BRPI0818528B1 - Aumento do rendimento da metionina - Google Patents

Abstract

AUMENTO DO RENDIMENTO DA METIONINA. A presente invenção se refere a um processo pra a produção de metionina e seus derivados pelo cultivo de um microrganismo em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de enxofre. O microrganismo e/ou o meio de cultura são modificados de tal forma que o rendimento de metionina/fone de carbono é aumentado. O isolamento da metionina ou seus derivados do meio de fermentação também é descrito.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um processo para a produção de metionina ou seus derivados pelo cultivo de um microrganismo em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de enxofre. O microrganismo e/ou o meio de cultura foram modificados de uma forma que o rendimento metionina/fonte de carbono é aumentado. O isolamento da metionina ou de seus derivados do meio de fermentação também é reivindicado.

Antecedentes da Invenção

Compostos contendo enxofre, tais como cisteina, homocisteina, metionina ou S-adenosilmetionina são criticos para o metabolismo celular e são produzidos industrialmente para serem usados como aditivos de alimentos ou ração e medicamentos. Particularmente a metionina, um aminoácido essencial, o qual não pode ser sintetizado por animais, desempenha um papel importante em muitas funções corporais. Além de seu papel na biossintese de proteinas, metionina está envolvida na transmetilação e na biodisponibilidade do selênio e do zinco. Metionina, também é diretamente usada como tratamento para distúrbios como alergia e febre reumática. Todavia, a maior parte da metionina, a qual é produzida é adicionada à ração animal.

Com o uso reduzido de proteinas de origem animal como resultado de BSE e da gripe aviária, a demanda por metionina pura aumentou. Quimicamente, D,L-metionina é comumente produzida a partir de acroleina, metilmercaptano e cianeto de hidrogênio. Todavia, a mistura racêmica não apresenta um desempenho tão bom quanto a L-metionina pura, como por exemplo, em aditivos de ração de galinha (Saunderson, C. L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633) . L-metionina pura pode ser produzida a partir de metionina racêmica, por exemplo, através do tratamento da acilase de N-acetil-D,L-metionina, o qual aumenta dramaticamente os custos de produção. A crescente demanda por L-metionina pura juntamente com preocupações ambientais torna atrativa a produção microbiana de metionina.

Microrganismos desenvolveram mecanismos regulatórios altamente complexos que ajustam muito bem a biossintese dos componentes celulares, deste modo permitindo taxas de crescimento máximas. Consequentemente, somente as quantidades necessárias dos metabólitos, tais como aminoácidos são sintetizadas e podem comumente não ser detectadas no sobrenadante da cultura das cepas selvagens. Bactérias controlam a biossintese de aminoácidos principalmente por inibição por retroalimentação das enzimas, e a repressão ou ativação da transcrição gênica. Efetores para essas vias regulatórias são, na maioria dos casos, os produtos finais das vias relevantes. Consequentemente, estratégias para a superprodução de aminoácidos em microrganismos requer a desregulagem desses mecanismos de controle.

A via da sintese de L-metionina é bem conhecida em muitos microrganismos (Figura 1) . Metionina é derivada a partir do aminoácido aspartato, porém a sua sintese requer a convergência de duas vias adicionais, a biossintese de cisteina e o metabolismo Cl.

Aspartato é sintetizado a partir de oxaloacetato. Em E. coli, um pool de oxaloacetato estável é necessário para o funcionamento adequado do ciclo do ácido citrico. Consequentemente, a transformação de oxaloacetato em aspartato requer reações que compensem a retirada de oxaloacetato deste pool. Várias vias, chamadas de reações anapleróticas, preenchem essas funções em E. coli (Sauer & Eikmanns (2005) FEMS Microbiol Reviews 29 p765-94). Sob condições de crescimento exponencial e excesso de glicose, a PEP carboxilase catalisa a carboxilação de PEP, produzindo oxaloacetato. A eficiência da carboxilação depende, dentre outras coisas, da concentração de PEP intracelular. PEP é um metabólito central que sofre uma variedade de reações. Uma delas a transformação glicolitica de PEP em piruvato, não é essencial para E. coli, uma vez que a importação de glicose através do sistema PTS transforma uma das duas moléculas PEP geradas a partir de glicose em piruvato. Na glicólise, a enzima piruvato quinase, a qual em E. coli é codificada por duas isoenzimas codificadas pelos genes pykA e pykF, catalisa a transformação de PEP em piruvato.

Aspartato é convertido em homosserina por uma sequência de três reações. Homosserina pode subsequentemente entrar na via biossintética de treonina/isoleucina ou metionina. Em E.coli, a entrada na via da metionina requer a acilação da homosserina em succinil-homosserina. Este passo de ativação permite a subsequente condensação com cisteina, levando à cistationina contendo tioéter, a qual é hidrolisada para produzir homocisteina. A transferência de metil final que leva à metionina é efetuada por uma metiltransferase dependente de B12 ou independente de Bi2. A biossintese de metionina em E. coli é regulada pela repressão e ativação dos genes biossintéticos da metionina, através das proteinas MetJ e MetR, respectivamente (revisto em Figge RM (2006), ed Wendisch VF, Microbiol Monogr (5) Amino acid biosynthesis pl64-185) . MetJ, juntamente com o seu co repressor S-adenosilmetionina é conhecido por regular os genes metA, metB, metC, metE e metF. Outros genes codificando enzimas envolvidas na produção de metionina, tais como glyA, metE, metH e metF são ativado por MetR na presença de seu co-ativador homocisteina, enquanto que metA é somente ativado por MetR na ausência de homocisteina. Todas essas enzimas estão envolvidas na produção e transferência das unidades Cl de serina para metionina. GlyA codificando serina hidroximetiltransferase catalisa a conversão de serina em glicina e a transferência concomitante de uma unidade Cl na co-enzima tetraidrofolato (THF) . Glicina pode então ser transformada em CO2, NH3, enquanto que outra unidade Cl é transferida em THF. Esta reação é catalisada pelo complexo de divagem de glicina codificado pelos genes gcvTHP e Ipd.

Unidades Cl produzidas pelas duas reações na forma de metileno-THF podem ser subsequentemente ou reduzidas para metil-THF ou ainda oxidadas para formil-THF. A biossintese de metionina requer a redução a metil-THF. Deste modo, a reação de oxidação compete com a biossintese de metionina por unidades Cl. Formil-THF ou formato é necessário para a biossintese de purinas e histidina. Em E. coli, formil-THF pode ser transformado em THF e formato livre em uma reação catalisada pela formil-THF desformilase codificada pelo gene purU (Nagy et al. (1995) J. Bacteriol 177 (5) p. 1292-98).

A redução de metileno-THF em metil-THF é catalisada pela proteína MetF. A transferência do grupo metil em homocisteina é ou catalisada por MetH através da vitamina B12 ou diretamente por MetE. A enzima MetH é conhecida por ter uma taxa catalítica que é cem vezes mais alta do que a da enzima MetE. Na ausência de vitamina B^, e deste modo MetH, MetE pode compor até 5% da proteína celular total. A presença de MetH ativo reduz a atividade MetE provavelmente pela redução da quantidade de homocisteina que normalmente ativa a transcrição de metE através de MetR. Consequentemente, a produção de metionina através de MetH economiza importantes fontes para a célula, uma vez que MetE não é expresso em grandes quantidades. O acúmulo de homocisteina é tóxico para E. coli (Tuite et al., 2005 J. Bacteriol, 187-, 13, 4362-4371.) e ao mesmo tempo tem um efeito regulatório negativo na expressão de metA através de MetR. Deste modo, uma forte expressão das enzimas MetH e/ou MetE é claramente necessária para a eficiente produção de metionina.

Em E. coli, enxofre reduzido é integrado na cisteína e a seguir transferido no precursor de metionina O-succinil- (revisto em Neidhardt, F. C. (Editor-Chefe), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, e H. E. Umbarger (eds) . 1996. Escherichia coli e Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology). Cisteina é produzida de O-acetilserina e H2S por sulfidrilação. O processo é retroalimentado negativamente regulada pelo produto, cisteina, atuando na serina transacetilase, codificada por cysE. N-acetilserina, a qual é espontaneamente produzida a partir de O-acetilserina, juntamente com o fator de transcrição CysB, ativa os genes que codificam as enzimas envolvidas no transporte de compostos de enxofre, suas reduções em H2S e suas integrações no composto de organoenxofre cisteina, o qual, como a metionina, é um aminoácido essencial.

Na ausência de cisteina, MetB catalisa a conversão do precursor de metionina O-succinil-homosserina em amónia, ot- cetobutirato e succinato, uma reação chamada de y- eliminação (Aitken & Kirsch, 2005, Arch Biochem Biophys 433, 166-75). α-cetobutirato pode ser subsequentemente convertida em isoleucina. Esta reação secundária não é desejada para a produção industrial de metionina, uma vez que os dois aminoácidos são dif iceis de separar. Deste modo, a baixa atividade de y-eliminação ou outros meios para manter baixa a produção de isoleucina são importantes aspectos para a produção industrial de metionina. O pedido e patente provisório US 60/650.124 descreve como a y- eliminação pode ser reduzida pela otimização da enzima MetB. A otimização da biossintese de cisteina também pode reduzir a y-eliminação e, deste modo, a produção do subproduto isoleucina e constitui uma modalidade dessa invenção.

Sumário da Invenção

A invenção se refere a um método para a produção de metionina, seus derivados ou precursores em um processo fermentative compreendendo os seguintes passos: - cultivar um microrganismo modificado em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de enxofre, e - recuperar metionina do meio de cultura, em que em comparação com um microrganismo não- modificado ou método, o microrganismo ou o método foram modificados para apresentar um rendimento de metionina/fonte de carbono aumentado por pelo menos uma das seguintes modificações e combinações suas: 1 - Um decréscimo na desformilação de formil-THF no microrganismo 2 - Um decréscimo do consumo de fosfoenolpiruvato (PEP) no microrganismo 3 - Uma limitação do crescimento do microrganismo pela limitação ou privação do microrganismo para um ou vários substratos inorgânicos no meio de cultura.

Na descrição da presente invenção, genes e proteinas são identificados usando as denominações dos genes correspondentes em E. coli. Entretanto, e a não ser que seja especificado de ouro modo, o uso dessas denominações tem um significado mais geral de acordo com a invenção e cobre todos os genes correspondentes e proteinas em outros organismos, mais particularmente microrganismos. Genes e proteinas de outros organismos podem também ser especificados, particularmente para Corynebacterium glutamicum como informação adicional. O propósito dessa informação adicional não é limitar a definição geral para um gene ou uma proteina.

