DE69118516T2 - Kolorimetrische enzymatische analyse - Google Patents

Kolorimetrische enzymatische analyse

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Description

  • Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur quantitativen, kolorimetrischen Enzymanalyse von Analyten, insbesondere von solchen Analyten, die oxidiert werden können, um direkt oder indirekt Wasserstoffperoxid zu ergeben. Bevorzugte Aspekte der Erfindung betreffen auch kolorimetrische, enzymatische, Analyseteststreifen, die im wesentlichen von der Dosierung unabhängig sind, das heißt, daß die Genauigkeit der Vorrichtung nicht von der Anwendung einer genauen Menge einer Flüssigkeit abhängt, in der der Analyt vorhanden ist.
  • Die Verwendung von Enzymsystemen, um quantitative Messungen von Analytkonzentrationen nachzuweisen und zu erhalten, ist wohlbekannt. Verschiedene Enzymsysteme wurden mit den notwendigen Cofaktoren, Farbreagenzien, Puffern etc., die benötigt werden, um ein kompaktes, genaues analytisches Einmalelement herzustellen, stabilisiert und in Trockenreagenzformate eingearbeitet. Zu den Beispielen gehören: das Reflotron System; BCL Katalog; Boehringer Mannheim Technische Daten; das Ektachem System von Kodak-Eastman (US 3992158 und EP 0013156); der einfache Clinistix (Marke) oder Dextrostix (Marke) zur Glucosebestimmung (Ames Corporation), und viele andere. Zu den gemessenen Analyten gehören Ethanol (EP 0110173) (1983)); Kreatinin und Trigylcerid (Clin. Chem. 24 (1978), 1343); Cholesterin (EP-A-02562 (1981)); Harnsäure (US 3983005); Alaninaminotransferase (DE-32067231 (1982)) und Amylase (Clin. Chem. 24 (1978), 1343). Spätere Methoden haben die Einarbeitung immunologischer Reaktionen in Systeme der Trockenchemie ermöglicht, so daß die analytischen Methoden derart erweitert wurden, daß sie Substrate umfassen, für die eine direkte Enzymbestimmung nicht möglich war. Zu den Beispielen gehören Gentamycin, Thyroxin und Thyophyllin (Clin. Chem. 30 (1984), 194) und
  • Ein digitales Grenzwert-Farbkontrollsystem wurde offenbart, in dem Oxireduktasen, die NAD(P) als Cofaktor verwendet, bei der Zugabe des Substrates reagieren (wobei der Analyt gemessen wird) und das entsprechende Produkt und NAD(P)H erzeugt (EP 0279988 (1987)). Das NAD(P)H wurde durch Umsetzung mit einem Tetrazolium-Salz nachgewiesen, wobei das Enzym Diaphorase verwendet wurde, um die Farbentwicklung zustande zu bringen. Das Farbkontrollsystem hat die Fähigkeit von Diaphorase benutzt, NaD(P)H zu oxidieren. Bei Anwesenheit eines NAD(P)H-Überschusses hat das Enzym das Tetrazolium-Salz als Substrat akzeptiert. Diese Reaktion kann so eingestellt werden, daß sie Einfärbungen bei Niveaubereichen des Analyts durch Veränderung der Menge des konkurrierenden Substrats erzeugt.
  • Dieses Verfahren hat Nachteile. Die verwendeten Enzyme machen die Zugabe eines teuren Cofaktors notwendig. Dehydrogenase-Enzyme sind in trockenem Zustand verhältnismäßig instabil. Die Anzahl der Farbstoffsysteme, die verwendet werden können, ist begrenzt, und somit ist der Bereich der wahrnehmbaren Färbungen gering. Auch die Farbintensität neigt dazu gering zu sein, so daß die Empfindlichkeit solcher Systeme verringert wird.
  • Die EP-A-133481 offenbart einen Ethanol-Einmalteststreifen, bei dem die Farbreaktion proportional der Ethanol-Konzentration ist.
  • Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung weist die Vorrichtung für eine kolorimetrische Enzymanalyse ein Testelement auf, das einen Träger enthält, wobei der Träger eine Zone trägt, die eine getrocknete Enzymzusammensetzung, eine vorbestimmte Menge eines Thiol-Mediators und einen Farbstoff enthält, und wobei die Enzymzusammensetzung so aufgebaut ist, daß sie bei Kontakt der Zone mit einem Analyt Wasserstoffperoxid erzeugt, wobei der Farbstoff bei der Umsetzung mit Wasserstoffperoxid eine kolorimetrische Anzeige liefert, wobei die kolorimetrische Anzeige in Gegenwart des Mediators reversibel ist, und der Mediator so ausgelegt ist, daß er, bis er erschöpft ist, Wasserstoffperoxid abfängt und dadurch die kolorimetrische Anzeige verhindert.
  • Ein Testelement kann einen Teststreifen oder eine alternative Form aufweisen, die dem Fachmann bekannt ist. Der Begriff "Teststreifen" wird nachstehend aus Gründen der Bequemlichkeit verwendet.
