CN102776217B - 一种提高l-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法和一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒及其构建方法和应用。本发明提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因folA和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因metF序列。本发明提供的提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法为，将L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒转化累积L-5-甲基四氢叶酸原始细菌株，获得重组菌并发酵该重组菌。最终发酵产物中L-5-甲基四氢叶酸累积量显著高于原始细菌株，提高了原料利用率，降低了生产成本和能耗，为生物法合成L-5-甲基四氢叶酸的产业化奠定了基础。

Description

一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，具体地说，是关于一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法。

背景技术

L-5-甲基四氢叶酸又名(6S)-5-甲基四氢叶酸，化学名称为(6S)-N-[4-[[(2-氨基-1，4，5，6，7，8-六氢-4-氧-5-甲基-6-喋啶基)甲基]氨基]苯甲酰]-L-谷氨酸。

L-5-甲基四氢叶酸是叶酸最具生物活性和功能的形式，在人生命活动中起着不可或缺的作用。普通叶酸只有转换为L-5-甲基四氢叶酸才能参与甲基化过程及DNA合成。

L-5-甲基四氢叶酸是体内重要的甲基供体，可参与体内多种生化反应。例如，L-5-甲基四氢叶酸是叶酸循环中的主要形式，也是同型半胱氨酸甲基化合成蛋氨酸反应的甲基供体，如果缺乏则导致体内同型半胱氨酸含量的升高，造成高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化、血栓栓塞、血管损伤的独立致病因素，并与高血脂、脑血管疾病、肾脏疾病、糖尿病、冠状动脉疾病、周围血管病、类风湿关节炎、自然流产及阿尔茨海默症高度相关。

L-5-甲基四氢叶酸是人体血浆和细胞内游离叶酸存在的唯一形式，也是唯一可以穿透血脑屏障的叶酸类药物，并对阿兹海默症有很好的防治作用。此外它还可以与抗癌药物甲酰蝶呤等配伍使用，降低药物的毒副作用。L-5-甲基四氢叶酸也被用于巨幼红细胞性贫血、风湿性关节炎等疾病的治疗。

叶酸也在肿瘤的发生中起着重要作用。一方面，叶酸受体正成为值得期待的肿瘤治疗靶点，常用的载体为叶酸和叶酸类似物，叶酸类似物主要有L-5-甲基四氢叶酸、亚甲基四氢叶酸等。叶酸与叶酸类似物在其γ羧基与效应分子结合形成叶酸偶联物的过程中，大分子物质的生物活性不会受到破坏。另一方面，叶酸在人体中的主要功能是作为一碳单位载体参与核酸代谢，叶酸缺乏导致肿瘤发生可能有两个机制：影响核酸甲基化和破坏DNA完整性。

美国、日本和欧洲已经批准将L-5-甲基四氢叶酸上市，作为一种食品添加剂添加到各种食品中，使得其市场需求量剧增。目前，L-5-甲基四氢叶酸的生产主要依靠化学方法合成，但由于其自身稳定性很差，合成工艺复杂，所以并未得到普遍工业化。在合成L-5-甲基四氢叶酸过程中会不可避免的产生难以拆分的光学异构体D-5-甲基四氢叶酸，该异构体不能被人体吸收利用，无治疗保健作用。虽然目前的拆分方法已有不少报道，包括微生物拆分法、化学拆分法、高效液相色谱拆分法等，但拆分效率都不理想，收率也不高。

由于化学合成对合成工艺的要求极高，使得生产成本也较高，因此，需要寻找一种新方法降低生产成本，并且得到光学纯度较高的L-5-甲基四氢叶酸。

微生物一般都能在常温常压下，利用简单的营养物质生长繁殖，而且代谢旺盛。目前L-5-甲基四氢叶酸的生物合成研究较少。生物体的代谢由酶促反应组成，酶促反应具有高度特异性，一种酶只能特异地产生唯一产物，而不会产生异构体。因此利用生物体的代谢反应，在生物体中合成L-5-甲基四氢叶酸，可以产生唯一的代谢产物，从而解决化学方法难以达到的对光学纯度要求高的难题，是未来发展的趋势，为生物法合成L-5-甲基四氢叶酸的产业化奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒，以用于转化累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株。

本发明还有一个目的在于，提供一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒的构建方法。

本发明还有一个目的在于，提供一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒的应用。

本发明还有一个目的在于，提供一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的方法。

本发明提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒包括二氢叶酸还原酶基因folA序列、亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF和一个合适的载体片段；所述folA和metF序列分别如NCBI上Gene ID为944790和948432的序列所示。

