DD224951A1 - Analytisches material zur bestimmung von h tief 2 o tief 2, organischen peroxiden und h tief 2 o tief 2-bildenden stoffgemischen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein analytisches Material zur Bestimmung von H2O2, organischen Peroxiden und H2O2-bildenden Stoffgemischen, das vorzugsweise angewendet wird in der medizinischen Diagnostik zur Glucosebestimmung in Koerperfluessigkeiten. Das Material soll einfach und reproduzierbar zu handhaben und fuer Reihenuntersuchungen und Patientenselbstkontrolle geeignet sein. Auf einer transparenten Traegerschicht befindet sich nur eine quellfaehige Indikatorschicht, die das Indikatorsystem diffusionsfest eingelagert enthaelt und gute physikalisch-mechanische Eigenschaften aufweist. Die Indikatorschicht enthaelt als Filmbildner Gelatine und eine Polykation der allgemeinen Formel I, als Indikatorsystem ein p-Phenylendiaminderivat und einen Kuppler mit einer CH-aciden Gruppe und als Gelatinevernetzungsmittel Cr(III)-Salze. Das Polykation bildet mit dem Indikatorsystem Salze.

Description

Analytisches Material zur Bestimmung von HpO₂, organischen Peroxiden und H₂O- bildenden Stoffgeraischen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Material zur Bestimmung von H₂O₂, organischen Peroxiden und H-Op-bildenden Stoffgemischen, das Anwendung findet in der Industrie, in der Landwirtschaft, im Umweltschutz, vorzugsweise jedoch zur Glucosebestimmung in der medizinischen Diagnostik.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Materialien zur Bestimmung von organischen Peroxiden und H 0 sind in der Praxis hinreichend bekannt. Zunehmend setzen sich für diese analytischen Bestimmungsmethoden Schnell- oder Streifentests durch, die durch Farbreaktionen in den gequollenen festen Indikatorschichten eine quantitative oder samiquantitative Bestimmung ermöglichen. Hierbei haben sich zwei prinzipielle Verfahren durchgesetzt, die sich durch die Art der Schichtbildner für die Indikatorschichten unterscheiden. Häufig findet Papier al3 fibrillärer Schichtbildner Anwendung (DE-OS 2546252, US-PS 3092465,

DD-PS 143379).

Zunehmend, bedingt durch die Forderung der quantitativen Auswertung, setzen sich jedoch dünne Polymerschichten als Trägermaterial durch, die aus filmbiidenden natürlichen oder synthetischen Polymeren hergestellt werden (DE-OS 2910134,.-US-PS 3992158, DD-PS 140175). Diese äImbildenden Polymere erlauben es, schichtdickendefinierte Indikatorschichten reproduzierbar herzustellen, eins Voraussetzung für quantitative Teststreifen. Als Unterlage für die Indikatorschicht werden z.B. transparente Trägermatsrialien in Form von Folien verwendet. Die gewünschte Reflexion wird durch Aufbringen einer pigmentierten Schicht erreicht, die meist noch als Filter- und Verteilerschicht fungiert (US-PS 4050898). Diesen Systemen ist gemeinsam, daß das nachzuweisende H O oder organische Peroxid in einer durch eine peroxidatisch aktive Verbindung katalysierten Reaktion aus ungefärbten Substanzen Farbstoffe bildet, deren optische Dichte proportional der H O₂ - oder Peroxidkonzentration ist, wodurch eine fotometrische oder visuelle Quantifizierung möglich wird. Der Nachweis kann durch eine Ein- oder Zweistufenreaktion erfolgen. Beim Einstufenprozeß liegt zumeist in der Reaktionsschicht ein farbloser Indikator vor, der über die Zwischenstufe des Indikatoroxidationsproduktes zur mehr oder weniger stabilen seraichinoiden Form umgewandel-t wird. Beim Zweistufsn- prozaß wird zunächst ebenfalls das Indikatoroxidationsprodukt gebildet, wobei hier jedoch die Farbstoffbildung durch eine Reaktion mit entsprechenden Kupplern unter Ausbildung kova-Isnter Bindungen zwischen Indikatoroxidationsprodukt und Kuppler erfolgt, lsi ersten Fall als Indikator werden Bisphenylderivate, wie o-Tolidin und o-Dianisidin und im zweiten Fall substituierte p-Phenylandiamine und als Kuppler z,B. substituierte Naphthole oder Pyrazolone (DO-PS 135243) verwendet.

