ES2627792T3 - O-acetilhomoserina sulfhidrilasa novedosa o variante de la misma y procedimiento para transformar la metionina usando la misma - Google Patents
O-acetilhomoserina sulfhidrilasa novedosa o variante de la misma y procedimiento para transformar la metionina usando la misma Download PDFInfo
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Abstract
Uso de una proteína representada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 para producir Lmetionina, que funciona como O-acetilhomoserina sulfhidrasa.
Description
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homogenados celulares, se observó que MetZ-rsp mostraba un nivel de expresión aproximadamente 4 veces mayor que MetZ-hne (figura 3).
Para determinar la especificidad de sustrato de dos enzimas, la O-acilhomoserina se disolvió en tampón fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,5) hasta una concentración final de 3 mM. Además, se añadió 5'-fosfato de piridoxal (Sigma, EE. UU.), que se utiliza como cofactor, a la mezcla de reacción hasta una concentración final de 10 μM. Se añadió otro sustrato, metilmercaptano (Japan Tokyo Chemical Industry Ltd.), a la mezcla de reacción hasta una concentración final de 2 mM. El 1 ml de la mezcla de reacción se puso a 37 ºC, y luego se añadieron 10 μl de cada extracto enzimático para hacer una concentración final de proteína de 5 mg/ml. El progreso de la reacción se confirmó midiendo la absorbancia a 415 nm recogiendo 100 µl de la mezcla de reacción tras iniciar la reacción y añadiéndola a 900 µl de solución de DTNB (ácido 5,5-ditiobis(2-nitro-benzoico) Sigma, EE. UU.) a 4 mg/ml.
El DTNB reacciona con el grupo -SH del metilmercaptano que permanece en la mezcla de reacción y sintetiza una sustancia amarilla. Por lo tanto, el progreso de la reacción puede controlarse observando la desaparición del color amarillo en la mezcla de reacción a medida que el metilmercaptano de la mezcla de reacción se convierte en metionina. Además, si la diferencia en la absorbancia de DTNB antes y después de la reacción (ΔDO415) es alta, sugiere que la actividad de la enzima es fuerte.
Como resultado de la reacción de la mezcla de reacción de O-acilhomoserina y solución enzimática, se observó que tanto la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa derivada de Hyphomonas neptunium como la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa derivada de Rhodobacter sphaeroides mostraban una especificidad de sustrato más alta hacia Oacetilhomoserina que hacia O-succinilhomoserina. La especificidad de sustrato de cada enzima se muestra simplemente como el número de "+" en la tabla 1. En general, se identificó que ambas cepas tienen mayor especificidad de sustrato hacia O-acetilhomoserina que hacia O-succinilhomoserina.
[Tabla 1]
- Cepa
- Nombre del gen Especificidad de sustrato
- O-succinilhomoserina (OSH)
- O-acetilhomoserina (OAH)
- Hyphomonas neptunium
- metZ + + + +
- Rhodobacter sphaeroides
- metZ + + + + + +
Ejemplo 3:Comparación de las reacciones de MetZ-hne y MetZ-rsp durante la fase temprana en un medio de O-acetilhomoserina a alta concentración
Para comparar las tasas de conversión de las enzimas MetZ-hne y MetZ-rsp en alta concentración de Oacetilhomoserina, se realizó un experimento de conversión de metionina a una concentración de O-acetilhomoserina de 80 g/l. Las tasas relativas de producción de metionina se compararon entre la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa derivada de Hyphomonas neptunium y la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa derivada de Rhodobacter sphaeroides a partir de la conversión enzimática de 80 g/l de O-acetilhomoserina en una escala de tubo de 1 ml en el tiempo. Las velocidades de reacción de la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa se pueden comparar midiendo la concentración de metionina producida a partir de la reacción. Más específicamente, la reacción de conversión enzimática se realizó a 33 ºC añadiendo 0,01 ml de metilmercaptano de sodio (15 %, p/v) que es otro sustrato requerido para producir metionina, 0,01 ml de O-acetilhomoserina sulfhidrilasa y el cofactor enzimático 5'-fosfato de piridoxal 0,1 mM a 1 ml de O-acetilhomoserina a 80 g/l, y agitando a 800 rpm. Cada uno de los extractos enzimáticos se añadió a una concentración de proteína final de 5 mg/ml. La concentración de metionina y O-acetilhomoserina se analizó por HPLC. La tasa de conversión de metionina se calculó como el número de moles de metionina producidos a partir de 1 mol de metilmercaptano añadido a la reacción.
Como se muestra en la tabla 2, la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa derivada de Rhodobacter sphaeroides mostró mayor tasa de reacción durante la fase temprana y una tasa de conversión más alta que la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa derivada de Hyphomonas neptunium incluso a alta concentración de O-acetilhomoserina.
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60, 120 y 240 minutos y después se comparó la actividad residual de las enzimas usando un procedimiento de DTNB del ejemplo 2.
Como se muestra en la tabla 5, la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa derivada de Rhodobacter sphaeroides mostró una actividad residual de un 95 % después de un tratamiento térmico de 240 minutos de duración a 45 ºC en comparación con su actividad antes del tratamiento térmico. Por otra parte, MetZ-hne mostró una actividad residual de un 75 %, lo que sugiere que MetZ-rsp tiene una estabilidad térmica superior.
