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Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung
von Glycerin und ein Reagens zur Durchführung dieses Verfahrens.
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Die Bestimmung von Triglyceriden (=Glycerinester von langkettigen
Fettsäuren) hat für die medizinische Diagnostik eine erhebliche Bedeutung. Ein erhöhter
Triglyceridspiegel im Blut...ist~ein wesentlicher Risikofåktor der Arteriosklerose.
Bei hohen Triglyceridwerten, also Hypertriglyceridämie, kommen Koronarinsuffizienz
und Herzinfakt häufiger vor als bei niedrigen Triglyceridwerten. Hypertriglyceridämie
begünstigt das Auftreten von Arteriosklerose und Kornonarerkrankungen und muß daher
frühzeitig erkannt-werden, damit die Behandlung rechtzeitig beginnen kann. Eine
rasche und zuverlässige durchführbare Methode zur Bestimmung von Triglyceriden bzw.
Glycerin hat daher große Bedeutung.
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Die bekannten und brauchbaren Methoden zur Triglyceridbestimmung basieren
auf der enzymatischen Hydrolyse der Triglyceride mittels Lipase/Esterase und Bestimmung
des freigesetzten Glycerins mittels Glycerokinase/Pyruvatkinase/Lactatdehydrogenase
(A.W.Wahlefeld, in Methods of Enzymatic Analysis IV, H.U. Bergmeyer, Ed. Academic
Press, New York, London, 1974, S. 1831-1835).
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Dieses bekannte Verfahren weist-jedoch wesentliche Nach-
teile
auf. Um Störungen durch Eigenfärbungen des Serums (Bilirubin, Hämoglobin) sowie
Trübungen zu eliminieren, müssen stets Probenleerwert-Bestimmungen durchgeführt
werden, was den Zeitbedarf pro Analyse sowie den Reagensverbrauch und damit die
Kosten erhöht. Ferner ergeben sich infolge der Anwesenheit zahlreicher empfindlicher
Coenzyme und Enzyme nur relativ geringe Haltbarkeiten für die Gebrauchslösungen.
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Neben diesem UV-Test sind auch Farbtests auf Basis einer Formazan-Bildung
bekannt. Letztere erlauben zwar die Bestimmung gegen einen Reagenzien-Leerwert,
sind jedoch relativ kompliziert aufgebaut und störanfällig.
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Schließlich ist ein Verfahren unter Verwendung einer Glycerinoxidase
bekannt, welche H202 und Glycerinaldehyd bildet, die bestimmt werden können. Dieses
Enzym wird jedoch entweder aus hochpathogenen Mikroorganismen, wie Pestbazillen,
oder nur in recht geringen Ausbeuten aus anderen Mikroorganismen erhalten.
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Es besteht daher ein Bedarf an einem Verfahren und einem Reagens,
welches die oben geschilderten Nachteile nicht aufweist. Insbesondere besteht ein
Bedarf an einem Verfahren, welches mit einem einfach in guter Ausbeute zugänglichen
Enzym durchgeführt werden kann und welches auch ohne Messung gegen Probenleerwerte
ausreichend genaue Ergebnisse liefert. Insbesondere soll ein derartiges Verfahren
als Indikatorreaktion eine Farbreaktion mit ausreichend großem Extinktionskoeffizienten
des gebildeten Farbstoffs (e > 18 cm2/t£Mol) verwenden können.
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Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur
Bestimmung von Glycerin, welches darin besteht, daß Glycerin in wäßrigem Medium
mit Galactoseoxidase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebil-
detes
H202 bzw. Glycerinaldehyd bestimmt werden.
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Galactoseoxidase EC 1.1.3.9 ist ein bekanntes Enzym,welches in Gegenwart
von Sauerstoff D-Galactose zu D-Galactosehexodialdose und H202 oxidiert. Es handelt
sich um ein kupferhaltiges Enzym. Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung,
daß sich dieses Enzym gut zur quantitativen Bestimmung von Glycerin verwenden läßt.