Em uma modalidade especifica da invenção, o rendimento de metionina/fonte de carbono é aumentado pelo decréscimo da desformilação de formil-THF, o que é efetuado pela atenuação da expressão do gene purU (YP_001137322 em C. glutamicum). A enzima PurU catalisa a reação de formil-THF desformilase. A atenuação da atividade desformilase aumenta a produção de metil-THF que é necessária para a metilação da homocisteina. A perda dos metabólitos Cl por desformilação leva a uma produção aumentada de homocisteina que não pode ser transformada em metionina. Homocisteina pode ser então um substrato para a enzima cistationina gama-sintase (MetB) que pode catalisar a reação entre O- succinil-homosserina e homocisteina, resultando na produção de homolantionina.

Em outra modalidade especifica da invenção, o rendimento de metionina/fonte de carbono é aumentado pelo decréscimo do consumo de fosfoenolpiruvato (PEP), o que é efetuado pela atenuação de pelo menos um ou ambos dentre os genes que codificam a piruvato quinase pykA e pykF. A disponibilidade aumentada de PP pode aumentar a produção de oxaloacetato, um importante precursor de aspartato, o qual por sua vez é um precursor da metionina. C. glutamicum somente abriga um gene da piruvato quinase, o qual corresponde ao YP_226326.

Em outra modalidade da invenção, o rendimento de metionina/fonte de carbono é aumentado pela limitação do crescimento do microrganismo ou privação do microrganismo para um substrato inorgânico. Isto pode ser conseguido pela limitação da quantidade de fosfato e/ou potássio disponivel no meio de cultura. Tal limitação do crescimento celular permite uma melhoria no rendimento de metionina/fonte de carbono, uma vez que o carbono não é usado para a produção de biomassa e/ou manutenção dessa biomassa, mas sim para a produção de metionina. Particularmente, a concentração de fosfato no meio de cultura permite o crescimento até uma ODgoo de menos de 200, preferivelmente de 150, mais preferivelmente de 100. Uma OD600 de 100 corresponde a 30 a 35 g/L de biomassa para E. coli, para levedura de 40 - 50 g/L. Para outros microrganismos, o fator de conversão será conhecido pelo especialista do assunto. Para E. coli, a quantidade de fosfato necessária para produzir um g de biomassa está entre 10 e 20 mg, preferivelmente aproximadamente 18 mg. A quantidade de potássio necessária para produzir um g de biomassa está entre 10 e 20 mg, preferivelmente cerca de 18 mg. Para Corynebacterium glutamicum, a quantidade de fosfato necessária para produzir uma g de biomassa está entre 14 e 21 mg, preferivelmente aproximadamente 17 mg. A quantidade de potássio requerida para produzir um g de biomassa está entre 23 e 33 g, preferivelmente aproximadamente 28 mg. Para outros microrganismos, o fator de conversão será conhecido pelo especialista no assunto.

O microrganismo cresce em meio rico ou minimo, preferivelmente em meio minimo. Os meios minimos adequados estão descritos abaixo.

Essas três formas de modular o rendimento de metionina/fonte de carbono podem ser usadas sozinhas ou combinadas com um ou dois dos outros meios.

Concordantemente, a redução da desformilação de formil-THF pela atenuação da expressão do gene purU pode estar associada com uma redução do consumo de PEP pela atenuação da expressão dos genes pykA, pykF ou ambos e com uma limitação ou provação de fosfato e/ou potássio no meio de cultura.

Semelhantemente, a redução da desformilação de formil- THF pela atenuação da expressão do gene purU pode estar associada com uma redução do consumo de PEP pela atenuação da expressão dos genes pykA, pykF ou ambos.

Semelhantemente, a redução da desformilação de formil- THF pela atenuação da expressão do gene purU pode estar associada com uma limitação ou privação de fosfato e/ou potássio no meio de cultura.

Semelhantemente, a redução do consumo e PEP pela atenuação da expressão dos genes pykA, pykF ou ambos pode estar associada com uma limitação ou privação de fosfato e/ou potássio no meio de cultura.

Conforme aqui utilizados, os termos a seguir podem ser usados para a interpretação das reivindicações e relatório descritivo.

De acordo com a invenção, os termos "cultura", "fermentação" ou "processo fermentative" são usados intercambiavelmente para denotar o crescimento de bactérias em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples.

O rendimento de metionina/fonte de carbono total é definido como a quantidade de metionina + NAM (para massa de NAM da quantidade equivalente de metionina) (g) %/glicose (g) consumida durante o tempo de fermentação.

Derivados de metionina se originam de vias de transformação e/ou degradação de metionina. Particularmente, esses produtos são S-adenosilmetionina (SAM) tiometilribose e N-acetilmetionina (NAM). Especialmente NAM é um derivado de metionina facilmente recuperável que pode ser isolado e transformado em metionina por desacilação. A frase (recuperando metionina do meio de cultura" designa a ação de recuperar metionina, SAM e NAM e todos os outros derivados que podem ser úteis.

Precursores da metionina são definidos como metabolites que são parte da via metabólica especifica da metionina ou podem ser derivados desses metabolites. Particularmente, precursores são O-succinil-homosserina (OS), gama-cistationina, homocisteina e homolantionina. A via especifica da metionina se inicia com a transformação de homosserina em succinil-homosserina pela enzima homosserina succinil transferase (MetA).

O termo "microrganismo" designa uma bactéria, levedura ou um fungo. Preferivelmente, o microrganismo é selecionado dentre Enterobacteria ceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteria ceae. Mais preferivelmente, o microrganismo é uma espécie de Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella ou Corynebacterium. Ainda mais preferivelmente, o microrganismo é da espécie Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum.

O termo "microrganismo modificado" denota um microrganismo que foi geneticamente modificado com o objetivo de aumentar o rendimento metionina/fonte de carbono. Modificações comuns incluem a transformação de microrganismos com elementos genéticos, incluindo substituições de genes, modificações de promotores e introdução de vetores para a expressão dos genes heterólogos.

O termo "rendimento de metionina/fonte de carbono" define a quantidade de metionina obtida durante a fermentação dividido pela quantidade de fonte de carbono que foi consumida. Ele pode ser expresso em porcentagem de g de metionina/g de fonte de carbono ou mol de metionina/mol de fonte de carbono. O termo "intensificado" neste contexto descreve um aumento mensurável em comparação com o microrganismo sem as modificações especificadas e/ou o meio de cultura sem as modificações. Em modalidades preferidas, o aumento é de pelo menos 2% g/g, preferivelmente de pelo menos 4% g/g, mais preferivelmente de pelo menos 7% g/g. 0 rendimento de metionina/fonte de carbono total é preferivelmente de pelo menos 7% g/g, preferivelmente de pelo menos 12% g/g, preferivelmente de pelo menos 15% g/g, mais preferivelmente de pelo menos 19% g/g.

Para medir este aumento, a guantidade de glicose consumida e metionina produzida tem que ser determinadas. A quantidade da fonte de carbono que foi consumida é calculada pela determinação da concentração de glicose no meio de crescimento por HPLC com detecção refratométrica ou de acordo com o método de Brix para soluções de alimentação em lote. Para culturas em lote, a glicose consumida corresponde à quantidade de glicose residual no inicio do experimento a partir do qual a quantidade de glicose residual no final do experimento é subtraída. Para a fermentação de alimentação em lote (ver exemplos para uma explicação detalhada) , a quantidade de glicose corresponde à soma de glicose na cultura em lote, a glicose adicionada no inóculo e a quantidade de glicose injetada durante a fase de alimentação em lote do qual a quantidade de glicose residual no final do experimento é subtraida.

O termo "metionina obtida" inclui L-metionina e o derivado de metionina facilmente recuperável NAM. A quantidade de metionina obtida no meio é medida por HPLC depois da derivatização de OPA/Fmoc com detecção fluorimétrica usando L-metionina (Fluka, Ref 64319) como padrão. A quantidade de NAM é determinada usando HPLC refratométrico usando NAM (Sigma, Ref 01310) como um padrão.

O termo "fonte de carbono", de acordo com a presente invenção, denota qualquer fonte de carbono que possa ser usada pelas pessoas versadas na técnica para suportar o crescimento normal de um microrganismo, o qual pode ser composto por hexoses (tais como glicose, galactose ou lactose), pentoses, monossacarideos, dissacarideos, oligossacarideos (tais como sacarose, celobiose ou maltose), melaços, amido ou seus derivados, hemiceluloses, glicerol e suas combinações. Uma fonte de carbono simples especialmente preferida é glicose. Outra fonte de carbono simples preferida é a sacarose.

O termo "atenuação da expressão de um gene" de acordo com a invenção, denota a supressão parcial ou completa da expressão de um gene, a qual é então dita como sendo"atenuada". Essa supressão da expressão pode ser ou uma inibição da expressão do gene, uma eliminação de toda ou parte da região promotora necessária para a expressão do gene, uma eliminação na região codificadora do gene, ou a troca do promotor tipo selvagem por um promotor sintético ou natural mais fraco. Preferencialmente, a atenuação de um gene é essencialmente a eliminação completa daquele gene, o qual pode ser substituido por um gene marcador de seleção que facilita a identificação, isolamento e purificação das cepas de acordo com a invenção. Um gene é inativado preferivelmente pela técnica de recombinação homóloga (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640- 6645).

Os termos "intensificado" ou "superexpresso" neste contexto descreve o aumento na atividade intracelular de uma atividade enzimática a qual é codificada pelo DNA correspondente, por exemplo, pelo aumento da quantidade de cópias do gene, usando um promotor mais forte ou usando um alelo com atividade aumentada e possivelmente combinando essas medidas.

Os termos "expressão aumentada", "expressão intensificada" ou "superexpressâo" são usados intercambiavelmente no texto e têm significado similar.

Para aumentar a expressão de um gene, este pode ser codificado cromossomalmente ou extracromossomalmente. Cromossomalmente, pode haver uma ou várias cópias no genoma que podem ser introduzidas pelos métodos de recombinação conhecidos pelo especialista no assunto. Genes extracromossomalmente podem ser efetuados por diferentes tipos de plasmideos que diferem em relação Às suas origens de replicação e, deste modo, seus números de cópias na célula. Eles podem estar presentes como 1 a 5 cópias, de cerca de 20 ou até 500 cópias, correspondendo a plasmideos com um baixo número de cópias com replicação firme (pSClOl, RK2), baixa número de cópias de plasmideos (pACYC, pRSFlOlO) ou alto número de cópia de plasmideos (pSK bluescript II).