Für das System der Bisphenylderivate hat es sich als vorteilhaft erwiesen, durch Zugabe von sogenannten Fixiermittel das Farbstoffsystem zu stabilisieren (VVP C Ol N/ 236 500, WP C 01 N/244 .218).

Als Schichtbildner für diese Indikatorsysteme hat sich zunehmend Gelatine durchgesetzt, da sie neben ihrer guten Schutzkolloidwirkung den Vorteil der Thermoreversibilität ihrer Gele bietet, wodurch die Herstellung der Materialien und ihre Handhabungvesentlich erleichtert wird. (DD-PS 135 843, 140 175, 145 428).

Als kritisch ist in diesen Systemen der Einsatz von Q-Tolidin oder o-Oianisidin als Indikatoren zu beurteilen, da sie über eine hohe Toxizität verfugen und als Cancerogene bekannt sind. Bei unzureichender Diffusionsfestigkeit in der Schicht können sicn diese Verbindungen an der Oberfläche der Materialien ablagern, wodurch eine Gefährdung bei ihrer Anwendung entsteht. „AuSerdsra ist beim Aufbringen der zu untersuchenden Flüssigkeiten eine deutliche Diffusion dieser Indikatoren in die Flüssigkeiten festzustellen, wodurch ein Verlust an Indikator in der Nachweisschicht "eintritt und die Genauigkeit des Ma- £θ rials ..Kexloä-engebt..

Ähnliche Nachteile sind von Materialien bekannt geworden, bei denen ein wasserlöslicher Farbstoff als Ergebnis der Nachweisreaktion entsteht. Hier werden große Teile des Farbstoffs von dar in diesen Materialien vorhandenen pigmentierten obersten Verteilerschicht gebunden und bei Reflexionslichtmessung nicht erfaSt. Ss wurde versucht, durch Zugabe von Beizraltteln das Problem zu lösen (US-PS 3585 112_r 3917 453). Durch diese Verfahrensweise konnte das Problem auch nicht zufriedenstellend gelöst werden, so daß eine praktische Anwendung nicht in Frage kommt.

Eins zusätzliche Schicht als Diffusionsbarriere für den wasserlöslichen Farbstoff (DE-PS 2834 713) soll Verluste Verhindern. Neben dem notwendigen Antrag einer weiteren Schicht erfordern diese Materialien aufgrund der Farbstoffdiffusion sehr exakte Auswertebedingungen,. die nur durch Automaten gewährleistet werden können.

Eine schnelle Patientenselbstkontrolle ist hier nicht möglich. Bei Einsatz von p-Phenylendianiinderivaten und Kupplern mit OH-aciden Gruppen und langkettigen Alkylresten als Indikatorsystem werden Diffusionsvorgänge ebenfalls nicht vollständig ausgeschlossen und der Farbbildungsprozeß wird herabgesetzt» Weitere Nachteile werden durch die hydrophilen Kuppler bedingt, die in Gegenwart von Gelatine deutliche Viskositätsanstiege bewirken (Ewa E*, Bertyp.v Kolloid« Z. 149 (1956)). Hierdurch ist die geforderte reproduzierbare Herstellung dünner Indikatorschichten unmöglich. Dieser Effekt ist mit steigendem pH-Wert besonders deutlich ausgeprägt. •\ Durch den Kuppler wird die Nachweisschicht auch deutlich versprödet, was sich z.B. in einer unerwünschten Rolltendenz der Materialien bemerkbar macht,, wodurch deren Handhabung erschwert oder unmöglich wird. Gelatine selbst zeigt bei unterschiedlichen Luftfeuchten unterschiedliches Brüchigkeitsverhalten,,wodurch ebenfalls eine stete Schwankung der Qualität der physikalisch-mechanischen Eigenschaften resultiert· Durch das Aufbringen extrem starker Gelatineüberzüge kann zwar der Ablagerung der Indikatoren auf der Oberfläche begegnet werden,, die unkontrollierte Diffusion des Indikators im Schichtverband bleibt jedoch erhalten. Zudem treten die Probleme der Bruchigkeit noch stärker in den Vordergrund« Diese Materialien sind zumeist für eine Vollblutbestimmung, die bei der Betreuung von diabetis mellitus wesentlich ist, nicht geeignet.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist ein analytisches Material zur Bestimmung von H^O₂, organischen Peroxiden und H_0₂-bildenden Stoffgeraischen, insbesondere zur Glucosebestiaraung in Körperflüssigkeiten, öas Material soll in Form von Teststreifen einfach und reproduzierbar zu handhaben und für Reihenuntersuchungen und Patientenselbstkontrolle geeignet sein,