  • Auf einem einzelnen Streifen kann eine Vielzahl von Zonen zur Verfügung gestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung bietet Vorteile, die vorher nicht zu erlangen waren. Ein scharfer und deutlich sichtbarer, von der Konzentration des Analyts abhängiger, Endpunkt, ist sehr vorteilhaft. Obwohl Teststreifen bekannt sind, die die Anwesenheit von mehr als einer Minimalmenge eines Analyts anzeigen, waren einfache quantitative Streifen unzuverlässig. Komplizierte mechanische Anordnungen waren daher vorgeschlagen worden. Die vorliegende Erfindung erleichtert die einfache Herstellung dosierungsunabhängiger Streifen. Anordnungen, bei denen eine abgemessene Flüssigkeitsmenge verwendet werden muß, sind unbequem und anfällig für Fehler.
  • Bei einer bevorzugten Anordnung in Übereinstimmung mit dieser Erfindung ist die Anzeige im wesentlichen unabhängig von der Flüssigkeitsmenge, die auf den Träger aufgebracht wird. Eine ausreichende Flüssigkeitsmenge sollte aufgebracht werden, um die Zonen, die Reagenzien enthalten, zu sättigen, aber jede weitere Flüssigkeitsmenge, die bei den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung vorhanden ist, wird daran gehindert, in diese Zonen zu penetrieren.
  • Gemäß bevorzugten Aspekten der vorliegenden Erfindung ist eine Vielzahl von Zonen angeordnet, um eine Anzeige einer entsprechenden Vielzahl inkrementeller Werte der Analytkonzentration zur Verfügung zu stellen. Zum Beispiel können Endpunkte, die einer Anzahl von Alkoholkonzentrationen entsprechen, so ange zeigt werden, daß die Anzahl der Zonen, in denen die kolorimetrische Anzeige sichtbar ist, dem Anwender eine quantitativen Bewertung der Blut- oder Speichel-Alkoholkonzentration zur Verfügung stellt.
  • Die Zonen werden vorzugsweise mit Zwischenräumen auf dem Streifen angeordnet. Die Zonen können so aufgebaut sein, daß sie ähnliche kolorimetrische Anzeigen beim Erreichen ihres entsprechenden Endpunktes anzeigen. In einer anderen Ausführungsform kann die Auswahl entsprechender Farbstoffe die Anzeige verschiedener Färbungen ermöglichen, um zum Beispiel anzuzeigen, ob die Analytkonzentration oberhalb oder unterhalb eines vorgewählten Grenzwertes liegt. Die Auswahl geeigneter reaktionsfähiger Kombinationen von Farbstoffen und Thiolen ergibt die reversible Reaktion, die die Klarheit des Endpunktes steigert. Zu geeigneten Farbstoffen gehören Kombinationen von 4-Aminoantipyrin gekoppelt mit substituierten Phenolen; substituierten Anilinen; diamino-substituierten Aromaten; N,N-disubstituierten Phenylendiaminen, gekoppelt mit den obengenannten Phenolen, Anilinen und Aromaten oder amino-substituierten Heterocyclen, zu denen Pyrazolone und Pyrimidine gehören; substituierte Pyrimidine gekoppelt mit den obengenannten Kopplungsmitteln; Tetramethylbenz idin; substituierte Napth-1-ole; 9-Ethylcarbazol und andere Verbindungen, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff "Farbstoff" betrifft Verbindungen, die ihre Färbung ändern können oder bei Anwesenheit von Wasserstoffperoxid oder anderer Zwischenprodukte farbig werden. Es können auch Redoxfarbstoffe oder Materialien, die kondensieren, um Farbstoffe zu bilden, zur Verfügung gestellt werden.
  • Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung weisen eine Peroxidase auf, die adaptiert wurde, um die Umsetzung des Farbstoffs und Wasserstoffperoxid zu katalysieren.
  • Obwohl eine große Anzahl von Mediatoren in Systemen quantitativer Enzymnachweisverfahren verwendet werden kann, wie zum Beispiel in der US 4042329 (Hochstrasser) vorgeschlagen, ist die Mehrzahl kommerziell nicht akzeptabel. Wir haben gefunden, daß aus dem weiten Bereich der möglichen Reduktionsmittel eine Auswahl an Thiolen besonders vorteilhaft ist.
  • Der Mediator, der als Peroxid-Abfangmittel dient, kann aus den vielen Thiolen, die erhältlich sind, ausgewählt werden. Zu bevorzugten Mediatoren gehören Thiolsulfonate, zum Beispiel Natrium-mercaptoalkylsulfonate, einschließlich Natrium-mercaptoethansulfonat und Natrium-mercaptopropansulfonat; Dithioerythritol; Dithiothreit und das Natriumsalz der Thioglycolsäure, obwohl die letztgenannte Verbindung luftempfindlich ist und einen unangenehmen Geruch hat. Polymere Mediatoren mit Thiolgruppen, wie thiolysiertes Dextran, zum Beispiel Mercaptodextran, können auch verwendet werden. Zusätzlich zu einer wirksamen Umsetzung mit Wasserstoffperoxid sind bevorzugte Mediatoren auch in Wasser löslich sowie lager- und auch verwendungsstabil. Eine übermäßig lange Stabilität gegenüber -Oxidation in Lösung ist nicht wichtig. Farbverstärker, Farbbeiz mittel und Inhibitoren können zugegeben werden, um die Farbreaktion zu modifizieren und zu verstärken. Promotoren, Cofaktoren und dergleichen können auch verwendet werden.