根据本发明的一个优选实施例，在L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒中，folA和metF编码区置于T7启动子和lac操纵子之下。

根据本发明的另一个优选实施例，所述L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒还包括一个卡那霉素抗性基因(nptII)，用以筛选重组菌。

本发明提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒的构建方法包括以下步骤：

A)PCR扩增获得folA和metF序列；

B)将folA和metF序列共同克隆入合适的表达载体。

本发明提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒可用于转化累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株。

本发明提供的提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法包括通过将本发明提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒转化累积L-5-甲基四氢叶酸原始细菌株的步骤，获得重组菌。

根据本发明的一个优选实施例，通过发酵培养该重组菌，提高L-5-甲基四氢叶酸累积量。

根据本发明的另一个优选实施例，该重组菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

根据本发明的另一个优选实施例，提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法还通过，在发酵培养一定时间后，用诱导剂诱导L-5-甲基四氢叶酸代谢途径中的两个关键酶基因-folA和metF的表达。

使用本发明提供的L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒可以转化累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株，获得的重组菌发酵培养，发酵产物中L-5-甲基四氢叶酸累积量显著高于累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株E.coli BL21(DE3)。说明采用本发明提供的提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的方法，提高了原料利用率，降低了生产成本和能耗，可为进一步研究生物法合成L-5-甲基四氢叶酸建立一个基础模型，为生物法合成L-5-甲基四氢叶酸的产业化奠定基础。

附图说明

图1是PCR扩增获得的folA的检测结果，其中泳道1为folA。

图2是PCR扩增获得的metF的检测结果，其中泳道1为metF。

图3是质粒pETfolAmetF的三酶切凝胶电泳检测结果，其中，5350bp左右的条带为质粒pET-28a(+)的DNA片段，900bp左右的条带为基因metF的DNA片段，500bp左右的条带为基因folA的DNA片段。

图4是质粒pETfolAmetF的结构示意图。

图5是含pETfolAmetF、pETfolA和pETmetF质粒的菌株的可溶性蛋白SDS-PAGE检测结果，其中泳道1为含pETfolAmetF质粒的菌株，泳道2为含pETmetF质粒的菌株，泳道3为含pETfolA质粒的菌株，泳道4为含pET-28a(+)质粒的空白对照菌株。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

以下实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南精编版》(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2006)中所述的条件或厂商提供的方案进行。

在本发明的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒均购自生工生物公司。

在本发明的下述实施例中，使用的pMD-18T Simple Vector，Hind III，Sac I，BamH I，Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，DNA Marker，蛋白质Marker，均购自Takara公司。

在本发明的下述实施例中，使用的表达载体pET-28a(+)，菌种E.coli BL21(DE3)、E.coliDH5α，为中国药科大学生化教研室保存，其中菌种E.coli BL21(DE3)的ATCC编号为BAA-1025^TM。

在本发明的下述实施例中，使用的E.coli BL21(DE3)感受态细胞、E.coli DH5α感受态细胞，购自天根生化科技有限公司。

在本发明的下述实施例中，使用的LB培养基的配方为：1％胰蛋白栋，0.5％酵母浸粉，1％NaCl；使用的摇瓶发酵培养基的配方为：0.5％蔗糖，0.4％酵母浸粉，0.1％(NH₄)₂SO₄，0.3％K₂HPO₄；使用的发酵罐发酵培养基的配方为：1.2％蔗糖，0.5％酵母浸粉，0.2％(NH₄)₂SO₄，0.5％K₂HPO₄，0.01％MgSO₄，0.3％NaCl。配置固体LB平板培养基时，按照上述配方添加1％琼脂粉。

在本发明的下述实施例中，感受态细胞的制备和转化，按照Invitrogen公司PichiaExpression Kit手册中提供的方法进行。

在本发明的下述实施例中，L-5-甲基四氢叶酸累积量的检测参照：Jelena Jastrebova，AndersGrahn，Ulla Svensson，et al.HPLC determination of folates in raw and processed beetroots[J].FoodChemistry，2003，80：579-588.