Em uma modalidade preferida da invenção, o gene pode ser expresso usando promotores com diferente força, os quais podem ser induziveis. Esses promotores podem ser homólogos ou heterólogos. A pessoa versada na técnica sabe quais promotores são os mais convenientes, por exemplo, os promotores Ptrc, Ptac, Plac ou o promotor lâmbda cl são amplamente usados.

A expressão das enzimas pode ser impulsionada ou reduzida pelos elementos estabilizando ou desestabilizando o RNA mensageiro correspondente (Carrier e Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64) ou as proteinas (por exemplo, etiquetas GST, Amersham Biosciences).

A presente invenção também se refere a microrganismos que contêm um ou vários alelos do gene a ser intensificado de acordo com a invenção.

Na descrição da presente invenção, genes e proteinas são identificados usando as denominações dos genes correspondentes em E. coli. Entretanto, e a não ser que seja especificado ao contrário, o uso dessas denominações tem um significado mais geral de acordo com a invenção e abrange todos os genes correspondentes e proteinas em outros organismos, mais particularmente microrganismos. PFAM (banco de dados de familias de proteinas de alinhamentos e modelos Markov escondidos; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa uma grande coleção de alinhamentos de sequência de proteina. Cada PFAM torna possivel visualizar alinhamentos múltiplos, ver dominios de proteina, avaliar a distribuição dentre os organismos, obter acesso a outros bancos de dados e visualizar estruturas proteicas conhecidas. COGs {clusters de grupos ortólogos de proteinas; comparação de sequências proteicas de 66 genomas totalmente sequenciados representando 30 principais linhagens filogênicas. Cada COG é definido a partir de pelo menos três linhagens, o que permite a identificação dos primeiros dominios conservados.

Os meios de identificar sequências homólogas e suas homologias porcentuais são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, e incluem particularmente os programas BLAST, os quais podem ser utilizados a partir do sitio da internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros predefinidos indicados naquele sitio da internet. As sequências obtidas podem ser então exploradas (por exemplo, alinhadas) usando, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) ou MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi- bin/multalin.pl), com os parâmetros predefinidos indicados naqueles sitios da internet.

Usando as referências dadas no GenBank para genes conhecidos, as pessoas versadas na técnica são capazes de determinar os genes equivalentes em outros organismos, cepas bacterianas, leveduras, fungos, mamiferos, plantas, etc. Este trabalho rotineiro é vantajosamente feito usando sequências de consenso que podem ser determinadas efetuando os alinhamentos de sequência com os genes derivados de outros microrganismos, e projetando sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo. Esses métodos rotineiros de biologia molecular são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e são reivindicados, por exemplo, em Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2a ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Nova Iorque.). "Submeter um organismo a uma limitação de um substrato inorgânico" define uma condição sob a qual o crescimento dos microrganismos é governado pela quantidade de uma substância quimica não-orgânica fornecida que ainda permite um fraco crescimento. Exemplos para esses substratos são fosfato, potássio, magnésio ou uma combinação desses.

Privar um microrganismo para um substrato inorgânico define a condição sob a qual o crescimento do microrganismo para completamente devido à ausência do substrato inorgânico. Exemplos para esses substratos são o fosfato, potássio, magnésio ou uma combinação desses. Nesta invenção, os inventores objetivaram aumentar o rendimento de metionina/fonte de carbono por engenharia metabólica da cepa da produção. Em uma modalidade particular da invenção, o rendimento de metionina/glicose e/ou metionina/sacarose (g/g) é de pelo menos 10% g/g, preferivelmente pelo menos 15% g/g, mais preferivelmente 19% g/g.

Em uma modalidade especifica da invenção, a expressão de pelo menos um gene envolvido na assimilação de enxofre, a produção de serina, sua transformação em glicina ou a divagem de glicina é aumentada. É vantajoso aumentar a assimilação de enxofre do microrganismo, uma vez que metionina é um aminoácido contendo enxofre (C5H11NO2S). Além disso, é vantajoso aumentar a produção dos aminoácidos serina e glicina e a clivagem (isto é, o catabolismo) da glicina. A clivagem da glicina e a transformação da serina em glicina são as duas reações principais que produzem metileno-THF que pode ser reduzido para metil-THF, o qual por sua vez é necessário para a metilação de homocisteina em metionina. A produção de serina é catalisada pelas enzimas 3-fosfoglicerato desidrogenase, fosfosserina fosfatase e fosfosserina aminotransferase. A divagem de glicina é catalisada pelo complexo de divagem da glicina.

Em E. coli e Corynebacterium glutamicum, as enzimas que poderiam ser aumentadas em relação às suas atividades e que estão envolvidas nas atividades anteriormente descritas são codificadas pelos seguintes genes (acompanhado por números de acesso e função do polipeptideo correspondente):

Em uma modalidade especifica da invenção, a expressão dos operons cysPUWAM, codificando o importador de sulfato/tiossulfato e a cisteina sintase especifica para tiossulfato, e/ou o operon cysJIH codificando a sulfito 5 redutase e PAPS redutase são aumentadas. No caso de Corynebacterium cysA, cysT, cyl e cysJ são preferivelmente aumentados nas suas expressões.

Em outra modalidade especifica da invenção, a expressão do operon gcvTHP, e/ou o gene Ipd codificando o complexo de clivagem de glicina é/são aumentado(s) . O complexo de clivagem de glicina pode ser introduzido e superexpresso em Corynebacterium glutamicum pela introdução dos genes gcvTHP de Corynebacterium jekeium possivelmente como gene sintético.

Em outra modalidade especifica da invenção, pelo menos um gene envolvido na produção de glicina, tal como serA, serB, serC ou glyA é superexpresso.

Em outra modalidade da invenção, enzimas envolvidas na via metabólica da biossintese de metionina podem ser superexpressas ou suas atividades aumentadas, para impulsionar a produção de metionina. Particularmente, pelo menos um dos seguintes genes codificando tais enzimas podem ser superexpressos: - metF 1790377 Cgl2171 5,10-metilenotetraidrofolato redutase metA (1790443) alelos codificando homosserina succiniltransferases com sensibilidade à retroalimentação reduzida à S-adenosilmetionina e/ou metionina, conforme descrito em WO 2005/10856 ou no caso de Corynebacterium glutamicum o gene metX Cgl0652. - thrA ou thrA (1786183) alelos codificando aspartoquinases/homosserina desidrogenases com inibição da retroalimentação reduzida à treonina. - No caso de asp e horn de Coryn ebact er ium glutamicum, potencialmente resistentes à retroalimentação, conforme descrito em WO 2007/012078, pode ser superexpresso - metH 1790450 Cgll507 homocisteina-N5- metiltetraidrofolato transmetilase dependente de B12 - CysE 1790035 Cgl2563 Serina acetiltransferase

A superexpressão de metY (Cgl0653) em C. glutamicum pode ser prevista com ou sem a superexpressão dos genes aecD/metB (Cgl2309/Cgl2446).

A superexpressão de metF e metH foi sugerida em WO 2007/077041 e W02007/012078, os quais são incorporados por referência neste pedido. Neste documento, os inventores demonstraram que mesmo a superexpressão adicional de metF usando elementos que estabilizam o RNA mensageiro de metF ainda aumentou a produção de metionina. Esses elementos estabilizantes são geralmente estruturas em alça que reduzem o ataque por nucleases degradadoras de RNA (Carrier e Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64).

A superexpressão dos alelos da homosserina succiniltransferase com sensibilidade à retroalimentação reduzida aos seus inibidores SAM e metionina é descrita no pedido de patente WO 2005/111202, que é incorporado por referência neste pedido. A superexpressão de cysE foi sugerida em WO 2007/077041, o qual é incorporado por referência neste pedido.

A produção de metionina pode ser ainda mais aumentada pelo uso de um alelo metB alterado que usa preferivelmente ou exclusivamente H2S e, deste modo, produz homocisteina de O-succinil-homosserina conforme foi descrito no pedido de patente WO 2004/076659 que é incorporado aqui por referência.

Um aumento adicional na produção de L-metionina em E. coli, seus precursores ou compostos derivados dela, é alcançado pela atenuação ou eliminação do gene para a proteina repressora MetJ (GenBank 1790373), responsável pela infrarregulação do regulon da metionina, conforme foi sugerido no pedido de patente JP 2000/157267. Em Corynebacterium, o regulador de enxofre principal McbR (AAP45010) deve ser eliminado conforme indicado em W02007/012078.

Em outra modalidade especifica da invenção, a produção do subproduto isoleucina é reduzida. Isoleucina é um aminoácido que pode ser separado da metionina somente com grande dificuldade, aumentando drasticamente o custo para a produção de metionina pura. Além disso, a produção de isoleucina consome carbono que poderia ser usado para a produção de metionina. Consequentemente, é desejável que a produção de isoleucina seja mantida o mais baixa possivel.

Isoleucina é produzida ou através da via de biossintese de treonina ou através de uma reação de y- eliminação da O-succinil-homosserina, na ausência de cisteina. Meios para reduzir a atividade de y-eliminação foram descritos nos pedidos de patente WO 2006/082254 e WO 2007/077041, que são incorporados por referências nesse pedido.

A produção de isoleucina está abaixo do nivel de detecção (HPLC) em um microrganismo não-modifiçado, tal como E. coli. No microrganismo modificado, a quantidade produzida pode atingir 2% em g de isoleucina/g de glicose. A quantidade de isoleucina recuperada no meio pode ser maior do que 40 mM.

Os inventores demonstraram que a superexpressão de pelo menos um dos seguintes genes envolvidos na biossintese de serina também reduz a produção de isoleucina. serA 1789279 YP_22557 fosfoglicerato desidrogenase serB 1790849 YP_226764 fosfosserina fosfatase serC 1787136 YP_225120 fosfosserina aminotransferase

Em uma modalidade mais especifica da invenção, os inventores demonstraram que a expressão aumentada de serA, serB e/ou SerC reduz a produção do subproduto isoleucina.