  • Zu den Enzymzusammensetzungen, die verwendet werden können, gehoren einzelne Oxidasen oder Gemische davon. Diese können an immunologisch aktive Moleküle konjugiert sein, um immunologische Bestimmungen zu ermöglichen. Zu diesen Zusammensetzungen können Promotoren oder Coenzyme gehören, und sie können auch Verbindungen enthalten, die hinzugefügt wurden, um die Enzyme im Trockenzustand zu stabilisieren. Die Enzymzusammensetzung kann Wasserstoffperoxid direkt durch Umsetzung mit dem Analyt erzeugen. In einer anderen Ausführungsform kann die Zusammensetzung Wasserstoffperoxid indirekt durch Umwandlung des Produktes der Enzymreaktion erzeugen.
  • Die Zonen der bevorzugten Vorrichtung können mit einer mikroporösen Deckschicht versehen sein. Diese dient dazu, die Reagenzien von der Flüssigkeit, die auf den Teststreifen aufgebracht werden, zu trennen. Feste Partikel, wie Blutzellen, die die kolorimetrische Anzeige stören können, werden von den Reagenzien getrennt. Das Absorptionsvermögen der darunterliegen den Matrix wird durch die Deckschicht begrenzt, so daß eine beträchtliche Dosierungsunabhängigkeit erreicht wird. Die Geschwindigkeit der Enzymreaktion wird erhöht. Dieses unerwartete Ergebnis ist sehr vorteilhaft, da die kolorimetrische Anzeige schneller entwickelt wird. Dies ist besonders wichtig für Teststreifen-Anwendungen. Dieser Effekt kann auflokal erhöhte Sauerstoffkonzentrationen zurückzuführen sein, die durch das kleine Volumen an Flüssigkeit in der Reagenszone verursacht wird.
  • Die mikroporöse Deckschicht kann aus jedem geeigneten Material ausgewählt werden, wozu Ethylcellulose, Celluloseacetat und substituierte Cellulosederivate gehören. Die Deckschicht kann von einer organischen Phasenlösung auf die Oberfläche des Teststreifens aufgegossen werden.
  • Eine Membran kann so angeordnet werden, daß sie die enzymhaltige Zone abdeckt. Diese kann dazu dienen, das Volumen der Flüssigkeit zu begrenzen, die der enzymhaltigen Zone zur Verfügung steht, so daß praktisch eine vollständige Dosierungs unabhängigkeit geboten wird. Die Membran kann auch eine Trenneinrichtung enthalten, um Blutzellen und andere Partikel von den Reagenzien abzutrennen. Reaktionen für zusätzliche Reaktionsstufen können über der Membran angeordnet sein, zum Beispiel zum Abscheiden von Lipoproteinen niedriger Dichte zur Bestimmung von Lipoproteinen hoher Dichte. Vorbereitende Enzymreaktionen, z.B. Lipase-katalysierte Reaktionen, können in einer Schicht durchgeführt werden, die über der Membran angeordnet ist. Hierdurch kann die Abneigung hydrophober Verbindungen überwunden werden hydrophile Membrane zu penetrieren.
  • Zu den Analyten, auf die die vorliegende Erfindung anwendbar ist, gehören Alkohol, Cholesterin, Lactat, Hamsäure, Glycerin, Triglyceride, Glutamat, Glucose, Cholin, NADH und viele andere. Die Enzymzusammensetzung kann gemäß dem zu bestimmenden Analyt aus Alkoholoxidase (insbesondere aus Hansenula polymorpha, weil dieses Enzym eine gute Gebrauchsstabilität hat, so daß sich nützliche Lagereigenschaften bieten), Cholesterinoxidase, NADH-Oxidase (um zu ermöglichen, daß Dehydrogenasen verwendet werden können), ausgewählt werden. Ethanol kann unter Verwendung von Alkoholoxidase und Meerrettichperoxidase bestimmt werden. Zu alternativen Peroxidasen gehören Lactoperoxidase und Microperoxidase.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch ein Verfahren zur kolonmetrischen Enzymanalyse angeben, das die Verwendung der vorstehend offenbarten Vorrichtung umfaßt. Die Reagenzien können auf den Träger durch Drucken aufgebracht werden, zum Beispiel durch Siebdruck und Maskendruck. Dies erleichtert die kommerzielle Herstellung der Teststreifen oder anderer Vorrichtungen gemäß dieser Erfindung.
  • Das Verfahren kann weiterhin die Anwendung einer mikroporösen Schicht oder Deckschicht für die Enzymzusammensetzung und andere Reagenzien umfassen. Eine Membran kann anschließend oder alternativ aufgebracht werden.