实施例1共表达质粒的构建

1.1引物设计

根据NCBI报道的folA和metF序列，设计以下4条引物：

folAUP：GAGCTCGGGATAATGATCAGTCTGATTGCGGC

folADOWN：AAGCTTTTACCGCCGCTCCAGAATCTCAA

metFUP：GGATCCATGAGCTTTTTTCACGCCAGCCAGCG

metFDOWN：GAGCTCTTATAAACCAGGTCGAACCCCCA

其中folAUP和folADOWN用于扩增folA编码区；metFUP和metFDOWN用于扩增metF编码区；folAUP、folADOWN、metFUP、metFDOWN上的下划线表示在folAUP、folADOWN、metFUP、metFDOWN上分别引入的Sac I酶切位点、Hind III酶切位点、BamH I酶切位点和Sac I酶切位点。

1.2 PCR扩增folA和metF序列

抽提得到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组。

以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组为模板，分别以步骤1.1中设计的引物对folAUP和folADOWN以及引物对metFUP和metFDOWN为引物对，进行PCR扩增，具体如下：

扩增folA和metF的反应体系均为：10×PCR Buffer 5μL，2mM dNTPs 2μL，25mM MgSO₄1μL，上下游引物(10μM)各1μL，E.coli BL21(DE3)基因组DNA 5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，加入去离子水，至体系总体积为50μL。

扩增folA的反应条件：94℃5min；94℃1min，50℃1min，72℃5min，25个循环；72℃10min。

扩增metF的反应条件：94℃5min；94℃1min，50℃2min，72℃5min，25个循环；72℃10min。

PCR扩增产物分别进行凝胶电泳检测，检测结果如图1和图2所示。根据图1和图2的结果，获得的产物的大小分别为500bp和900bp，符合folA和metF产物的预期大小。

1.3表达载体的构建

1.3.1构建预处理

使用胶回收试剂盒纯化步骤1.2中获得的PCR产物，然后和pMD-18T SimpLe载体，用T4 DNA连接酶连接过夜，反应体系如下：

1μL的PCR产物，4μL pMD-18T SimpLe载体，5μL SoLution I。

连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布含有20μg/mL氨苄青霉素的固体LB平板，37℃培养至转化子长出。其中E.coli DH5α是无氨苄青霉素抗性菌株，不能在含有氨苄青霉素的固体LB平板上生长，因此，平板上长出的转化子均为转化了pMDfolA或pMDmetF质粒的大肠杆菌。挑取转化子鉴定，根据鉴定结果，最终获得两个质粒pMDfolA和pMDmetF。

质粒pMDfolA和pMDmetF经测序验证，分别包含folA、metF编码区(folA、metF编码区序列分别如SQ ID NO.1和SQ ID NO.2所示)，而且编码区无氨基酸残基突变。

1.3.2表达载体的构建

将1.3.1中双酶切产物folA和metF凝胶回收纯化，分别与Sac I/Hind III酶切的表达载体pET-28a(+)和BamH I/Sac I酶切的表达载体pET-28a(+)连接，将连接产物分别转化入宿主菌E.coli DH5α，并涂布含有20μg/mL卡那霉素的固体LB平板，37℃培养至转化子长出。其中E.coli DH5α是无氨苄青霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素的固体LB平板上生长，因此，平板上长出的转化子均为转化了pETfolA或pETmetF质粒的大肠杆菌。挑取转化子鉴定，根据鉴定结果，最终获得两个质粒pETfolA和pETmetF。

质粒pETfolA和pETmetF经测序验证，分别包含folA、metF编码区(folA、metF编码区序列分别如SQ ID NO.1和SQ ID NO.2所示)，其中folA、metF编码区分别置于T7启动子和lac操纵子之下，而且编码区无氨基酸残基突变。

由于T7启动子是强转录和翻译信号，因此，在合适浓度的诱导剂诱导下，这两个质粒可以分别高水平表达folA和metF。

1.4共表达质粒的构建

BamH I/Sac I酶切质粒pETmetF，获得metF表达框，然后将其连入使用BamH I/Sac I酶切的质粒pETfolA，获得质粒pETfolAmetF。

质粒pETfolAmetF的三酶切鉴定：提取阳性克隆的质粒pETfolAmetF，并用Sac I/HindIII/BamH I进行三酶切，酶切体系为：Sac I 5μL，BamH I 5μL，Hind III 5μL，质粒pETfolAmetF10μL，10×K Buffer 5μL，补水至50μL。酶切时间为5min，将酶切产物凝胶电泳，结果如图3。根据图3的结果，获得的产物的大小分别为500bp、900bp和5350bp的DNA片段，符合folA和metF产物的预期大小。

经测序，并对测序结果进行分析获得pETfolAmetF质粒的结构示意图，结果如图4所示。该质粒中，folA和metF编码区(folA、metF编码区序列分别如SQ ID NO.1和SQ ID NO.2所示)串联排列在质粒pETfolAmetF的T7启动子和lac操纵子之下，而且编码区无氨基酸残基突变。根据图4、SDS-PAGE的检测结果以及T7启动子的强转录和翻译信号，在合适浓度的乳糖诱导下，质粒pETfolAmetF可以高水平共表达folA和metF。

