BRPI0917192B1 - Produção de metionina sem n-acil-metionina - Google Patents
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(54) Título: PRODUÇÃO DE METIONINA SEM N-ACIL-METIONINA (51) lnt.CI.: C12P 13/12 (30) Prioridade Unionista: 12/02/2009 US 12/370,422, 22/08/2008 EP PCT/EP2008/061005 (73) Titular(es): EVONIK DEGUSSA GMBH (72) Inventor(es): GWÉNAÉLLE BESTEL-CORRE; RAINER FIGGE; PHILIPPE SOUCA1LLE (85) Data do Início da Fase Nacional: 21/02/2011
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: PRODUÇÃO
DE METIONINA SEM N-ACIL-METIONINA.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um método para a produção de metionina ou seus derivados cultivando um microorganismo em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de enxofre.
microorganismo e/ou o meio de cultura e/ou os parâmetros do processo foram modificados de um modo que o acúmulo do subproduto N-acil-metionina (NAM) é reduzido. O isolamento de metionina ou seus derivados a partir do meio de fermentação também é reivindicado.
TÉCNICA ANTERIOR
Os compostos contendo enxofre, tais como cisteína, homocisteína, metionina ou S-adenosilmetionina são críticos para o metabolismo celular e são produzidos industrialmente para serem usados como aditivos de alimento ou de alimentação e farmacêuticos. Em particular, metionina, um aminoácido essencial, que não pode ser sintetizado por animais, desempenha um papel importante em muitas funções do corpo. Atualmente, D,L-metionina é produzida por síntese química de acroleína, metil mercaptano e cianeto de hidrogênio. 0 aumento dos preços para os precursores de derivados de petróleo acroleína e metil mercaptano, somados à procura aumentada de metionina torna a produção microbiana de metionina atrativa.
A via para a síntese de L-metionina é bem conhecida em muitos microorganismos (revisado em Figge RM (2006), ed Wendisch VF, Microbíol Monogr (5) Amino acid biosynthesis pl64-185). As cepas de E. coli e C. glutamícum produtoras de metionina são descritas nos pedidos de patente
W02005/111202, W02007/077041, W02007/012078 e
WO2007/135188.
A metionina produzida por fermentação precisa ser purificada a partir do caldo de fermentação. A purificação de metionina de custo eficaz depende das cepas produtoras e dos processos de produção que minimizam a quantidade de subprodutos no caldo de fermentação. Os subprodutos originam-se das vias de transformação e/ou degradação de metionina. Em particular, estes produtos são S-adenosilmetionina (SAM), tio-metil-ribose e N-acil-metioninas (NAM) tal como N-acetil-metionina e N-propionil-metionina. Como no pedido de patente PCT/EP2007/060433, as cepas de E. coli produtoras de metionina produzem N-acetil-metionina. E.
coli também produz N-propionil-metionina.
A produção de NAM não é desejável, já que ela reduz o rendimento de metionina e torna a purificação de metionina mais difícil. NAM pode ser transformado em metionina e acetato pela adição de NAM acilases ao término do ciclo de fermentação, mas isto aumenta drasticamente o custo do produto. Portanto, é necessário reduzir ou eliminar o acúmulo de NAM durante o ciclo de fermentação. Isto requer uma boa compreensão das reações que são responsáveis pelo acúmulo de NAM.
A aciiação no término N de metionina como um processo co-translacional é uma das modificações de proteína mais comuns em eucariotos. Contudo, é improvável que a N-acetil10 metionina seja produzida por acetilases no término N (para revisão ver Polevoda & Sherman 2000 JBC 275, 47, pp 3647936482), desde que metionina parece ser acetilada como um aminoácido livre em metionina produzindo bactérias e a acetilação de metionina como um processo co-translacional é rara em procariotos (Driessen et al. 1985, CRC Crit. Rev.
Biochem. 18, 281-325). A N-acetil-metionina é mais provavelmente obtida acetilando L-metionina livre. As enzimas de N-acetilação, que possivelmente podem acetilar metionina, são descritas. Por exemplo, ArgA codifica um N20 acetil-glutamato sintase em E. coli (Marvil & Leisinger
1977 JBC 252, 10 pp. 3295-3303).
Até agora, as enzimas capazes de catalisar a produção biossintética de N-acetil-metionina, N-propil-metionina ou outros derivados de metionina com cadeias de acila mais longas eram desconhecidas. A identificação das atividades maiores de metionina-N-acil transferase e sua atenuação em metionina produzindo microorganismos são assim cruciais para a redução da produção de NAM.
0 acúmulo de NAM também pode ser reduzido desacetilando o NAM acumulado para obter metionina. A desacetilação de grupos N-acila de aminoácidos é demonstrada em bactérias. Por exemplo, N-acetilornitina codificada por ArgE tem um amplo espectro de substrato e desacetila eficazmente N-acetilmetionina (Javid-Majd &
Blanchard 2000 Biochemistry 39, 1285-93). Assim, a superexpressão de argE ou outro aminoácido desacetilase, tal como acilase I de rim de rato (Giardina et al 2000 Eur. J.
Biochem. 267, 6249-55), Aspergillus niger ou rim de porco aminoácido acilase de (Gentzen et al. 1980 Z. Naturforsch c, 544-50) pode reduzir o acúmulo de NAM.
Desde que NAM é exportado no espaço extracelular, a exportação de NAM acilases no espaço periplásmico ou extracelular pode ser uma vantagem. Vários sistemas de exportação são conhecidos em E. coli, que permitem a exportação no periplasma, por exemplo sistemas TAT e Sec (revisado em Manting & Driessen 2000 Mol Microbiol 37, 22638, Choi & Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 625635). Exportação através da via de TAT ou Sec requer a presença de peptídeos de sinal específicos. Se a exportação no espaço extracelular é favorecida, a proteína de interesse pode ser fundida a proteínas transportadoras que são normalmente exportadas no meio, tal como ompF ou hemolisina (Choi & Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol.
64, 625-635). A proteína também pode ser exportada no meio ou exibida sobre a superfície das células fundindo a mesma a domínios de proteína que são requeridos para a exportação de proteínas auto-transportadoras, tal como IgAl de N.
gonorrhoeae ou AIDA-I de E. coli. As proteínas também podem ser exportadas através da via de dois parceiros ou exibição de fago (Jacob-Dubuisson et al. 2004 Biochim et Biophys Act
1694 235-257, José & Meyer 2007 Microbiol and Molecul Biol
Rev 71, 600-19). O projeto do processo também mostra impactar sobre a exportação de certas proteínas (Shokri et al 2003 Appl Microbiol Biotechnol 60, 654-64).
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Os requerentes resolveram o problema de reduzir o acúmulo do subproduto N-acil-metionina (NAM) em cepas produtoras de metionina.
Os inventores identificaram a atividade maior de metionina N-acriltransferase (MNAT), que catalisa a conversão de metionina em NAM, a ser codificada pelo gene yncA em E. coli.
Um microorganismo modificado apresentando uma atenuação da expressão do gene yncA, e, portanto, uma produção reduzida de NAM, é divulgado no presente.
Os inventores também mostraram que a super-expressão de enzimas de desacilação, tal como o aminoácido acilase de
Aspergillus oryzae ou rim de porco aminoácido acilase, que convertem NAM em metionina, leva a uma quantidade diminuída de NAM. De preferência, as ditas enzimas de desacetilação são exportadas no periplasma ou no espaço extracelular.
Em outro aspecto, as condições de cultura foram adaptadas para obter uma redução da produção e/ou acúmulo de NAM.
Estes três meios para reduzir o acúmulo de NAM foram aplicados individualmente ou em combinação, para reduzir o acúmulo de NAM.