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde,, durch Einsatz geeigneter Bauelemente ein analytisches Material zur Bestimmung von H O₂, organischen Peroxiden und H₂0₂-bildenden Stoffgemischen zu entwickeln, dessen Indikaorsystera diffusionsfest in der Indikatorschicht verankert ist· Das Material soll gute physikalisch-meehanische Eigenschaften aufweisen» problemlos zu handhaben sein und bei der Anwendung eine stabile reproduzierbare Farbreaktion zeigen·

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daS die Indikatorschicht als Schichtbildner Gelatine tnd ein PoIykation der allgemeinen

Formel I

CHR--CR--CR„-CHR₀ 2 j 3 j 4 2

CH, CH,

worin R.-* R₂, R₃, R₄

^R5' ^R6 η

nCl" η

= H, Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen a Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen i 50- 1000

bedeuten,

als Indikatorsystem für einen ZwischenstufenprozeS ein p-

Phenylendiaminderivat der allgemeinen

Formel II

X-R

._t

R- a Alkyl mit 1-8 Kohlenstoffatomen

X = H, Y

Y = -^S0 ₃H,· -COOH

bedeuten und einen Kuppler der allgemeinen

OH Formel III .-si**^-^^-Z-

worin Z = -CONH-, -₂

R= Alkylrest mit 12 - 20 Kohlenstoffatomen, gegebenen falls substituierter Phenylrest R-= Alkylrest mit 1-20 Kohlenstoffatomen U= H, -SO₃H, -COOH

bedeuten oder einen Kuppler der allgemeinen Formel IV CH -C-Z-R_±

worin Z= -CH₂-, -NH-CO-

R₁= Alkylrest mit 10 - 20 Kohlenstoffatomen R₂ a substituierter Phenylrest, der als Substituent -SO₃H oder -COOH enthalten suß,

bedeuten und

als Gelatinevernetzungsmittel eine Chrom(III)-verbindung enthält.

Ein wesentlicher Vorteil dös erfindangsgemäßen Materials besteht darin, daß auf den Schichtträger nur eine Schicht aufgetragen werden süß, während andere bekannte Materialien aus mehreren Schichten bestehen.

Vorzugsweise wird das Material in Form von Teststreifen verwendet. Als transparenter Schichtträger eignet sich vor allein hydrophilierte Filoanterlags, in Betracht kommen auch andere transparente Folien.

In der Indikatorschicht kann die Gelatine innerhalb weiter Grenzen durch ein erfindungsgemäßes Polykation ersetzt werden. Vorzugsweise eignen sich Polykationen der allgemeinen Formel I mit einen Polymerisationsgrad η =» 300 - 600, die in wäßriger Lösung mit Gelatine eine gute Verträglichkeit aufweisen, so daß weder Trübungserscheinungen noch Viskositätsveränderungen auftreten. Schichten aus Gelatine/Polykation weisen bessere physikalisch-mechanische Eigenschaften auf als reine Gelatineschichten, Anstelle des Polykations der Formel I lassen sich auch Copolymere von Viny!monomeren, wie Acrylsäure, Acrylamid, Acrylnitril, Di ace ^acrylamid oder Vinylpyrrolidon und dem Monomeren der Formel I einsetzen.

