KR20100075587A

KR20100075587A - 메티오닌 수득량의 증가법

Info

Publication number: KR20100075587A
Application number: KR1020107009579A
Authority: KR
Inventors: 라이너 피게; 필리프 수카유; 길로메 바르비에르; 그웨넬 베스텔-코레; 세드릭 보아사르트; 미셸 샤토
Original assignee: 메타볼릭 익스플로러
Priority date: 2007-10-02
Filing date: 2008-09-25
Publication date: 2010-07-02
Also published as: RU2010115225A; CN103087971B; HUE030032T2; WO2009043803A2; US10858679B2; US20160160249A1; MY180720A; PL2573189T3; KR20150038696A; EP2205754A2; BRPI0818528A2; JP5701604B2; US20100248311A1; BRPI0818528A8; WO2009043803A3; EP2573189B1; CN101821401B; CN103087971A; WO2009043372A1; KR101636662B1

Abstract

탄소의 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지내 미생물 배양에 의한 메티오닌 또는 이의 유도체의 생산 방법에 관한 것이다. 상기 미생물 및/또는 상기 배양 배지는 메티오닌/탄소 공급원 수득량이 증가되도록 변형된다. 발효 배지로부터 메티오닌 또는 이의 유도체의 단리법이 또한 기술된다.

Description

메티오닌 수득량의 증가법{INCREASING METHIONINE YIELD}

본 발명은 탄소의 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지내 미생물 배양에 의한 메티오닌 또는 이의 유도체의 생산 방법에 관한 것이다. 상기 미생물 및/또는 상기 배양 배지는 메티오닌/탄소 공급원 수득량이 증가되는 방식으로 변형되었다. 발효 배지로부터 메티오닌 또는 이의 유도체의 단리법 또한 청구된다.

시스테인, 호모시스테인, 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌과 같은 황-함유 화합물은 세포 대사에 결정적으로 중요하고 식품 또는 사료 첨가제 및 약제로 사용하기 위하여 공업적으로 제조된다. 특히, 동물들이 합성할 수 없는 필수 아미노산인 메티오닌은 수많은 신체 기능에서 중요한 역할을 한다. 단백질 생합성에서 이의 역할과는 별개로, 메티오닌은 트랜스메틸화에 및 셀레늄 및 아연의 생체내이용율에 관여한다. 메티오닌은 또한 알레르기 및 류마티스성 열과 같은 질환의 치료로 직접적으로 사용된다. 그럼에도 불구하고 제조된 메티오닌의 대부분은 동물 사료에 첨가된다.

BSE 및 조류 독감(chicken flu)으로 인한 동물-유래 단백질의 사용의 감소로 순수한 메티오닌에 대한 수요는 증가하였다. 화학적으로 D,L-메티오닌은 아크롤레인, 메틸 머캅탄 및 시안화수소로부터 통상적으로 제조된다. 그럼에도 불구하고 라세미 혼합물은 예를 들어 닭 사료 첨가제에서처럼 순수한 L-메티오닌만큼 잘 기능하지 않는다 (문헌 [Saunderson, CL., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633] 참조). 순수한 L-메티오닌은 예를 들어 제조 비용을 급격하게 증가시키는 N-아세틸-D,L-메티오닌의 아실라제 처리를 통하여 라세미 메티오닌으로부터 제조될 수 있다. 순수한 L-메티오닌에 대하여 증가하는 수요와 환경에 대한 우려가 미생물에 의한 메티오닌의 생산을 매력적이게 한다.

미생물들은 세포 성분의 생합성을 미세 조정(fine-tune)하여 최대의 성장 속도를 가능하게 하는 고도로 복잡한 조절 메커니즘을 발달시켜 왔다. 결과적으로 아미노산과 같은 대사물질은 필요한 양만이 합성되고 야생형 균주의 배양 상등액에서 일반적으로 검출될 수 없다. 박테리아는 주로 효소의 피드백 저해 및 유전자 전사의 억제 또는 활성화로 아미노산 생합성을 제어한다. 이러한 조절 경로들의 이펙터(effector)는 대부분의 경우 관련 경로의 최종 생성물이다. 결과적으로, 미생물에서 아미노산을 과다생산하기 위한 전략들은 이러한 제어 메커니즘의 탈조절을 요구한다.

L-메티오닌 합성 경로는 많은 미생물들에서 공지되어 있다 (도 1). 메티오닌은 아미노산 아스파르테이트로부터 유도되나, 이의 합성은 2가지의 추가적인 경로, 시스테인 생합성 및 C1 대사의 수렴을 요구한다.

아스파르테이트는 옥살로아세테이트로부터 합성된다. 대장균에서 구연산 회로의 제대로 된 기능을 위하여 안정적인 옥살로아세테이트 풀(pool)이 필요하다. 따라서 옥살로아세테이트의 아스파르테이트로의 변환은 이러한 풀로부터 옥살로아세테이트의 회수(withdrawl)를 보상하는 반응을 필요로 한다. 아나플레로틱(anaplerotic) 반응이라 불리는 몇몇의 경로들이 대장균에서 이러한 기능들을 수행한다 (문헌 [Sauer & Eikmanns (2005) FEMS Microbiol Reviews 29 p765-94] 참조). 지수 성장 조건 및 글루코스 과량하, PEP 카르복실라아제는 옥살로아세테이트를 생산하는 PEP의 카르복실화를 촉매한다. 카르복실화 효율은 그중에서도 특히 세포내 PEP 농도에 의존한다. PEP는 다수의 반응들을 일으키는 중심 대사물질이다. 이들 중 하나, PEP의 피루베이트로의 당분해 변환은 PTS 시스템을 통한 글루코스의 유입(import)이 글루코스로부터 생성된 두개의 PEP 분자 중 하나를 피루베이트로 변환시키기 때문에 대장균에게 필수적이지 않다. 해당작용에서 대장균내 유전자 pykA 및 pykF로 코딩되는 두개의 동질 효소로 코딩되는 효소 피루베이트 키나아제는 PEP의 피루베이트로의 변환을 촉매한다.

아스파르테이트는 세가지 일련의 반응으로 호모세린으로 전환된다. 호모세린은 이어서 트레오닌/이소루이신 또는 메티오닌 생합성 경로에 진입할 수 있다. 대장균에서 메티오닌 경로로의 진입은 호모세린의 숙시닐-호모세린으로의 아실화를 요구한다. 이러한 활성화 단계는 뒤이은 시스테인과의 축합을 가능하게 하고, 티오에테르-함유 시스타티오닌으로 이어지고 이는 가수분해되어 호모시스테인을 제공한다. 메티오닌으로 이어지는 최종 메틸 전달은 B₁₂-의존성 또는 B₁₂-독립성 메틸트랜스퍼라제 중 어느 것으로 수행된다.

대장균내 메티오닌 생합성은 각각 MetJ 및 MetR 단백질을 통한 메티오닌 생합성 유전자의 억제 및 활성화로 조절된다 (문헌 [Figge RM (2006), ed Wendisch VF, Microbiol Monogr (5) Amino acid biosynthesis p164-185]에서 검토됨). MetJ 및 이의 보조억제자 S-아데노실메티오닌은 유전자 metA, metB, metC, metE 및 metF를 조절한다고 공지되어 있다. glyA, metE, metH 및 metF와 같이 메티오닌 생산에 관여하는 효소를 코딩하는 다른 유전자들은 MetR에 의하여 이의 공동-활성자 호모시스테인의 존재하 활성화되는 반면, metA는 단지 호모시스테인의 부재하에서 MetR에 의하여 활성화된다. 이러한 효소들 모두는 세린으로부터 메티오닌으로의 C1 유닛의 전달 및 생성에 관여한다. 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 GlyA는 세린의 글리신으로의 전환 및 보조효소(coenzyme) 테트라히드로폴레이트(tetrahydrofolate) (THF)상 C1 유닛의 수반되는 전달을 촉매한다. 글리신은 그다음 CO2, NH3로 변환될 수 있고 그동안 다른 C1 유닛이 THF상으로 전달된다. 이러한 반응은 유전자 gcvTHP 및 Ipd으로 코딩되는 글리신 절단 복합체로 촉매된다.

이러한 두가지의 반응으로 메틸렌-THF의 형태로 생성된 C1 유닛은 이어서 메틸-THF로 환원되거나 포르밀-THF로 추가적으로 산화될 수 있다. 메티오닌 생합성은 메틸-THF로의 환원을 필요로 한다. 따라서, 산화 반응은 C1 유닛에 대하여 메티오닌 생합성과 경쟁한다. 포르밀-THF 또는 포르메이트는 퓨린 및 히스티딘의 생합성을 위하여 요구된다. 대장균내 포르밀-THF는 purU 유전자로 코딩된 포르밀-THF 데포르밀라제로 촉매되는 반응에서 THF 및 유리 포르메이트로 변환될 수 있다 (문헌 [Nagy et al. (1995) J. Bacteriol 177 (5) p. 1292-98] 참조).

메틸렌-THF의 메틸-THF로의 환원은 MetF 단백질로 촉매된다. 호모시스테인상으로 메틸기의 전달은 비타민 B12를 통한 MetH에 의해 또는 직접적으로 MetE에 의해 촉매된다. MetH 효소는 MetE 효소보다 100배 더 높은 촉매반응 속도(catalytic rate)를 가진다고 공지되어 있다. 비타민 B₁₂의 부재, 따라서 활성 MetH의 부재하에 MetE는 전체 세포 단백질의 최대 5 %를 구성할 수 있다. 활성 MetH의 존재는 아마도 일반적으로 MetR을 통하여 metE의 전사를 활성화하는 호모시스테인의 양을 감소시킴으로써 MetE 활성을 감소시킨다. 따라서 MetE가 다량으로 발현되지 않기 때문에 MetH를 통한 메티오닌의 생성은 세포에게 있어 중요한 자원을 절약하게 한다. 호모세스테인의 축척은 대장균에게 독성이 있고 (문헌 [Tuite et al., 2005 J. Bacteriol, 187, 13, 4362-4371] 참조) 동시에 MetR을 통한 metA 발현에 부정적인 조절 효과를 가진다. 따라서 효소 MetH 및/또는 MetE의 강한 발현이 효율적인 메티오닌 생성을 위하여 명백히 필요하다.

대장균에서 환원된 황은 시스테인내로 통합되고 그다음 메티오닌 전구체 O-숙시닐-호모세린상으로 전달된다 (트랜스황화(transulfuration)라 불리는 과정) (문헌 [Neidhardt, F. C. (Ed. in Chief), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (eds). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology]에서 검토됨). 시스테인은 술프히드릴화(sulfhydrylation)로 O-아세틸세린 및 H₂S로부터 생성된다. 이 과정은 cysE로 코딩된 세린 트랜스아세틸라제에 작용하며 생성물, 시스테인에 의해 부정적으로 피드백 조절된다. O-아세틸-세린으로부터 자발적으로 생성된 N-아세틸-세린은 전사 인자 CysB와 함께 황 화합물의 수송, H₂S로의 이들의 환원 및 메티오닌과 같이 필수 아미노산인 유기-황 화합물 시스테인으로 이들의 통합에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 활성화한다.

시스테인의 부재하, MetB는 메티오닌-전구체 O-숙시닐 호모세린의 암모니아, α-케토부티레이트 및 숙시네이트로의 전환을 촉매한다 (γ-제거라 불리는 반응) (문헌 [Aitken & Kirsch, 2005, Arch Biochem Biophys 433, 166-75] 참조). α-케토부티레이트는 이어서 이소루이신으로 전환될 수 있다. 이러한 두가지의 아미노산은 분리하기가 어렵기 때문에 이러한 부반응은 메티오닌의 공업적 제조에 있어서 바람직하지 않다. 따라서, 이소루이신의 생성을 낮게 유지하기 위한 낮은 γ-제거 활성 또는 다른 수단들이 메티오닌의 공업적 제조에 있어서 중요한 측면이다. 미국 가출원 제60/650,124호는 효소 MetB를 최적화함으로써 어떻게 γ-제거가 감소될 수 있는지 기술한다. 시스테인 생합성의 최적화는 또한 γ-제거 및 이에 따라 부산물 이소루이신의 생성을 감소시킬 수 있고 본 발명의 실시양태를 구성한다.