Glicose é usada como um substrato modelo e E. coli recombinante como organismo modelo, mas a invenção não está limitada a estas características.
Consequentemente, o objeto da presente invenção é prover um microorganismo em que a expressão dos genes codificando MNAT (metionina N-acil-transferase) maiores é atenuada, de preferência os genes correspondentes deletados, e/ou as enzimas de desacilação de NAM homólogas ou heterólogas foram supre-expressadas, para reduzir o acúmulo de NAM.
Este microorganismo com produção e/ou acúmulo de NAM diminuída mostra uma produção/rendimento da fonte de carbono de metionina melhorada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção refere-se a um método para a produção de metionina, seus derivados, ou precursores em um processo fermentativo compreendendo as seguintes etapas:
- cultivar um microorganismo modificado em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono, uma fonte de enxofre e uma fonte de nitrogênio, e
- recuperar metionina e/ou seus derivados do meio de cultura, sendo que comparado a um microorganismo ou método não modificado, o microorganismo ou o método foi modificado para reduzir o acúmulo do subproduto N-acil metionina.
Em um aspecto particular da invenção, a N-acil metionina cujo acúmulo é reduzido é escolhida dentre o seguinte grupo: N-acetil-metionina, N-propionil-metionina,
N-butiril-metionina, e combinações dos mesmos.
O acúmulo do subproduto N-acil metionina pode ser obtido em pelo menos uma das seguintes modificações:
- A atenuação da expressão de pelo menos uma metionina
N-acil transferase (isto é, transacilases) no microorganismo, e/ou
- A expressão (ou intensificação da expressão) de pelo menos uma amino acilase específica de metionina no microorganismo; e/ou
- A variação das condições de cultura tais como pH, temperatura de oxigenação, e/ou adição de um NAM acilase no meio de cultura, e combinações dos mesmos.
De acordo com a invenção, os termos 'cultura', 'fermentação' ou 'processo fermentativo' são usados intercambiavelmente para denotar um crescimento de bactérias em um meio de crescimento contendo uma fonte de carbono simples.
Um meio de cultura apropriado é um meio apropriado para a cultura e crescimento do microorganismo. Tais meios são bem conhecidos na técnica de fermentação de microorganismos, dependendo do microorganismo a ser cultivado.
A frase recuperar metionina e/ou seus derivados do meio de cultura designa a ação de recuperar metionina, e possivelmente SAM e NAM e todos os outros derivados que podem ser úteis.
O termo microorganismo designa uma bactéria, levedura ou fungo. De preferência, o microorganismo é selecionado dentre Enterobacteriaceae, Bacillaceae,
| Streptomycetaceae e | Corynebacteriaceae. | Mais | |
| preferivelmente, | o microorganismo é uma espécie | de | |
| Escherichia, | Klebsiella, | Pantoea, Salmonella | ou |
| Corynebacterium. | Ainda | mais preferivelmente, | o |
| microorganismo | é tanto a | espécie Escherichia coli | ou |
| Corynebacterium | glutamicum. | ||
| 0 termo | microorganismo modificado denota | um |
microorganismo que foi modificado geneticamente com o objetivo de reduzir o acúmulo de NAM no caldo de fermentação. O perito na técnica sabe como modular a expressão de genes específicos. Modificações comuns incluem transformar microorganismos com elementos genéticos, incluindo deleções de genes, substituições de genes, modificação de promotores, e introdução de vetores para a expressão de genes heterólogos.
Os inventores mostraram que NAM é formado pela acilação de metionina e identificaram o gene yncA como a maior enzima produzindo NAM. yncA, também conhecido como gene bl448 de E. coli, foi mencionado no pedido de patente
| 20 WO 2001070776. Ele é | parte de um | grupo de | genes | induzidos |
| pelo regulador Mar, | envolvido na | resistência a | múltiplas | |
| drogas. | ||||
| As enzimas de | aminoácido | acilases | (EC | 3.5.1.14), |
também denominadas desacetilases, catalisam a divagem hidrolítica de um aminoácido de acila para produzir o aminoácido livre e o ácido carbônico correspondente ao resto de acila. Mais especificamente, N-acil metionina acilases catalisam a reação de NAM em metionina e o ácido carbóxi correspondente.
O termo N-acil metionina designa N-formil-metionina,
N-acetil-metionina, N-propionil-metionina, N-butiril metionina e, em geral, qualquer derivado de metionina compreendendo um grupo funcional derivado de qualquer ácido carboxílico em que falta a função hidroxila.
Para medir o acúmulo de N-acetil-metionina, a quantidade de N-acetil-metionina é determinada no caldo de fermentação usando HPLC refratométrica usando N-acetilmetionina (Sigma, Ref. 01310) como um padrão. N-propionil15 metionina é determinada no caldo de fermentação por GC-MS usando N-acetil-metionina como um padrão.
O acúmulo de NAM deveria ser reduzido pelo menos em
20%, de preferência 50%, mais preferivelmente, 80% e ainda mais preferivelmente 95% da quantidade acumulada em um processo com o organismo não modificado ou no processo não modificado.
O termo fonte de carbono, de acordo com a presente invenção, denota qualquer fonte de carbono que pode ser usada pelos peritos na técnica para suportar o crescimento normal de um microorganismo, que pode ser hexoses (tal como glicose, galactose ou lactose), pentoses, monossacarídeos, dissacarídeos (tal como sacarose, celobiose ou maltose), oligossacarídeos, melaços, amido ou seus derivados, hemiceluloses, glicerol e combinações dos mesmos. Uma fonte de carbono especialmente preferida é glicose. Outra fonte de carbono preferida é sacarose.
Em uma modalidade particular da invenção, a fonte de carbono é derivada de matéria-prima renovável. A matéria10 prima renovável é definida como o material bruto requerido para certos processos industriais que podem ser regenerados dentro de um breve retardo e em quantidade suficiente para permitir sua transformação no produto desejado.
O termo fonte de nitrogênio corresponde tanto a um sal de amônio ou a gás amoníaco. A fonte de nitrogênio é suprida na forma de amônio ou amoníaco.
A fonte de enxofre usada para a produção fermentativa de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados dos mesmos, pode ser qualquer um dos seguintes: sulfato, tiossulfato, sulfeto de hidrogênio, ditionato, ditionito, sulfito, metilmercaptano, sulfeto de dimetila ou uma combinação dos mesmos.
Em uma modalidade preferida da invenção, a fonte de enxofre é sulfato e/ou tiossulfato.
Ά fermentação é geralmente conduzida em fermentadores com um meio de cultura apropriado adaptado ao microorganismo que é usado, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples e, se necessário, co-substratos para a produção de metabólitos.
Os peritos na técnica são capazes de definir as condições de cultura para os microorganismos de acordo com a invenção. Em particular, as bactérias são fermentadas a uma temperatura entre 20°C e 55°C, de preferência entre 25°C 10 e 40°C, e mais especificamente cerca de 30°C para C.
glutamicum e cerca de 37°C para E. coli.
Como um exemplo de meio de cultura conhecido para E.
coli, o meio de cultura pode ser de composição idêntica ou similar a um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 32:120-128), e meio M63 (Miller, 1992; A Short
Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and
Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ou um meio tal como definido por Schaefer et ai.
(1999, Anal. Biochem. 270: 88-96).
Como um exemplo de meio de cultura conhecido para C. glutamicum, o meio de cultura pode ser de composição idêntica ou similar ao meio BMCG (Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210) ou a um meio tal como descrito por Riedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol.
Biotechnol. 3: 573-583).