实施例2表达质粒转化累积L-5-甲基四氢叶酸细菌株

将质粒pETfolAmetF、pETfolA、pETmetF和pET-28a(+)分别转化入宿主菌E.coliBL21(DE3)，各自命名为PAF01、PA02、PF03和P04，并涂布含有20μg/mL卡那霉素的固体LB平板，37℃培养至转化子长出。其中E.coli BL21(DE3)是无卡那霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素的固体LB平板上生长，因此，平板上长出的转化子为转化了pETfolAmetF、pETfolA、pETmetF和pET-28a(+)质粒的大肠杆菌。

分别随机挑取PAF01、PA02、PF03和P04的转化子，摇瓶发酵培养，在适当时间添加诱导剂，继续培养3-8h，超声破碎细胞，对可溶性蛋白进行SDS-PAGE，结果如图5。根据图5的结果，PAF01、PA02和PF03分别高水平表达了folA和metF、folA、metF，符合folA和metF产物的预期大小；而P04既没有大量表达folA，也没有大量表达metF。

抽提PAF01、PA02和PF03的质粒DNA，分别使用引物folAUP和folADOWN、metFUP和metFDOWN作为引物对，进行PCR反应，分别扩增获得了长度为500bp和900bp的DNA片段、500bp的DNA片段、900bp的DNA片段、0bp的DNA片段。经质粒测序验证，folA和metF表达框插入了质粒pETfolAmetF，folA表达框插入了质粒pETfolA，metF表达框插入了质粒pETmetF。

根据上述结果，质粒pETfolAmetF、pETfolA和pETmetF均成功转化入宿主菌E.coliBL21(DE3)，分别命名为PAF01、PA02和PF03。

实施例3 PAF01、PA02、PF03和E.coli RL21(DE3)摇瓶发酵L-5-甲基四氢叶酸

将于37℃固体LB平板上生长过夜的PAF01、PA02、PF03和E.coli BL21(DE3)(原始菌，命名为BL21)的单菌落，分别接入液体LB培养基中，摇瓶培养过夜。

分别取适量菌液转接入摇瓶发酵培养基，培养10h。其中，在适当时间加入诱导剂；适时添加前体叶酸0.05g和甘油8％，并于发酵4h、6h、8h、10h取样，检测发酵产物中L-5-甲基四氢叶酸的累积量，检测结果如表1所示。

根据表1的结果，PAF01、PA02、PF03和BL21中的L-5-甲基四氢叶酸的累积量，在发酵10h时达到最高，分别达到原始菌的大约11倍、5倍、1.5倍，且菌株PAF01的累积量最大。因此，在下一实施例中，仅选取摇瓶发酵后期累积量最高的PAF01进行发酵罐发酵。

表1 PAF01、PA02、PF03和BL21中L-5-甲基四氢叶酸的累积量随培养时间的变化

实施例4 PAF01发酵罐发酵L-5-甲基四氢叶酸

将于固体LB(含有20μg/mL卡那霉素)平板上长出的PAF01单菌落，接种至发酵罐发酵培养基，摇瓶培养过夜；取1mL接种至100mL发酵罐发酵培养基，摇瓶培养2h左右；然后接入1L的发酵罐发酵培养基中(2.5L发酵罐)，并添加消泡剂聚氧丙稀聚氧乙烯甘油醚(即泡敌GPE)，发酵罐发酵培养，发酵过程中适时添加适当浓度的诱导剂，并流加满足细胞生长需要的甘油，同时，通过流加氨水，控制pH为6.4；发酵过程中添加前体物质叶酸。发酵10h停止发酵。

采用上述方法，进行平行实验，并分别取样检测发酵产物中的L-5-甲基四氢叶酸累积量，检测结果显示，在上述平行实验中，发酵产物中L-5-甲基四氢叶酸的累积量达到0.4-1.1mg/L，均高于目前报道的关于L-5-甲基四氢叶酸累积的27.5μg/L的最高水平。

综上所述，使用本发明提供的共表达质粒可以转化累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株，获得的重组菌发酵培养，发酵产物中L-5-甲基四氢叶酸累积量显著高于累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株E.coli BL21(DE3)。这说明采用本发明提供的生物合成方法，提高了原料利用率，降低了生产成本和能耗，可为进一步研究生物法合成L-5-甲基四氢叶酸建立一个基础模型，为生物法合成L-5-甲基四氢叶酸的产业化奠定了基础。