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Dies war nicht zu erwarten, -da zwar eine minimale Aktivität der Galactoseoxidase
(im folgenden als Gal-OD bezeichnet) gegenüber Glycerin bekannt war, aber nach Hamilton
et al. "Oxidases and Related Redox Systems", Ed. King, Bd. 1 (1971) die Umsatzrate
nur ein 150stel, bezogen auf Galactose beträgt. Da in Körperflüssigkeiten, in denen
die Glycerinbestimmung erwünscht ist, auch Galactose in freier oder gebundener Form
vorkommen kann, war eine unerträglich starke Störung durch Galactose zu erwarten
-gewesen, ganz abgee-hen davor, daß nach den bekannten Befunden eine quantitative
Umsetzung des Glycerins nicht vorhersehbar war. überraschenderweise wurde jedoch
gefunden, daß in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum, die befürchtete Störung
nicht auftritt.
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Das Verfahren der Erfindung kann auch bei vorheriger oder gleichzeitiger
enzymatischer Verseifung von Triglyceriden unter Freisetzung von Glycerin oder bei
vorheriger chemischer Verseifung von Triglyceriden durchgeführt werden. Zur chemischen
Verseifung eignet sich beispielsweise alkoholische Kalilauge, zur enzymatischen
Verseifung Lipase mit Esterase oder Esterase allein.
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Die Messung des Sauerstoffverbrauchs, der H202-Bildung oder der Glycerinaldehyd-Bildung
kann nach den hierfür bekannten Methoden erfolgen.
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Geeignete Methoden zur Bestimmung des Sauerstoffver-
brauchs
sind beispielsweise Gaschromatographie und Depolarisationsverfahren. Bevorzugt wird
die polarometrische Bestimmung mittels Sauerstoffelektrode, da sich dieses Verfahren
besonders zur automatischen Durchführung der Bestimmung eignet. Derartige Bestimmungsmethoden
sind bekannt. Besonders geeignet erwiesen sich die in den deutschen Offenlegungsschriften
21 30 340 und 21 30 308 beschriebenen Methoden zur polarometrischen Messung des
Sauerstoffverbrauchs in wäßrigen Medien. Gebildetes Wasserstoffperoxid kann sowohl
titrimetrisch als auch potentiometrisch, polarographisch und colorimetrisch sowie
enzymatisch bestimmt werden. Bevorzugt werden die enzymatischen Methoden unter Verwendung
von Katalase oder Peroxidase, da diese nicht nur äußerst spezifisch und zuverlässig
sind, sondern auch mit der Hauptreaktion unter Bildung von Wasserstoffperoxid auf
einfachste Weise kombiniert werden können. Als geeignet erwies sich auch die Bestimmung
mittels Katalase in Gegenwart von ß-Diketonen, z.B. Acetylaceton und Methanol bzw.
Äthanol oder Methylenglykol, sowie die Bestimmung mittels Peroxidase in Gegenwart
eines oder mehrerer Chromogene. Bei der Bestimmung mittels Katalase, Acetylaceton
und Methanol wird letzteres zu Formaldehyd oxidiert, der mit Acetylaceton eine Farbreaktion
eingeht, die gemessen werden kann. Bei der Bestimmung mittels Peroxidase werden
als Chromophor Verbindungen eingesetzt, die nach der Reaktion photometrisch bestimmt
werden können. Ein Beispiel für ein geeignetes Chromophor ist 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure
(ABTS). Ein anderes Beispiel ist das Indikatorsystem nach Trinder (Ann. Clin. Biochem.
6 (1969, 24-27), bei dem Phenol und 4-Aminoantipyrin (4-AAP) in Gegenwart von POD
und unter der Einwirkung von H202 oxidativ zu einem Farbstoff gekuppelt werden.
Anstelle von Phenol können andere aromatische Alkohole, wie p-Chlorphenol, Anilinderivate,
Naphthol, Naphtholderivate, Naphthylamin, Naphthylaminderivate, Aminochinoline,
Hy-
droxychinoline, Dihydroxyphenylessigsäure und ähnlich reagierende
Substanzen eingesetzt werden. Anstelle von 4-Aminoantipyrin können 4-Aminoantipyrin-Derivate,
wie 4-Aminoantipyrinamid , Phenylendiaminsulfonsäure, MBTH (Methylbenzothiazolonhydrazon)
S-MBTH (sulfoniertes Methylbenzothiazolonhydrazon), MBTH- und S-MBTH-Derivate sowie
ähnlich reagierende Verbindungen eingesetzt werden.