Em outra modalidade especifica da invenção, a produção do subproduto homolantionina é reduzida. Homolantionina é um aminoácido que é produzido a partir de homosserina ativada e homocisteina (Kromer et al (2006) J Bacteriol 188, 609-18; e pedido de patente WO 2007/051725 da BASF). Homolantionina é um aminoácido que pode ser separado da metionina somente com grande dificuldade, aumentando drasticamente o custo para a produção de metionina pura. Além disso, homolantionina compreende duas moléculas de homosserina derivadas de aspartato e uma molécula de enxofre reduzida, todas as quais poderiam aumentar o rendimento de metionina/fonte de carbono, se transformada em metionina. Consequentemente é desejável que a produção de homolantionina seja mantida o mais baixo possivel e os precursores usados sejam transformados em metionina. O pedido PCT WO 2007/051725 propõe alguns meios para reduzir a produção de homolantionina. Os inventores descobriram outros meios de reduzir a produção de homolantionina que, ao mesmo tempo, permitem a transformação do substrato homocisteina em metionina. Meios que favorecem a transformação de homocisteina em metionina especificamente são a atenuação da atividade da formil-THF desformilase codificada pelo gene purU, a superexpressão da atividade da metileno-THF redutase codificada pelo gene metF, a atenuação da expressão do gene pykA e/ou pykF, a superexpressão de serA, serB ou serC ou a superexpressão do gene Ipd.

A fonte de enxofre usada para a produção fermentativa de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados dela pode ser qualquer uma das seguintes: sulfato, tiossulfato, sulfeto de hidrogênio, ditionato, ditionita, sulfito ou uma combinação desses.

Em uma modalidade preferida da invenção, a fonte de enxofre é sulfato e/ou tiossulfato. Como a fonte de carbono preferida,os inventores recomendam glicose ou sacarose.

A invenção também envolve o processo para a produção de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados dele, compreendendo a fermentação do microrganismo produtor de metionina descrito acima, a concentração demetionina, seus precursores ou derivados e o isolamento do(s) produto(s) desejado(s) do caldo fermentativo.

Técnicos versados no assunto são capazes de definir as condições de cultivo para os microrganismos de acordo com a invenção. Particularmente, as bactérias são fermentadas em uma temperatura entre 20 °C e 55 °C, preferivelmente entre 25 °C e 40 °C, e mais especificamente de cerca de 30 °C para C. glutamicum e cerca de 37 °C para E. coli.

A fermentação é geralmente efetuada em fermentadores com um meio de cultura inorgânico de composição definida conhecida adaptado para a bactéria usada, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples, e se necessário um co- substrato necessário para a produção do metabólito. Particularmente, o meio de cultura inorgânico para E. coli pode ser de composição idêntica ou similar a um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128), e meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque) ou um meio tal como definido por Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88- 96) .

De maneira análoga, o meio de cultura inorgânico para C. glutamicum pode ser de composição idêntica ou similar ao meio BMCG (Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210) ou a um meio tal como descrito por Riedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583). O meio pode ser suplementado para compensar as auxotrofias introduzidas pelas mutações.

Depois da fermentação de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados dela é/são recuperados e purificados, caso necessário. Os métodos para a recuperação e purificação do composto produzido, tal como metionina e N-acetilmetionina no meio de cultura são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.

Opcionalmente, de 0 a 100%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente 95%, ainda mais preferivelmente pelo menos 99% da biomassa pode ser retida durante a purificação do produto de fermentação.

Opcionalmente, o derivado de metionina N- acetilmetionina é transformado em metionina por desacilação, antes de a metionina ser recuperada.

A invenção também se refere a um microrganismo que é otimizado para a produção fermentativa de metionina, isto é, com um rendimento de metionina/fonte de carbono melhorado em comparação com um microrganismo não- modificado, e que compreende as modificações genéticas descritas acima.

Breve Descrição dos Desenhos:

A Figura 1 mostra a biossintese de metionina em E. coli. Abreviação: P fosfato, GA3P gliceraldeido-3-fosfato, PGA fosfoglicerato, PEP fosfoenolpiruvato, Pyr piruvato, Asp aspartato, ASp-P aspartilfosfato, Asp-SA aspartatosemialdeido, homoser homosserina, OSH O-succinil- homosserina, y-cys y-cistationina, homocys homocisteina, homolan homolantionina, THF tetraidrofolato, Ser serina, Cyst cisteina, Gly glicina, PPP derivação pentose fosfato.

A Figura 2 mostra a evolução de D06oo nm θ 7 met + NAM para a cepa 1 PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH QpykF OpykA PtrcOP- gcvTHP crescida sob três diferentes condições de cultivo: crescimento com excesso de fosfato (simbolos sólidos), crescimento com privação de fosfato a 100 UDO600 nm (simbolos em branco) e crescimento com limitação de fosfato (simbolos cinzas).

Descrição Detalhada da Invenção

Uma cepa de E. coli, na qual o repressor de metionina codificado pelo gene metJ foi substituído por um cassete de cloranf enicol (zlmet J: : Cm) e que abriga um alelo metA com sensibilidade à retroalimentação reduzida à metionina e SAM (metA*ll) foi descrito em PCT W02005108561, depositado no dia 12 de maio de 2004. A superexpressão dos genes metF e metH a partir de promotores artificiais integrados à montante dos genes estruturais no cromossomo (Ptrc-metF, Ptrc-met) foi descrita no pedido de patente WO 2007/077041. Este documento também descreve a superexpressão de uma aspartoquinase/homosserina desidrogenase com inibição À retroalimentação reduzida em relação à treonina (thrA*) e a superexpressão de serina acetiltransferase (cysE) e a metA*ll do plasmideo pMElOl. Uma cepa com todas as modificações descritas nos pedidos de patente acima, chamada cepa 1 neste pedido, tem o genótipo [taetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF (pMElOl-thrA*l-cysE-PgapA-metA*ll). Todos os constructos subsequentes descritos abaixo são baseados nesses constructos.

Construção de cepas superexpressando os operons cysPUWAM, CYSJTH, GCVTHP e os genes metF, serA, serC, serB, glyA e Ipd, e cepas com eliminações dos genes pykA, pykF e purU

Todos os constructos com exceção de metF foram inicialmente preparados na cepa de E. coli MG1655 e subsequentemente transferidos na cepa final por transdução. Construção de MG1655 Ptcr-cysPUWAM

Para colocar o operon cysPUWAM sob o controle do promotor heterólogo Ptrc, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência ao cloranfenicol ou canamicina juntamente com o promotor heterólogo à montante dos genes envolvidos. Para esta finalidade, o seguintes oligonucleotideos foram utilizados: Ptrc-cysPUWAM F (SEQ ID NO 1) GCGCGAGTGAGTTCTTTTTCAGTAAGTTAACGGCCATTGCGCACCCTTATAAATTTAAT GACTTTCTTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACAGCTTGTAGGCTGG AGCTGCTTCG com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (2541512 - 2541578) do gene cysP (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), - uma região (letras maiúsculas em itálico) para a sequência do promotor trc com a caixa -35 e -10 sublinhada Ptrc-cysPUWAM R (SEQ ID NO 2) CCAAATCACCAAACGGTATATAAAACCGTTACTCCTTTCACGTCCGTTATAAATATGAT GGCTATTATCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTrTCTGCCATATGAATATCCTCCT TAG com - uma região (letras maiúsculas) homólogas à sequência (2541644 - 2541578) da região à montante do gene cysP (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), - uma região (letras maiúsculas em itálico) para a sequência terminadora T7 de bacteriófago (Genbank V01146)

Os oligonucleotideos Ptrc-cysPUWAM F e Ptrc-cysPUWAM R foram usados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmideo pKD3. O produto de PCR obtido foi a seguir introduzido na cepa MG1655 (pKD46) por eletroporação. Nessa cepa, a enzima Red recombinase foi expressa e permitida a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao cloranfenicol foram então selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotideos Ptrc-cysPUWAMRv e Ptcr-cysPUWAMFv mostrados abaixo. A cepa retida foi designada MG1655 Ptrc-cysPUWAM:Cm. Ptrc-cysPUWAMRv (SEQ ID NO 3): GCAGGATTTGTACGTCGGTCACC (homóloga à sequência de 2541260 a 2541282). Ptrc-cysPUWAMFv (SEQ ID NO 4): cgtcttgaactaagttcaccaggc (homóloga à sequência de 2541812 a 2541789). Construção de MG1655 Ptrc-cysJIH Para colocar o operon cysJIH sob o controle do promotor Ptrc heterólogo, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência ao cloranfenicol ou canamicina juntamente com o promotor heterólogo à montante dos genes envolvidos. Para esta finalidade, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados: PtrcF-cysJIH R (SEQ ID NO 5) CCAGTAAGCAAAGCTGTTTCTGCGCCCTGTCAGCGCCCATAAAACAGAAGAGATTCCAC AC ATT A TACGAGCCGGA TGATTAA TTGrCAACAGCTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (2889935 - 2889987) do gene cysJ (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), - uma região (letras maiúsculas em itálico) para a sequência do promotor trc com a caixa -35 e -10 sublinhada PtrcF-cysJIH F (SEQ ID NO 6) GGTTATTAGTTATCGCTATCCCGTCTTTAATCCACACCGTTTGCCCCGTTAACCTTACC TTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCCK∑M!G1ATM!CCTCCTTAG com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (2890047 - 2889988) da região à montante do gene cysJ (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), - uma região (letras maiúsculas em itálico) para a sequência terminadora T7de bacteriófago (Genbank V01146)

Os oligonucleotideos PtrcF-cysJIH F e PtrcF-cysJIH R foram usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmideo pKD4. O produto de PCR obtido foi a seguir introduzido na cepa MG1655 (pKD46) por eletroporação. Nessa cepa, a enzima Red recombinase foi expressa e permitida a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes à canamicina foram então selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotideos Ptrc-cysJIHFv e Ptrc-cysJIHRv mostrados abaixo. A cepa retida foi designada MG1655 Ptrc-cysJIH: Km. Ptrc-cysJIHFv (SEQ ID NO 7) : GCAGTTCGACAAGTTCTTTCACC (homóloga à sequência de 2889042 a 2889064). Ptrc-cysJIHRv (SEQ ID NO 8) : CCAGAACACAACACCCTAACATAGCG (homóloga à sequência de 2890663 a 2890638) . Construção do MG1655 PtrcO9-gcvTHP Para colocar o operon gcvTHP sob o controle do promotor Ptrc heterólogo. a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência ao cloranfenicol ou canamicina juntamente com o promotor heterólogo à montante dos genes envolvidos. Para esta finalidade, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados: Ptrc-gcvTHP F (SEQ ID NO 9) CCACCATGCGAGCGCCGCAAAGCGTGTGTTGTTCGTACAAAGGAGTCTGTTGTGCCATA A TA TACCTCCTTATTCCACACATTA TACGAGCCGGA TGATTAATTGTCAACAGCTCTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (3048630 - 3048687) do gene gcvT (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), - uma região (letras maiúsculas em itálico) para a sequência do promotor trc com a caixa -35 e -10 sublinhada Ptrc-gcvTHP R (SEQ ID NO 10) CTGTCGCGATTTTTGCATTTTTTAACCATAAGCTAATGTGATGATCAATTTTACCTTAC ATATGAATATCCTCCTTAG com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (3048887 - 3048830) da região à montante do gene gcvT (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