Das erfindungsgeraäße Polykation ist zurSalzbildung mit dem Indikatorsystem fähig. Dieser Beizeffekt verhindert eine Diffusion des p-Phenylendiaminderivats und des Kupplers aus der Schicht beim Auftragen der Probelösung, so daß bei der Anwendung eine quantitative Erfassung des gebildeten Farbstoffes gewährleistet ist

Durch Zusatz von Chrom (Ill)-Salzen der

Formel V a)

NH

^Cr|0=cC'/ I ^C13·

b) K₃[cr(C₂0₄)₃]. 3 H₂O C)JCr Cl₂(H₂O)^Cl.2 H₂O

e) JCr₃(OH)₂(CH₃COO) ~| CH₃-COO.6H₂O

f) ^r₃(OHJ₂(CH₃COO)5 Cl . 8 H₂O

g) [(NH₂CH₂COO)₂Cr(OH)₂Cr (00CCH₂NH₂ J₂] . H₃O

vorzugsweise jedoch Cr(CH₃-COO)₃ , 6 H-O

als Gelatinevernetzungsraittel wird ein definiertes Flüssig« keitsaufnahmeverrnögen der Indikatorschicht erreicht, so daß anhand der Dichte des gebildeten Farbstoffes der H O₂- oder Psroxidgehalt der Probelösung quantitativ bestimmt wer den kann.

Es werden transparente Indikatorschichten erhalten, die nach Auftragen der Probe eine visuelle Auswertung des entstandenen Farbstoffes gegen eine Vergleichsskala oder eine Ausmessung in einem handelsüblichen Photometer ermöglichen. Die bei diesem Indikatorsysteni entstehenden Azomethin- bzw. Indophenolfarbstoffe sind stabil. Test und Auswertung können zeitlich voneinander getrennt werden, was eine breite Anwendung der Teststreifen ermöglicht.

Bei Anwesenheit von Glucoseoxidase und Peroxidase in der Indikatorschicht eignet sich das Material zur Schnellbestimroung von Glucose in Körperflüssigkeiten. Breite Anwendung dieser Testmaterials ist in der medizinischen Diagnostik möglich bei Reihenuntersuchungen und besonders bei der Selbstkontrolle von diabetis mellitus.

Ausführungsbeispiele Beispiell

BegieSlösung A enthält 50 g/kg Gelatine BegieSlösung B-O = Gelatine wird schrittweise ersetzt durch das Polykation der

Formel Ia

CH-CH-CH-CH₁--

²Ii ²

CH CH-

CH.

CH

3^J

η = 300 (Tabelle 1)

Begießlösung K enthält 45 g/kg Gelatine und 5 g/kg Polykation gemäß-. DE-PS 2 834 713 der

Formel Vi 4CH-CH„-CH-CH-1

CpH*)

Z¹Z

CH-

nCl"

η = 250

Die Viskositätsmessungen der Begießlösungen A - K wurden bei 4O⁰C durchgeführt, die erhaltenen Werte zeigt Tabelle 1. Zur Bestimmung der Durchlässigkeit wurden die Begießlösungen A-K auf hydrophilierte Callulosetriacetatunterlage vergossen und die erhaltenen Schichten am Meßgerät Spekol des VEB C.Zeiss Jena ausgemessen

Die Schichtdicke beträgt 6,USi

Dia erhaltenen Werte zeigt Tabelle 1.