Em uma modalidade específica da invenção, a produção de N-acil-metionina é reduzida atenuando pelo menos uma das metionina transacilases. As metionina transacilases são também denominadas metionina N-aciltransferase (MNAT). argA codifica enzimas com atividade de metionina transacilase putativa. Os inventores purificaram a atividade de MNAT a partir de uma cepa de E. coli com uma delação de argA, sequenciaram a proteína purificada e mostraram que a proteína purificada, YncA, tem atividade de MNAT (pedido de patente PCT/EP2008/060999). A atenuação da expressão do gene yncA elimina uma grande quantidade da atividade de
MNAT residual, levando a uma redução dramática da produção de NAM, especialmente dos compostos N-acetil-metionina e Npropionil-metionina. Em uma modalidade preferida da invenção, YncA é inteiramente deletado do genoma de E.
coli.
Outras aciltransferases com uma atividade mais baixa foram identificadas, que permitem obter uma produção de NAM reduzida quando atenuadas; estas enzimas são codificadas pelos seguintes genes: yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ. Qualquer uma das metionina N-acil transferases descritas pode ser atenuada individualmente ou em combinação com as outras.
Os termos atenuar um gene ou 'atenuação da expressão de um gene' de acordo com a invenção denota a supressão parcial ou completa da expressão de um gene, que é então dito ser 'atenuado' . Esta supressão de expressão pode ser tanto uma inibição da expressão do gene, uma inserção em ou uma deleção de toda ou parte da região de promotor necessária para expressão do gene, uma deleção ou inserção na região de codificação do gene, ou a troca do promotor do tipo selvagem por um promotor natural ou sintético mais fraco. De preferência a atenuação de um gene é essencialmente a deleção completa desse gene, que pode ser substituído por um gene marcador de seleção que facilita a identificação, isolamento e purificação das cepas de acordo com a invenção. Um gene é inativado de preferência pela técnica de recombinação homóloga (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal· genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 97: 6640-6645).
Em outra modalidade específica da invenção, o acúmulo de N-acil-metionina pode ser reduzido pela expressão nas enzimas amino acilases específicas de microorganismo nativo ou metionina heteróloga.
• Ãsperçrillus N-acil amino ácido acilase • Porco N-acil amino ácido acilase • Acetilornitina desacetilase codificando E. coli argE, agindo também em N-acetilmetionina.
A expressão aumentada de amino acilases específicas de metionina aumenta a taxa de conversão de NAM em metionina com a produção concomitante de uma molécula do ácido carbóxi correspondente, tal como acetato, propionato ou butirato. O favorecimento do consumo de acetato superexpressando os genes acs, pta-ackA ou genes codificando a derivação de glioxilato também é parte da invenção.
Os termos intensificado ou super-expressado neste contexto descreve o aumento na atividade intracelular de uma atividade enzimática que é codificada pelo DNA correspondente, por exemplo, aumentando o número de cópias do gene, usando um promotor mais forte ou usando um alelo com atividade aumentada e possivelmente combinando estas medidas.
Os termos expressão aumentada, expressão intensificada ou super-expressão são usados 20 intercambiavelmente no texto e têm significado similar.
Para aumentar a expressão de um gene, ele pode ser codificado cromossomicamente ou extra-cromossomicamente.
Cromossomicamente pode haver uma ou várias cópias no genoma que podem ser introduzidas por métodos de recombinação conhecidos dos peritos no campo.
Extra-cromossomicamente, os genes podem ser transportados por diferentes tipos de plasmideos que diferem com respeito à sua origem de replicação e, assim, seu número de cópias na célula.
Eles podem estar presentes como 1-5 cópias, cerca de ou até 500 cópias, correspondendo a plasmideos com baixo número de cópias com replicação firme (pSClOl, RK2), plasmideos com baixo número de cópias (pACYC, pRSFlOlO) ou plasmideos com alto número de cópias (pSK bluescript II).
Em uma modalidade preferida da invenção, o gene pode ser expresso usando promotores com força diferente que podem ser indutíveis. Estes promotores podem ser homólogos ou heterólogos. O perito na técnica sabe que os promotores são os mais convenientes, por exemplo, os promotores Ptrc,
Ptac, Plac ou o promotor lamba cl são amplamente usados.
A expressão das enzimas pode ser reforçada ou reduzida por elementos estabilizando ou desestabilizando o RNA mensageiro correspondente (Carrier e Keasling (1998)
Biotechnol. Prog. 15, 58-64) ou as proteínas (por exemplo,
GST tags, Amersham Biosciences).
A presente invenção refere-se também a microorganismos que contêm um ou vários alelos do gene a ser intensificado de acordo com a invenção.
Todas as técnicas para transformar os microorganismos e elementos reguladores usados para intensificar a produção da proteína da invenção são bem conhecidas na técnica e disponíveis na literatura, incluindo os pedidos de patente de propriedade do requerente sobre a modificação das vias de biossíntese em vários microorganismos, incluindo
W02008/052973, W02008/052595, W02008/040387, WO2007/144346,
W02007/141316, W02007/077041, W02007/017710, W02006/082254,
W02006/082252, W02005/111202, W02005/073364, WO2005/047498,
W02004/076659, o conteúdo dos quais é incorporado ao presente por referência.
As enzimas N-acil-metionina serão expressas no espaço intracelular e podem permanecer no espaço intracelular ou ser exportadas no periplasma ou ser exportada no espaço extracelular. O perito no campo será capaz de identificar meios para marcar a proteína para o periplasma. A exportação também pode ser baseada na fusão de N-acetilmetionina acilases a proteínas como OmpF, por exibição de fago ou usando os sistemas de exportação de proteínas tal como via de dois parceiros ou auto-transporte. Em uma modalidade preferida da invenção, as enzimas NAM acilases são expostas no periplasma ou no compartimento extracelular para evitar a ciclização inútil entre NAM e metionina.
Em uma modalidade desta invenção, os inventores adaptaram os parâmetros do processo de fermentação, isto é, as condições de cultura, para reduzir a produção de NAM.
Isto é realizado trocando o pH do caldo de fermentação, modificando os parâmetros de alimentação de oxigenação ou do substrato. Outra opção é adicionar no meio de cultura uma acilase especifica de NAM.
Em uma modalidade, a troca dos parâmetros de fermentação não inclui a privação do microorganismo para um substrato inorgânico tal como fosfato, potássio, magnésio.
Estes três meios para modular o acúmulo de NAM podem ser usados sozinhos ou combinados com um ou dois de outros meios.
Consequentemente, a atenuação da atividade de MNAT é obtida atenuando a expressão dos seguintes genes: yncA e/ou argA e/ou, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ, estes genes codificando as enzimas com metionina-N-aciltransferases. Esta atenuação pode ser combinada com a expressão aumentada das enzimas Nacil-metionina desacilase, tais como Aspergillus N20 aminoácido acilase, porco N-aminoácido acilase ou acetilornitina desacetilase codificada pelo gene argE.
Similarmente, a atenuação de pelo menos uma enzima
MNAT, como descrito acima, pode ser combinada com a adaptação dos parâmetros do processo, tal como pH, oxigenação, temperatura e/ou adicionando NAM acilase ao caldo de fermentação, permitindo juntos uma redução do acúmulo de NAM.
Similarmente, a expressão das enzimas NAM acilases pode ser combinada com a adaptação do processo. Detalhes de ambos os meios foram descritos acima.
Finalmente, todos os três meios podem ser combinados:
a atenuação da atividade de MNAT, a expressão aumentada das enzimas NAM acilases e a adaptação das condições de processo.
Na descrição da presente invenção, os genes e as proteínas são identificadas usando as denominações dos genes correspondentes em E. coli. No entanto, e a menos que especificado ao contrário, o uso destas denominações tem um significado mais geral de acordo com a invenção e cobre todos os genes e proteínas correspondentes em outros organismos, mais particularmente microorganismos.