  • Bei bevorzugten Analyseverfahren wird eine Flüssigkeitsmenge, die den Analyt enthält, auf den Träger aufgebracht, vorzugsweise auf die Deckschicht oder eine darüberliegende Membran oder ein Reaktionskissen, und sie kann mit der Reagenszusammensetzung in Berührung kommen, nachdem sie durch eine solche Membran oder durch solch ein Kissen hindurchgetreten ist. Wenn die Zusammensetzung mit der Flüssigkeit gesättigt ist, kann die Membran entfernt oder abgewischt werden, um eine Inaugenscheinnahme der kolorimetrischen Anzeige zu ermöglichen.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden die Enzyme in Übereinstimmung mit der Offenbarung der WO 90/05182 stabilisiert. Diese Druckschrift offenbart den Schutz von Enzymen gegen Denaturierung beim Trocknen durch Vermischung mit wässsrigen Lösungen kationischer Polyelektrolyte und cyclischer Polyole. Gemische von Lactit, Sorbit, Inositol, Lactose, Maltose oder Sucrose können in Verbindung mit DEAE-Dextran oder entsprechenden geladenen Polymeren verwendet werden.
  • Die Polyolmenge kann in einem bevorzugten Bereich von 1 bis 20%, stärker bevorzugt 2 bis 10%, am meisten bevorzugt 5 bis 10%, liegen. Der Polyelektrolyt, vorzugsweise DEAE-Dextran oder Chitosan, kann ein MW von 5000 bis 500000, vorzugsweise von 5000 bis 20000, stärker bevorzugt 5000 bis 10000, haben. Eine Menge von 0,1 bis 10%, insbesondere 0,5 bis 2%, wird bevorzugt. Der pH-Wert, bei dem die Enzyme getrocknet werden, ist wichtig und sollte durch einfache experimentelle Untersuchungen optimiert werden. Alkoholoxidase kann zum Beispiel bei pH 7,8 getrocknet werden, während Cholesterinoxidase bei pH 5 oder 9 getrocknet werden kann.
  • Abhängig von dem betreffenden Enzym können anionische Polyelektrolyte anstelle von kationischen Polyelektrolyten verwendet werden.
  • Eine bevorzugte Vorrichtung in Übereinstimmung mit dieser Erfindung weist einen Teststreifen auf, der eine Zone oder eine Vielzahl von Zonen oder Bereiche trägt, die den Enzym-Mediator und die Farbstoffzusammensetzung enthalten. Die Unterlage ist vorzugsweise undurchdringlich und trägt einen oder mehrere Segmente von Trägermaterial, wobei jedes Segment eine Zone oder einen Bereich festlegt. Die Analysezonen können mit absorptionsfähigem Material umgeben sein, das so angeordnet ist, daß es überschüssige Analytflüssigkeit, die auf die Oberfläche des Teststreifens aufgebracht wurde, absorbiert. Das Trägermaterial kann auf der Unterlage mit herkömmlichen Mitteln befestigt werden. Klebstoffe, die verwendet werden, enthalten vor zugsweise keine biochemisch wirksamen oder inhibierenden Bestandteile, die den Reaktionsprozeß der Enzymverbindungen behindern können. Es kann eine Lösung eines Polymers, aus dem der Unterlagestreifen gebildet ist, in einem entsprechenden Lösungsmittel verwendet werden. Die Analysebereiche können somit auf einem Polyolefin-Unterlagestreifen befestigt werden, indem der Unterlagestreifen unter Verwendung von Trichlorethan oder einem anderen entsprechenden Lösungsmittel erweicht wird.
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können eine Vielzahl von Analysezonen oder -bereichen jeweils eine unterschiedliche Menge eines Mediators enthalten und dadurch so aufgebaut sein, daß sie eine entsprechende, vorbestimmte Menge des Analyts nachweisen. Ethanol kann somit in Konzentrationen von 300, 500 und 800 mg/l&supmin;¹ auf entsprechenden Bereichen des Teststreifens nachgewiesen werden. Die Farbstoffe können für jeden Bereich gleich oder verschieden sein. Die unterschiedlich gefärbten Farbstoffe können so zusammengestellt sein, daß sie unterschiedliche Analytkonzentrationen anzeigen.
  • Diese Erfindung wird anhand von Beispielen, die aber nicht einschränkend sind, unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher beschrieben, von denen:
  • Figur 1 bis 5 Kurven sind, die die Ergebnisse der Beispiele 1 bis 5 zeigen;
  • Figur 6 eine Querschnittsansicht eines Teststreifens gemäß dieser Erfindung ist;
  • Figur 7 eine Querschnittsansicht eines weiteren Teststreifens gemäß dieser Erfindung ist;
  • Figur 8 eine Draufsicht des Testreifens, der in Figur 7 gezeigt wird, ist;
  • Figur 9 die Draufsicht einer Vorrichtung gemäß dieser Erfindung ist;
  • Figur 10 ein Querschnitt durch die Vorrichtung von Figur 9 ist; und
  • Figur 11 eine weitere Vorrichtung gemäß der Erfindung zeigt. Die nachfolgenden experimentellen Verfahren wurden verwendet.
    • 1) Enzyme
  • Alkoholoxidase (EC 1.1.3.13), isoliert und gereinigt aus einer methylotrophischen Hefe (Hansenula polymorpha), wurde zugegeben, um eine Konzentration von 100 bis 300 Einheiten cm&supmin;³, vorzugsweise 200 Einheiten cm&supmin;³ zu ergeben.
  • Peroxidase (EC 1.11.1.7), isoliert und gereinigt aus Meerrettich (Sigma Typ II), wurde in einer Konzentration von 10 bis 200 Einheiten cm&supmin;³ , vorzugsweise 100 Einheiten cm&supmin;³ verwendet. Lactoperoxidase oder Microperoxidase können auch verwendet werden.