Os oligonucleotideos Ptrc-gcvTHP F e Ptrc-gcvTHP R foram usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmideo pKD4. O produto de PCR obtido foi a seguir introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46). Nessa cepa, a enzima Red recombinase foi expressa e permitida a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes à canamicina foram então selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotideos Ptrc-gcvTHP F2 e Ptrc-gcvTHP R2 mostrados abaixo. A cepa retida foi designada MG1655 Ptrc-gcvTHP:Km. Ptrc-gcvTHP F2 (SEQ ID NO 11) : CTATCACACCGCCAGAGGCATTC homóloga à sequência de 3048399 a 3048421). Ptrc-gcvTHP R2 (SEQ ID NO 12): CCCATCACACTTTCATCTCCCG (homóloga à sequência de 3049106 a 3049085). Construção do MG1655 üpyJtA Para eliminar o gene pykA, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência ao cloranfenicol ou canamicina nos genes envolvidos. Para esta finalidade, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados: DpykA F (SEQ ID NO 13) cgcggcgggtgccaacgttgtacgtatgaacttttctcacggctcgcctgaaga tcacaaaatgcgcgcggataaagttcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com - uma região (letras minúsculas) homóloga à sequência (1935756- 1935838) da região pykA (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), DpykA R (SEQ ID NO 14) CGCCGCATCCGGCAACGTACTTACTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAGTAGAACC CACGGTACTCATCACGTCGCCCCATATGAATATCCTCCTTAG com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (1937135 - 1937055) da região pykA (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) para a amplificação do cassete de resistência ao cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

Os oligonucleotideos DpykA F e DpykA R foram usados para amplificar o cassete de resistência ao cloranfenicol a partir do plasmideo pKD3. O produto de PCR obtido foi a seguir introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46). Nessa cepa, a enzima Red recombinase foi expressa e permitida a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes ao cloranfenicol foram então selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotideos pykA F e pykA R mostrados abaixo. A cepa retida foi designada MG1655 DpykA: : Cm. PykA F (SEQ ID NO 15) : ggcaattaccctcgacgtaccgg (homóloga à sequência de 1935338 a 1935360). PykA R (SEQ ID NO 16) : ccgcctctaacagatcatccatcgg (homóloga à sequência de 1935401 a 1937425). Constipação de MG1655 \ pykF Para eliminar o gene pykF, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência ao cloranfenicol ou canamicina nos genes envolvidos. Para esta finalidade, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados: DpykF F (SEQ ID NO 17) cccatccttctcaacttaaagactaagactgtcatgaaaaagaccaaaattgtttgcac catcggaccgaaaaccgaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com - uma região (letras minúsclas) homóloga à sequência (1753689 - 1753767) da região pykF (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/) , - uma região (letras maiúsculas em negrito) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), DpykF R (SEQ ID NO 18) ggacgtgaacagatgcggtgttagtagtgccgctcggtaccagtgcaccagaaaccata actacaacgtcacctttgtgCATATGAATATCCTCCTTAG com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (1755129 - 1755051) da região pykF (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

Os oligonucleotideos DpykF F e DpykF R foram usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmideo pKD4 . O produto de PCR obtido foi a seguir introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46). Nessa cepa, a enzima Red recombinase foi expressa e permitida a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes à canamicina foram então selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotideos pykF F e pykF R mostrados abaixo. A cepa retida foi designada MG1655 DpykF: : Km. PykF F (SEQ ID NO 19) : gcgtaaccttttccctggaacg (homóloga à sequência de 1753371 a 1753392). PykF R (SEQ ID NO 20) : gcgttgctggagcaacctgccagc (homóloga à sequência de 1755518 a 1755495). Construção de MG1655 JpurU Para eliminar o gene purU, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência ao cloranfenicol ou canamicina nos genes envolvidos. Para esta finalidade, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados: DpurU F (SEQ ID NO 21) ggtaaaaaatttaaaaagtgctgcggccaataatggttgacggtacggtttagcaaaca ctctcaacaaggtttttccagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com - uma região (letras minúsclas) homóloga à sequência (1287929 - 1287849) da região purU (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), DpurU R (SEQ ID NO 22) ggttgcgtaattttcatccgtaacggattaaaggtaaccagttatttttgctggcgatt aaagaataatcgttcgattaccCATATGAATATCCTCCTTAG com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (1286948 - 1287028) da região purU (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

Os oligonucleotideos DpurU F e DpurU R foram usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmideo pKD4. O produto de PCR obtido foi a seguir introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46). Nessa cepa, a enzima Red recombinase foi expressa e permitida a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes à canamicina foram então selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotideos purU F e purU R mostrados abaixo. A cepa retida foi designada MG1655 DpurU: : Km. PurU F (SEQ ID NO 23) : ggaatgcaatcgtagccacatcgc (homóloga à sequência de 1288447 a 1288424). PurU R (SEQ ID NO 24): gcggattcgttgggaagttcaggg (homóloga à sequência de 1286129 a 1286452) . Construção de pCCIBAC-ser A-serC Para aumentar a expressão dos genes serA e serC, a dosagem do gene dos dois genes foi aumentada na célula produtora de metionina pela expressão das enzimas a partir do vetor de controle de cópia pCCIBAC (Epicentre) usando seus próprios promotores. Para esta finalidade, o primeiro gene serC foi amplificado a partir do genoma de E. coli usando os oligonucleotideos -serC F (Xbal) e serC R (HindIII) . O produto de PCR foi restringido usando enzimas Xbal e HindIII e clonado no vetor pUC18 (Stratagene) restringido pelas mesmas enzimas de restrição. O vetor resultante foi chamado de pUC18-serC. serC F(Xbal) (SEQ ID NO 25): tgcTCTAGAgtccgcgctgtgcaaatccagaatgg com - uma região (letras minúsculas) homóloga à sequência (956619 - 956644) do gene serC (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org /) , - uma região (letras maiúsculas em negrito) abrigando o sitio Xbal serC R (HindIII) (SEQ ID NO 26): c c cAAGCTTAAC T C T C TACAACAGAAATAAAAAC com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (958028 - 958004) do gene serC (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) abrigando o sitio HindIII Subsequentemente, o gene serA foi amplificado a partir do genoma de E. coli usando os oligonucleotideos serA F (Xbail) e serA R (Smal-HindIII) . O produto de PCR foi restringido usando as enzimas Xbal e Smal e clonado no vetor pUC18-serC restringido pelas mesmas enzimas de restrição. O vetor resultante foi verificado por sequenciamento e chamado de pUC18-serA-serC. serA F (Xbal) (SEQ ID NO 27): ctaqTCTAGAttaqtacaqcaqacgqgcgcq com - uma região (letras minúsculas) homóloga à sequência (3055198 - 3055218) do gene serA (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/) , - uma região (letras maiúsculas) abrigando o sitio Xbal serA R (Smal - HindIII) (SEQ ID NO 28): tccCCCGGGaagcttCCGTCAGGGCGTGGTGACCG com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (3056878 - 3056859) do gene serA (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras em negrito) abrigando os sitios Smal e HindIII Para transferir os genes serA e serC no vetor de controle de cópia pCCIBAC, o vetor pUC18-serA-serC foi restringido com a enzima HindIII e clonado no pCCIBAC pronto para clonagem HindIII (Epicentre). O constructo resultante foi verificado e chamado de pCCIBAC-serA-serC. Construção do vetor pCClBAC-serB-serA-serC Para aumentar a expressão dos genes serA, serB e serC, a dosagem de gene dos três genes foi aumentada na célula produtora de metionina pela expressão das enzimas a partir do vetor de controle de cópia pCCIBAC (Epicentre) usando seus próprios promotores. Para esta finalidade, o gene serB foi amplificado a partir do genoma de E. coli usando os oligonucleotideos - serB (Sphl) e serB (Smal). O produto de PCR foi restringido usando enzimas Sphl e Smal e clonado no vetor pUC18-serA- serC restringido pelas mesmas enzimas de restrição. O vetor resultante foi chamado de pUC18-serB-serA-serC. serB (Sphl) (SEQ ID NO 29): atgcGCATGCCCACCCTTTGAAAATTTGAGAC com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (4622362 - 4622383) do gene serB (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org /) , - uma região (letras maiúsculas sublinhadas) abrigando o sitio Sphl serB (Smal) (SEQ ID NO 30) : gcatgtcgaca tCCCGGGGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTGTGATT ACTTCTGATTCAGGCTGCC com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (4623433 - 4623412) do gene serB (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas sublinhadas) abrigando o sitio Smal uma região(letras maiúsculas em itálico) para a sequência terminadora T7 de bacteriófago (Genbank V01146) Para transferir os genes serA, serB e serC no vetor de controle de cópia pCClBAC, o vetor pUC18-serB-serA-serC foi restringido com a enzima HindIII e clonado no pCClBAC pronto para clonagem HindIII (Epicentre).