본 발명은

- 탄소의 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지내 변형된 미생물을 배양하는 단계, 및

- 상기 배양 배지로부터 메티오닌을 회수하는 단계

를 포함하고, 이때 비-변형된 미생물 또는 방법과 비교하여 향상된 메티오닌/ 탄소 공급원 수득량을 나타내도록 미생물 또는 방법이

1- 미생물내 포르밀-THF의 탈포르밀화(deformylation)의 감소

2- 미생물내 포스포에놀(phosphoenol) 피루베이트 (PEP)의 소비의 감소

3- 배양 배지내 미생물에게 하나 또는 수개의 무기 기질을 제한 또는 고갈시킴으로써 미생물의 성장의 제한

의 변형 또는 이들의 조합 중 1종 이상에 의해 변형된, 발효 과정에서 메티오닌, 이의 유도체, 또는 전구체의 생성 방법에 관한 것이다.

본 발명의 설명에서, 유전자 및 단백질은 대장균내 상응하는 유전자의 명칭을 사용하여 확인된다. 그러나, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 이러한 명칭의 사용은 본 발명에 따라 보다 일반적인 의미를 가지며 다른 유기체, 보다 구체적으로 미생물내 상응하는 유전자 및 단백질 모두를 포함한다. 다른 유기체의 유전자 및 단백질, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)의 경우 또한 추가 정보로서 명시될 수 있다. 이러한 추가 정보의 목적은 유전자 또는 단백질의 일반적인 정의를 한정하기 위한 것이 아니다.

본 발명의 구체적인 실시양태에서 메티오닌/탄소 공급원 수득량은 포르밀-THF의 탈포르밀화를 감소 (이는 purU 유전자 (C, 글루타미컴내 YP_00l137322)의 발현을 감쇠시킴으로써 달성됨)시킴으로써 증가된다. PurU 효소는 포르밀-THF 데포르밀라제 반응을 촉매한다. 데포르밀라제 활성의 감쇠는 호모시스테인의 메틸화에 필요한 메틸-THF의 생성을 증가시킨다. 탈포르밀화로 인한 C1 대사물질의 손실은 메티오닌으로 변환될 수 없는 호모시스테인의 증가된 생성으로 이어진다. 호모시스테인은 이어서 호모란티오닌(homolanthionine)의 생성을 야기하는 O-숙시닐호모세린 및 호모시스테인간의 반응을 촉매시킬 수 있는 효소 시스타티오닌 감마 신타아제 (MetB)를 위한 기질이 될 수 있다.

본 발명의 다른 구체적인 실시양태에서 메티오닌/탄소 공급원 수득량은 포스포에놀 피루베이트 (PEP)의 소비를 감소 (이는 피루베이트 키나아제 코딩 유전자 pykA 및 pykF 중 1종 이상 또는 모두를 감쇠시킴으로써 달성됨)시킴으로써 증가된다. PEP의 증가된 이용율(availability)은 옥살로아세테이트 (옥살로아세테이트는 아스파르테이트의 중요한 전구체이고 아스파르테이트는 다시 메티오닌의 전구체임)의 생성을 증가시킬 수 있다. C. 글루타미컴은 YP_226326에 대응하는 오직 하나의 피루베이트 키나아제 유전자를 보유한다.

본 발명의 다른 실시양태에서 메티오닌/탄소 공급원 수득량은 미생물의 성장을 제한하거나 또는 미생물에게 무기 기질을 고갈시킴으로써 증가된다. 이는 배양 배지내 이용가능한 인산염 및/또는 칼륨의 양을 제한함으로써 달성될 수 있다. 이러한 세포 성장의 제한은, 탄소가 생체물질(biomass)의 생성 및/또는 이러한 생체물질의 유지에 사용되지 않고 메티오닌의 생성에 사용되기 때문에 메티오닌/ 탄소 공급원 수득량의 개선을 가능하게 한다. 특히, 배양 배지내 인산염의 농도는 200 미만의, 우선적으로 150의, 보다 우선적으로 100의 OD₆₀₀까지의 성장을 가능하게 한다. OD₆₀₀ 100은 대장균에서 30 내지 35 g/l 생체물질, 효모에서 40 내지 50 g/l의 생체물질에 해당한다. 다른 미생물에 대하여 전환 인자는 당 분야내 전문가들이 알고 있을 것이다. 대장균에서 1 g의 생체물질을 생성하기 위하여 필요한 인산염의 양은 10 내지 20 mg, 우선적으로 약 18 mg이다. 1 g의 생체물질을 생성하기 위하여 필요한 칼륨의 양은 10 내지 20 mg, 우선적으로 약 18 mg이다. 코리네박테리움 글루타미컴에서, 1 g의 생체물질을 제조하기 위하여 필요한 인산염의 양은 14 내지 21 mg, 우선적으로 약 17 mg이다. 1 g의 생체물질을 제조하기 위하여 필요한 칼륨의 양은 23 내지 33 g, 우선적으로 약 28 mg이다. 다른 미생물에 대하여 전환 인자는 당 분야내 전문가들이 알고 있을 것이다.

미생물은 영양(rich) 또는 최소 배지내에서, 우선적으로 최소 배지내에서 성장된다. 적합한 최소 배지가 하기에 기술된다.

메티오닌/탄소 공급원 수득량을 조정하기 위한 이러한 세가지의 수단은 단독으로 또는 다른 수단들 중 하나 또는 둘과 함께 조합되어 사용될 수 있다.

그런 이유로, purU 유전자의 발현 감쇠에 의한 포르밀-THF 탈포르밀화의 감소는 유전자 pykA, pykF 또는 양자의 발현 감쇠에 의한 PEP의 소비 감소와 및 배양 배지내 인산염 및/또는 칼륨의 제한 또는 고갈과 관련될 수 있다.

유사하게, purU 유전자의 발현 감쇠에 의한 포르밀-THF 탈포르밀화의 감소는 유전자 pykA, pykF 또는 양자의 발현 감쇠에 의한 PEP의 소비 감소와 관련될 수 있다.

유사하게, purU 유전자의 발현 감쇠에 의한 포르밀-THF 탈포르밀화의 감소는 배양 배지내 인산염 및/또는 칼륨의 제한 또는 고갈과 관련될 수 있다.

유사하게, 유전자 pykA, pykF 또는 양자의 발현 감쇠에 의한 PEP의 소비 감소는 배양 배지내 인산염 및/또는 칼륨의 제한 또는 고갈과 관련될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 하기의 용어들은 본 특허청구범위 및 명세서의 해석을 위하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면 용어 '배양', '발효' 또는 '발효 과정'은 단순한 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 박테리아의 성장을 나타내기 위하여 혼용되어 사용된다.

총 메티오닌/탄소 공급원 수득량은 메티오닌 + NAM (메티오닌의 등가량의 NAM 물질의 경우)의 양 (g) %/ 발효 운전(run) 동안 소비된 글루코스 (g)로 정의된다.

메티오닌의 유도체는 메티오닌 변환 및/또는 분해 경로로부터 유래한다. 구체적으로 이러한 생성물들은 S-아데노실-메티오닌 (SAM), 티오-메틸-리보스 및 N-아세틸메티오닌 (NAM)이다. 특히 NAM는 탈아실화로 단리 및 메티오닌으로 변환될 수 있는 용이하게 회수가능한 메티오닌 유도체이다. 어구 "배양 배지로부터 메티오닌을 회수하는 단계"는 메티오닌, SAM 및 NAM 및 유용할 수 있는 다른 모든 유도체들을 회수하는 행위를 명명한다.

메티오닌의 전구체는 메티오닌 특이적 대사경로의 일부분인 대사물질로 정의되거나 또는 이러한 대사물질들로부터 유도될 수 있다. 구체적으로, 전구체는 O-숙시닐-호모세린 (OSH), 감마-시스타티오닌, 호모시스테인 및 호모란티오닌이다. 상기 메티오닌 특이적 경로는 효소 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제 (MetA)에 의한 호모세린의 숙시닐호모세린으로의 변환으로부터 출발한다.

용어 "미생물"은 박테리아, 효모 또는 진균을 명명한다. 우선적으로, 이러한 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토마이세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae) 중에 선택된다. 보다 우선적으로 이러한 미생물은 에쉐리히아(Escherichia), 클렙시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 살모넬라(Salmonella) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium)의 종들이다. 더욱 보다 우선적으로 이러한 미생물은 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미컴 종이다.

용어 "변형된 미생물"은 메티오닌/탄소 공급원 수득량 증가의 목표로 유전자적으로 변형된 미생물을 나타낸다. 당업자는 특정한 유전자의 발현을 조정하는 법을 알고 있다. 일반적인 변형은 유전자 치환, 프로모터의 변형, 및 이종 유전자의 발현을 위한 벡터의 도입을 비롯한 유전자적 요소로의 미생물의 형질전환을 포함한다.

용어 "메티오닌/탄소 공급원 수득량"은 발효 동안 수득된 메티오닌의 양을 소비된 탄소 공급원의 양으로 나눈 것으로 정의된다. 이는 g 메티오닌/ g 탄소 공급원 또는 몰 메티오닌/ 몰 탄소 공급원의 백분율로 표현될 수 있다. 본 맥락에서 용어 "향상된"은 명시된 변형이 이루어지지 않은 미생물 및/또는 변형이 이루어지지 않은 배양 배지와 비교하여 측정가능한 증가를 설명한다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 증가는 2 % g/g 이상, 바람직하게는 4 % g/g 이상, 보다 바람직하게는 7 % g/g 이상이다. 총 메티오닌/탄소 공급원 수득량은 우선적으로 7 % g/g 이상, 우선적으로 12 % g/g 이상, 우선적으로 15 % g/g 이상, 가장 우선적으로 19 % g/g 이상이다.

이러한 증가를 측정하기 위하여 소비된 글루코스 및 생성된 메티오닌의 양이 구해져야 한다. 소비된 탄소 공급원의 양은 굴절계 검출을 갖는 HPLC에 의해 또는 공급물-배치 용액을 위한 브릭스(Brix)의 방법에 따라 성장 배지내 글루코스 농도를 구함으로써 계산된다. 배치 배양에서 소비된 글루코스는 실험 초반의 잔류 글루코스의 양으로부터 실험 종료시 잔류 글루코스의 양을 뺀 것에 해당한다. 공급물 배치 발효 (상세한 설명을 위하여 실시예 참조)에서 소비된 글루코스의 양은 배치 배양내 글루코스, 접종원(inoculum)내 첨가된 글루코스 및 공급물 배치 단계 동안 주입된 글루코스의 양의 합(계)로부터 실험 종료시 잔류 글루코스의 양을 뺀 것에 해당한다.

용어 "수득된 메티오닌"은 L-메티오닌 및 용이하게 회수가능한 메티오닌 유도체 NAM을 포함한다. 배지내 수득된 메티오닌의 양은 기준으로 L-메티오닌 (Fluka, Ref 64319)을 사용하여 형광측정 검출과 함께 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC에 의해 측정된다. NAM의 양은 기준으로 NAM (Sigma, Ref 01310)을 사용하여 굴절계 HPLC를 사용하여 측정된다.