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Die Bestimmung des Glycerinaldehyds erfolgt mit Hilfe von Aldehydreagenzien,
vorzugsweise einem mit Aldehydgruppen unter Hydrazonbildung umsetzenden Hydrazinderivat,
wie z.B. 2,4-Dinitrophenylhydrazin. Das gebildete Hydrazon kann dann colorimetrisch
bestimmt werden.
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Als besonders geeignet und daher im Rahmen der Erfindung bevorzugt
wird die Umsetzung in Gegenwart von Peroxidase und einem Chromogen, wie ABTS. Es
wurde hier auch bei kurzen Reaktionszeiten ein linearer Zusammenhang zwischen Extinktionsdifferenz
und Glycerinkonzentration festgestellt, so daß sich diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens besonders zur kinetischen Bestimmung eignet, aber auch für Endpunktbestimmungen
verwendbar ist. Die erzielte Proportionalität zwischen Extinktion und Glyceringehalt
ist in der beigefügten Zeichnung in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 1 zeigt in
graphischer Darstellung den Zusammenhang zwischen Extinktion und Glyceringehalt.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführung der Erfindung erfolgt die Bestimmung
in Gegenwart von Glycerindehydrogenase und ihrem Coenzym NAD. Glycerindehydrogenase
EC 1.1.1.6 ist bekannt und beispielsweise aus Mikroorganismen, wie Enterobacter
aerogenes erhältlich und handelsüblich. Es wurde gefunden, daß in Gegenwart von
Glycerindehydrogenase (Glyc-DH} die Empfindlichkeit und Spezifität der Bestim-
mungsmethode
noch weiter verbessert wird. Bei dieser bevor zugten Ausführungsform der Erfindung
kann NAD im überschuß über die stöchiometrisch benötigte Menge zugesetzt werden,
vorzugsweise gibt man jedoch lediglich katalytische Mengen NAD und ein NAD-regenerierendes
System zu. Geeignete NAD-regenerierende. Systeme- sind beispielsweise beschrie.-ben
in der DE-OS 28 34 705. Ein bevorzugtes NAD-regenerierendes System zur Verwendung
im Rahmen der Erfindung besteht aus Lactatdehydrogenase und ihrem Substrat Pyruvat.
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Wird NAD im Überschuß zugesetzt, so kann anstelle von H202 auch reduziertes
NAD optisch gemessen werden.
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Bei dieser Ausführungsform der Erfindung sollte der pH--Wert zwischen
7,0 und 9,0 eingestellt werden, da in diesem Bereich sämtliche beteiligten Enzyme,
also Galactoseoxidase (Gal-OD), Glyc-DH und gegebenenfalls Peroxidase (POD) eine
für das Verfahren gut geeignete Aktivität aufweisen.
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überraschenderweise verläuft die Umsetzung in dieser Ausführungsform
glatt und quantitativ unter Verbrauch von molekularem Sauerstoff und Bildung von
112021 obwohl die beiden Enzyme Gal-OD und Glyc-DH um das Glycerin konkurrieren
und die Glyc-DH weder Sauerstoff verbraucht noch H202 bildet.
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Durch die bevorzugte kombinierte Anwendung von Gal-OD und Glyc-DH
wird der Empfindlichkeitsbereich mindestens bis 0,001 Mol/l herabgesetzt.
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Die Durchführung der Messung kann sowohl nach dem Endwertverfahren
gegen einen Reagenzienleerwert oder nach,dem kinetischen Verfahren erfolgen. Abbildung
3 der beigefügten Zeichnung zeigt, daß auch bei dieser Ausführungsform ein linearer
Zusammenhang wischen Glycerinkonzentration und Extinktionsdifferenz mindestens bis
herab zu Glycerin-
konzentrationen von 0,0005 MQlil gegeben ist.