虽然，在本发明的实施例中，转化pETfolA和pETmetF质粒的累积L-5-甲基四氢叶酸原始细菌株中L-5-甲基四氢叶酸的累积量，低于转化pETfolAmetF质粒的累积L-5-甲基四氢叶酸原始细菌株，但是通过将质粒pETfolA和pETmetF转化累积L-5-甲基四氢叶酸原始细菌株，获得重组菌，发酵该重组菌，并在一定时间加诱导剂乳糖，提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的方法，同样应当属于本发明的范围。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

中国药科大学

中国药科大学生命科学与技术学院生物化学教研室

一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法

2

1

480

DNA

大肠杆菌

1

atgatcagtc tgattgcggc gttagcggta gatcgcgtta tcggcatgga aaacgccatg    60

ccgtggaacc tgcctgccga tctcgcctgg tttaaacgca acaccttaaa taaacccgtg    120

attatgggcc gccatacctg ggaatcaatc ggtcgtccgt tgccaggacg caaaaatatt    180

atcctcagca gtcaaccggg tacggacgat cgcgtaacgt gggtgaagtc ggtggatgaa    240

gccatcgcgg cgtgtggtga cgtaccagaa atcatggtga ttggcggcgg tcgcgtttat    300

gaacagttct tgccaaaagc gcaaaaactg tatctgacgc atatcgacgc agaagtggaa    360

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cacgatgctg atgcgcagaa ctctcacagc tattgctttg agattctgga gcggcggtaa    480

2

891

DNA

大肠杆菌

2

atgagctttt ttcacgccag ccagcgggat gccctgaatc agagcctggc agaagtccag    60

gggcagatta acgtttcgtt cgagtttttc ccgccgcgta ccagtgaaat ggagcagacc    120

ctgtggaact ccatcgatcg ccttagcagc ctgaaaccga agtttgtatc ggtgacctat    180

ggcgcgaact ccggcgagcg cgaccgtacg cacagcatta ttaaaggcat taaagatcgc    240

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accattgcac gcgactactg gaataacggt attcgtcata tcgtggcgct gcgtggcgat    360

ctgccgccgg gaagtggtaa gccagaaatg tatgcttctg acctggtgac gctattaaaa    420

gaagtggcag atttcgatat ctccgtggcg gcgtatccgg aagttcaccc ggaagcaaaa    480

agcgctcagg cggatttgct taatctgaaa cgcaaagtgg atgccggagc caaccgcgcg    540

attactcagt tcttcttcga tgtcgaaagc tacctgcgtt ttcgtgaccg ctgtgtatcg    600

gcgggcattg atgtggaaat tattccggga attttgccgg tatctaactt taaacaggcg    660

aagaaatttg ccgatatgac caacgtgcgt attccggcgt ggatggcgca aatgttcgac    720

ggtctggatg atgatgccga aacccgcaaa ctggttggcg cgaatattgc tatggatatg    780

gtgaagattt taagccgtga aggagtgaaa gatttccact tctatacgct taaccgtgct    840

gaaatgagtt acgcgatttg ccatacgctg ggggttcgac ctggtttata a             891

Claims (8)

1.一种L-5-甲基四氢叶酸合成酶系共表达重组质粒，其特征在于，共表达重组质粒包括二氢叶酸还原酶基因folA序列、亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF序列和一个带有诱导型T7启动子的载体片段，所述folA和metF序列分别如NCBI上Gene ID为944790和948432的序列所示。 

2.如权利要求1所述的共表达重组质粒，其特征在于，所述folA和metF序列置于T7启动子和lac操纵子之下。 

3.如权利要求1或2所述的共表达重组质粒，其特征在于，所述共表达重组质粒还包括一段抗性基因片段---卡那霉素抗性基因(nptII)。 

4.如权利要求1-3中任一项所述的共表达重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 

A)PCR扩增获得folA和metF序列； 

B)将folA和metF序列共同克隆到合适的表达载体。 

5.如权利要求1-3中任一项所述的共表达重组质粒用于转化累积L-5-甲基四氢叶酸的原始细菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的应用。 

6.一种提高L-5-甲基四氢叶酸累积量的生物合成方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1-3中任一项所述的共表达重组质粒转化累积L-5-甲基四氢叶酸原始细菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组菌。 

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，通过发酵培养所述重组菌，并在发酵培养一定时间后，用诱导剂诱导L-5-甲基四氢叶酸代谢途径中的两个关键酶基因folA和metF的表达，提高L-5-甲基四氢叶酸的累积量。 

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所用诱导剂为乳糖。 

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