본 발명에 따른 용어 '탄소 공급원'은 (글루코스, 갈락토스 또는 락토스와 같은) 헥소오스, 펜토오스, 단당류, 이당류, (슈크로스, 셀로비오스 또는 말토스와 같은) 올리고당, 당밀, 전분 또는 이의 유도체, 헤미셀룰로스, 글리세롤 및 이들의 조합일 수 있는, 미생물의 정상적인 성장을 지지하기 위하여 당업자가 사용할 수 있는 임의의 탄소의 공급원을 나타낸다. 특히 바람직한 간단한 탄소 공급원은 글루코스이다. 다른 바람직한 간단한 탄소 공급원은 슈크로스이다.

본 발명에 따른 용어 '유전자의 발현의 감쇠'는 유전자의 발현의 부분적 또는 완전한 억제 (그러면 이를 '감쇠되었다'고 한다)를 나타낸다. 이러한 발현의 억제는 유전자의 발현의 저해, 유전자 발현을 위하여 필수적인 프로모터 영역의 모두 또는 일부분의 결실, 유전자의 코딩 영역의 결실, 또는 야생형 프로모터의 보다 약한 천연 또는 합성 프로모터로의 교환 중 어느 것일 수 있다. 우선적으로, 유전자의 감쇠는 본질적으로 유전자의 완전한 결실이고 이는 본 발명에 따른 균주의 동정, 단리 및 정제를 용이하게 하는 선택 마커 유전자로 대체될 수 있다. 유전자는 우선적으로 동종 재조합의 방법으로 불활성화된다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K- 12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645] 참조).

본 맥락에서 용어 "향상된" 또는 "과다발현된"은 예를 들어 유전자 복제 수의 증가, 보다 강한 프로모터의 사용 또는 증가된 활성을 갖는 대립유전자의 사용 및 가능하게는 이러한 조치들을 조합하여, 상응하는 DNA로 코딩되는 효소 활성의 세포내 활성의 증가를 설명한다.

용어 "증가된 발현" "향상된 발현" 또는 "과다발현"은 본 명세서에서 혼용되어 사용되고 유사한 의미를 가진다.

유전자의 발현을 증가시키기 위하여 염색체적으로 또는 염색체외적으로 코딩될 수 있다. 염색체적으로 당 분야내 전문가에게 공지된 재조합 방법으로 도입될 수 있는 게놈상 하나 또는 수개의 복제가 있을 수 있다. 염색체외적으로 유전자는 복제 개시점 및 이에 따라 세포내 복제 수에 관하여 상이한 플라스미드의 상이한 유형들에 의해 운반될 수 있다. 치밀한(tight) 복제를 갖는 낮은 복제 수 플라스미드 (pSClOl, RK2), 낮은 복제 수 플라스미드 (pACYC, pRSFlOlO) 또는 높은 복제 수 플라스미드 (pSK bluescript II)에 상응하여 이들은 1 내지 5 복제, 약 20 또는 최대 500 복제로 존재할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서 유전자는 유도가능할 수 있는, 상이한 강도를 가진 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 이러한 프로모터들은 동종 또는 이종일 수 있다. 당업자는 어느 프로모터가 가장 편리한지 알고 있으며 예를 들어 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac 또는 람다 프로모터 cI가 광범위하게 사용된다.

효소의 발현은 상응하는 메신저 RNA (문헌 [Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64] 참조) 또는 단백질 (예를 들어, GST tags, Amersham Biosciences)을 안정화 또는 불안정화하는 요소들로 부스팅 또는 감소될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따라 향상되는 유전자의 하나 또는 수개의 대립유전자를 포함하는 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 설명에서, 유전자 및 단백질은 대장균내 상응하는 유전자의 명칭을 사용하여 확인된다. 그러나, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 이러한 명칭의 사용은 본 발명에 따라 보다 일반적인 의미를 가지며 다른 유기체, 보다 구체적으로 미생물내 상응하는 유전자 및 단백질 모두를 포함한다.

PFAM (protein families database of alignments and hidden Markov models; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)은 단백질 서열 정렬의 큰 수집을 나타낸다. 각각의 PFAM은 다수의 정렬을 가시화하고, 단백질 도메인을 보고, 유기체들중 분포를 평가하고, 다른 데이타베이스에 접근하고, 그리고 공지된 단백질 구조를 가시화하는 것을 가능하게 한다.

COG (clusters of orthologous groups of proteins; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는 30개 주요 계통 발생의 라인을 나타내는 66개의 완전히 서열분석된 게놈들로부터 단백질 서열을 비교함으로써 수득된다. 각각의 COG는 전의 보존된 도메인의 확인을 가능하게 하는, 셋 이상의 라인으로부터 정의된다.

동종 서열 및 이들의 상동성 백분율의 확인 수단은 당업자에게 공지되어 있고, 구체적으로 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/로부터 이 웹사이트에 표시된 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 BLAST 프로그램을 포함한다. 수득된 서열은 그다음 예를 들어, 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://prodes.Toulouse. inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)을 이러한 웹사이트에 표시된 디폴트 파라미터와 함께 사용하여 활용 (예를 들어, 정렬)될 수 있다.

공지된 유전자에 대하여 젠뱅크(GenBank)에 제시된 참조를 사용하여, 당업자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물, 등등내 등가 유전자를 알아낼 수 있다. 이러한 통상적인 작업은 다른 미생물들로부터 유도된 유전자로 서열 정렬을 수행하고 다른 유기체내 상응하는 유전자를 클로닝하기 위하여 변성 프로브를 설계함으로써 알아낼 수 있는 컨센서스(consensus) 서열을 사용하여 유리하게 행하여진다. 이러한 분자 생물학의 통상적인 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.]에서 청구된다.

"유기체에 무기 기질의 제한을 겪게 함"은 여전히 약한 성장을 가능하게 하는 공급된 비-유기 화학물질의 양으로 미생물의 성장이 지배되는 조건을 정의한다. 이러한 기질들의 예로는 인산염, 칼륨, 마그네슘 또는 이들의 조합이 있다.

미생물에 무기 기질을 고갈시킴은 무기 기질의 부재로 인하여 미생물의 성장이 완전하게 멈추는 조건을 정의한다. 이러한 기질들의 예로는 인산염, 칼륨, 마그네슘 또는 이들의 조합이 있다.

본 발명에서 발명자들은 생산 균주의 대사 조작(engineering)으로 메티오닌/ 탄소 공급원 수득량을 증가시키는 것을 목표로 삼았다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 메티오닌/ 글루코스 및/또는 메티오닌/ 슈크로스 수득량 (g/g)은 10 % g/g 이상, 우선적으로 15 % g/g 이상, 보다 우선적으로 19 % g/g이다.

본 발명의 구체적인 실시양태에서, 황 동화, 세린의 생성, 이의 글리신으로의 변환 또는 글리신의 절단(cleavage)에 관여하는 1종 이상의 유전자의 발현이 증가된다. 메티오닌은 황 함유 아미노산 (C5H11NO2S)이기 때문에 미생물의 황 동화를 증가시킴이 유리하다. 더욱이, 아미노산 세린 및 글리신의 생성 및 글리신의 절단 (즉, 이화작용)을 증가시킴이 유리하다. 글리신 절단 및 세린의 글리신으로의 변환은 메틸-THF (이것은 다시 호모시스테인의 메티오닌으로의 메틸화를 위하여 필요함)로 환원될 수 있는 메틸렌-THF를 생성하는 2가지의 주요 반응이다. 세린 생성은 효소 3-포스포글리세레이트 탈수소화효소(3-phosphoglycerate dehydrogenase), 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase) 및 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase)로 촉매된다. 글리신 절단은 글리신 절단 복합체로 촉매된다.

대장균 및 코리네박테리움 글루타미컴내, 활성이 증가될 수 있는 및 상기 기재된 활성에 관여하는 효소는 하기의 유전자 (기탁 번호 및 상응하는 폴리펩티드의 기능이 뒤따름)에 의해 코딩된다:

본 발명의 구체적인 실시양태에서, 술페이트/티오술페이트 임포터(importer) 및 티오술페이트 특이적 시스테인 신타아제를 코딩하는 오페론 cysPUWAM, 및/또는 술파이트 리덕타제 및 PAPS 리덕타제를 코딩하는 오페론 cysJIH의 발현이 증가된다. 코리네박테리움의 경우 cysA, cysT, cyI 및 cysJ이 바람직하게 이들의 발현에 있어 증가된다.

본 발명의 다른 구체적인 실시양태에서 글리신 절단 복합체를 코딩하는 유전자 lpd, 및/또는 오페론 gcvTHP의 발현이 증가된다. 상기 글리신 절단 복합체는 가능하게 합성 유전자로서 코리네박테리움 제케이움(Corynebacterium jekeium)으로부터 유전자 gcvTHP를 도입함으로써 코리네박테리움 글루타미컴내 도입 및 과다발현될 수 있다.

본 발명의 다른 구체적인 실시양태에서 serA, serB, serC 또는 glyA와 같은 글리신의 생성에 관여하는 1종 이상의 유전자가 과다발현된다.

본 발명의 다른 실시양태에서 메티오닌 생성을 부스팅하기 위하여 메티오닌 생합성의 대사 경로에 관여하는 효소가 과다발현되거나 또는 이들의 활성이 증가될 수 있다. 구체적으로 이러한 효소를 코딩하는 하기의 유전자 1종 이상이 과다발현될 수 있다:

- metF 1790377 Cgl2171 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트(Methylenetetrahydrofolate) 리덕타제

- metA (1790443) S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌 (WO 2005/10856에 기술된 바와 같음)에 감소된 피드백 감응성을 가진 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제를 코딩하는 대립유전자 또는 코리네박테리움 글루타미컴의 경우 유전자 metX CglO652.

- thrA 또는 thrA (1786183) 트레오닌에 감소된 피드백 저해를 가진 아스파르토키나아제/호모세린 탈수소화효소를 코딩하는 대립유전자

- 코리네박테리움 글루타미컴의 경우 WO 2007/012078에 기술된 바와 같이 잠재적으로 피드백 내성(resistant)인 asp 및 hom은 과다발현될 수 있다.

- metH 1790450 Cgll507 B12-의존성 호모시스테인-N5-메틸테트라히드로폴레이트 트랜스메틸라제(transmethylase)

- CysE 1790035 Cgl2563 세린 아세틸트랜스퍼라제

C. 글루타미컴내 metY(CglO653)의 과다발현은 유전자 aecD / metB. (Cgl2309/Cgl2446)의 과다발현이 있거나 없이 계획될 수 있다.

metF 및 metH의 과다발현은 본 명세서에서 참고문헌으로 도입된 WO 2007/077041 및 WO2007/012078에서 시사되었다. 본 문서에서 발명자들은 metF의 메신저 RNA를 안정화하는 요소를 사용한 metF의 더욱 추가적인 과다발현이 메티오닌 생성을 더욱 증가시킴을 입증하였다. 이러한 안정화 요소들은 일반적으로 RNA 분해 뉴클레아제의 공격을 감소시키는 루프 구조이다 (문헌 [Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64] 참조).

이의 억제제(inhibitor) SAM 및 메티오닌에 감소된 피드백 감응성을 가진 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 대립유전자의 과다발현은 본 명세서에 참고문헌으로 도입된 출원 공개 WO 2005/111202에서 기술된다.

cysE의 과다발현은 본 명세서에 참고문헌으로 도입된 WO 2007/077041에서 시사되었다.

메티오닌의 생성은 본 명세서에 참고문헌으로 도입된 출원 공개 WO 2004/076659에서 기술된 바와 같이 우선적으로 또는 전적으로 H₂S를 사용하는 및 따라서 O-숙시닐-호모세린으로부터 호모시스테인을 생성하는 변경된 metB 대립유전자를 사용하여 더욱 증가될 수 있다.