O constructo resultante foi verificado e chamado de pCClBAC-serB-serA-serC. Construção do vetor pCCIBAC-serB-glyA-serA-serC Para aumentar a expressão dos genes serA, serB, serC e glyA, a dosagem de gene dos três genes foi aumentada na célula produtora de metionina pela expressão das enzimas a partir do vetor de controle de cópia pCClBAC (Epicentre) usando seus próprios promotores. Para esta finalidade, o gene glyA foi amplificado a partir do genoma de E. coli usando os oligonucleotideos - PglyA F (HindIII) e glyA R (EcoRI-HindIII) . O produto de PCR foi restringido usando a enzima HindIII, cega com o fragmento Klenow e clonado no vetor pUC18-serB-serA-serC restringido pela enzima de restrição Smal. O vetor resultante foi chamado de pUCl8-serB-glyA-serA-serC. PglyA F (HindIII) (SEQ ID NO 31): TCATCGGATCCATCAAGCTT G AAAGAATGTGATGAAGTG com - uma região (letras maiúsculas em negrito) homóloga à sequência (2683760 - 2683742) da região glyA (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas sublinhadas) abrigando o sitio HindIII glyA R (EcoRI-HindIII) (SEQ ID NO 32): ATCTAGTAAGCTTAGTGAATTCGTTACGACAGATTTGATGGGGCG com - uma região (letras maiúsculas em itálico) homóloga à sequência (2682084 - 2682061) da região glyA (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas sublinhadas) abrigando os sitios HindIII e EcoRI Para transferir os genes serA, serB, serC e glyA no vetor de controle de cópia pCCIBAC, o vetor pUC18-serB- glyA-serA-serC foi restringido com a enzima HindIII e clonado no pCCIBAC pronto para clonagem HindIII (Epicentre).

O construct© resultante foi verificado e chamado de - pCCIBAC-serB-glyA-serA-serC. Construção do vetor pJB137-lpd - gene Ipd foi amplificado a partir do genoma de E. coli usando os oligonucleotideos Ipd F (HindIII) e Ipd R (EcoRI). O produto PCR foi restringido usando as enzimas EcoRI e HindIII e clonado no vetor pJB137 restringido pelas mesmas enzimas de restrição. O vetor resultante foi chamado de pJB137-lpd. Ipd F (HindIII) (SEQ ID NO 33) atgcgctaAAGCTTGGTTATTAGCGAATAGACAAATCGG com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (127644 - 127668) do gene Ipd (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/), - uma região (letras maiúsculas em negrito) abrigando o sitio HindIII Ipd R (EcoRI) (SEQ ID NO 34): qcatqatcGAATTCTGCAGACGTAAAAAAAGCGGCGTGG com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (129404 - 129380) do gene Ipd (sequência de referência no sitio da internet http://www.ecogene.org/) , - uma região (letras maiúsculas em negrito) abrigando o sitio EcoRI

O constructo resultante foi verificado e chamado de pJB137-lpd. Integração de mutações individuais na cepal Subsequentemente, as seguintes cepas foram derivadas a transdução do fago PI e remoção dos cassetes de resistência quando requerido. Cepas construídas DmetJ metA^ll Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF- cysJIH DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF- cysJIH DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF- cysJIH DpykF DpykA DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF- cysJIH DpykF DpykA PtrcQ9-gcvTHP DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF- cysJIH DpykF DpykA PtrcQ9-gcvTHP DpurU DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF- cysJIH DpykF DpykA PtrcO9-gcvTHP Ptrc36-ARNmst11-metF DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF- cysJIH DpykF DpykA PtrcO9-gcvTHP DpurU Ptrc36-ARNmst17-metF A transferência a partir da transdução de PI e remoção dos cassetes de resistência a antibiótico serão exemplificadas pela cepa DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM: :Cm PtrcF-cysJIH: : Km. Todos os outros constructos, exceto para as cepas contendo Ptrc36-ARNmstl7- metF (ver abaixo) foram construídos de modo similar. Para transferir o constructo do promotor PtrcF- cysPUWAM: : Cm na cepa MG1655 DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc- metF, o método de transdução do fago PI foi usado. O protocolo seguido foi implementado em 2 passos com a preparação do lisato de fago da cepa MG1655 PtrcF- cysPUWAM: •. Cm e a subsequente transdução na cepa MG1655 DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF Preparação do lisato de fago Pl: - Inoculação com 100 μL de uma cultura de um dia para o outro da cepa MG1655 PtrcF-cysPUWAM: : Cm de 10 mL de LB + Km 50 μg/mL + glicose 0,2% + CaCl2 5 mM. - Incubação por 30 min a 37 °C com agitação. - Adição de 100 μL de lisato de fago Pl preparado na cepa MG1655 (por volta de 1.109 fago/mL). - Agitação a 37 °C por 3 horas até todas as células serem lisadas. - Adição de 200 μL de clorofórmio e agitação em vórtex. - Centrifugação por 10 min a 4500 g para eliminar os fragmentos celulares. - Transferência do sobrenadante para um tubo estéril e adição de 200 μL de clorofórmio. - Armazenamento do lisato a 4 °C. Transdução - Centrifugação por 10 min a 1500 g de 5 mL de uma cultura de um dia para o outro da cepa MG1655 DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF em meio LB. - Suspensão de um pélete celular em 2,5 mL de MgSO4 10 mM, CaCl2 5 mM. - Tubos de controle: 100 μL de células 100 μL de fagos PI da cepa MG1655 PtrcF- cys PUWAM: : Cm - Tubo de teste: 100 μL de células + 100 μL de fagos PI da cepa MG1655 PtrcF-cysPUWAM: : Cm - Incubação por 30 min a 30 °C sem agitação. - Adição de 100 μL de citrato de sódio 1 M em cada tubo e agitação com vórtex. - Adição de 1 mL de LB. - Incubação por 1 hora a 37 °C com agitação. - Espalhamento nas placas LB+ Cm 50 μg/mL depois da centrifugação dos tubos por 3 min a 7000 rpm. - Incubação a 37 °C de um dia para o outro. Verificação da cepa Transformantes resistentes ao cloranfenicol foram selecionados e a presença do constructo do promotor MG1655 PtrcF-cysPUWAM::Cm foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotideos descritos acima para a verificação da cepa MG1655 PtrcF-cysPUWAM: : Cm. A cepa retida foi designada □metJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM::Cm. Subsequentemente, o alelo PtrcF-cysJIH foi introduzido usando o procedimento de transdução PI conforme descrito acima. A cepa resultante foi chamada de QmetJ metA*ll Ptrc- metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM: : Cm PtrcF-cysJIH:: Km. Para a introdução das eliminações de pykA e pykF, os cassetes de resistência foram eliminados da cepa DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM::Cm PtrcF- cysJIH: : Km. Para este propósito, o plasmideo pCP20 carregando a FLP recombinase atuando nos sitios FRT dos cassetes de resistência foi introduzido na cepa recombinante por eletroporação. Depois de uma série de culturas a 42 °C, a perda dos dois cassetes foi verificada por análise de PCR. A cepa retida foi designada DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc- metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH. A seguir, as eliminações dos alelos pykA e pykF poderiam ser introduzidas através da transdução de Pl. Semelhantemente, a eliminação do gene purU e do constructo de superexpressão do complexo de clivagem de glicina PtrcO9-gcvTHP foram introduzidos depois da eliminação dos cassetes correspondentes. Por questões de proximidade, o constructo Ptrc36- ARNmst11-metF não pode ser introduzido por transdução de Pl e foi construído por introdução via PCR. Para esta finalidade, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência ao cloranfenicol ou canamicina próximo dos genes envolvidos. Para esta finalidade, os seguintes oligonucleotideos foram utilizados: Pt rc36-ARNmst-metF (SEQ ID NO 35) (GGCTCTGATTCAGGGCATCCCGCTGGCTGGCGTGAAAAAAGCTCATAATATACCTCCT cgtcaacaatatctcactcgagataactccaccTATTCCACACATTATACGAGCCGG Letra maiuscula em negrito: Sitio de ligação ao ribossomo e região -10 Letras minúsculas: seguência de estabilização de RNA Letras em itálico: parte do promotor Ptrc Ptrc-metF F (SEQ ID NO 36) ccttcatctttacatctggacgtctaaacggatagatgtgcacaacacaacata taactacaagcgattgatgaggtaaggttcacactggctcaccttcgggtgggcctttc t grcCATATGAATATCCTCCTTAG com: - uma região (letras minúsculas) homóloga à sequência (4130114 - 4130195) da região do gene metF (sequência de referência no sitio da internet http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), - uma região (em itálico, letras minúsculas) homóloga à sequência do terminal T7 bacteriófago (Genbank V01146) - uma região (letras maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645). Para o PCR, DNA isolado de MG1655 metA*ll DmetJ::Cm Ptrc-metF::Km descrito no pedido de patente WO 2007077041 foi usado como matriz.

Os oligoucleotideos Ptrc-metF F e Ptrc36-ARNmst-metF foram usados para amplificar o cassete de resistência à canamicina do plasmideo pKD4. O produto de PCR obtido foi a seguir introduzido por eletroporação na cepa DmetJ metA*ll Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH DpykF DpykA PtrcOP-gcvTHP DpurU (pKD4 6) , na qual a enzima Red recombinase expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes de resistência à canamicina foram selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos Ptrc-metFv F e Ptrc-metFv R definidos abaixo. Ptrc-metFv F (SEQ ID NO 37) : GCCCGGTACTCATGTTTTCGGGTTTATGG (homóloga à sequência de 4129866 a 4129894). Ptrc-metFv R (SEQ ID NO 38): CCGTTATTCCAGTAGTCGCGTGCAATGG (homóloga à sequência de 4130524 a 4130497) .

A cepa resultante foi chamada de □met.J metA*ll Ptrc- metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH DpykF DpykA PtrcO9-gcvTHP DpurU Ptrc36-ARNmst11-metF: Km.