    • 2) Stabilisatoren
  • Diese wurden vor allem zugegeben, um die Enzyme zu stabilisie ren, insbesondere Alkoholoxidase (EC 1.1.3.1.3). Die Stabihsatoren wurden bis zu einer Endkonzentration von 50 mg cm&supmin;³ im Fall von Inositol und Dextran zugegeben. Die Kombination von Lactit und Diethylaminoethyldextaran (DEAE-Dextran) wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 mg cm&supmin;³ bzw. 10 mg cm&supmin;³ zugegeben.
    • 3) Puffer
  • Verschiedene Puffersysteme können verwendet werden. Es wurden zum Beispiel Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7, bis 8,0 verwendet, wobei die Molarität zwischen 20 und 100 mM variiert wurde. Ein bevorzugter Puffer war 3(N-morpholin)propansulfonsäure (MOPS), der die Reaktion und die Farbentwicklung unterstützte. Er wurde bei einem pH-Wert von 7,8 bis 8,0 bei 10 bis 100 mM verwendet.
    • 4) Nachweissysteme
  • Es existieren viele und verschiedenartige Peroxid-Nachweissysteme. Das nicht-kanzerogene Benz idinderivat 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin entwickelt bei der Umsetzung mit Peroxid und Peroxidase eine blaue Farbe und wurde häufig bei Trockenstreifenraktionen verwendet. Diese Verbindung wurde untersucht, und es wurde gefunden, daß sie als Hydrochloridsalz ungeeignet war und in einigen Fällen beim Trocknen gefärbte Streifen erzeugte, oder beim Entwickeln überhaupt keine Farben bildete. Die freie Base jedoch, die aus einer organischen Phase über die Enzyme gelegt wurde, war akzeptabel.
  • Es wurde gefunden, daß andere Systeme, die substituierte Aniline oder Phenole zusammen mit heterocyclischen Verbindungen, wie 4-Aminoantipyrin (4AAP) oder 3-Methyl-2-benzothiazolonhydrazon (MBTH) umfassen, stabiler sind und zufriedenstellende Färbungen erzeugten, wenn sie in Gegenwart von Peroxidase mit Peroxid reagierten. Es können auch N,N-disubstituierte Phenylendiamine, tetrasubstituierte Pyrimidine, 9-Aminoethylcarbazol oder in 4-Stellung substituierte 1-Naphthole verwendet werden. Die bevorzugten Farbstoffsysteme sprechen auf die Mediatorreaktion an, die in Gegenwart von dem jeweiligen zugeordneten Puffer/Farbbeizmittel/Additiv verwendet wird.
  • Die Konzentration der verwendete heterocyclischen Farbstoffe wurde im Bereich von 10 bis 50 mM gehalten.
    • 5) Mediatoren
  • Verschiedene Mediatoren wurden verwendet. Zu diesen gehörten Cyste in, Cysteinhydrochlorid, Natriummercaptoethylsulfonat, Natriummercaptopropylsulfonat, Dithioerythritol, reduziertes Glutathion, Mercaptodextran, Thioglycolsäure, Thiopyridin, 2- Thiouracil und 2-Mercaptothiazolin. Es können weitere Mediatoren verwendet werden, z.B. Cysteamin, Cysteinethyl- oder methylester, 2-Mercaptopyridin, Bisulfite und Sulfite, die Tautomere mit S-H Bindung haben, sind auch nützlich und ökonomisch, sind aber unbeständig in saurer Lösung.
  • Die bevorzugten Mediatoren waren Cystein, Cysteinhydrochlorid und Natriummercaptoalkylsulfonate. Es wurde gefunden, daß sie das Enzym nicht inhibieren oder bei Raumtemperatur instabil sind.
    • Beispiel 1 Grenzwerttest für Glucose
  • Filterpapier Whatmann_ 3mm Güteklasse Chromatographie wurde mit einer Reihe Lösungen gesättigt, die folgendes in 1,0 ml, pH-Wert 7,9, 100 mM MOPS-Puffer enthielten:
  • Glucoseoxidase 200 Einheiten
  • Peroxidase 100 Einheiten
  • Inositol 50 mg
  • 4-Aminoantipyrin 20 mMolar
  • 3-Hydroxy-2,4,6-tribombenzoesäure 25 Molar
  • Rinderserumalbumin 30 mg
  • Die Konzentration des Mediators (Cystein)wurde von 1 mg bis auf 80 mg in Schritten von 1 mg verändert.
  • Das gesättigte Papier wurde 30 Minuten lang bei 30 bis 35ºC in einem Vakuumofen getrocknet, und es wurden Scheiben (5 mm) aus dem getrockneten Papier ausgeschnitten und auf Papier oder einer Karte durch Anheften mit einer Kunststofflösung (Lösungsmittel: 1,1,1-Trichlorethan) befestigt. Standard-Glucoselösungen wurden verwendet, um die Scheiben zu entwickeln, wobei 8µl zugegeben wurden. Die endgültige Farbausbildung wurde unter Verwendung eines Dr. Lange Mikrofarbreflektometer gemessen. Die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse sind graphisch in Figur 1 dargestellt.