대장균내 L-메티오닌, 이의 전구체 또는 이들의 유도된 화합물의 생성에서의 추가적 증가는 출원 공개 JP 2000/157267에서 시사된 바와 같이 메티오닌 레귤론(regulon)의 저하-조절의 원인이 되는 억제자 단백질 MetJ (GenBank 1790373)의 유전자를 감쇠 또는 결실시킴으로써 달성된다. 코리네박테리움에서 마스터 황 조절자 McbR (AAP45010)는 WO2007/012078에 나타난 바와 같이 결실되어야 한다.

본 발명의 다른 구체적인 실시양태에서, 부산물 이소루이신의 생성이 감소된다. 이소루이신은 순수한 메티오닌의 생성을 위한 비용을 크게 증가시키며 매우 어렵게 메티오닌으로부터 분리될 수 있는 아미노산이다. 추가로, 이소루이신의 생성은 메티오닌의 생성을 위하여 사용될 수 있는 탄소를 소비한다. 따라서 이소루이신의 생성이 가급적 낮게 유지됨이 바람직하다.

이소루이신은 시스테인의 부재하, O-숙시닐호모세린의 γ-제거 반응을 통하여 또는 트레오닌 생합성 경로를 통하여 생성된다. γ-제거 활성을 감소시키는 수단이 본 명세서에 참고문헌으로 도입된 출원 공개 WO 2006/082254 및 WO 2007/077041에서 기술되었다.

대장균과 같은 비-변형된 미생물내 이소루이신 생성은 검출 수준 (HPLC) 이하이다. 변형된 미생물에서, 생성된 양은 2 % g 이소루이신/g 글루코스에 도달할 수 있다. 배지내 회수된 이소루이신의 양은 40 mM보다 클 수 있다.

발명자들은 또한 세린 생합성에 관여하는 하기 유전자의 1종 이상의 과다발현은 이소루이신의 생성을 감소시킴을 증명하였다.

본 발명의 보다 구체적인 실시양태에서 발명자들은 serA, serB 및/또는 serC의 향상된 발현이 부산물 이소루이신의 생성을 감소시킴을 입증하였다.

본 발명의 다른 구체적인 실시양태에서, 부산물 호모란티오닌의 생성이 감소된다. 호모란티오닌은 활성화된 호모세린 및 호모시스테인으로부터 생성된 아미노산이다 (문헌 [Kromer et al (2006) J Bacteriol 188, 609-18] 및 BASF의 특허 출원 공개 WO 2007/051725 참조). 호모란티오닌은 순수한 메티오닌의 생성을 위한 비용을 크게 증가시키며 매우 어렵게 메티오닌으로부터 분리될 수 있는 아미노산이다. 추가로, 호모란티오닌은 메티오닌으로 변환된다면 모두 메티오닌/ 탄소 공급원 수득량을 증가시킬 수 있는 두가지의 아스파르테이트 유도된 호모세린 분자 및 환원된 황 분자를 포함한다. 따라서 호모란티오닌의 생성이 가급적 낮게 유지되고 사용된 전구체가 메티오닌으로 변환됨이 바람직하다. PCT 출원 공개 WO 2007/051725는 호모란티오닌의 생성을 감소시키는 수단 일부를 제안한다. 발명자들은 동시에 기질 호모시스테인의 메티오닌으로의 변환을 가능하게 하는 호모란티오닌의 생성을 감소시키기 위한 다른 수단을 발견하였다. 특별히 호모시스테인의 메티오닌으로의 변환에 유리하게 작용하는 수단들은 purU 유전자로 코딩되는 포르밀-THF 데포르밀라제 활성의 감쇠, metF 유전자로 코딩되는 메틸렌-THF 리덕타제 활성의 과다발현, pykA 및/또는 pykF 유전자의 발현의 감쇠, serA, serB 또는 serC의 과다발현 또는 lpd 유전자의 과다발현이다.

L-메티오닌, 이의 전구체 또는 이들의 유도된 화합물의 발효적 생성을 위하여 사용되는 황 공급원은 다음 중 임의의 것일 수 있다: 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트 또는 이들의 조합.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 황 공급원은 술페이트 및/또는 티오술페이트이다.

바람직한 탄소 공급원으로, 발명자들은 글루코스 또는 슈크로스를 추천한다.

본 발명은 또한 상술된 메티오닌 생산 미생물의 발효, 메티오닌, 이의 전구체 또는 유도체의 농축 및 발효 브로쓰의 요망되는 생성물의 단리를 포함하는, L-메티오닌, 이의 전구체 또는 이들의 유도된 화합물의 생산 방법에 관한 것이다.

당업자는 본 발명에 따른 미생물을 위한 배양 조건을 정의할 수 있다. 특히 박테리아는 20 ℃ 내지 55 ℃, 우선적으로 25 ℃ 내지 40 ℃, 및 보다 구체적으로 C. 글루타미컴의 경우 약 30 ℃ 및 대장균의 경우 약 37 ℃의 온도에서 발효된다.

발효는 일반적으로 1종 이상의 간단한 탄소 공급원, 및 필요하다면 대사물질의 생성을 위하여 필수적인 보조-기질을 함유하는, 사용된 박테리아에 맞추어진 공지된 정의된 조성물의 무기 배양 배지와 함께 발효조내에서 수행된다.

구체적으로, 대장균을 위한 무기 배양 배지는 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128] 참조), M63 배지 (문헌 [Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York] 참조) 또는 셰퍼(Schaefer) 외 (문헌 [1999, Anal . Biochem. 270: 88-96] 참조)가 정의한 바와 같은 배지와 동일 또는 유사한 조성물일 수 있다.

유사하게, C. 글루타미컴을 위한 무기 배양 배지는 BMCG 배지 (문헌 [Liebl et al ., 1989, Appl . Microbiol . Biotechnol. 32: 205-210] 참조) 또는 리에델(Riedel) 외 (문헌 [2001, J. Mol . Microbiol . Biotechnol. 3: 573-583] 참조)가 기술한 바와 같은 배지와 동일 또는 유사한 조성물일 수 있다. 이러한 배지는 돌연변이에 의하여 도입된 영양요구성(auxotrophy)을 보상하기 위하여 보충될 수 있다.

발효 후 L-메티오닌, 이의 전구체 또는 이들의 유도된 화합물은 회수 및 정제 (필요한 경우)된다. 배양 배지내 메티오닌 및 N-아세틸-메티오닌과 같은 생성된 화합물의 회수 및 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

경우에 따라, 생체물질의 0 내지 100 %, 우선적으로 90 % 이상, 보다 우선적으로 95 %, 보다 더욱 우선적으로 99 % 이상이 발효 생성물의 정제 동안 보유될 수 있다.

경우에 따라, 메티오닌 유도체인 N-아세틸-메티오닌을 탈아실화로 메티오닌으로 변환시킨 후, 메티오닌을 회수한다.

본 발명은 또한 메티오닌의 발효적 생산을 위하여 최적화된, 즉 비-변형된 미생물과 비교하여 개선된 메티오닌/ 탄소 공급원 수득량을 가진, 및 상술된 유전자적 변형을 포함하는 미생물에 관한 것이다.

도 1
대장균내 메티오닌 생합성. 약어: P 인산염, GA3P 글리세르알데히드-3-포스페이트, PGA 포스포글리세레이트, PEP 포스포에놀피루베이트, Pyr 피루베이트, Asp 아스파르테이트, Asp-P 아스파르틸포스페이트, Asp-SA 아스파르테이트세미알데히드, homoser 호모세린, OSH O-숙시닐호모세린, γ-cys γ-시스타티오닌, homocys 호모시스테인, homolan 호모란티오닌, THF 테트라히드로폴레이트, Ser 세린, Cyst 시스테인, Gly 글리신, PPP 펜토오스 포스페이트 션트(shunt).
도 2
3가지의 상이한 배양 조건 (과량의 인산염으로의 성장 (색칠한 부호), 100 UDO₆₀₀ _nm에서 인산염 고갈로의 성장 (속이 빈 부호) 및 인산염 제한으로의 성장 (회색 부호))하 성장한 균주1 PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA PtrcO9-gcvTHP에 대한 DO₆₀₀ _nm 및 Y_met ₊ _NAM의 전개.

metJ 유전자에 의하여 코딩된 메티오닌 억제자가 클로람페니콜 카세트 (ΔmetJ::Cm)로 치환되고, 메티오닌 및 SAM에 감소된 피드백 감응성을 가진 metA 대립유전자 (metA*11)를 보유하는 대장균 균주가 2004년 5월 12일자로 출원된 PCT WO2005108561에 기술되었다. 구조 유전자의 상류에서 염색체내로 통합된 인공 프로모터 (Ptrc - metF, Ptrc - metH)로부터 유전자 metF 및 metH의 과다발현이 출원 공개 WO 2007/077041에서 기술되었다. 상기 문서는 또한 트레오닌에 감소된 피드백 저해를 가진 아스파르토키나아제/호모세린 탈수소화효소 (thrA *)의 과다발현 및 플라스미드 pME101으로부터의 metA *11 및 세린 아세틸-트랜스퍼라제 (cysE)의 과다발현을 기술한다. 상기의 특허 출원에 기술된 모든 변형을 가진 균주 (본 출원에서 균주1이라 불림)는 유전자형 ΔmetJ metA*11 Ptrc - metH Ptrc - metF (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)을 가진다. 하기에 기술된 뒤이은 구축은 이러한 구축물에 기초한다.

오페론 cysPUWAM , cysJIH , gcvTHP 및 유전자 metF , serA , serC , serB , glyA 및 lpd 과다발현 균주 및 유전자 pykA , pykF 및 purU 의 결실을 갖는 균주의 구축

metF를 제외한 모든 구축물은 처음에는 대장균 균주 MG1655에서 제조되었고 뒤이어 형질도입으로 최종 균주내로 전달되었다.

MG1655 P trc - cysPUWAM 의 구축

오페론 cysPUWAM을 이종 Ptrc 프로모터의 제어하에 두기 위하여, 다첸코(Datsenko) 및 워너(Wanner) (2000)가 기술하는 동종 재조합 전략을 사용하였다. 이 전략은 관심 유전자의 상류에 이종 프로모터와 함께 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 카세트의 삽입을 가능하게 한다. 이러한 목적을 위하여 하기의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

여기서

- 유전자 cysP의 서열 (2541512 - 2541578)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- 클로람페니콜 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (진하게 한 대문자) (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]내 참조 서열),

- 밑줄친 -35 및 -10 박스를 가진 trc 프로모터 서열을 위한 영역 (이탤릭체의 대문자)을 가진다.

여기서

- 유전자 cysP의 상류 영역의 서열 (2541644-2541578)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- 박테리오파지 T7 종결 서열을 위한 영역 (이탤릭체의 밑줄친 대문자) (Genbank V01146)을 가진다

플라스미드 pKD3로부터 클로람페니콜 내성 카세트를 증폭하기 위하여 올리고뉴클레오티드 Ptrc-cysPUWAM F 및 Ptrc-cysPUWAM R을 사용하였다. 수득된 PCR 생성물을 그다음 전기천공법으로 균주 MG1655 (pKD46)내로 도입하였다. 이러한 균주에서 Red 재조합 효소를 발현하였고 동종 재조합을 가능하게 하였다. 클로람페니콜 내성 형질전환체를 그다음 선택하였고 내성 카세트의 삽입을 하기에 나타난 올리고뉴클레오티드 Ptrc-cysPUWAMRv 및 Ptrc-cysPUWAMFv와 함께 PCR 분석으로 확인하였다. 보유된 균주는 MG1655 Ptrc - cysPUWAM : Cm이라고 지칭하였다.