Subsequentemente, o plasmideo (pMElOl-thrA*l-cysE- PgapA-metA*11) foi introduzido nas cepas descritas acima produzindo as cepas: cepal PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH cepal PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH DpykF DpykA cepal PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH DpykF DpykA PtrcOP-gcvTHP cepal PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH DpykF DpykA PtrcQ9-gcvTHP DpurU cepal PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH DpykF DpykA PtrcO9-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF cepal PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH DpykF DpykA PtrcO9-gcvTHP DpurU Ptrc36-ARNmstl7-metF

Em certas cepas, os plasmideos pJB137-lpcí, pCClBAC- serA-serC, pCCIBAC-serB-serA-serC ou pCCIBAC-serB-glyA- serA-serC foram introduzidos produzindo: cepal PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH DpykF DpykA PtrcO9-gcvTHP (pJB137-2pd> cepal PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH DpykF DpykA PtrcO9-gcvTHP DpurU {pCCIBAC-serA-serC) cepal PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH DpykF DpykA PtrcOP-gcvTHP DpurU Ptrc36-ARNmst17-metF (pCClBAC- serA-serC) cepal PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH DpykF DpykA PtrcOP-gcvTHP DpurU Ptrc36-ARNmst17-metF (pCCIBAC-serB-serA-serC) cepal PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH DpykF DpykA PtrcOP-gcvTHP DpurU Ptrc36-ARNmstl7-metF (pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC) Avaliação das cepas produtoras de metionina

As cepas de produção foram inicialmente avaliadas em pequenos frascos erlenmeyer. Uma préOcultura de 5,5 mL cresceu em um meio misturado (10% de meio LB (Sigma 25%) com 2,5 g.L-1 de glicose e 90% de meio PCI minimo) e foi usada para inocular 50 mL de cultura até uma OD600 de 0,2 em meio PCI. Canamicina e espectinomicina foram adicionados, se necessário, em uma concentração de 50 mg.L'1, cloranfenicol a 30 rng.L"1. Quando a cultura atingiu uma ODβoo de 6 a 7, os aminoácidos extracelulares foram quantificados por HPLC depois da derivatização de OPA/Fmoc e outros metabólitos relevantes foram analisados usando HPLC com detecção refratométrica (ácidos orgânicos e glicose) e GC-MS depois da sililação. Tabela 1: Composição média minima (PCI)

Conforme pode ser observado na Tabela 2, o rendimento de metionina/glicose (Ymet) é aumentado na superexpressão de cysJIH e cysPUWAM. A eliminação dos alelos codificando a piruvato quinase pykA e pykF pode aumentar ainda mais o 5 rendimento de metionina/glicose. A eliminação da formil-THF desformilase codificada pelo gene purU impulsiona ainda mais o rendimento de metionina/glicose. A expressão adicional do gene metF pelo constructo Ptrc36-ARNmst17-metF ainda fornece maior rendimento de metionina/glicose. A 10 superexpressão de serA serC e de serB aumenta ainda mais o rendimento de metionina/glicose e a expressão adicional de glyA aumenta adicionalmente o rendimento de metionina/glicose. Tabela 2: Rendimento de metionina (Ymet) em %g de 15 metionina/g de glicose produzida em cultura de lote pelas cepas descritas acima, n.d., não-determinado. Para a definição precisa do rendimento de metionina/glicose ver abaixo. SD denota o desvio padrão para Ymet. *teste efetuado com 5 g/L de glicose na cultura final.

Determinação das alterações nas atividades enzimáticas de CysM, cysJI, PykA/F, GcvTHP e Lpd, serA, serB, serC e glyA

Para validar as alterações na expressão de CysM, 5 CysJI, PykA/F, GcvTHP, SerA, SerB, SerC, GlyA e Lpd, as atividades das enzimas correspondentes foram determinadas em extratos brutos.

Para a determinação das atividades enzimáticas in vitro, as cepas de E. coli foram cultivadas em meio minimo 10 conforme descrito acima e coletadas no meio a fase log. As células foram suspensas em tampão de fosfato de potássio gelado e submetidas ao ultra-som em gelo (Ultra-som Branson, 70W) . Em dois casos (mostrados em casas cinzas na tabela 3), as proteinas foram extraidas pelo uso de um 15 sistema de extração Precellys (Bertin technologies, França). As células foram suspensas em tampão de fosfato de potássio gelado, misturadas com 0,1 mm de pérolas de vidro e extraidas com uma corrida de 30 s. Depois da centrifugação, as proteínas contidas nos sobrenadantes foram quantificadas (Bradford, 1976).

A atividade da sulfocisteina sintase (CysM) foi avaliada por quantificação por LC-MS da sulfocisteina produzida. Para o teste, 25 μg/mL de proteina foram colocados em um tampão de fosfato de potássio (0,5 M, pH 6,5) contendo 25 mM de O-acetilserina e 25 mM de tiossulfato. A reação ocorreu por 10 minutos a 30 °C, e foi ainda processada para quantificação por LC-MS.

A atividade da sulfito redutase (CysJI) foi avaliada pelo desaparecimento de NADPH. A mistura reacional foi composta de hidrogenossulfito de sódio 10 mM e NADPH 10 mM em Tris-HCl (0,5 M, pH 7,5) . A reação foi iniciada pela adição de 30 μL de extrato proteico e acompanhado a 340 nm por 30 °C min em um espectrofotômetro trmostatizado.

Para a determinação da atividade da piruvato quinase (PykA/F), um ensaio acoplado à lactato desidrogenase (LDH) foi efetuado. 10 μL de extrato de proteina foram adicionados a uma solução tamponada com Tris-HCl (0,5 M, pH 7,5) contendo DTT 10 mM, MgC12 100 mM, KC1 100 mM, PEP 10 mM, AMP 50 mM, f rutose-1,6-bisfosfato 10 mM, NADH 10 mM e 10 unidades de LDH. A reação prosseguiu a 340 nm a 30 °C por 30 min em um espectrofotômetro termostatizado.

A atividade do GcvTHP, componentes do complexo de clivagem da glicina foi estimada pela medição da produção de CO2 que ocorre durante a reação de descarboxilação de glicina. A reação foi efetuada em um frasco Warburg com braço lateral contendo tampão fosfato de potássio 0,5 M em pH 7,2 mM, piridoxal fosfato, lipoamida 200 mM e 1-14C- glicina 1M a 50 μCi/mL. 400 pL de hiamina foram colocados em um poço central do frasco e o sistema reacional como um todo foi pré-incubado por 5 min a 37 °C. A reação enzimática foi iniciada pela adição de 2 mg de proteina e ocorreu a 37 °C. Ela foi interrompida pela adição através do septo do braço lateral de 500 μL de H2SO4 6N, e 14C-CO2 foi pego pela hiamina pela incubação por outra hora a 37 °C. 0 liquido no poço central foi a seguir removido e adicionado a 3 mL de liquido de cintilação antes da determinação de CPM em um contador de cintilação.

A atividade da metileno tetraidrofolato redutase (MTHFR, MetF) foi determinada pela derivatização do veiculo radioativo metil desmetilado. A mistura reacional continha fosfato de potássio (50 mM, pH 6,7), BSA 0,02% (solução a BSA 2% em EDTA 30 mM) , FAD 37,5 μM, menadiona 14 0 μM e 5- 14C-met il-THF 300 μM a 925 dpm/nmol. Depois de uma pré- incubação de 5 min a 37 °C, 100 μL do extrato de proteina em 1 μg de proteina/mL foram adicionados. A reação ocorreu por 15 min a 37 °C e foi interrompida pela adição de 300 μL de uma solução de dimedona 3 mg/mL em acetato de sódio (1M, pH 4,7) . A solução reacional foi a seguir incubada por 2 min a 100 °C e ficou em repouso em gelo por 5 min. 3 mL de tolueno foram a seguir adicionados e a solução reacional foi centrifugada por 5 min a 1500 g em temperatura ambiente. 1,5 mL da fase aquosa foram tomados e adicionados a 3 mL do liquido de cintilação. O CPM foram determinados com um contador de cintilação e a atividade foi calculada.

A atividade da lipoamida desidrogenase de Lpd foi determinada baseando-se na redução da lipoamida com NADH como o doador de elétrons. EDTA 10 mM, NADH 1 mM e NAD+ 25 mM e 1 μg de extrato de proteina foram adicionados a uma solução tamponada com Tris-HCl (0,5 M, pH 8,0) . A reação foi iniciada pela adição e 200 mM de lipoamida e o desaparecimento de NADH ocorreu a 340 nm a 30 °C por 30 min em um espectrofotômetro termostatizado.

A atividade da fosfoglicerato desidrogenase de SerA foi monitorada pelo acompanhamento do desaparecimento de NADH. 30 μL de extrato de proteina foram colocados em solução TrisHCl (10 mM, pH 8,8) contendo 3-P- hidroxipiruvato 360 μM. NADH 200 μM foram adicionados para iniciar a reação e o desaparecimento e NADH foi acompanhado a 340 nm a 30 °C por 30 min em um espectrofotômetro termostatizado.

A atividade da fosfosserina fosfatase efetuada pela proteina SerB foi determinada pela medição da serina produzida por GC-MS. A mistura reacional continha TEA-HCL (10 mM, pH 7,5), MgClg 1 mM, O-fosfo-L-serina e 15 μg de proteina. A reação foi incubada a 37 °C e interrompida a 10 e 30 minutos pela adição de acetona e adicionalmente processada para quantificação de GC-MS.

A atividade da fosfosserina-aminotransferase de SerC foi medida pelo acoplamento do ensaio com glutamato desidrogenase. A mistura reacional foi tamponada por Tris- HC1 (50 mM, pH 8,2) e continha acetato e amónio 32 mM, glutamato 2 mM, glutamato desidrogenase2 uts, NADH 200 μM. A reação foi iniciada pela adição de 30 μL de extrato de proteina e o desaparecimento de NADH foi acompanhado a 340 nm a 30 °C por 30 min em um espectrofotômetro termostatizado.

A atividade da serina hidroximetil transferase foi medida pelo monitoramento da glicina produzida por GC-MS. 30 μg de proteina foram adicionados a uma solução contendo fosfato de potássio (50 mM, pH 7,3), tetraidropteroil glutamato 400 μM, L-serina 10 mM e DTT 500 μM. A reação ocorreu por 10 minutos a 37 °C e parou depois de 10 minutos pela adição de acetona e foi adicionalmente processada para quantificação por GC-MS. Tabela 3: Atividades mostradas estão em mUI/mg de 5 proteina para a cisteina sintase B (CysM), sulfito redutase (CysJI), piruvato quinase (PykA/F), metileno-ttraidrofolato redutase (MetF), lipoamida desidrogenase (Lpd), 3- fosfoglicerato desidrogenase (SerA), fosfosserina fosfatase (SerB), fosfosserina aminotransferase (SerC) , serina 10 hidroximetil transferase (GlyA) em cepas produtoras de metionina. A atividade da glicina descarboxilase de GcvTHP está em μU/mg de proteina. As atividades marcadas nas casas cinzas foram obtidas a partir de culturas extraídas em um sistema Precellys. LOQ: limite de quantificação; ND: não determinado

Conforme pode ser observado a partir da Tabela 3, todos os constructos PtrcF-cysPUWAM, PtrcF-cysJIH Ptrc09- gcvTHP e Ptrc39-ARNmstl7-metF, pJB137-ipd, pCCIBAC-serB- serA-serC e pCCIBAC-serB-glyA-serA-serC aumentam a 5 atividade da enzima correspondente em comparação com a cepa não modificada para o alelo correspondente. A eliminação de pykA e pykF leva a uma perda completa da atividade da piruvato quinase.