Tabelle 1

Begieß	Gelatine	Ia/g/kgJ	Polykation	frisch	^Jm Pas]	nach 24 h	Durchlässig-"""
lösung	fg/kg]		Vl^g/kgJ	7	^ nach 4 h	7,5	keit der Schicht [%l
A	50	5	—	7,7	7.7	8,0	100
B .	45	10	-	8,4	8,2	8.9	100
C	40	15	-	8,9	8.9	9,5	100
D	35	20		9,0	9.6	10,0	100
E	30	25	* *	9,2	9.9	10,0	100
F	25	30	mm	9,0	9,2	9,1	100
G	20	35	—	9,1	9,1	9,2	100
H	15	40	-.	9,0	9,3	9,0	100
I	10	45	Ml	9.0	9,1	9,0	100
α	5	-	«Μ	20,6 ;j	8,9	36,8	100
K	45 „, ..,.., J	5	,, 33,0	96

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~ 12 -

In den Begießlösungen weist das Polykation Ia eine gute Verträglichkeit mit Gelatine auf und bewirkt keine Trübung und keinen Viskositätsanstieg, so daß ein problemloser Ersatz der Gelatine durch das Polykation in weiten Grenzen möglich ist. Das Polykation V| (DE-PS 2 834 713) zeigt diesen Vorteil nicht. Es bewirkt einen Viskositätsanstieg, dar bei Verlängerung der Stehzait noch zunimmt.

Beispiel 2

Zur Charakterisierung der physikalisch-mechanischen Eigenschaften werden eine reine Gelatineschicht und 3 weitere Gelatineschichten mit steigendem Gehalt an Polykation Ia hergestellt und vermessen, die erhaltenen Werte zeigt Tabelle 2

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Tabelle 2

Γ%]Gelatine	[%~jpolykation Ia	WRV|% Η2θ7	Fp(0C?	D/X)	Rote/
100	.	790	31	6	ίο13
95	5	460	45	16	108
90	10	490	45	24	107
80	20	510	46	30	10 6

WRV a Wasserrückhaltevermögen

D a Dehnung (Messung bei 30 % rel. Lüftfeuchte) Ro a Oberflächenwiderstand

Das Wasserrückhaltevermögen der Schicht wird durch Zusatz des Polykation Ia nicht verschlechtert, der Gel-Sol-Urawahdlungspunkt erhöht sich vorteilhafterweise etwas und das Brüchigkeitsverhalten wird verbessert. Zusätzlich resultiert eine antistatische Ausrüstung des Materials, die bei Polymerfolien stets von Vorteil ist.

Beispiel 3

Herstellung der 3egieSlösungen für Indikatorschichten BegieSlösungen L-S

Schichtbildner (Gelatine und Polykation der For«©l Ia ) siehe Tabelle 3

Kuppler

4-(NN-cf-Sulfobutyl- buty!ammonium J-anilinsulfat Glucoseoxidase Peroxidase

Na-Hexadecylsulfohat Chrom(III)-acetat

3,7 g/kg

2,4 g/kg

100 000 U/kg 4 000 U/kg 0,03 g/kg 4,5 g/kg

mit Natronlauge auf pH - 7,4 einstellen Nach 1 h Stehzeit wird bei 40°C die Viskosität gemessen

Tabelle 3

	Schichtbildner	Polykation /g/kgj	6	Kuppler	^/ra Pas/'
BegieSlösung	GeIa tine fg/kgj		12	1	46,2
L	60	5	IS	1	11,6
M	54	12		1
N	48	18	1	9,2
O	42	-	2	66,8
P	60	2	12,6
O.	54	2	9,1
R	48	2	8,9
S	42

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Kuppler 1 a 1-(3-SuIfo~4-phenoxyphenyl)~3—carboxyhepta-

decylamino-pyrazolon-(5) Kuppler 2 = l-Hyciroxy-4-sulfo-2-naphthoe3äure-okta-

decylatnid

Der übliche Viskositätsanstieg der als Schichtbildner nur Gelatine enthaltenden BegieSiösungsn bei Zusatz der Kuppler wird in Anwesenheit des Polykations der Formel Ia fast

unterbunden* Man vergleiche die Viskositäten

der Begießlösung A (Tabelle 1) der Begießlösung L,.P (Tabelle 3) und der Begießlösung N,N₁O,Q,R,S (Tabelle 3)

Beispiel4

Begießlösung M gemäß Seispiel 3 wird auf hydrophiiierte Ceilulasetriacetat-JJnteriage vergossen* Erhalten wird das

Material A,

Als Vergleich wird Begießlösung L gemäß Beispiel 3,: jedoch ohne Chrom (Ili)-acetat auf die gleiche Unterlage vergossen,

Haterial B.