MG1655 P trc - cysJIH 의 구축

오페론 cysJIH을 이종 Ptrc 프로모터의 제어하에 두기 위하여, 다첸코 및 워너 (2000)가 기술하는 동종 재조합 전략을 사용하였다. 이 전략은 관심 유전자의 상류에 이종 프로모터와 함께 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 카세트의 삽입을 가능하게 한다. 이러한 목적을 위하여 하기의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

여기서

- 유전자 cysJ의 서열 (2889935 - 2889987)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- 카나마이신 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (진하게 한 대문자) (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]내 참조 서열),

여기서

- 유전자 cysJ의 상류 영역의 서열 (2890047 - 2889988)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- 박테리오파지 T7 종결 서열을 위한 영역 (이탤릭체의 밑줄친 대문자) (Genbank V01146)을 가진다.

플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 내성 카세트를 증폭하기 위하여 올리고뉴클레오티드 PtrcF-cysJIH F 및 PtrcF-cysJIH R을 사용하였다. 수득된 PCR 생성물을 그다음 전기천공법으로 균주 MG1655 (pKD46)내로 도입하였다. 이러한 균주에서 Red 재조합 효소를 발현하였고 동종 재조합을 가능하게 하였다. 카나마이신 내성 형질전환체를 그다음 선택하였고 내성 카세트의 삽입을 하기에 나타난 올리고뉴클레오티드 Ptrc-cysJIHFv 및 Ptrc-cysJIHRv와 함께 PCR 분석으로 확인하였다. 보유된 균주는 MG1655 Ptrc - cysJIH : Km이라고 지칭하였다.

MG1655 PtrcO9 - gcvTHP 의 구축

오페론 gcvTHP를 이종 Ptrc 프로모터의 제어하에 두기 위하여, 다첸코 및 워너 (2000)가 기술하는 동종 재조합 전략을 사용하였다. 이 전략은 관심 유전자의 상류에 이종 프로모터와 함께 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 카세트의 삽입을 가능하게 한다. 이러한 목적을 위하여 하기의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

여기서

- 유전자 gcvT의 서열 (3048630 - 3048687)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- 밑줄친 -35 및 -10 박스를 가진 trc 프로모터 서열을 위한 영역 (이탤릭체의 대문자)을 가진다.

여기서

- 유전자 gcvT의 상류 영역의 서열 (3048887 - 3048830)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- 카나마이신 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (진하게 한 대문자) (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]내 참조 서열)을 가진다.

플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 내성 카세트를 증폭하기 위하여 올리고뉴클레오티드 Ptrc-gcvTHP F 및 Ptrc-gcvTHP R을 사용하였다. 수득된 PCR 생성물을 그다음 전기천공법으로 균주 MG1655 (pKD46)내로 도입하였다. 이러한 균주에서 Red 재조합 효소를 발현하였고 동종 재조합을 가능하게 하였다. 카나마이신 내성 형질전환체를 그다음 선택하였고 내성 카세트의 삽입을 하기에 나타난 올리고뉴클레오티드 Ptrc-gcvTHP F2 및 Ptrc-gcvTHP R2와 함께 PCR 분석으로 확인하였다. 보유된 균주는 MG1655 Ptrc - gcvTHP : Km이라고 지칭하였다.

MG1655 Δ pykA 의 구축

pykA 유전자를 결실시키기 위하여, 다첸코 및 워너 (2000)가 기술하는 동종 재조합 전략을 사용하였다. 이 전략은 관심 유전자내로의 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 카세트의 삽입을 가능하게 한다. 이러한 목적을 위하여 하기의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

여기서

- pykA 영역의 서열 (1935756 - 1935838)과 동종인 영역 (소문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- 클로람페니콜 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (진하게 한 대문자) (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]내 참조 서열)을 가진다.

여기서

- pykA 영역의 서열 (1937135 - 1937055)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

플라스미드 pKD3로부터 클로람페니콜 내성 카세트를 증폭하기 위하여 올리고뉴클레오티드 DpykA F 및 DpykA R을 사용하였다. 수득된 PCR 생성물을 그다음 전기천공법으로 균주 MG1655 (pKD46)내로 도입하였다. 이러한 균주에서 Red 재조합 효소를 발현하였고 동종 재조합을 가능하게 하였다. 클로람페니콜 내성 형질전환체를 그다음 선택하였고 내성 카세트의 삽입을 하기에 나타난 올리고뉴클레오티드 pykA F 및 pykA R과 함께 PCR 분석으로 확인하였다. 보유된 균주는 MG1655 ΔpykA::Cm이라고 지칭하였다.

MG1655 Δ pykF 의 구축

pykF 유전자를 결실시키기 위하여, 다첸코 및 워너 (2000)가 기술하는 동종 재조합 전략을 사용하였다. 이 전략은 관심 유전자내로의 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 카세트의 삽입을 가능하게 한다. 이러한 목적을 위하여 하기의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

여기서

- pykF 영역의 서열 (1753689 - 1753767)과 동종인 영역 (소문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

여기서

- pykF 영역의 서열 (1755129 - 1755051)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 내성 카세트를 증폭하기 위하여 올리고뉴클레오티드 DpykF F 및 DpykF R을 사용하였다. 수득된 PCR 생성물을 그다음 전기천공법으로 균주 MG1655 (pKD46)내로 도입하였다. 이러한 균주에서 Red 재조합 효소를 발현하였고 동종 재조합을 가능하게 하였다. 카나마이신 내성 형질전환체를 그다음 선택하였고 내성 카세트의 삽입을 하기에 나타난 올리고뉴클레오티드 pykF F 및 pykF R과 함께 PCR 분석으로 확인하였다. 보유된 균주는 MG1655 DpykF :: Km이라고 지칭하였다.

MG1655 Δ purU 의 구축

purU 유전자를 결실시키기 위하여, 다첸코 및 워너 (2000)가 기술하는 동종 재조합 전략을 사용하였다. 이 전략은 관심 유전자내로의 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 카세트의 삽입을 가능하게 한다. 이러한 목적을 위하여 하기의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

여기서

- purU 영역의 서열 (1287929 - 1287849)과 동종인 영역 (소문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

여기서

- purU 영역의 서열 (1286948 - 1287028)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 내성 카세트를 증폭하기 위하여 올리고뉴클레오티드 DpurU F 및 DpurU R을 사용하였다. 수득된 PCR 생성물을 그다음 전기천공법으로 균주 MG1655 (pKD46)내로 도입하였다. 이러한 균주에서 Red 재조합 효소를 발현하였고 동종 재조합을 가능하게 하였다. 카나마이신 내성 형질전환체를 그다음 선택하였고 내성 카세트의 삽입을 하기에 나타난 올리고뉴클레오티드 purU F 및 purU R과 함께 PCR 분석으로 확인하였다. 보유된 균주는 MG1655 DpurU :: Km이라고 지칭하였다.

pCC1BAC - serA - serC 의 구축

serA 및 serC 유전자의 발현을 증가시키기 위하여, 복제 제어 벡터 pCClBAC (Epicentre)으로부터 이들의 적절한 프로모터를 사용하여 효소를 발현함으로써 메티오닌 생산 세포내 이 두 유전자의 유전자 용량(gene dosage)을 증가시켰다.

이러한 목적을 위하여, 먼저 올리고뉴클레오티드 -serC F (XbaI) 및 serC R (HindIII)을 사용하여 대장균 게놈으로부터 serC 유전자를 증폭하였다. 효소 XbaI 및 HindIII을 사용하여 상기 PCR 생성물을 제한하였고 동일한 제한 효소에 의하여 제한된 벡터 pUC18 (Stratagene)내로 클로닝하였다. 생성된 벡터를 pUCl8-serC이라 명명하였다.

여기서

- 유전자 serC의 서열 (956619 - 956644)과 동종인 영역 (소문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- XbaI 부위를 보유하는 영역 (진하게 한 대문자)을 가진다.

여기서

- 유전자 serC의 서열 (958028 - 958004)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- HindIII 부위를 보유하는 영역 (진하게 한 대문자)을 가진다.

이어서 올리고뉴클레오티드 serA F (XbaI) 및 serA R (SmaI-HindIII)을 사용하여 대장균 게놈으로부터 serA 유전자를 증폭하였다. 효소 XbaI 및 SmaI을 사용하여 상기 PCR 생성물을 제한하였고 동일한 제한 효소에 의하여 제한된 벡터 pUC18-serC내로 클로닝하였다. 생성된 벡터를 서열분석으로 확인하였고 pUC18-serA - serC이라 명명하였다.

여기서

- 유전자 serA의 서열 (3055198 - 3055218)과 동종인 영역 (소문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- XbaI 부위를 보유하는 영역 (대문자)을 가진다.

여기서

- 유전자 serA의 서열 (3056878 - 3056859)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- SmaI 및 HindIII 부위를 보유하는 영역 (진하게 한 것)을 가진다.

유전자 serA 및 serC를 복제 제어 벡터 pCC1BAC내로 전달하기 위하여, 효소 HindIII로 벡터 pUC18-serA - serC를 제한하였고 HindIII 바로 클로닝가능한 pCC1BAC (Epicentre)내로 클로닝하였다.

생성된 구축물을 확인하였고 pCC1BAC-serA - serC이라 명명하였다.

벡터 pCC1BAC - serB - serA - serC 의 구축

serA , serB 및 serC 유전자의 발현을 증가시키기 위하여, 복제 제어 벡터 pCClBAC (Epicentre)으로부터 이들의 적절한 프로모터를 사용하여 효소를 발현함으로써 메티오닌 생산 세포내 이 세 유전자의 유전자 용량(gene dosage)을 증가시켰다.

이러한 목적을 위하여, 올리고뉴클레오티드 serB (SphI) 및 serB (SmaI)을 사용하여 대장균 게놈으로부터 serB 유전자를 증폭하였다. 효소 SphI 및 SmaI을 사용하여 상기 PCR 생성물을 제한하였고 동일한 제한 효소에 의하여 제한된 벡터 pUC18-serA-serC내로 클로닝하였다. 생성된 벡터를 pUCl8-serB - serA - serC이라 명명하였다.

여기서

- 유전자 serB의 서열 (4622362 - 4622383)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- SphI 부위를 보유하는 영역 (밑줄친 대문자)을 가진다.

여기서

- 유전자 serB의 서열 (4623433 - 4623412)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- SmaI 부위를 보유하는 영역 (밑줄친 대문자)

- 박테리오파지 T7 종결 서열을 위한 영역 (이탤릭체의 대문자) (Genbank V01146)을 가진다.

유전자 serA , serB 및 serC를 복제 제어 벡터 pCC1BAC내로 전달하기 위하여, 효소 HindIII로 벡터 pUC18-serB - serA - serC를 제한하였고 HindIII 바로 클로닝가능한 pCC1BAC (Epicentre)내로 클로닝하였다.

생성된 구축물을 확인하였고 pCClBAC-serB - serA - serC이라 명명하였다.

벡터 pCC1BAC - serB - glyA - serA - serC 의 구축

serA , serB , serC 및 glyA 유전자의 발현을 증가시키기 위하여, 복제 제어 벡터 pCClBAC (Epicentre)으로부터 이들의 적절한 프로모터를 사용하여 효소를 발현함으로써 메티오닌 생산 세포내 이 세 유전자의 유전자 용량을 증가시켰다.

이러한 목적을 위하여, 올리고뉴클레오티드 PgIyA F (HindIII) 및 glyA R (EcoRI-HindIII)을 사용하여 대장균 게놈으로부터 glyA 유전자를 증폭하였다. 효소 HindIII을 사용하여 상기 PCR 생성물을 제한하였고, 클레노우(Klenow) 단편으로 블런팅(blunt)하였으며 제한 효소 SmaI에 의하여 제한된 벡터 pUC18-serB-serA -serC내로 클로닝하였다. 생성된 벡터를 pUCl8-serB - glyA - serA - serC이라 명명하였다.

여기서

- glyA 영역의 서열 (2683760 - 2683742)과 동종인 영역 (진하게 한 대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- HindIII 부위를 보유하는 영역 (밑줄친 대문자)을 가진다.