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Auch diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann unter
gleichzeitiger enzymatischer Verseifung von Triglyceriden, bei welcher Glycerin
freigesetzt und erfindungsgemäß sofort bestimmt wird, durchgeführt werden.
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Das Verfahren eignet sich daher besonders auch für Analysenautomaten,
da sich durch Eichung mit einem einzigen Standard die Glycerinkonzentration exakt
bestimmen läßt.
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Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Reagens zur Bestimmung von
Glycerin, welches aus Galactoseoxidase und einem System zur Bestimmung von H2O2
und einem System zur Bestimmung von lI202 oder einem System zur Bestimmung von Glycerinaldehyd
besteht. In einer ersten bevorzugten Ausführungsform besteht dieses Reagens im wesentlichen
aus Galactoseoxidase, Peroxidase, wenigstens einem Chromogen und Puffer, einzeln
oder gemischt. Als Chromogen wird ABTS bevorzugt. Ein anderes bevorzugtes Farbindikator-System
ist das System nach Trinder.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Reagens
im wesentlichen aus Galactoseoxidase, Katalase, Acetylaceton, Methanol und Puffer,
einzeln oder gemischt.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße
Reagens im wesentlichen aus Galactoseoxidase und einem mit Aldehydgruppen unter
Hydrazonbildungreagierenden Hydrazinderivat sowie einem Puffer. Als Hydrazinderivat
wird 2,4-Dinitrophenyl-hydrazin bevorzugt.
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Die oben erwähnten bevorzugten Reagenskombinationen können außer den
aufgeführten obligaten Bestandteilen zusätzlich übliche Lösungsmittel, Stabilisatoren-oder/und
oberflä--
chenaktive Substanzen enthalten. Alle diese Zusatzstoffe
sind dem Fachmann bekannt und in Nachweissystemen für Wasserstoffperoxid bzw. Glycerinaldehyd
üblich. Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen Reagenzien zusätzlich noch
lipolytische Enzyme, wie Lipase/Esterase oder Esterase allein, so daß sie auch zur
Bestimmung von gebundenem Glycerin, welches in Form von Triglyceriden vorliegt,
eingesetzt werden können.
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Vorzugsweise enthalten die oben erwähnten Reagenskombinationen die
essentiellen Bestandteile in folgenden Mengenverhältnissen: 1) 15 bis 30 U/ml Galactoseoxidase
0,5 bis 100 U/ml Peroxidase 0,05 bis 20 ßMol/ml Chromogen sowie gegebenenfalls 0,001
bis 0,1 g/ml oberflächenaktives Mittel und Puffer, pH 6 bis 9; 2) 15 bis 30 U/ml
Galactoseoxidase 1 bis 10 ßMol/l 2,4-Dinitrophenylhydrazin und gegebenenfalls 0,001
bis 0,1 g/ml oberflächenaktives Mittel und Puffer, pH 6 bis 9.
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In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße
Reagens zusätzlich Glyc-DH, NAD undgegebenenfalls ein NAD-regenerierendes. System.
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Für die NAD-regenerierenden Systeme gilt das oben zum Ver fahren Mitgeteilte
in gleicher Weise. Das bevorzugte NAD-regenerierende System besteht aus Lactatdehydrogenase
(LDH) und Pyruvat. Die Gegenwart des NAD-regenerierenden Systems macht es möglich,
mit einer katalytischen Menge
des Coenzyms NÄD für die Glyc-DH
auszukommen, da im Laufe der Reaktion gebildetes NADH sofort durch das regenerierende
System wieder zu NAD aufoxidiert wird. In Gegenwart eines derartigen NAD-regenerierenden
Systems kann daher die NAD-Menge bis herab zu 0,05 ßMol/ml betragen.
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In dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reagens
beträgt die Glyc-DH-Menge zweckmäßig 5 bis 100 U/ml. Natürlich können auch größere
Mengen zugesetzt werden, dies ist jedoch weniger wirtschaftlich. Mengen unter 5
U/ml sind verwendbar, die durch den Glyc-DH erzielten Vorteile treten dann aber
nicht mehr in vollem Umfang auf.