PFAM (famílias de proteínas na base de dados de alinhamentos e modelos Markov ocultos;
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa uma grande coleção de alinhamentos de sequências de proteína.
Cada PFAM torna possível visualizar múltiplos alinhamentos, ver domínios, avaliar a distribuição entre os organismos, ganhar acesso a outras bases de dados e visualizar estruturas de proteínas conhecidas.
COGs (agrupamentos de grupos ortólogos de proteínas;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/ são obtidos comparando as sequências de proteína a partir de genomas completamente sequenciados representando linhagens filogênicas maiores.
Cada COG é definido a partir de pelo menos três linhagens, que permite a identificação dos primeiros domínios conservados.
Os meios para identificar sequências homólogas e suas homologias de percentagem são bem conhecidos dos peritos na técnica, e incluem em particular os programas BLAST, que podem ser usados a partir de um site da web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros default indicados no site da web. As sequências obtidas podem então ser exploradas (por exemplo, alinhadas) usando, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) ou MULTALIN (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html), com os parâmetros default indicados nos sites da web.
Usando as referências dadas em GenBank para genes conhecidos, os peritos na técnica são capazes de determinar os genes equivalentes em outros organismos, cepas bacterianas, leveduras, fungos, mamíferos, plantas, etc. Este trabalho de rotina é vantajosamente feito usando sequências de consenso que podem ser determinadas realizando os alinhamentos de sequência com genes derivados de outros microorganismos, e projetando sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo. Estes métodos de rotina de biologia molecular são bem conhecidos dos peritos na técnica, e são reivindicados, por exemplo, em Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory
Manual. 2- ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor,
New York.).
A presente invenção também se refere a um microorganismo tal como descrito acima. Um microorganismo com um acúmulo e/ou produção reduzida de N-acil metionina é de particular utilidade para produzir metionina com alto rendimento. De preferência, o microorganismo de acordo com a invenção já é um alto produtor de metionina antes de ser usado no processo de acordo com a invenção.
A produção eficaz de metionina requer a otimização da via específica de metionina e várias vias que provêem precursores. As cepas que produzem metionina foram descritas nos pedidos de patente WO 2005/111202,
W02007/077041 e PCT/EP2007/060433 e são incorporadas como referência neste pedido.
Uma cepa que produz metionina que super-expressa alelos de homoserina succiniltransferase com sensibilidade à matéria-prima reduzida para seus inibidores SAM e metionina é descrita no pedido de patente WO 2005/111202.
Este pedido descreve também a combinação destes alelos com uma deleção do repressor de metionina MetJ (GenBank
1790373), responsável pela regulação para baixo do regulon de metionina como foi sugerido no pedido de patente JP
2000/157267. Além disso, as combinações das duas modificações com a super-expressão de aspartocinase/homoserina desidrogenase são descritas no pedido de patente WO 2005/111202.
A super-expressão dos genes cysE, metH e metF foi sugerida em WO 2007/077041.
A produção de metionina pode ser mais aumentada usando um alelo metB alterado que usa preferivelmente ou exclusivamente H2S e assim produz homocisteína de 0succinil-homoserina como foi descrito no pedido de patente
WO 2004/076659 que é incorporado ao presente por referência.
Outro aumento na produção de metionina pode ser obtido deletando os genes pykA, pykF e/ou purU como descrito no pedido de patente PCT/EP2007/060433. Este pedido também descreve cepas produzindo metionina em que os operons cysPUWAM, cysJIH e gevTHP e os genes será, serB, serC, Ipd e glyA são super-expressos.
Em E. coli, outras enzimas podem ser aumentadas em sua atividade para aumentar a produção de metionina (seguidas por números de acesso e da função do polipeptídeo correspondente):
A expressão dos genes envolvidos na assimilação de enxofre pode ser aumentada:
| gene | número de | acesso função | |
| cysK | 1788754 | cisteína sintase | |
| CysZ | gl788753 | ORF a montante de cysK | |
| 10 | cysK | gl789108 | ATP sulfurilase |
| cysV) | gl789109 | sulfato adenililtransferase | |
| cysC | gl789107 | adenililsulfato cinase | |
| cysZ | 1788753 | transporte de sulfato | |
| sbp | 1790351 | Proteína de ligação a sulfato |
periplásmico
As reações anapleróticas podem ser reforçadas
| expressando | ||
| ppc | 1790393 | fosfoenolpiruvatocarboxilase |
| pps | 1787994 | fosfoenolpiruvato sintase |
| 20 As reações que consomem | acetato podem ser reforçadas | |
| super-expressando | ||
| - a cs | 1790505 | acetil-CoA sintetase |
Além disso, a expressão de genes nas vias de degradação de metionina (ver lista abaixo) ou desviando da
4 via de produção de metionina pode ser atenuada ou os genes podem ser deletados.
A atenuação deste contexto descreve a redução da atividade intracelular de uma enzima por medidas tais como
| 5 | reduzir sua | expressão, | reduzir a estabilidade da | enzima, |
| aumentar sua | degradação | e/ou outras soluções conhecidas dos | ||
| peritos no campo. | ||||
| Gene | entrada no GenBank atividade | |||
| ackA | 1788633 | acetato cinase | ||
| 10 | pta | 1788635 | fosfotransacetilase | |
| aceE | 1786304 | piruvato desidrogenase El | ||
| aceF | 1786305 | piruvato desidrogenase E2 | ||
| Ipd | 1786307 | piruvato desidrogenase E3 | ||
| sucC | 1786948 | succinil-CoA sintetase, subunidade | ||
| 15 | beta | |||
| sucD | 1786949 | succinil-CoA sintetase, subunidade | ||
| alfa | ||||
| pck | 1789807 | fosfoenolpiruvato carboxicinase | ||
| poxB | 1787096 | piruvato oxidase | ||
| 20 | il vB | 1790104 | ácido aceto-hidróxi sintase | I, |
subunidade grande ilvN 1790103
1790202 il vG ácido aceto-hidróxi sintase I, subunidade pequena ácido aceto-hidróxi sintase II, subunidade grande
| 1790203 | |||
| i IvM | 1790204 | ácido aceto-hidróxi sintase II, 1 subunidade pequena | |
| 5 | ilvl | 1786265 | ácido aceto-hidróxi sintase III, subunidade grande |
| ilvh | 1786266 | ácido aceto-hidróxi sintase III, subunidade pequena | |
| aroF | 1788953 | DAHP sintetase | |
| 10 | aroG | 1786969 | DAHP sintetase |
| ar oh | 1787996 | DAHP sintetase | |
| trB | 1786184 | homoserina cinase | |
| trC | 1786185 | treonina sintase | |
| sdaA | 1788116 | serina desaminase | |
| 15 | sdaB | 1789161 | serina desaminase |
| speD descarboxilase | gl786311 | S-Adenosilmetionina | |
| speC | gl789337 | Ornitina descarboxilase | |
| as tA | gl788043 | Arginina succiniltransferase | |
| 20 | dapA | gl788823 | Diidrodipicolinato sintase |
| A invenção também | diz respeito a processo para a |
produção de L-metionina, seus precursores ou compostos derivados dos mesmos, compreendendo a fermentação do microorganismo que produz metionina descrito acima, a concentração de metionina, seus precursores ou derivados e o isolamento do(s) produto(s) desejado(s) do caldo de fermentação.
Os peritos na técnica são capazes de definir as condições de cultura para os microorganismos de acordo com a invenção. Em particular, as bactérias são fermentadas a uma temperatura entre 20°C e 55°C, de preferência entre 25°C e 40°C, e mais especificamente cerca de 30°C para C. glutamicum e cerca de 37°C para E. coli.