Validação da produção de metionina sob condições de fermentação

As cepas que produziram quantidades substanciais dos metabolites de interesse foram subsequentemente testadas sob condições de produção em fermentadores de 2,5 L (Pierre Guerin) usando a estratégia de lote de alimentação com privação de fosfato.

O meio de pré-cultura Bl continha somente fosfato 50 mM para evitar a introdução de fosfato adicional no meio de lote com o inóculo. Para interromper o crescimento em uma concentração celular de 30 g.L’1, o fosfato foi adicionado até 28,7 mM adicionado ao meio mineral B2. Os meios de alimentação em lote (Fl e F2) estavam sem fosfato.

Resumidamente, uma cultura de 8 horas crescida em 10 mL de meio LB com 2,5 g.L-1 de glicose foi usada para inocular uma pré-cultura de 12 h em meio minimo (Bl sem tiossulfato de amónio, porém com MOPS 5 g.L-1). Essas incubações foram efetuadas em frascos com chicanas de 500 mL contendo 50 mL de meio minimo (Bl) em um agitador giratório (200 RPM) a 37 °C.

Um terceiro passo de procedimento foi efetuado em biorreatores (Sixfors) preenchidos com 200 mL de meio minimo (Bl) inoculado até uma concentração de biomassa de 0,05 g.L-1 com 1,5 mL de pré-cultura concentrada (5 g.L-1).

A temperatura da pré-cultura foi mantida constante a 37 °C e o pH foi automaticamente mantido em um valor de 6,8 5 usando uma solução de NH4OH 10%. A concentração de oxigênio dissolvida foi continuamente ajustada até um valor de 30% da saturação de pressão de ar parcial com fornecimento de ar e/ou agitação. Depois do esgotamento da glicose do meio do lote, o lote de alimentação foi iniciado com uma taxa de 10 fluxo inicial de 0,7 mL.h-1, aumentado exponencialmente por 24 horas com uma taxa de crescimento de 0,18 h-1 para obter uma concentração celular final de cerca de 24 g.L-1. Tabela 4: Composição do meio mineral da batelada de pré- cultura (Bl)

Tabela 5: Composição do meio mineral da batelada de pré- cultura (Fl)

Tabela 6: Composições do meio mineral do lote de cultura (B2 e B3)

Tabela 7: Composição de meio e lote de alimentação de cultura (F2)

Subsequentemente, os fermentadores de 2,5 L (Pierre Guerin) foram preenchidos com 600 mL de meio minimo (B2) e foram inoculados até uma concentração de biomassa de 2,1 g.L-1 com um volume de pré-cultura variando de 45 a 60 mL. 5 A temperatura da cultura foi mantida constante em 37 °C e o pH foi mantido no valor de trabalho (6,8) por adição automática de soluções de NH4OH (NH4OH 10% por 10 horas e 24% até o final da cultura). A taxa de agitação inicial foi ajustada em 200 rpm durante a fase do lote e foi aumentado 10 até 1000 rpm durante a fase de lote de alimentação. A taxa de fluxo e ar inicial foi ajustada a 40 NL.h-1 durante a fase de lote e foi aumentada atélOO NL.h 1 no inicio da fase de lote de alimentação. A concentração de oxigênio dissolvido foi mantida em valores entre 20 e 40%, preferivelmente 30% da saturação pelo aumento da agitação.

Quando a massa celular atingiu uma concentração próxima de 5 g.L"1, o lote de alimentação foi iniciado com uma taxa de fluxo inicial de 5 mL.h"1. A solução de alimentação foi injetada com um perfil sigmóide com uma taxa de fluxo crescente que atingiu 21 mL.h"1 depois de 21 horas. As condições de alimentação precisas foram p2 calculadas pela equação:

onde Q(t) é a taxa de fluxo e alimentação em mL.h” 1 para um volume de lote de 600 mL com pl = 1,15, p2 = 18,32, p3 = 0,270, p4 = 5.

Depois de 21 h de lote de alimentação, a concentração celular que atingiu 30 g.L"1 de fosfato foi esvaziada do meio e as células entraram em privação de fosfato. Naquele ponto, a injeção da solução de alimentação foi aumentada até um volume constante de 37 mL.h"1 por 4 horas. A seguir, a taxa de fluxo constante foi diminuida até 10 mL.h’1, e esse valor de fluxo foi mantido até o final do lote de alimentação (50 horas). Tabela 8. Rendimento de metionina/glicose máximo (NAM foi contado como metionina, %g/g ver abaixo) obtido em fermentações de lote de alimentação das cepas descritas acima. Para a definição precisa de rendimento de metionina/glicose, ver abaixo.

Conforme pode ser visto a partir da tabe a 8, a eliminação do gene purU aumenta significativamente o rendimento de metionina/glicose. A produção de isoleucina é significativamente reduzida pela superexpressão de serA 5 serC a partir de pCCIBAC-serA-serC. A expressão adicional do gene serB diminui ainda mais a produção de isoleucina e aumenta o rendimento de metionina/glicose.

Determinação do rendimento de metionina/glicose (Ymet)

A concentração de metionina extracelular foi 10 quantificada por HPLC depois da derivatização de OPA/FMOC. A concentração de NAM e a concentração de glicose residual foi analisada usando HPLC com detecção refratométrica. O rendimento de metionina foi expresso da seguinte forma:

Culturas de lote: Para determinar os volumes de cultura inicial e final, o frasco erlenmeyer foi pesado vazio, com o meio e no final da cultura. O rendimento de metionina foi expresso da seguinte forma:

Com metionina0 e metioninaf sendo respectivamente as concentrações de metionina inicial e final, glicoseo e glicosef sendo respectivamente as concentrações inicial e final de glicose e Vo e Vf sendo os volumes inicial e final.

Culturas de lote de alimentação:

O volume do fermentador foi calculado pela adição ao volume inicial da guantidade de solução adicionadas para regular o pH e para alimentar a cultura e pela subtração do volume usado para amostragem e perda por evaporação.

O volume do lote de alimentação foi acompanhado continuamente pela pesagem do estogue de alimentação. A quantidade de glicose injetada foi a seguir calculada com base no peso injetado, a densidade da solução e a concentração de glicose foi determinada pelo método de Brix ([Glicose]). O rendimento de metionina foi expresso da seguinte forma:

Com metioninat e metioninat sendo respectivamente as concentrações de metionina inicial e final e Vo e Vt o volumes t inicial e do momento. A glicose consumida foi calculada da seguinte forma:

Glicose injetadat - volume de alimentaçãot * [Glicose] Glicose consumidat = [Glicose]0 * Vo + glicose injetada — [Glicose ] residual * Vt Com [Glicose] 0, [Glicose], [Glicose] residual sendo respectivamente as concentrações de glicose inicial, da alimentação e a residual. Limitação ou privação de fosfato aumenta o rendimento de metionina/glicose

Para demonstrar que a limitação de fosfato e também a privação de fosfato aumenta o rendimento de metionina/glicose, fermentações em lote de alimentação foram efetuadas como descrito acima. Para a cultura sem privação ou limitação de fosfato, o meio mineral B3 foi usado e o meio de lote de alimentação foi F2 completado com Na2SO4 (8,95 . L-1) e (NH4)2SO4 (8,32 g.L-1). Para a cultura crescida sob limitação de fosfato as seguintes modificações foram introduzidas. O meio mineral do lote usado foi B2 e o meio de lote de alimentação foi F2 completado com 60 mL de fosfato. A limitação de fosfato ocorreu em uma OD600 nm de 100.

Conforme pode ser observado a partir da fig 2 sob excesso de fosfato, a ODgoonm aumentou continuamente durante a cultura e atingiu 160 UDO no final do experimento. No caso da limitação e privação de fosfato, a taxa de crescimento celular diminuiu partindo de uma OD6oonm de 100 5 (20 horas) e a OD60onm final foi próxima de 120. A concentração de fosfato residual foi próxima de zero, o que foi confirmado por cromatografia iônica. Como consequência da privação e limitação de fosfato, o rendimento de metionina aumentou e atingiu o valor máximo de 0,147 e 10 0,139 g.g-1, respectivamente, em comparação com 0,124 g.g1 sob excesso de fosfato.

Claims (5)

1. Método para a produção de metionina utilizando um microrganismo geneticamente modificado em um processo fermentativo caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: - cultivar uma E. coli e C. glutamicum modificada em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de enxofre, em que: A) a expressão do repressor de metionina codificado pelo gene metJ no referido microrganismo é atenuada; B) a expressão do gene purU é atenuada resultando em desformilação de formil-THF reduzida; C) a expressão de pelo um dos seguintes genes é atenuada resultando no consumo de PEP reduzido: • pykA • pykF; e - recuperar metionina do meio de cultura, em que em comparação com um método não-modificado, o método foi modificado para apresentar um rendimento de metionina/fonte de carbono aumentado de pelo menos 2% g/g: - limitação do crescimento e produção de biomassa do microrganismo modificado pela limitação ou privação do microrganismo por fosfato no meio de cultura; em que a E. coli e C. glutamicum modificada é conforme estabelecida a seguir: ΔmetJ metA*11 Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔmetJ metA*11 Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA ΔmetJ metA*11 Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09-gcvTHP ΔmetJ metA*11 Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09-gcvTHP ΔpurU ΔmetJ metA*11 Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ metA*11 Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09-gcvTHP ΔpurU Ptrc36- ARNmst17-metF cepa1 PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09- gcvTHP (pJB137-lpd) cepa1 PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09- gcvTHP ΔpurU (pCC1BAC-serA-serC) cepa1 PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09- gcvTHP ΔpurU Ptrc36-ARNmst17-metF (pCC1BAC- serA-serC) cepa1 PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09- gcvTHP ΔpurU Ptrc36-ARNmst17-metF (pCC1BAC-serB-serA-serC) cepa1 PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09- gcvTHP ΔpurU Ptrc36-ARNmst17-metF (pCC1BAC-serB-glyA-serA- serC); em que a cepal é ΔmetJ metA*11 Ptrc-metH Ptrc-metF.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é limitado ou privado para potássio.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a fonte de enxofre no meio de cultura é sulfato ou tiossulfato, ou uma mistura das duas.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é glicose ou sacarose.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de transformar N-acetilmetionina em metionina por desacilação, antes de a metionina ser recuperada.

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