Von beiden Materialien werden die physikalisch-mechanischen Eigenschaften wie Wasserrückhaltevermögen, Gel-So 1-Uinv/andlungspunktj Dehnung und Oberflächenwiderstand bestimmt. Die Maßfestigkeit, die ein Maß für die notwendige Wischfestigkeit der Indikatorschicht ist, wird beurteilt nach der Verletzbarkeit äer Schicht durch einen Meßstift, auf den unterschiedliche Massestücke aufgelegt werden» Die Prüfung auf Diffusionsfestigkeit das Indikatorsystsms erfolgt, indem das Material zunächst gewässert, dann GIucoselösung aufgetragen und anschließend die Farbdichte im Absorptionsmaximum des entstandenen Farbstoffes gemessen wi rc!« . '

Tabelle 4

Material	WRV fei	Fp [°C]	D I«]	Reiß]	Naßfestigkeit	Verlust an Farbstc
						dichte [%]
						noch 10'' 20·' 3C
						Wasserbehandlung
A	220	70	20	107	500	0 0 2
B t*>~~—"-1——"**——·—	875	28	4 „.ν..-. _„i	1013	50	4 14 20

Schichtdicke der Indikatorschicht 6,Um

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- iO -

Tabelle 4 zeigt deutlich die Vorteile des erfindungsgemäßen Materials A. Das Indikatorsystem verbleibt auch bei längerer Wässerung diffusionsfest in der Schicht und gestattet quantitative Glucosebestiramungen. Die guten physikalisch-mechanischen Eigenschaften gestatten eine problemlose Handhabung des Testraaterials bei der Anwendung. Material B weist wesentlich schlechtere physikalisch-mechanische Eigenschaften auf und läßt eine quantitative Glucosebeatiiamung aufgrund der Diffusion des Indikatorsystems nicht zu.

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Claims (1)

1. Erfindungsanspruch

   1. Analytisches Material zur Bestimmung von HpO₂* organischen Peroxiden und H₅O₂ bildenden Stoffgemischen, bestehend aus einem transparenten Schichtträger und einer Indikatorschicht,

   gekennzeichnet dadurch, daß die Indikatorschicht als Schichtbildner Gelatine und ein Polykation der allgemeinen

   Formel I

   CHR. -CR₃-CR₄-CHR₂J-

   nCl"

   ^R5 "^R6

   worin R_±, R₂, R₃,

   ₄ = H, Alkyl .mit 1 - 5 Kohlenstoffatomen

   h = 50 - 1000 R₅, R₆ = Alkyl mit 1 - δ Kohlenstoffatomen

   bedeuten, als Indikatorsystera für einen Zweistufenprozeß ein p-Phenylendiarainderivat der allgemeinen

   Formel II

   X-R

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   worin R., Rp = Alkyl mit 1-8 Kohlenstoffatomen X = H, Y Y=- SO_H, -COOH

   bedeuten und einen Kuppler der allgemeinen

   OH Formel III «s=»->^_r-^5s,-Z-R_H

   CO .*

   worin Z = -CONH-, -CONR₂-

   Ra Alkylrest mit 12 - 20 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituierter Phenylrest R₂ a Alkylrest mit 1-20 Kohlenstoffatomen U = H-,-SO₃H* -COOH

   bedeuten oder einen Kuppler der allgemeinen

   Formel IV CH₀-C-T-R '

   I²P¹

   worin Z = -CH₂-, -nh-CO-

   R a Alkylrest rait IO - 20 Kohlenstoffatomen R = substituierter Phenylrest, der als Substituent - SO H oder -COOH enthalten muß, bedeuten und als Gelatinevernetzungsmittel eine Chrom (III)' verbindung enthält.