여기서

- glyA 영역의 서열 (2682084 - 2682061)과 동종인 영역 (이탤릭체의 대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- HindIII 및 EcoRI 부위를 보유하는 영역 (밑줄친 대문자)을 가진다.

유전자 serA , serB , serC 및 glyA를 복제 제어 벡터 pCC1BAC내로 전달하기 위하여, 효소 HindIII로 벡터 pUCl8-serB - glyA - serA - serC를 제한하였고 HindIII 바로 클로닝가능한 pCC1BAC (Epicentre)내로 클로닝하였다.

생성된 구축물을 확인하였고 pCClBAC-serB - glyA - serA - serC이라 명명하였다.

벡터 pJB137 - lpd 의 구축

올리고뉴클레오티드 lpd F (HindIII) 및 lpd R (EcoRI)을 사용하여 대장균 게놈으로부터 lpd 유전자를 증폭하였다. 효소 EcoRI 및 HindIII을 사용하여 상기 PCR 생성물을 제한하였고 동일한 제한 효소에 의하여 제한된 벡터 pJB137내로 클로닝하였다. 생성된 벡터를 pJB137-lpd이라 명명하였다.

여기서

- 유전자 lpd의 서열 (127644 - 127668)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

여기서

- 유전자 lpd의 서열 (129404 - 129380)과 동종인 영역 (대문자) (웹사이트 http://www.ecogene.org/상 참조 서열),

- EcoRI 부위를 보유하는 영역 (진하게 한 대문자)을 가진다.

생성된 구축물을 확인하였고 pJB137-lpd이라 불렀다.

개개의 돌연변이의 균주1내로의 통합

이어서 하기의 균주들을 P1 파지 형질도입 및 내성 카세트의 제거 (필요한 경우)로 균주 ΔmetJ metA*11 Ptrc - metH Ptrc - metF으로부터 유도하였다.

구축된 균주

P1 형질도입 및 항생 물질 내성 카세트의 제거를 통한 전달은 균주 ΔmetJ metA*11 Ptrc - metH Ptrc - metF PtrcF-cysPUWAM :: Cm PtrcF-cysJIH :: Km로 예증 될 것이다. Ptrc36-ARNmstl7-metF (하기 참조)를 포함하는 균주를 제외한 다른 구축물 모두를 유사한 방법으로 구축하였다.

프로모터 구축물 PtrcF-cysPUWAM :: Cm을 균주 MG1655 ΔmetJ metA*11 Ptrc -metH Ptrc - metF내로 전달하기 위하여, 파지 P1 형질도입의 방법을 사용하였다. 하기의 프로토콜을 균주 MG1655 PtrcF-cysPUWAM :: Cm의 파지 용해물의 제조 및 뒤이은 균주 MG1655 ΔmetJ metA*11 Ptrc - metH Ptrc - metF내로의 형질도입의 2 단계로 구현하였다.

파지 용해물 P1 의 제조:

- LB 10 ml + Km 50 ㎍/ml + 글루코스 0.2 % + CaCl₂ 5 mM의 균주 MG1655 PtrcF-cysPUWAM::Cm의 철야 배양물의 100 ㎕로의 접종.

- 37 ℃에서 30분 동안 진탕 인큐베이션.

- 균주 MG1655에서 제조된 파지 용해물 P1 (약 1.10⁹ 파지/ml)의 100 ㎕의 첨가.

- 모든 세포들이 분해될 때까지 37 ℃에서 3시간 동안 진탕.

- 200 ㎕ 클로로포름의 첨가 및 볼텍싱.

- 4500 g에서 10분 동안 원심 분리로 세포 잔해 제거.

- 상등액의 무균 튜브로의 전달 및 200 ㎕ 클로로포름의 첨가.

- 4 ℃에서 용해물의 저장.

형질도입

- LB 배지내 균주 MG1655 ΔmetJ metA*11 Ptrc - metH Ptrc - metF의 철야 배양물 5 ml의 1500 g에서 10분 동안 원심 분리.

- 2.5 ml의 10 mM MgSO₄, 5 mM CaCl₂내 세포 펠렛의 현탁

- 대조군 튜브: 100 ㎕ 세포

100 ㎕ 균주 MG1655 PtrcF-cysPUWAM :: Cm의 파지 P1

- 시험 튜브: 100 ㎕의 세포 + 100 ㎕의 균주 MG1655 PtrcF-cysPUWAM :: Cm의 파지 P1

- 30 ℃에서 30분 동안 진탕없이 인큐베이션.

- 각자의 튜브내 100 ㎕의 1 M 시트르산나트륨의 첨가 및 볼텍싱.

- 1 ml의 LB의 첨가.

- 37 ℃에서 1시간 동안 진탕 인큐베이션.

- 7000 rpm에서 3분 동안 튜브의 원심 분리 후 디쉬상 LB + Cm 50 ㎍/ml의 확산배양.

- 밤새 37 ℃에서 인큐베이션.

균주의 확인

클로람페니콜 내성 형질전환체를 선택하고 프로모터 구축물 MG1655 PtrcF -cysPUWAM::Cm의 존재를 균주 MG1655 PtrcF-cysPUWAM :: Cm의 확인을 위하여 상술된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 분석으로 확인하였다. 보유된 균주를 ΔmetJ metA*11 Ptrc - metH Ptrc - metF PtrcF - cysPUWAM :: Cm이라 지칭하였다. 이어서 PtrcF-cysJIH 대립유전자를 상술된 바와 같은 P1 형질도입 절차를 사용하여 도입하였다. 생성된 균주를 ΔmetJ metA*11 Ptrc - metH Ptrc - metF PtrcF-cysPUWAM :: Cm PtrcF-cysJIH::Km이라 명명하였다.

pykA 및 pykF 결실의 도입을 위하여 내성 카세트를 균주 DmetJ metA*1l Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM :: Cm PtrcF-cysJIH :: Km으로부터 제거하였다.

이러한 목적을 위하여 내성 카세트의 FRT 부위에 작용하는 FLP 재조합효소를 운반하는 플라스미드 pCP20을 전기천공법으로 재조합 균주내로 도입하였다. 42 ℃에서 일련의 배양 후, 두 카세트의 손실을 PCR 분석으로 확인하였다. 보유된 균주를 ΔmetJ metA*11 Ptrc - metH Ptrc - metF PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH이라 지칭하였다. 그다음 pykA 및 pykF 대립유전자의 결실을 P1 형질도입을 통하여 도입할 수 있었다. 유사하게, 글리신 절단 복합체 과다발현 구축물 PtrcO9-gcvTHP 및 purU 유전자의 결실을 상응하는 카세트의 제거 후 도입하였다.

근접성의 이유로 구축물 Ptrc36-ARNmstl7-metF을 P1 형질도입으로 도입할 수 없었고 PCR을 통한 도입으로 구축하였다.

이러한 목적을 위하여 다첸코 및 워너 (2000)가 기술하는 동종 재조합 전략을 사용하였다. 이러한 전략은 관심 유전자 근처에 클로람페니콜 또는 카나마이신 내성 카세트의 삽입을 가능하게 한다. 이러한 목적을 위하여 하기의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

진하게 한 대문자: 리보솜 결합 부위 및 -10 영역

소문자: RNA 안정화 서열

이탤릭체의 대문자: Ptrc 프로모터의 부분

여기서

- 유전자 metF의 영역의 서열 (4130114-4130195)과 동종인 영역 (소문자) (웹사이트 http://genolist.pasteur.fr/Colibri/상 참조 서열),

- 박테리오파지 T7 말단의 서열과 동종인 영역 (이탤릭체의 소문자) (Genbank V01146)

- 카나마이신 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (대문자) (문헌[Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]내 참조 서열)을 가진다.

PCR을 위하여 출원 공개 WO 2007077041에서 기술된 MG1655 metA*11 DmetJ::Cm Ptrc - metF::Km으로부터 단리된 DNA를 매트릭스로 사용하였다.

플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 내성 카세트를 증폭하기 위하여 올리고뉴클레오티드 Ptrc-metF F 및 Ptrc36-ARNmst-metF을 사용하였다. 수득된 PCR 생성물을 그다음 전기천공법으로, 발현된 Red 재조합 효소가 동종 재조합을 가능하게 하는 균주 ΔmetJ metA*11 Ptrc - metH Ptrc - metF PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH ΔpykF ΔpykA PtrcO9-gcvTHP ΔpurU (pKD46)내로 도입하였다. 카나마이신 내성 형질전환체를 선택하였고 내성 카세트의 삽입을 하기에 정의된 올리고뉴클레오티드 Ptrc-metFv F 및 Ptrc-metFv R과 함께 PCR 분석으로 확인하였다.

생성된 균주를

이라 불렀다.

이어서 플라스미드 (pMElOl-thrA*1-cysE-PgapA - metA*11)를 상술된 균주내로 도입하여 하기의 균주를 수득하였다:

특정 균주내로 플라스미드 pJB137-lpd, pCC1BAC-serA - serC, pCC1BAC-serB -serA-serC 또는 pCC1BAC-serB - glyA - serA - serC를 도입하여 하기를 수득하였다:

메티오닌 생산 균주의 평가

처음에는 생산 균주를 소형 엘렌마이어 플라스크에서 평가하였다. 5.5 mL 예비배양물을 혼합 배지 (2.5 g/L 글루코스 및 90 % 최소 배지 PC1을 가진 10 % LB 배지 (시그마 25 %))내에서 성장시켰고 배지 PC1내 0.2의 OD₆₀₀으로 50 mL 배양물을 접종하는데 사용하였다. 필요에 따라 카나마이신 및 스펙티노마이신을 50 mg/L의 농도로, 클로람페니콜을 30 mg/L으로 첨가하였다. 상기 배양물이 6 내지 7의 OD₆₀₀에 도달하였을 때, 세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC로 정량화하였고 다른 관련 대사물질은 실릴화 후 굴절계 검출이 있는 HPLC (유기 산 및 글루코스) 및 GC-MS을 사용하여 분석하였다.

표 2에서 알 수 있는 바와 같이 메티오닌/글루코스 수득량 (Y_met)은 cysJIH 및 cysPUWAM의 과다발현으로 증가된다. 피루베이트 키나아제 코딩 대립유전자 pykA 및 pykF의 결실은 메티오닌/글루코스 수득량을 더욱 증가시킬 수 있다. purU 유전자에 의하여 코딩되는 포르밀-THF 데포르밀라제의 결실은 메티오닌/글루코스 수득량을 더욱 부스팅한다. 구축물 Ptrc36-ARNmstl7-metF에 의한 metF 유전자의 더욱 추가적인 발현은 여전히 더욱 높은 메티오닌/글루코스 수득량을 제공한다. serA serC 및 serB의 과다발현은 메티오닌/글루코스 수득량을 훨씬 더 증가시키고 glyA의 추가적인 발현은 여전히 메티오닌/글루코스 수득량을 증가시킨다.

CysM , cysJI , PykA /F, GcvTHP 및 Lpd , serA , serB , serC 및 glyA 의 효소 활성의 변화의 측정

CysM, CysJI, PykA/F, GcvTHP, SerA, SerB, SerC, GIyA 및 Lpd의 발현의 변화를 검증하기 위하여, 상응하는 효소의 활성을 조추출물(crude extract)에서 측정하였다.

시험관내 효소 활성의 측정을 위하여, 대장균 균주를 상술된 바와 같은 최소 배지내에서 배양하였고 중간(mid) 대수기에서 수확하였다. 세포들을 저온의 인산칼륨 완충액내 현탁하였고 얼음 상 초음파 처리하였다 (Branson sonifier, 70W). 두 경우에서 (표 3에서 회색으로 나타남), 단백질을 프리셀리스(precellys) 추출 시스템 (Bertin technologies, France)을 사용하여 추출하였다: 세포들을 저온의 인산칼륨 완충액내 현탁하고, 0.1 mm 유리 구슬과 혼합하였으며 30초의 한번의 실행으로 추출하였다. 원심 분리 후, 상등액내 함유된 단백질을 정량화하였다 (Bradford, 1976).