  • Beispiele 2 und 5 Grenzwerttest für Cholesterin Filterpapier (Whatman 3mm Güteklasse Chromatographie) wurde mit einer Reihe Lösungen gesättigt, die folgendes in 1,0 ml, pH-Wert 7,0, 20 mM MOPS-Puffer, enthielten: Cholesterinoxidase 50 Einheiten
  • Peroxidase 100 Einheiten
  • Lactit 50 mg
  • DEAE-Dextran 10 mg
  • 4-Aminoantipyrin 20 mMolar
  • 3-Hydroxy-2,4,6-tribrombenzoesäure 25 mMolar
  • Natriumcholat 5 mg
  • Die Konzentrationen der Mediatoren Cystein (Beispiel 2) und Natriummercaptoethansulfonat (Beispiel 5) wurden von 1,0 bis auf 7,0 mg cm&supmin;³ in der Endlösung verändert. Alle nachfolgenden Schritte waren wie bei Beispiel 1, außer daß Standard-Serumproben, die Cholesterin enthielten (Sigma Lipid E) verwendet wurden, um die Scheiben zu entwickeln. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2, Figur 2 und Tabelle 5, Figur 5 gezeigt.
    • Beispiele 3 und 4 Grenzwerttests für Alkohol
  • Der Aufbau dieser Tests war genau wie in Beispiel 1, außer daß die Glucoseoxidase durch Alkoholoxidase ersetzt wurde. In Beispiel 3 wurde 3-Hydroxy-2,4,6-tribrombenzoesäure als Farbstoffkomponente verwendet, wohingegen in Beispiel 4 N,N-Bishydroxyethyl-3-toluidin verwendet wurde. In beiden Fällen war der Mediator Cystein mit 12 mg bis 8 mg cm&supmin;³ Die gebildeten Scheiben wurden unter Verwendung von wässrigen Standard-Ethanollösungen entwickelt. Die Ergebnisse werden in den Tabellen 3 und 4 und den Figuren 3 und 4 gezeigt.
  • Die Figuren 6 und 7 veranschaulichen den Aufbau der Teststreifen gemäß der Erfindung sind. Der Teststreifen, der im Querschnitt in Figur 6 gezeigt wird, weist eine nicht-absorptionsfähige Trägerunterlage auf, die eine absorptionsfähige Karte 2 trägt, wobei die Karte eine Vielzahl von Perforationen enthält, in denen enzymhaltige Scheiben 3 angeordnet sind. Die Scheiben 3 können zylindrisch sein, obwohl auch andere Konfigurationen, die eine Verbindung mit der umgebenden absorptionsfähigen Karte erleichtert, verwendet werden können. Die Scheiben 3 werden auf der Unterlage unter Verwendung eines inerten Klebstoffes befestigt, zum Beispiel gelöster Kunststoff in Trichlorethan. Bei der Verwendung des Teststreifens wird die zu analysierende Flüssigkeit, zum Beispiel alkoholhaltiger Speichel, auf den Teststreifen aufgebracht, wie in Figur 6 ge zeigt. Eine Überlagerung der Flüssigkeit über die Enzymscheibe 3 und die umgebende Absorptionsmittelkarte 2 erleichtert die Absorption überschüssiger Flüssigkeit in die Karte, damit ein genau abgemessenes Aufbringen von Flüssigkeit auf die Enzymscheibe zur Verfügung gestellt wird. Wasserstoffperoxid, das durch Oxidation von Ethanol in der Flüssigkeit erzeugt wird, wird durch den Mediator abgefangen, bis der Mediator erschöpft ist. Überschüssiges Ethanol in der Flüssigkeitsprobe, das oberhalb des gewählten Grenzwertes oder Endpunktes liegt, erzeugt Wasserstoffperoxid, das nicht abgefangen wird und das den Farbstoff oxidiert, so daß eine Farbreaktion hervorgerufen wird.
  • Figur 7 veranschaulicht eine andere Ausführungsform der Erfindung, bei der eine Absorptionsmittelschicht 5 zwischen zwei undurchlässigen Schichten 6 und 7 angeordnet ist. Die enzymhaltigen Scheiben 8, die entlang des Streifens angeordnet sind, enthalten verschiedene vorbestimmte Mengen des Mediators, und zeigen deshalb unterschiedliche Endpunkte an, die zum Beispiel Alkoholkonzentrationen von 0,3, 0,5 und 0,8 gl&supmin;¹ anzeigen. Die Probe kann mittelbar direkt auf die Absorptionsmittelschicht 9 aufgebracht und somit auf die entgegengesetzte Seite des Analysebereiches transferiert werden. Hierdurch wird ein verhältnismäßig dosierungsunabhängiges System erzeugt. Des weiteren kann dieser einzelne Streifen der Absorptionsmittelschicht alle analytischen Elemente enthalten, wie in Figur 7 gezeigt. In anderen Ausführungsformen der Erfindung kann die enzymhaltige Scheibe zum Beispiel mit einer 1%igen Lösung Ethylcellulose in Toluol abgedeckt werden. Eine solche Abdeckung dient als Filter, um zum Beispiel die Absorption roter Blutzellen in die enzymhaltige Schicht zu verhindem. Zusätzlich verringert die Abdeckung die Permeationsgeschwindigkeit der Probe in die Scheibe, so daß die Flüssigkeit in die letztere abgemessen wird, und verhindert eine Berührung zwischen dem Enzym und der nicht-absorbierten Flüssigkeit.
