56 91 8.25-7.93 51 6,82-6,45 162
5. ^-Chymotrypsin 8 7.08-6,93 134 8.65-8,19 64 7.00-6.94 160
6. Pronase 5 6,82-6,66 96 8.72-7.99 63 7,01-6,89 Π9
7. S. griseus 5 6,88-6,48 8,60-7.94 6.89-6.68
*) Die verwendete Puffersubstanz bestand aus Tris(hydroxymethyl)aminomethan in Form von »Trizma Base«, Handelsbe
zeichnung der Puffersubstanz der Firma Sigma Chemical Corp., USA. Die Puffersubstanz wurde in Form eines Pulver;
dem Serum zugesetzt
**) Verwendet wurde das HCl-SaIz von Tris(hydroxymelhyl)aminomethan, pH-Wert = 7.2 gefriergetrocknet, dem Serum ir
Form eines Pulvers direkt zugegeben.
***) pH-Wert zu Beginn der Inkubation und pH Wert am Ende der Inkubation.
*·**) Gelegentlich lagen einige Werte bei über 160 mg/100 ml bei Verwendung der gleichen Probe des Standard-Serum:
(Validate), geeicht bei 160 mg/100 ml.
Obgleich die quantitative Ermittlung des Gesamt-Cholesteringehaltes bevorzugt durch Gasflüssigkeits Chromatographie erfolgt lassen sich doch auch alle anderen bekannten Verfahren zur Bestimmung des Gesamtgehaltes an freiem Cholesterin (nach der Cholesterinester-Hydrolyse) anwenden. Hierzu gehören beispielsweise die von Pearson, Stern und McGarack, Carr und Drecker sowie Zak in »Fundamentals of Clinical Chemistry«. Tietz, N. W, W.
B. Saunders Co. (1970). Seite 355 bis 361, beschriebenen Methoden, ferner die bekannte Liebermann-Burchard-Methode sowie schließlich die Cholesterin-Oxidase-Methode. die in der DT-OS 22 46 695 beschrieben wird. Irr ietzteren Falle erfolgt die quantitative Bestimmung de;
f>5 gesamten freien Cholesteringehaltes durch Behandlung einer Cholesterinlösung mit Cholesterin-Oxidase unc Messung der Menge eines oder mehrerer der Produkt« dieser Oxidation.
Hierzu 1 Blatt Zcichnuncen

Claims (8)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes wäßriger, Cholesterinester enthalten- der Flüssigkeiten, bei dem vor der quantitativen Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes der Flüssigkeiten die Cholesterinester mittels einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität unter Freisetzen des Cholesterins hydrolysiert werden, ι ο dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse der Cholesterinester mit einer Kombination aus einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität und einer Protease bewirkt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gek^nnzeichnet daß eine Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität verwendet wird, die mindestens 25 mg Cholesterin/!«) ml in 2Stunden bei 37°C unter Stickstoff freisetzt, wenn 50 mg eines Präparates der Lipase in 5 ml einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung bei einem pH-Wen von 7,0 zur Behandlung einer Dispersion von Cholestcryllinoleat verwendet werden, die hergestellt wurde durch Dispergieren von 200 mg Cholestcryllinoleat in 5 ml Äthyläther und 100 ml siedendem Wasser, enthaltend 4JO mg j.s Natriumcholat.
3. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mischung von etwa 600 bis etwa 1500 Einheiten der Lipase und von etwa 50 bis etwa 500 Einheiten der Protease pro ml Flüssigkeit (Serum) verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren bei einer Temperatur von 25 bis 55°C und einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 9,5 durchfuhr!.
5. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man als Lipase mit Hsicrase-Aktivität eine von Mikroorganismen stammende Lipase verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5. dadurch gekennzeichnet, daß man als mikrobiologische Lipase die Lipasc von Candida c\ lindracca verw endet.
7. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man als Lipase eine Weizenkeimlipasc oder eine pancrcatischc Lipase verwendet.
8 Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man als Protease vChymoirvpsin. Papain, Bromelain. Bacillus subtilis-Protease. Aspergillus oryzae-Protease. Streptomycin griseus-Protease oder eine Mischung derartiger Proteasen 5c verwendet.
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