A fermentação é geralmente conduzida em fermentadores com um meio de cultura inorgânico da composição definida conhecida adaptada às bactérias usadas, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples e, se necessário, um cosubstrato necessário para a produção do metabólito.
Em particular, o meio de cultura orgânico para E. coli pode ser de composição idêntica ou similar a um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 32:120-128), um meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial
Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York) ou um meio tal como definido por Schaefer et al
96) .
1999, Anal. Biochem. 270:
De modo análogo, o meio de cultura inorgânico para C.
glutamicon pode ser de composição idêntica ou similar ao meio BMCG (Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol.
32: 205-210) ou a um meio tal como descrito por Ríedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583) . Os meios podem ser suplementados para compensar auxotrofias introduzidas por mutações.
Após fermentação, L-metionina, seus precursores ou compostos derivados dos mesmos, é/são recuperado(s) e purificado(s) se necessário. Os métodos para a recuperação e purificação do composto produzido tal como metionina nos meios de cultura são bem conhecidos dos peritos na técnica.
Opcionalmente, de 0 a 100%, de preferência pelo menos
90%, mais preferivelmente 95%, ainda mais preferivelmente pelo menos 99% da biomassa podem ser eliminados durante a purificação do produto de fermentação.
Em uma modalidade preferida da invenção, o método para a produção de metionina compreende uma etapa de isolamento dos aminoácidos/constituintes desejados do caldo de fermentação e/ou a biomassa opcionalmente restante em porções ou na quantidade total (0-100%) no produto final.
Os meios para reduzir a quantidade de NAM podem ser combinados com limitação ou privação de fosfato e/ou potássio. O perito no campo será capaz de determinar as quantidades de fosfato ou potássio necessárias para o crescimento do organismo escolhido.
Submeter um organismo a uma limitação de um substrato inorgânico define uma condição sob a qual o crescimento dos microorganismos é governado pela quantidade de um produto químico inorgânico suprido que ainda permite um crescimento fraco. Exemplos destes substratos são fosfato, potássio, magnésio ou uma combinação dos mesmos.
Privar um microorganismo de um substrato inorgânico define a condição sob qual condição do microorganismo para completamente devido à ausência do substrato inorgânico.
Exemplos para estes substratos são fosfato, potássio, magnésio ou uma combinação dos mesmos.
A invenção também se refere a um microorganismo tal como descrito anteriormente que é otimizado para a produção fermentativa de metionina com um acúmulo reduzido de NAM, isto é, acumulando quantidades mais baixas de NAM comparado a um microorganismo não modificado, e o microorganismo que compreende as modificações genéticas descritas acima.
EXEMPLOS
0 Exemplo 1 - Construção da cepa MG1655 metA*ll AmetJ
Ptrc-mefcH Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH
ApykA ApykF PtrcO9-gcvTHP ApurU AyncA: :Km (pMElOl-thrA*lcysE-PgapA-me fcA* 11) (pCCIBAC- serB- serA- serC)
Para deletar o aciltranferase gene yncA putativa em uma cepa produtora de metionina, os requerentes usaram a cepa BW25113 EyncA de Escherichia coli:: Km da coleção do mutante Keio (Baba et al., 2006). A deleção de AyncA::Km foi transferida por transdução do fago PI (ver abaixo) a partir da cepa BW25113 AyncA::Km para a cepa MG1655 metA*ll
AmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH PtrcO9-gcvTHP ApykA ApykF ApurU (descrita em
PCT/EP2007/060433). Transformantes resistentes a canamicina foram selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise PCR com os oligonucleotídeos
YncAF e YncAR definidos abaixo (sequência de referência no site da web http: // ecogene. org /) . A cepa retida foi designada MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP ApykA ApykF
ApurU AyncA::Km.
YncAF: GTTTGCCGATTTGCCCCACCG (homólogos à região yncA de 1517564 a 1517544) (SEQ ID NO 01)
YncAR: CGCCCATCACGGTCGCAAGC (homólogo à região yncA de
1515827 a 1515846) (SEQ ID NO 02)
Então, os plasmideos pMElOl-thrA*l-cysF-PgapA-metA^ll and pCCIBAC-serB-serA-serC foram introduzidos na cepa
MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcFcysPUWAM PtrcF-cys JIH PtrcO 9-gcvTHP ApykA ApykF ApurJ
AyncA::Km, dando origem a MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH
Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP ApyAA ApykF ApurU AyncA::Km (pME101-thrA*l-cysEPgapA-metA*ll) (pCCIBAC-serB-serA-serC).
Preparação do lisado de fago PI:
- Inoculação de 10 ml de LB suplementado com canamicina (50 μς/πιΐ), glicose (0,2%) e CaCl3 (5 mM) com
100 μΣ de cultura durante a noite da cepa BW25113
AyncA::Km. Incubação durante 30 min a 37°C com agitação
- Adição de 100 μΕ de lisado de fago PI preparado na cepa BW25113 AyncA::Km (cerca de 1.109 fago/ml)
- Agitação a 37°C durante 3 horas até todas as células estarem lisadas
- Adição de 200 μΐ, de clorofórmio e vórtice
- Centrifugação durante 10 min a 4500 g para eliminar resíduos de células
- Transferência do sobrenadante para um tubo estéril e adição de 200 μ! de clorofórmio
- Armazenamento do lisado a 4°C
Transdução:
- Centrifugação durante 10 min a 1500 g de 5 ml de cultura durante a noite da cepa MG1655 metA*ll AmetJ PtrcmetH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH
PtrcO9-gcvTHP ApyAA ApykF ApurFS em meio LB
- Suspensão da pelota de células em 2,5 ml 10 mM de
MgSO4, 5 mM de CaCl2
- Tubos de controle:
100 pL de células
100 pL de fagos PI da cepa BW25113 AyncA::Km
- Tubos de teste: 100 pL de células + 100 pL de fagos
PI da cepa BW25113 AyncA::Km
- Incubação durante 30 min a 30°C sem agitação
- Adição de 100 pL 1M citrato de sódio a cada tubo e vórtice
- Adição de 1 ml de LB
- Incubação durante 1 hora a 37°C com agitação
Espalhar em pratos petri de LB suplementado com canamicina (50 pg/ml) (após centrifugação dos tubos durante
3 min a 7000 rpm
- Incubação a 37°C durante a noite
Verificação da cepa:
Os transformantes resistentes a canamicina foram selecionados e a presença da modificação de AyncA::Rm foi verificada por análise PCR com os oligonucleotídeos YncAF e
YncAR definidos acima.
Construção da cepa MG1655 metA*ll AmefcJ Ptrc-metH
Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cys PUWAM PtrcF-cysJIH SpykA.
ApyJcF PtrcO9-gcvTHP ApurU AyzicA: :Km AargA: :Cm
Para inativar o gene argA aminoácido acetiltransferase, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência a cloranfenicol, enquanto deletando a maior parte dos genes de interesse. Para este fim, dois oligonucleotídeos, DargAF e DargAR, foram usados (sequência de referência no site da web http://ecogene.org/) :
DargAF (SEQ ID NO: 03) gtggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgccattcggttccc tatatcaatacccaccggggaaaaacgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com
- uma região (caixa inferior) homólogo à região argA de 2947264 a 2947344, uma região (caixa superior) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS,
97: 6640-6645)
DargAR (SEQ ID NO: 04) ccctaaatccgccatcaacactttggatttacgctggtagttgtacaactgctt tttgctctcgggcagtaaatcaatatccCATATGAATATCCTCCTTAG com
- uma região (caixa inferior) homóloga à região argA de 2848592 a 2948511, uma região (caixa superior) para a ampliação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS,
97: 6640-6645).