  • Die Figuren 9 und 10 veranschaulichen eine andere Ausführungsform gemäß der Erfindung. Drei Reagenszonen 16 sind auf einer Kartenunterlage 11 mit einem Klebstreifen 13 befestigt. Die drei Zonen 16 enthalten jeweils eine getrocknete Enzymzusammensetzung, Farbstoff und verschiedene Gehaltsstufen des Mediators, um drei verschiedene, vorgewählte Endpunkte zur Verfügung zu stellen. Eine Membran 16 aus Nucleopore , Isopore , Cyclopore , Nylon , PTFE, Polyester oder einem anderen geeigneten Material überlagert die Zone 16 und wird an der Kartenunterlage mit einem wasserfesten Abreißstreifen 14 mit einer Lasche 12, um die manuelle Entfernung zu erleichtern, befestigt. Bei der Anwendung der Vorrichtung wird eine Menge der Flüssigkeit, die den Analyt enthält, zum Beispiel Speichel oder Blut, auf die Membran 15 aufgebracht und kann in die Zone 16 penetrieren. Dann kann an der Lasche 12 gezogen werden, um den Abreißstreifen 14 zu entfernen, so daß die kolorimetrische Anzeige beobachtet werden kann.
  • Figur 11 veranschaulicht eine andere Vorrichtung gemäß der Erfindung. Ein langgestreckter Träger 20 enthält einen linearen Teststreifen 22, der mit einer getrockneten, stabilisierten Enzymzusammensetzung, die immobilisiert sein kann, immobilisiertem Farbstoff und immobilisiertem Thiol-Mediator imprägniert ist. Ein Absorptionsmittelkissen 21 ist angeordnet, um eine Menge der zu analysierenden Flüssigkeit aufzunehmen. Ein Reservoir 24 enthält eine Pufferlösung, die angepaßt wurde, damit die den Analyt enthaltende Flüssigkeit entlang dem Streifen 22 diffundiert. Ein Reservoir 24 kann mit einem Verschluß zur Verfügung gestellt werden, der aufgerissen werden kann, um den verwendeten Puffer freizusetzen. Der Durchzug der analythaltigen Flüssigkeit durch den Streifen 22 ruft eine kolorimetrische Anzeige durch Oxidation des Farbstoffes hervor, wenn der Thiol-Mediator verbraucht worden ist. Die Entfernung, bis zu dem die kolorimetrische Anzeige den Streifen in Bezug zu der graduierten Skala 23 durchläuft, bietet einen Hinweis auf die Analytkonzentration in der in den Behälter 21 eingebrachten Flüssigkeit. Die Verwendung eines Mediators stellt einen Analytgrenzwert zur Verfügung unterhalb dem kein Ansprechen beobachtet wird, so daß vermieden wird, daß ein Nullpunkt auf der Skala 23 ist. Hierdurch kann ein kürzerer Streifen verwendet werden, so daß die Materialien sparsam verwendet werden und sich ein schnelleren Ansprechen ergibt. Die Skala kann so angeordnet sein, daß eine Anzeige nur zur Verfügung gestellt wird, wenn die Analytkonzentration einen vorbestimmten Wert überschreitet, zum Beispiel die legale Blutalkoholgrenze für Fahrer. Die vollständige Entwicklung des Teststreifens wird durch einen Kontrollpunkt 25 am Ende des Streifens 22 angezeigt, der von dem Behälter 21 entfernt ist.
  • In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung können durch Enzyme markierte, immunologisch aktive Verbindungen (Antikörper) durch Verwendung des entsprechend abgewandelten Systems quantitativ bestimmt werden. Immunologisch aktive Verbindungen (Antikörper), die frei oder immobilisiert sein können, können verwendet werden, um in einer Probe spezifisch Moleküle zu erkennen und zu komplexieren. Die Reaktion der enzymmarkierten, immunologisch aktiven Verbindung (Anitkörper) mit dem Analyt oder dem Analytkomplex, ermöglicht es, daß eine quantifizierbare Nachweisreaktion stattfindet.
  • Die Zugabe bestimmter Mediatorkonzentrationen zu der Nachweisreaktion ermöglicht eine halbquantitative Bestimmung von dem Analyt, der in der immunologischen Reaktion komplexiert wurde, z.B.