술포시스테인 신타아제 활성 (CysM)을 생성된 술포시스테인의 LC-MS 정량화로 검정하였다. 시험을 위하여 25 ㎍/mL의 단백질을 25 mM의 O-아세틸세린 및 25 mM 티오술페이트를 함유하는 인산칼륨 완충액 (0.5 M, pH 6.5)에 넣었다. 상기 반응을 30 ℃에서 10분 동안 진행하였고, LC-MS 정량화를 위하여 추가적으로 처리하였다.

술파이트 리덕타제 활성(CysJI)을 NADPH의 소멸(disappearance)로 검정하였다. 이러한 반응 혼합물은 트리스-염산 (0.5 M, pH 7.5)내 10 mM NADPH 및 10 mM 아황산수소나트륨으로 구성되어 있었다. 30 ㎕의 단백질 추출물을 첨가함으로써 반응을 개시하였고 30 ℃ 분 동안 340 nm에서의 온도조절된 분광광도계내에서 이어졌다.

피루베이트 키나아제 활성 (PykA/F)의 측정을 위하여, 락테이트 탈수소화효소 (LDH) 연결 분석을 수행하였다. 10 ㎕의 단백질 추출물을 10 mM DTT, 100 mM MgCl₂, 100 mM KCl, 10 mM PEP, 50 mM AMP, 1O mM 프럭토스 1,6 비스 포스페이트, 10 mM NADH 및 10 유닛의 LDH를 함유하는 트리스-염산 (0.5 M, pH 7.5)으로 완충된 용액에 첨가하였다. 반응은 30 ℃에서 30분 동안 340 nm에서의 온도조절된 분광광도계내에서 이어졌다.

글리신 절단 복합체의 성분인 GcvTHP의 활성을 글리신 탈카르복시 반응 동안 발생하는 CO₂ 생성을 측정함으로써 추정하였다. 상기 반응은 pH 7에서 0.5 M의 인산칼륨 완충액, 50 μCi/mL의 1M 1-14C-글리신, 200 mM 리포아미드 및 2 mM 피리독살 포스페이트를 함유하는 가지 달린 워버그(Warburg) 플라스크에서 수행하였다. 400 ㎕의 히아민(hyamine)을 플라스크의 중앙 웰에 넣었고 반응 시스템 전체를 37 ℃에서 5분 예비-인큐베이션하였다. 효소적 반응을 2 mg의 단백질을 첨가함으로써 개시하였고 37 ℃에서 진행하였다. 이를 500 ㎕의 6N H₂SO₄을 곁가지의 격벽을 통하여 첨가함으로써 정지하였고 14C-CO₂를 37 ℃에서 추가적으로 1시간 동안 인큐베이션함으로써 히아민으로 트랩핑하였다. 상기 중앙 웰내 액체를 그다음 제거하였고 3 mL의 섬광 액체에 첨가한 후 섬광 계수기에서 CPM을 측정하였다.

메틸렌 테트라히드로폴레이트 리덕타제 활성 (MTHFR, MetF)을 방사성 탈메틸화된 메틸 운반체의 유도체화로 측정하였다. 이러한 반응 혼합물은 인산칼륨 (50 mM, pH 6.7), 925 dpm/nmol에서 300 μM 5-14C-메틸-THF, 140 μM 메나디온(menadione), 37.5 μM FAD 및 0.02 % BSA (30 mM EDTA내 2 % BSA의 용액)을 포함한다. 37 ℃에서 5 분 예비인큐베이션 후, 1 ㎍의 단백질/㎕의 단백질 추출물 100 ㎕를 첨가하였다. 상기 반응을 37 ℃에서 15분 동안 진행하였고 소듐 아세테이트 (1 M, pH 4.7)내 3 mg/mL 디메돈(dimedone) 용액 300 ㎕을 첨가함으로써 정지하였다. 상기 반응 용액을 그다음 100 ℃에서 2분 인큐베이션하였고 5분 동안 얼음 상 냉각시켰다. 3 mL의 톨루엔을 그다음 첨가하였고 반응 용액을 실온에서 5분 동안 1500 g에서 원심 분리하였다. 1.5 mL의 수성상을 취하고 3 mL의 섬광 액체에 첨가하였다. CPM을 섬광 계수기로 측정하였고 활성을 계산하였다.

Lpd의 리포아미드 탈수소화효소 활성을 전자 공여체로서의 NADH로의 리포아미드의 환원에 기초하여 측정하였다. EDTA 10 mM, NADH 1 mM 및 NAD⁺ 25 mM 및 1 ㎍의 단백질 추출물을 트리스-염산 (0.5 M, pH 8.0) 완충된 용액에 첨가하였다. 반응을 200 mM의 리포아미드를 첨가함으로써 개시하였고 NADH 소멸이 30 ℃에서 30분 동안 340 nm에서의 온도조절된 분광광도계내에서 뒤따랐다.

SerA의 포스포글리세레이트 탈수소화효소 활성을 NADH의 소멸을 추적함으로써 관찰하였다. 30 ㎕의 단백질 추출물을 360 μM 3-P-히드록시피루베이트를 함유하는 트리스-염산 (10 mM, pH 8.8) 용액에 넣었다. 200 μM NADH를 첨가하여 반응을 개시하였고 NADH 소멸이 30 ℃에서 30분 동안 340 nm에서의 온도조절된 분광광도계내에서 뒤따랐다.

SerB 단백질에 의하여 운반되는 포스포세린 포스파타아제 활성을 GC-MS에 의하여 생성되는 세린을 측정함으로써 구하였다. 반응 혼합물은 TEA-HCL (10 mM, pH 7.5), 1 mM MgCl2, 1 mM O-포스포-L-세린 및 15 ㎍의 단백질을 포함하였다. 상기 반응을 37 ℃에서 인큐베이션하였고 아세톤의 첨가로 10 및 30분에 정지하였고 GC-MS 정량화를 위하여 추가적으로 처리하였다.

SerC의 포스포포세린-아미노-트랜스퍼라제 활성을 글루타메이트 탈수소화효소와 검정법을 결합시킴으로써 측정하였다. 반응 혼합물을 트리스-염산 (50 mM, pH 8.2)로 완충하였고, 32 mM 암모늄 아세테이트, 2 mM 글루타메이트, 2 uts 글루타메이트 탈수소화효소, 200 μM NADH를 포함하였다. 30 ㎕의 단백질 추출물을 첨가함으로써 반응을 개시하였고 NADH 소멸이 30 ℃에서 30분 동안 340 nm에서의 온도조절된 분광광도계내에서 뒤따랐다

세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제 활성을 GC-MS에 의하여 생성된 글리신을 관찰함으로써 측정하였다. 30 ㎍의 단백질을 인산칼륨 (50 mM, pH 7.3), 400 μM 의 테트라히도프테로일 글루타메이트, 10 mM L-세린 및 500 μM DTT를 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응을 37 ℃에서 10분 진행하였고 아세톤의 첨가로 10분 후 정지하였으며 GC-MS 정량화를 위하여 추가적으로 처리하였다.

표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이 구축물 PtrcF-cysPUWAM, PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP 및 Ptrc39-ARNmst17-metF, pJB137-lpd, pCC1BAC-serB - serA - serC 및 pCClBAC-serB-glyA-serA-serC은 상응하는 대립유전자로 변형되지 않은 균주와 비교시 모두 상응하는 효소의 활성을 증가시킨다. pykA 및 pykF의 결실은 피루베이트 키나아제 활성의 완전한 손실로 이어진다.

발효 조건하 메티오닌 생산의 검증

관심 대사물질의 상당량을 생산한 균주를 후속적으로 인산염 고갈의 공급물 배치 전략을 사용한 2.5 L 발효조 (Pierre Guerin)내 생산 조건하에서 시험하였다.

예비배양 배지 B1은 접종원을 갖는 배치 배지내로 추가적인 인산염의 도입을 방지하기 위하여 오직 50 mM 인산염만을 함유한다. 30 g/L의 세포 농도에서 성장을 중지시키기 위하여, 무기질 배지 B2에 첨가된 28.7 mM에 인산염을 첨가하였다. 공급물 배치 배지 (F1 및 F2)는 인산염 무함유이었다.

잠시, 2.5 g/L 글루코스를 갖춘 10 mL LB 배지에서 성장된 8시간 배양물을 최소 배지 (암모늄 티오술페이트는 갖지 않으나 MOPS 5 g/L을 갖춘 B1)내 12시간 예비배양물을 접종하는데 사용하였다. 이러한 인큐베이션은 37 ℃에서 회전식 진탕기 (200 RPM)내 최소 배지 (B1) 50 mL를 함유하는 500 mL 배플드(baffled) 플라스크에서 수행하였다.

세번째 예비배양 단계는 1.5 mL 농축된 예비배양물 (5 g/L)과 함께 0.05 g/L의 생체물질 농도로 접종된 최소 배지 (B1) 200 mL로 채워진 생물반응기 (Sixfors)에서 수행하였다. 상기 예비배양물 온도를 37 ℃에서 일정하게 유지하였고 pH는 10 % NH₄OH 용액을 사용하여 6.8의 값에서 자동적으로 유지하였다. 용해된 산소 농도를 공기 공급 및/또는 교반으로 부분 공기압 포화도의 30 %의 값으로 계속적으로 조정하였다. 배치 배지로부터 글루코스 소모 후, 공급물 배치를 초기 유속 0.7 mL/h으로 개시하였고 약 24 g/L의 최종 세포 농도를 달성하기 위하여 0.18/h의 성장 속도로 24시간 동안 지수적으로 증가시켰다.

이어서 2.5 L 발효조 (Pierre Guerin)를 최소 배지 (B2) 600 mL로 채웠고 45 내지 60 mL의 예비배양물 체적과 함께 2.1 g/L의 생체물질 농도로 접종하였다.

상기 배양물 온도를 37 ℃에서 일정하게 유지하였고 pH는 NH₄OH 용액의 자동 첨가 (NH₄OH 10시간 동안 10 % 및 배양 종료까지 24 %)로 작동(working) 값 (6.8)으로 유지하였다. 초기 교반 속도는 배치 단계 동안에는 200 rpm으로 설정하였고 공급물 배치 단계 동안에는 최대 1000 rpm으로 증가시켰다. 초기 공기 유속은 배치 단계 동안에는 40 NL/h로 설정하였고 공급물 배치 기간의 초반에 100 NL/h으로 증가시켰다. 용해된 산소 농도는 교반을 증가시킴으로써 20 내지 40 %의 값, 우선적으로 30 % 포화도로 유지하였다.

세포 군체가 5g/L에 근접한 농도에 도달했을 때, 공급물 배치를 5 mL/h의 초기 유속으로 개시하였다. 공급 용액(feeding solution)을 21시간 후 21 mL/h에 도달한 증가하는 유속으로 S자형 프로파일로 주입하였다. 정확한 공급 조건은 하기의 방정식으로 계산하였다:

상기 식에서, Q(t)는 p1 = 1.15, p2 = 18.32, p3 = 0.270, p4 = 5인 600 mL의 배치 체적에 대한 mL/h단위의 공급 유속이다.

21시간 공급물 배치 후, 세포 농도가 30 g/L에 달하였고 인산염을 배지로부터 고갈(deplete)시켰으며 세포들은 인산염 고갈에 진입하였다. 이 시점에서, 공급 용액의 주입을 4시간 동안 37 mL/h의 일정한 값으로 증가시켰다. 그다음, 상기 일정한 유속을 10 mL/h으로 감소시켰고 이러한 유속을 공급물 배치의 종료시까지 (50시간) 유지하였다.