Os oligonucleotídeos DargAF e DargAR foram usados para ampliar o cassete de resistência a cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto PCR obtido foi introduzido por eletroporação na cepa MG1655 MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH
Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP ApykA ApykF ApurU AyncA::Km (pKD46) em que a enzima
Red recombinase expressa permitiu a recombinação homóloga.
Os transformantes resistentes a cloranfenicol foram selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise PCR com os oligonucleotídeos ArgAF e
ArgAR definidos abaixo (sequência de referência no site de web http://ecogene.org/). A cepa retida foi designada
MG1655 MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmstl7-metF
PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP ApykA ApykF ApurU
AyncA::Km AargA::Cm.
ArgAF: cagctgacgatttgattcc (homóloga à região argA de
2946859 a 2946877) (SEQ ID NO 05)
ArgAR: gggttgtttaatggcgatatcgg (homóloga à região argA de 2949010 a 2948988) (SEQ ID NO 06)
Construção da cepa MG1655 znetA*ll AmetJ Ptrc-metH
Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykA
ApykF PtrcO9-gcvTHP ApurU AyncA AargA
Para eliminar os cassetes de resistência a cloranfenicol e a canamicina, o plasmideo pCP20, transportando recombinase FLP agindo nos sítios FRT dos cassetes de resistência a cloranfenicol e a canamicina, é introduzido na cepa recombinante MG1655 metA*ll AmetJ PtrcmetH Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH
PtrcO9-gcvTHP ApykA ApykF ApurU AyncA::Km AargA::Cm por eletroporação. Após uma série de culturas a 42°C, a perda dos cassetes de resistência a cloranfenicol e canamicina é verificada por análise PCR com os oligonucleotídeos descritos acima, YncAF / YncAR e ArgAF / ArgAR. A cepa retida é designada MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykA ApykF
PtrcO9-gcvTHP ApurU AyncA AargA.
Construção da cepa MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH
Ptrc36-ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykA
ApykF PtrcO9-gcvTHP ApurU AyncA AargA (pMElOl-thrA*l-cysEPgapA-metA* 11) (pCCIBAC-serB-serA-serC)
Os plasmídeos pMElOl-thrA*l-cysE-PgapA-metA*ll and pCCIBAC-serB-serA-serC são introduzidos na cepa MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM
PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP ApykA EpykF EpurF EyncA AargA dando origem a MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH PtrcO9-gcvTHP
FpykA EpykF ApurU AyncA AargA (pMElOl-thrA*l-cysF-FgapA5 metA*ll) (pCCIBAC-serB-serA-serC) .
Construção de genes sintéticos expressando atividade de aminoácido acilase
Para transformar NAM em metionina, NAM acilases (aminoácido acilases) foram expressas no microorganismo de produção de metionina.
Para este fim, genes sintéticos dos genes de porco e
Aspergillus acyl aminoácido acilase foram preparados pela empresa Codon Devices (www.codondevices.com/). 0 uso do códon e do teor de GC dos genes foi adaptado a E. coli de acordo com a matriz do fornecedor. Todas as sequências com o uso de códon otimizado são mostradas abaixo. A expressão dos genes sintéticos foi conduzida pelos promotores Ptrc controlados pelas sequências operadoras. Os terminadores transcricionais foram adicionados a jusante dos genes. As construções foram clonadas nos vetores pUC19 e verificadas por sequenciamento, antes de transformar as mesmas nas cepas produtoras de metionina.
Aspergillus acyl aminoacilase
Sequência de promotor e operador
Gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcgga taacaatttcatgacacaggaaacagacc (SEQ ID NO 07)
Aspergillus acyl aminoacilase sequência (XP_001827519.1) (SEQ ID NO 8)
Mttstvvsllsslmqtqstseheqelahflddhltnlgytverlpiaegstren vyaylgtqrktrvcltshldtvppyiplriegstiygrgacddkgpmaaqicaleelra egavkegdvgllfvvgeekggpgmiaanhqdlsfegvifgeptegklwghkghlvfel igegkachsgypqhgvnanfalietlsdfvqtefpsssllgpstfnvgkieggvsyniv petska1cavrvatdmagikkivsdtvarhsnvrlefkfeypetlldhdvegsfnvrsc cymnrsilvahgdneqieidelmegvraykkltmhalnsar (SEQ ID NO 9) atgaccacgtcgactgtcgtttctctgctgagttcactgatgcagacacaatcc acctcggaacacgagcaggaactggcgcactttctggatgaccatctgacaaacctggg atatactgtcgagcgtctgccgattgcagaagggtccactcgcgagaacgtctacgcat atctggggacccaacgtaaaacgcgtgtatgtctgacctctcacctggatactgttccg ccgtacatcccgctgcgtattgagggcagtacaatctatggtcgcggggcttgtgacga taagggcccgatggctgcacagatctgcgctctggaagagctgcgtgctgaaggtgcgg tcaaagaaggcgacgtaggtctgctgttcgtcgttggggaggaaaaaggcggtccgggc atgatcgcagcgaaccaccaggatctgtcttttgaaggggttatttttggggaaccgac ggaaggcaagctggtagtaggtcacaaagggcacctggtttttgagctgatcggtgagg gaaaggcttgtcactccggctacccgcaacacggtgtgaacgcgaatttcgccctgatt gagacactgtcggattttgtccagacggagtttcctagctctagtctgctggggccgtc aacatttaacgttggcaagatcgaaggtggcgtatcctataatattgtgccggaaacgt cgaaagccctgtgtgcagtgcgcgttgcgacggacatggccggtatcaaaaagattgtg agcgataccgtagcacgtcactctaacgtccgcctggagttcaagtttgaatatccaga gacactgctggaccatgatgttgaagggagttttaatgtgcgttcctgctgttatatga accgctccatcctggttgcccacggagacaatgagcaaattgaaatcgatgaactgatg gagggagtacgcgcctataaaaagctgacaatgcacgccctgaactcagcccgctaa
Sequência de terminador transcricional: (ref.:
Harrington K.J., Laughlin R.B. e Liang S. Proc Natl Acad
Sei USA. 24 de abril de 2001; 98(9):5019-24.)
Tcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc (SEQ ID NO 10)
Porco acyl aminoacilase
Sequência de promotor e operador
Gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcgga taacaatttcatgacacaggaaacagaac (SEQ ID NO 11)
Pig acyl aminoacilase sequência (NP_999061.1) (SEQ ID
NO 12)
Maskgregehpsvtlfrqylrirtvqpepdygaavafleerarqlglgcqkvev vpghvvtvltwpgtnptlssillnshtdvvpvfkehwshdpfegfkdadgyiygrgaqd mkcvsiqyleavrrlkveghhfprtihmtfvpdeevgghqgmelfvkrpefqalragfa ldeglasptdaftvfyserspwwlrvtstgkpghgsrfiedtaaeklhkvinsilafre kekqrlqsnqlkpgavtsvnltmleggvaynvvpatmsacfdfrvapdvdlkafeeqlq
0 swcqaagegvtf efvqkwmetqvt stddsdpwwaaf sgvf kdmklaleleicpastdar yiraagvpalgfspmnhtpvllhdhderlheavflrgvdiytqllsalasvpalpses (SEQ ID NO 13) atggcgagcaaaggccgtgaaggtgagcatccgtctgtgaccctgtttcgccag tatctgcgtattcgcacggttcagcctgaaccggattacggagcagctgtggctttcct ggaggaacgcgctcgtcagctgggtctgggttgccaaaaggtagaagttgtcccagggc acgtcgtaactgtactgacttggcctggaacgaatccgaccctgagttcaatcctgctg aactcccatacagatgtagtgccagtgttcaaggaacattggagtcacgaccctttcga agggtttaaagatgccgatggctatatttacggtcgtggggcacaggacatgaagtgtg tatccattcaatatctggaagctgttcgccgtctgaaagttgaagggcaccactttcca cgcactattcacatgactttcgtgcctgacgaggaagtcgggggtcaccaaggtatgga actgttcgtaaaacgccctgagtttcaggcactgcgtgcgggttttgctctggacgagg gtctggcgagcccgacagacgcgtttaccgtgttttacagtgaacgttcgccttggtgg ctgcgcgttacttccacaggtaagccggggcacggctcgcgtttcatcgaggatacagc cgctgaaaagctgcacaaagttattaatagcatcctggcctttcgcgagaaggaaaagc aacgtctgcagagcaaccagctgaaaccgggtgcggtcactagcgtgaatctgactatg ctggaggggggtgtcgcctataacgttgtgccggcaactatgagcgcatgcttcgactt tcgcgtagctccggatgttgacctgaaagccttcgaagaacaactgcagagctggtgtc aagcagcgggagaaggtgtaacctttgagttcgtccagaaatggatggaaacacaggtt acctcgactgatgatagcgatccttggtgggcagccttttctggtgtgttcaaagatat gaagctggcgctggaactggaaatctgcccagcgagtacagacgctcgttacatccgcg ccgcaggcgtaccagccctgggtttttcaccgatgaatcacacgccggtcctgctgcat gatcacgatgagcgcctgcatgaggcagttttcctgcgcggcgtcgacatttataccca actgctgagtgcactggcttctgttcctgcgctgccatcggaatca
Sequência de terminador transcricional: (ref.:
Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad
Sei USA. 24 de abril de 2001; 98(9):5019-24.)
Tcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc (SEQ ID NO 10)
Exemplo 2: Produção de metionina sob condições de fermentação
As cepas que produziram quantidades substanciais de metabólitos de interesse foram testadas sob condições de produção em fermentadores de 2,5 1 (Pierre Guerin) usando uma estratégia de batelada alimentada com privação de fosfato.
Para interromper o crescimento em uma concentração celular de' 30 g.L'1, fosfato foi adicionado a 28,7 mM ao meio mineral Blb. 0 meio de batelada alimentada F1 era livre de fosfato. Resumidamente, uma cultura de 8 horas crescendo em 10 ml de meio LB com 2m5 g.L-1 de glicose foi usada para inocular uma pré-cultura de 24 horas em meio mínimo Bla. Estas culturas crescerem em frascos defletidos contendo 50 ml de meio mínimo (Bla) em um agitador giratório (200 RPM) a 37°C.
TABELA 1: Composições de meio mineral em batelada de cultura (Bla e Blb)
| Composto | Concentração (g.L-1) Bla | Concentração (g.L-1) Blb |
| Zn(CH3COO)2· 2H2O | 0,0130 | 0,0130 |
| CuCl2. 2H2O | 0,0015 | 0,0015 |
| MnCl2. 4H2O | 0,0150 | 0,0150 |
| Composto | Concentração (g.L-1) Bla | Concentração (g.L'1) Blb |
| CoCl2.6H2O | 0,0025 | 0,0025 |
| H3BO3 | 0,0030 | 0,0030 |
| Na2Mo04.2H2O | 0,0025 | 0,0025 |
| MgSO4.7H2O | 1,00 | 1,00 |
| CaCl2.2H2O | 0,08 | 0,08 |
| Ácido cítrico | 1,70 | 1,70 |
| KH2PO4 | 2,50 | 2,50 |
| K2HPO4. 3H2O | 1,38 | 1,38 |
| (NH4) 2hpo4 | 0,6040 | 0,6040 |
| Citrato de Fe(III) H2O | 0,11 | 0,11 |
| (NH4)2S2O3 | 3,70 | 3,70 |
| EDTA | 0,0080 | 0,0080 |
| Tiamina | 0,01 | 0,01 |
| Glicose | 15,00 | 20, 00 |
| Vitamina B12 | 0,01 | 0,01 |
| NaOH 8 N | Ajustado em pH 6,8 | Ajustado em pH 6, 8 |
| IPTG | 0,0024 | 0,0024 |
| MOPS | 5,00 | 0, 00 |
TABELA 2: Composição de meio de batelada cultura (Fl).
alimentada na
| Composto | Concentração (g.L-1) |
| Zn (CH3COO) 2, 2H2O | 0,0104 |
| CuC12, 2H2O | 0,0012 |
| MnCl2, 4H2O | 0,0120 |
| CoC12.6H2O | 0,0020 |
| H3BO3 | 0,0024 |
| Na2Mo04.2H20 | 0,0020 |
| Citrato de Fe(III) H2O | 0,0524 |
| MgSO4 | 5, 00 |
| (NH4)2S2O3 | 44, 10 |
| EDTA | 0,0067 |
| Tiamina | 0,01 |
| Glicose | 500,00 |
| Vitamina B12 | 0,01 |
| IPTG | 0,0190 |
Guerin) foram preenchidos com 600 ml de meio mínimo (Blb) e
Subsequentemente, os fermentadores de
2,5 L (Pierre foram inoculados em uma concentração de biomassa de 0,1 g.L-1 com um volume de pré-cultura na faixa de 25 a 45 ml.
A temperatura da cultura foi mantida constante a 37°C e o pH foi mantido no valor de trabalho (6,8) pela adição automática de soluções de NH4OH (NH4OH a 10% durante 10 horas e 24% até o final da cultura) . A taxa de agitação inicial foi fixada em 200 rpm durante a fase de batelada e foi aumentada até 1200 rpm durante a fase de batelada alimentada. A taxa de fluxo de ar inicial foi fixada em 40
NL.h durante a fase de batelada e foi aumentada a 100
NL.h-1 no início da fase de batelada alimentada. A concentração de oxigênio dissolvida foi mantida em valores entre 20 e 40%, de preferência 30% de saturação aumentando a agitação.
Quando a massa celular alcançou uma concentração próxima a 5 g.L-1, a batelada alimentada foi privada com uma taxa de fluxo inicial de 5 ml.h1. A solução de alimentação foi injetada com um perfil sigmóide com uma taxa de fluxo crescente que alcançou 21 ml.h-1 após 21 horas. As condições de alimentação exata foram calculadas pela equação:
p2
Ç(tj = pl+- ρ~· onde Q(t) é a taxa de fluxo de alimentação em ml.h-1 para um volume de batelada de 600 ml com pl=l,15, p2=18,32, p3=0,270, p4=5.
Após a batelada alimentada de 21 horas, a concentração celular alcançou 30 g.L-1, o fosfato foi esgotado do meio e as células entraram na privação de fosfato. Nesse ponto, injeção de solução de alimentação foi aumentada em um valor constante de 37 ml. h-1 durante 4 horas. Então, a taxa de fluxo constante foi diminuída para 10 ml-h-1 e este valor de fluxo foi mantido até o término da batelada alimentada (50 horas).