  • 1. Immunologischer Antikörper + Analyt T Immobilisierter Antikörper/Analyt-Komplex
  • 2. Immobilisierter Antikörpen Analyt-Komplex + enzym-markierter Antikörper --> Immobilisierter Antikörper/Analyt/enzymmarkierter Antikörper-Komplex
  • 3. Immobilisierter Antikörper/Analy/enzymmarkierter Antikörper-Komplex + Enzym-substrat T Enzymprodukt
  • Mediator T Keine Farbe
  • Mediator T Farbe erschöpft
    • Bevorzugte Beispiele sind:
  • 1. Enzymmarkierung: Basische Phosphatase Enzymsubstrat: Glucose-6-phosphat Enzymprodukte: Glucose + Phosphat Mediatorreaktion: Glucoseoxidase/Peroxidase
  • 2. Enzymmarkierung: Basisches Phosphat
  • Enzymsubstrat: Glycerinaldehyd-3-phosphat
  • Enzymprodukt: Glycerinaldehyd + Phosphat
  • Mediatorreaktion: Glycerinaldehyd-3-phosphat Oxidase/Peroxid
  • 3. Enzymmarkierung: beta-D-Galactosidase
  • Enzymsubstrat: Lactose
  • Enzymprodukt: Galactose und Glucose
  • Mediatorreaktion: Glucoseoxidase /Peroxid Tabelle 1: Grenzwerttest für Glucose
    • Remission&supmin;¹ * Glucose-konzentration Mediator (Cystein)
  • Remission&supmin;¹ der unbehandelten Scheibe (entwickelt mit H&sub2;O) 0,019
  • * Ein Remissions&supmin;¹-Wert von 0,022 oder niedriger zeigt keine sichtbare Farbbildung an. Tabelle 2. Grenzwerttest für Cholesterin Farbstoff: 3-Hydroxy-2,4,6-tribrombenzoesäure Remission&supmin;¹* Glucose-konzentration Mediator (Cystein)
  • Remission&supmin;¹ einer unbehandelten Scheibe 0,016 * Ein Remissions&supmin;¹-Wert von 0,019 oder niedriger zeigt keine sichtbare Farbbildung an. Tabelle 3. Grenzwerttest für Alkohol Farbstoff: 3-Hydroxy-2,4,6-tribrombenzoesäure Remission&supmin;¹ Alkohol-konzentration (Ethanol) Mediator(Cystein)
  • Remission&supmin;¹ einer unbehandelten Scheibe (entwickelt mit H&sub2;O) 0,013
  • * Ein Remissions&supmin;¹-Wert von 0,015 oder niedriger zeigt keine sichtbare Farbbildung an. Tabelle 4. Grenzwerttest für Alkohol Farbstoff: N,N-Bishydroxyethyl-3-toluidin Remission&supmin;¹ Alkohol-konzentration (Ethanol) Mediator(Cystein)
  • Remission&supmin;¹ einer unbehandelten Scheibe (entwickelt mit H&sub2;O) 0,016
  • * Ein Remissions&supmin;¹-Wert von 0,019 oder niedriger zeigt keine sichtbare Farbbildung an. Tabelle 5. Grenzwerttest für Cholesterin Farbstoff: 3-Hydroxy-2,4,6-tribrombenzoesäure Remission&supmin;¹ Cholesterin- konzentration Mediator Natrium-mercapto-ethan-sulfonat
  • Remission&supmin;¹ einer unbehandelten Scheibe 0,016
  • Remissions&supmin;¹-Wert von 0,020 oder niedriger zeigt keine sichtbare Farbbildung an.

Claims (10)

1. Vorrichtung für eine kolorimetrische Analyse, die ein Testelement aufweist, das einen Träger enthält, wobei der Träger eine Zone trägt, die eine getrocknete Enzymzusammensetzung, eine vorbestimmte Menge eines Thiol-Mediators und einen Farbstoff enthält, und wobei die Enzymzusammensetzung so aufgebaut ist, daß sie bei Kontakt der Zone mit einem Analyt Wasserstoffperoxid erzeugt, wobei der Farbstoff bei der Umsetzung mit Wasserstoffperoxid eine kolorimetrische Anzeige liefert, wobei die kolorimetrische Anzeige in Gegenwart des Mediators reversibel ist und der Mediator so ausgelegt ist, daß er, bis er erschöpft ist, Wasserstoffperoxid abfängt und dadurch die kolorimetrische Anzeige verhindert.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, die eine Peroxidase enthält, die so ausgelegt ist, daß sie die Anzeige durch Umsetzung des Farbstoffes und Wasserstoffperoxids katalysiert.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei der der Mediator aus der Gruppe ausgewählt ist, die folgendes aufweist: Mercaptoalkylsulfonatsalze, einschließlich Natriummercaptoethansulfonat und Natriummercaptopropansulfonat, Dithioerythritol, Dithiothreit, Mercaptodextran, Glutathion.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die eine mikroporöse Deckschicht enthält, welche die Zone abdeckt.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Zone mit einer Membran oder einem Reaktionskissen bedeckt ist, die bzw. das an dem Träger befestigt ist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, bei der die Anzeige von der Analytkonzentration in der Lösung abhängt, die auf die Zone aufgebracht wird.
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Enzymzusammensetzung Alkoholoxidase ist, die von Hansenula polymorpha abstammt.
8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der der Analyt Alkohol, Cholesterin, Lactat, Harnsäure, Glycerol, Triglyceride, Glutamat, Glucose, Cholin oder NADH ist.
9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Enzymzusammensetzung ein mit einem Polyelektrolyten und einem cyclischen Polyol stabilisiertes Enzym aufweist.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in der Form eines Teststreifens, wobei die Zone langgestreckt und an einem Ende mit einem Behälter für die Anwendung des Analyten versehen ist, wobei die kolorimetrische Anzeige so ausgelegt ist, daß sie sich von dem Ende der Zone aus erstreckt, und wobei die Länge der Anzeige von dem Ende aus eine Konzentrationsangabe des Analyten einer in der Vorrichtung verwendeten Lösung bietet.
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