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Geeignete Puffer lassen sich durch einfache Vorversuche feststellen.
Als gut geeignet haben sich Kaliumphosphat-, Glycylglycin- und Bicin-Puffer '(N,N-Bls
(2-hydroxyäthyl)-glycin) in Konzentrationen zwischen 0,05 und 0,2 Mol/l erwiesen.
Die oben angegebenen Enzymeinheiten für Galactoseoxidase beziehen sich auf Galactose
als Substrat, wie beispielsweise von Pazur et al. in "Carbohydrates, Nucleosides,
Nucleotides" 4, 147 (1977) beschrieben.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
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Beispiel 1 Proben: Wäßrige Glycerinlösungen Reagens: Kaliumphosphat-Puffer
(0,1 Mol/l, pH 7,5) Peroxidase (12500 U/I), Galactoseoxidase (20000 U/l) , ABTS
(2 mMol/l).
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Probe: Wäßrige Glycerinlösung im Bereich von 0,005 bis 0,06 Mol/l
Bestimmungsansatz: Meßstrahlung: Hg 405 nm; Schichtdicke der Küvette: 1 cm, Inkubationstemperatur:
25 0C.
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2,0 ml Reagens in Küvette pipettieren, 0,1 ml Probe zusetzen und mischen.
Extinktionsänderung von der zweiten bis zur zehnten Minute registrieren (hE2 10
) Für die quantitative Glycerinbestimmung wird dieses bE über einen Standard zur
Glycerinkonzentration in Beziehung gesetzt.
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Beispiel 2 Bestimmung von Glycerin in Serum Reagens: Kaliumphosphat-Puffer
(0,1 Mol/l, pH 7,5) Peroxidase (12500 U/l), Galactoseoxidase 20000 U/l) , ABTS (2
mMol/l) Probe: Als Probe wird Serum eingesetzt, dem unterschiedliche Mengen Glycerin
im Bereich von 0,006 bis 0,07 Mol/l zugeführt wurden.
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Bestimmungsansatz: Meßstrahlung: Hg 405 nm; Schichtdicke der Küvette:
1 cm; Inkubationstemperatur: 250C.
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2,0 ml Reagens in Küvette pipettieren, 0,1 ml Probe zusetzen und mischen.
Nach Beendigung der lag-Phase wird die Extinktionsänderung von der zweiten bis zur
zehnten Minute registriert. Die lineare Abhängigkeit zwischen Glycerinkonzentration
und Extinktionsänderung zeigt Fig.
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2 der Zeichnung.
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Beispiel 3 Reagens: Glycylglyin-Puffer, pH 8,0; 0,1 Mol/l (NH4)2SO4
0,16 Mol/l ZnSO4.7H20 0,1 mMol/l Na2CO3 0,078 Mol/l 4-Aminoantipyrin-NH2 0,5 mMol/l
Reagens:
p-Chlorphenol 10 mMol/l POD 10000 U/l LDH 10000 U/l Pyruvat 2,25 mMol/l Gal-OD 20000
U/l Glyc-DH 50000 U/l NAD+ 1,5 mMol/l Probe: Wäßrige Glycerinlösungen im Bereich.
von 0,001 bis 0,01 Mol/1 (statt der wäßrigen Clycerinlösungen können Serum, andere
Körperflüssigkeiten und auch beispielsweise Lebensmittelextrakte eingesetzt werden).
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Bestimmungsansatz: Meßstrahlung: 546 nm Schichtdicke: 1 cm Temperatur:
250C bis 370C 1,0 ml --Reagens --in die üvette' geben und mit 0,01 ml Probe starten.
Extinktion nach 30 Minuten gegen Reagensleerwert messen. Für die quantitative Bestimmung
wird dieses. AE über einen Standard zur Glycerinkonzentration in Beziehung gesetzt.
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Die Mitführung eines Probenleerwerts ist nicht erforderlich. Eine
durch Auftragen der Glycerinkonzentration gegen die Extinktion bei 546 nm erhaltene
Kurve ist in Abbildung 3 wiedergegeben.