표 8으로부터 알 수 있는 바와 같이 purU 유전자의 결실은 메티오닌/글루코스 수득량을 상당히 증가시킨다. 이소루이신 생성은 pCC1BAC-serA - serC으로부터 serA serC의 과다발현으로 상당히 감소된다. serB 유전자의 더욱 추가적인 발현은 이소루이신 생성을 더욱 감소시키고 메티오닌/글루코스 수득량을 증가시킨다.

메티오닌/ 글루코스 수득량 ( Y _met )의 측정

세포외 메티오닌 농도를 OPA/FMOC 유도체화 후 HPLC로 정량화하였다. NAM 농도 및 잔류 글루코스 농도를 굴절계 검출을 갖는 HPLC를 사용하여 분석하였다. 메티오닌 수득량을 하기와 같이 표현하였다:

배치 배양물:

초기 및 최종 배양물 체적을 측정하기 위하여, 엘렌마이어 플라스크를 빈 상태로, 배지와 함께 및 배양의 종료시에서 칭량하였다. 메티오닌 수득량을 하기와 같이 표현하였다:

상기 식에서, 메티오닌₀ 및 메티오닌_f는 각각 초기 및 최종 메티오닌 농도, 글루코스₀ 및 글루코스_f는 각각 초기 및 최종 글루코스 농도 및 V₀ 및 V_f는 초기 및 최종 체적이다.

공급물 배지 배양물:

발효조 체적은 초기 체적에 pH를 조절하고 배양물을 공급하기 위하여 첨가된 용액의 양을 더하고 샘플링을 위하여 사용되고 증발로 손실된 체적을 뺌으로써 계산하였다.

공급물 배치 체적은 공급 모액을 칭량함으로써 계속적으로 추적하였다. 주입된 글루코스의 양을 그다음 주입된 중량, 용액의 밀도 및 브릭스 방법으로 측정된 글루코스 농도 ([글루코스])에 기초하여 계산하였다. 메티오닌 수득량을 하기와 같이 표현하였다:

상기 식에서, 메티오닌₀ 및 메티오닌_t는 각각 초기 및 최종 메티오닌 농도 및 V₀ 및 V_t는 초기 및 t 순간의 체적이다.

소비된 글루코스를 하기와 같이 계산하였다:

주입된 글루코스_t = 공급된 체적_t * [글루코스]

소비된 글루코스_t = [글루코스]₀ * V₀ + 주입된 글루코스 - [글루코스]_잔류 * V_t

상기 식에서, [글루코스]₀, [글루코스], [글루코스]_잔류는 각각 초기, 공급된 및 잔류 글루코스 농도이다.

인산염 제한 또는 고갈은 메티오닌/ 글루코스 수득량을 증가시킨다.

인산염 제한 및 또한 인산염 고갈이 메티오닌/글루코스 수득량을 증가시킴을 입증하기 위하여 상술된 바와 같은 공급물 배치 발효를 수행하였다. 인산염 고갈 또는 제한이 없는 배양을 위하여, 무기질 배지 B3을 사용하였고 공급물 배치 배지는 Na2SO4 (8.95 .L-1) 및 (NH4)2SO4 (8.32 g.L-1)를 갖춘 F2이었다. 인산염 제한하에 성장된 배양을 위하여 하기의 변형을 도입하였다. 사용된 배치 무기질 배지는 B2이고 공급물 배치 배지는 60 mM의 인산염을 갖춘 F2이었다. 인산염 제한는 100의 OD600nm에서 발생하였다.

도 2로부터 알 수 있는 바와 같이 인산염 과량하 OD_600nm는 배양 동안 계속적으로 증가하였고 실험의 종료시 160 UDO에 달하였다. 인산염 제한 및 고갈의 경우 세포 성장 속도는 100의 OD_600nm 으로부터 시작하여 감소하였고 (20시간) 최종 OD_600nm는 120에 근접하였다. 잔류 인산염 농도는 0에 근접하였고 이는 이온계 크로마토그래피(ionic chromatography)로 확인되었다. 인산염 고갈 및 제한의 결과로서 메티오닌 수득량이 증가하였고 인산염 과량하에서의 0.124 g/g과 비교하여 각각 0.147 및 0.139 g/g의 최대값에 달하였다.

SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER FIGGE, RAINER SOUCAILLE, PHILIPPE BARBIER, GUILLAUME BESTEL-CORRE, GWENAELLE BOISART, CEDRIC CHATEAU, MICHEL <120> Increasing methionine yield <130> D25824 <150> PCT/EP2008/062859 <151> 2007-09-25 <150> PCT/EP2007/060433 <151> 2007-10-02 <160> 38 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 1 gcgcgagtga gttctttttc agtaagttaa cggccattgc gcacccttat aaatttaatg 60 actttcttcc acacattata cgagccggat gattaattgt caacagcttg taggctggag 120 ctgcttcg 128 <210> 2 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 2 ccaaatcacc aaacggtata taaaaccgtt actcctttca cgtccgttat aaatatgatg 60 gctattatca cactggctca ccttcgggtg ggcctttctg ccatatgaat atcctcctta 120 g 121 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 3 gcaggatttg tacgtcggtc acc 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 4 cgtcttgaac taagttcacc aggc 24 <210> 5 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 5 ccagtaagca aagctgtttc tgcgccctgt cagcgcccat aaaacagaag agattccaca 60 cattatacga gccggatgat taattgtcaa cagcttgtag gctggagctg cttcg 115 <210> 6 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 6 ggttattagt tatcgctatc ccgtctttaa tccacaccgt ttgccccgtt aaccttacct 60 tcacactggc tcaccttcgg gtgggccttt ctgccatatg aatatcctcc ttag 114 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 7 gcagttcgac aagttctttc acc 23 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 8 ccagaacaca acaccctaac atagcg 26 <210> 9 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 9 ccaccatgcg agcgccgcaa agcgtgtgtt gttcgtacaa aggagtctgt tgtgccataa 60 tatacctcct tattccacac attatacgag ccggatgatt aattgtcaac agctctgtag 120 gctggagctg cttcg 135 <210> 10 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 10 ctgtcgcgat ttttgcattt tttaaccata agctaatgtg atgatcaatt ttaccttaca 60 tatgaatatc ctccttag 78 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 11 ctatcacacc gccagaggca ttc 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 12 cccatcacac tttcatctcc cg 22 <210> 13 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 13 cgcggcgggt gccaacgttg tacgtatgaa cttttctcac ggctcgcctg aagatcacaa 60 aatgcgcgcg gataaagttc gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 14 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 14 cgccgcatcc ggcaacgtac ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc 60 acggtactca tcacgtcgcc ccatatgaat atcctcctta g 101 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 15 ggcaattacc ctcgacgtac cgg 23 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 16 ccgcctctaa cagatcatcc atcgg 25 <210> 17 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 17 cccatccttc tcaacttaaa gactaagact gtcatgaaaa agaccaaaat tgtttgcacc 60 atcggaccga aaaccgaatg taggctggag ctgcttcg 98 <210> 18 <211> 99 <212> DNA <213> 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<223> PRIMER <400> 25 tgctctagag tccgcgctgt gcaaatccag aatgg 35 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 26 cccaagctta actctctaca acagaaataa aaac 34 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 27 ctagtctaga ttagtacagc agacgggcgc g 31 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 28 tcccccggga agcttccgtc agggcgtggt gaccg 35 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 29 atgcgcatgc ccaccctttg aaaatttgag ac 32 <210> 30 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 30 gcatgtcgac atcccggggc agaaaggccc acccgaaggt gagccagtgt gattacttct 60 gattcaggct gcc 73 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 31 tcatcggatc catcaagctt gaaagaatgt gatgaagtg 39 <210> 32 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 32 atctagtaag cttagtgaat tcgttacgac agatttgatg gcgcg 45 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 33 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Claims

- 탄소의 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지내 변형된 미생물을 배양하는 단계, 및
- 상기 배양 배지로부터 메티오닌을 회수하는 단계
를 포함하고, 이때 비-변형된 미생물 및/또는 방법과 비교하여, 향상된 메티오닌/ 탄소 공급원 수득량을 나타내도록 미생물 및/또는 방법이
- 미생물내 포르밀-THF의 탈포르밀화의 감소
- 미생물내 PEP의 소비의 감소
- 배양 배지내 미생물에게 하나 또는 수개의 무기 기질을 제한 또는 고갈시킴으로써 변형된 미생물의 성장 및 생체물질 생성의 제한
의 변형 또는 이들의 조합 중 1종 이상으로 변형된, 발효 과정에서 메티오닌, 이의 유도체, 또는 전구체의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 포르밀-THF의 탈포르밀화가 유전자 purU의 발현의 감쇠로 감소되는 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 PEP의 소비가 1종 이상의 하기의 유전자의 발현의 감쇠로 감소되는 생산 방법:
- pykA
- pykF.
제1항에 있어서, 상기 미생물에 인산염 및/또는 칼륨을 제한 또는 고갈시키는 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 포르밀-THF의 탈포르밀화가 유전자 purU의 발현의 감쇠로 감소되고, 상기 PEP의 소비가 pykA 또는 pykF 유전자 또는 양자의 발현의 감쇠로 감소되고 상기 미생물에 인산염 및/또는 칼륨을 제한 또는 고갈시키는 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 포르밀-THF의 탈포르밀화가 유전자 purU의 발현의 감쇠로 감소되고, 상기 PEP의 소비가 pykA 또는 pykF 유전자 또는 양자의 발현의 감쇠로 감소되는 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 포르밀-THF의 탈포르밀화가 유전자 purU의 발현의 감쇠로 감소되고, 상기 미생물에 인산염 및/또는 칼륨을 제한 또는 고갈시키는 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 PEP의 소비가 pykA 또는 pykF 유전자 또는 양자의 발현의 감쇠로 감소되고 상기 미생물에 인산염 및/또는 칼륨을 제한 또는 고갈시키는 생산 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 하기의 유전자의 발현이 미생물내에서 증가되는 생산 방법: cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, cysE, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, sera, serB, serC, glyA.
제9항에 있어서, 오페론 cysPUWAM 및/또는 cysJIH의 발현이 미생물내에서 증가되는 생산 방법.
제9항에 있어서, 유전자 gcvTHP 및/또는 lpd에 의하여 코딩되는 글리신 절단 복합체의 발현이 미생물내에서 증가되는 생산 방법.
제9항에 있어서, serA, serB, serC 또는 glyA과 같이 글리신 생합성 경로에 관여하는 1종 이상의 유전자가 과다발현되는 생산 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 하기 유전자가 미생물내에서 과다발현되는 생산 방법: metF, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 감소된 피드백 감응성을 가진 효소를 코딩하는 metA 대립유전자, thrA 또는 트레오닌에 감소된 피드백 저해를 가진 thrA 대립유전자, cysE, metH.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, metJ 유전자에 의하여 코딩되는 메티오닌 억제자의 발현이 미생물내에서 감쇠되는 생산 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지내 황 공급원이 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트 또는 상이한 공급원들의 조합인 생산 방법.
제15항에 있어서, 상기 배양 배지내 황 공급원이 술페이트 또는 티오술페이트 또는 이 둘의 혼합물인 생산 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄소 공급원이 글루코스 또는 슈크로스인 생산 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 요망되는 아미노산/ 발효 브로쓰의 구성성분 및/또는 최종 생성물내 일부분 또는 총량 (0 내지 100 %)으로 선택적으로 남아있는 생체물질의 단리 단계를 포함하는 생산 방법.
제18항에 있어서, 메티오닌 유도체인 N-아세틸-메티오닌을 탈아실화로 메티오닌으로 변환시킨 후, 메티오닌을 회수하는 생산 방법.
제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 변형을 포함하는 미생물.