TABELA 3: Rendimento máximo de metionina/glicose (Ymet) ί rendimento de metionina + N-acil-metionina + Npropionil-metionina/glicose (Ymet + nam) , rendimento de Nacetil-metionina /glicose e rendimento de N-propionil15 metionina/glicose (N-acetil-metionina e N-propionilmetionina foram contados como metionina, % g/g ver abaixo) obtida em fermentações de batelada alimentada das cepas descritas acima. Para a definição exata dos rendimentos ver abaixo. Os valores médios de três ciclos de fermentação são
0 mostrados para a cepa de referência 1 DyncA. Strainl corresponde a MG1655 metA*ll AmetJ Ptrc-metH Ptrc36ARNmstl7-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykA ApykF
PtrcO9-gcvTHP ApurU (pME101-thrA*l-cysE-PgapA-metA*ll) (pCCIBAC-serB-serA-serC).
| Cepa | Ymet (%g· | g1) | ^met + NAM (%g.g_1) | Y N-acetil- metionina (%g. g_1) | Y N-propionil metionina (%g. g’1) |
| Cepa de referência (cepa 1) | 16, 97 1,00 | ± | 20, 03 ± 0,83 | 2, 65 ± 0,17 | 0,41 ± 0,13 |
| Cepa 1 | 18,33 | ± | 18,62 ± | 0,27 ± | 0,02 ± |
| DyncA | 1,37 | 1,24 | 0,15 | 0,01 |
Determinação do rendimento de metionina/glicose (Ymet)
A concentração de metionina extracelular foi quantificada por HPLC após derivatização de OPA/FMOC. A Nacetil-metionina e as concentrações de glicose residuais foram analisadas usando HPLC com detecção refratométrica. A concentração de N-propionil metionina foi determinada por
GC-MS após sililação, ela foi expressa como equivalente de
N-acetil-metionina.
volume do fermentador foi calculado adicionando ao volume inicial a quantidade de soluções adicionadas para regular o pH e para alimentar a cultura e subtraindo o volume usado para amostragem e perdido por evaporação.
volume de batelada alimentada foi seguido continuamente pesando o estoque de alimentação. A quantidade de glicose injetada foi então calculada na base do peso injetado, a densidade da solução e a concentração de glicose controlada pelo método de Brix ([Glicose]). O rendimento de metionina foi expresso como a seguir:
Metioninat * — Metioninaa * Mg
100
V7 = 1 met
G lico se consumida.t Com Metionina0 e Metioninat, respectivamente as concentrações inicia e de metionina no tempo (t) e Vo e Vt os volumes iniciais e instante t.
A YN-acetii-metionina foi calculada como a seguir:
N — acetil metioninat * Mt
100* 0,1492,
F,v_,
Qcetii—e-ntfj-Q
Glicose consumidat
Com N-acetil-metioninat, a concentração em mmol por litro no instante t.
A YN-propioníi metionina foi calculada coiuo a seguir.
N — propion.il meticminat * Mt * 100 ’· 0,1492, σ t?c cm l i — mee t cm l na
Glicose consumidat Com N-propionil metionina, a concentração em mmol por litro no instante t.
A YMet+N-acetil-metionina + N-propionil-metionina (YmeT+NAm) foi calculada como a seguir:
_ ;·Γ;Γ1ΟΠίΠ£^Κί·>·ιν-2Γ*η'ί-Ι«Κ'Μ!1«!1-Γ[»ί.14?Σ4·ΑΓ-!ίΓΡρ{ΐ!·ηΐί-ΐη£η·οη-I Q Q “ gílío^s ronsumídcj
Com metioninat, a concentração de metionina em g por litro, N-acetil-metioninat e N-propionil-metioninat, as respectivas concentrações em mmol por litro no instante t.
A glicose consumida foi calculada como a seguir:
p eso aàTnentadoQ — p eso alimentado, volume alimentado. = — --— -----:—L densidade da solução alimentada
Glicose injetadat = volume alimentadot ★ [Glicose]
Glicose consumidat = [Glicose]o * Vo + Glicose
Injetada-[Glicose] residuai * Vt
Com [Glicose] o, [Glicose], [Glicose] residual, respectivamente a inicial, as concentrações de glicose alimentada e residual.
Exemplo 3: Adaptar as condições de cultura adicionando aminoácido acilase ao meio de fermentação
Para transformar N-acetil-metionina em metionina e acetato, 160 U de N-aminoácido acilase (rim de porco,
Sigma) foram adicionados a 200 μΐ de caldo de fermentação após o ciclo de fermentação da cepa 1 (realizado como descrito acima). A mistura da reação foi incubada a 37°C durante 2 horas. Subsequentemente, as concentrações metionina e N-acetil-metionina foram determinadas como descrito acima. 75-95% de N-acetil-metionina foram transformados em metionina por este tratamento enzimático.
REFERÊNCIAS
NÃO PATENTÁRIAS
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Claims (9)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para a produção de metionina ou seus precursores em um processo fermentativo caracterizado pelo fato de compreender reduzir o acúmulo de N-acil metionina pelas seguintes etapas:i. cultivar uma Escherichia coli modificada em um meio de cultura compreendendo:- uma fonte de carbono selecionada dentre glicose e sacarose;uma fonte de enxofre selecionada dentre sulfato, tiossulfato, ditionato, ditionito, sulfeto de hidrogênio, sulfito, metilmercaptano, sulfeto de dimetila ou uma combinação das diferentes fontes; e uma fonte de nitrogênio selecionada dentre amônio e amoníaco; e ii. recuperar a metionina e/ou seus derivados a partir do meio de cultura, em que a Escherichia coli é modificada por:Atenuação da expressão de pelo menos um dos seguintes genes yncA, argA, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ que codificam uma enzima metionina transacilase, e/ouExpressão de pelo menos uma amino acilase específica de metionina; e/ouPetição 870180040403, de 15/05/2018, pág. 20/23
- 2/4Adição de N-acil aminoácido acilase ao meio.2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a N-acil metionina, cujo acúmulo é reduzido, é escolhida dentre o seguinte grupo: Nacetil-metionina, N-propionil-metionina, N-butirilmetionina e combinações dos mesmos.
- 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima metionina transacilase, cuja expressão é atenuada, é codificada pelo gene yncA.
- 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção de N-acilmetionina é reduzida pela expressão de pelo menos uma enzima N-acil-L-aminoácido amido-hidrolase nativa ou heteróloga no microorganismo, escolhida dentre as seguintes:a. N-acil aminoácido acilase de Aspergillusb. N-acil aminoácido acilase de porcoc. acetilornitina desacetilase codificada pelo gene argE.
- 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção de N-acilmetionina é reduzida:a) atenuando a expressão de pelo menos um dos genesPetição 870180040403, de 15/05/2018, pág. 21/233/4 yncA, argA, yjdJ, yfaP, yedL e yjhQ codificando as enzimas metionina N-aciltransferase, eb) expressando pelo menos uma enzima N-acilmetionina desacilase, tal como:a. N-acil aminoácido acilase de Aspergillus,b. N-acil aminoácido acilase de porco, ec. acilornitina desacilase codificada pelo gene argE.
- 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção de N-acilmetionina é reduzida atenuando a expressão de pelo menos um dos genes yncA, argA, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ codificando as enzimas metionina N-aciltransferase e adicionando uma aminoácido acilase ao meio.
- 7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção de N-acilmetionina é reduzida expressando pelo menos uma enzima Nacil-metionina acilase nativa ou heteróloga, tal como:a. N-acil aminoácido acilase de Aspergillus,b. Porco N-acil aminoácido acilase de porco,c. acilornitina desacetilase codificada pelo gene argE, ed. adicionando uma aminoácido acilase ao meio.
- 8. Método, de acordo com a reivindicação 1,Petição 870180040403, de 15/05/2018, pág. 22/234/4 caracterizado pelo fato de que a produção de N-acilmetionina é reduzida:atenuando a expressão de pelo menos um dos seguintes genes yncA, argA, yiiD, yhhY, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ codificando as enzimas metionina N-aciltransferase, e expressando pelo menos uma enzima N-acil aminoácido acilase nativa ou heteróloga, tal como:a. N-acil aminoácido acilase de Aspergillus,b. N-acil aminoácido acilase de porco, ec. acilornitina desacetilase codificada pelo gene argE; e adicionando uma aminoácido acilase ao meio.
- 9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de enxofre no meio de cultura é sulfato ou tiossulfato, ou uma mistura dos dois.Petição 870180040403, de 15/05/2018, pág. 23/23
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