[Tabla 5]
- Tratamiento térmico a 45 ºC
- Tiempo (minutos)
- 0
- 10 30 60 120 240
- Actividad relativa (%)
- MetZ-hne 100 98 95 91 84 75
- MetZ-rsp
- 100 100 100 99 97 95
Ejemplo 6: Conversión enzimática del medio de O-acetilhomoserina en L-metionina utilizando MetZ-rsp en un reactor discontinuo
En el presente ejemplo, para evaluar la actividad de conversión de la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa (metZ-rsp) identificada en una escala de tubo, ahora en un sistema de reactor, se utilizó un reactor discontinuo que tenía un volumen óptimo de 1 l. La O-acetilhomoserina, que es un sustrato requerido para la reacción de conversión enzimática, se produjo fermentando una cepa microbiana descrita en la técnica anterior, y las células se retiraron del caldo de fermentación cultivado usando una centrífuga. Se utilizaron los 500 ml de medio de cultivo a aproximadamente 70 g/l (documento WO2008/013432). Dado que el metilmercaptano existe en forma gaseosa a temperatura ambiente, el experimento se realizó usando una solución de metilmercaptano de sodio en forma líquida (CH3S-Na, 4,7 M, 33 %, Arkema Francia) que se generó añadiendo metilmercaptano a una solución de sosa cáustica. Se utilizaron aproximadamente 50 ml de metilmercaptano de sodio en la reacción de conversión enzimática. Como solución de enzimas, se añadieron a la reacción 50 ml de homogenado celular MetZ-rsp producido por el procedimiento del ejemplo 1 junto con 5'-fosfato de piridoxal 0,1 mM (Sigma, EE. UU.). La reacción de conversión enzimática se realizó a un pH de 7,0 y a 33 ºC con agitación a 700 rpm. La reacción se llevó a cabo durante 3 horas mientras se añadía metilmercaptano de sodio. Las concentraciones de O-acetilhomoserina y Lmetionina producidas a lo largo del tiempo se analizaron por HPLC y estos resultados se muestran en la tabla 6.
[Tabla 6]
- Tiempo (minutos)
- O-Acetilhomoserina L-metionina
- (g/l)
- (g/l)
- 0
- 66,1
- 0
- 30
- 20,6 34,1
- 90
- 9,5 42,0
- 120
- 3,1 47,2
- 180
- 0 49,5
En general, se observó que la reacción de conversión enzimática del medio de O-acetilhomoserina en L-metionina utilizando una solución de enzima MetZ-rsp en un reactor discontinuo de 1 l era rápida y mostró una alto tasa de conversión (tasa de conversión molar de un 97 %).
Ejemplo 7: Aumento de escala de la reacción de conversión enzimática del medio de O-acetilhomoserina en L-metionina utilizando MetZ-rsp en un reactor discontinuo
En el presente ejemplo, para evaluar el sistema de reacción de conversión enzimática aumentado de escala de metionina a través de la actividad de conversión de la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa (metZ-rsp) identificada en el reactor discontinuo de 1 l, se realizó la reacción de conversión de metionina usando un reactor discontinuo de 30 l (fermentador Korea, Corea). Se produjo O-acetilhomoserina, que es un sustrato requerido en la reacción de conversión enzimática, como en el ejemplo 6, fermentando las cepas microbianas divulgadas en la técnica anterior (documento WO2008/013432) y la cepa microbiana se retiró del caldo de fermentación cultivado usando una centrífuga. El sobrenadante se diluyó añadiendo agua para hacer que la concentración de O-acetilhomoserina fuera 66 g/l y se usó en la reacción.
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Después de que se pusieran 23 l de sobrenadante de fermentación diluido en el fermentador, se añadieron al mismo 500 ml de homogenado de enzima metZ-rsp generado por el procedimiento descrito en el ejemplo 1 y luego se añadió el cofactor 5'-fosfato de piridoxal (Sigma, EE. UU.) a una concentración final de 0,1 mM. Posteriormente, se ajustó el pH de la mezcla de reacción a 6,5 añadiendo gas amoníaco y la temperatura y agitación se establecieron a 37 ºC y a 300 rpm, respectivamente.
Se utilizó metilmercaptano (CH3SH, 99,5 %, R.U., Intergas) en forma gaseosa y se introdujo directamente en la mezcla de reacción mientras se controlaba la cantidad de gas añadida usando un controlador de flujo masivo. Dado que se evaporó algo de metilmercaptano en la mezcla de reacción y aumentó la presión dentro del reactor, se ajustó la velocidad de suministro de metilmercaptano para mantener la presión a menos de 0,5 bar. Se añadieron aproximadamente 220 l (470 g) de metilmercaptano a la reacción durante un total de 120 minutos mientras se controlaba la velocidad de suministro entre 3 y 5 l/min durante los primeros 30 minutos del período de reacción rápida y luego entre 1 y 2 l/min durante los restantes 90 minutos del periodo de reacción lenta. La cantidad total de metilmercaptano añadida es la misma cantidad molar que la O-acetilhomoserina presente en la mezcla de reacción durante la reacción de conversión enzimática, cuya totalidad se consumió durante la síntesis de metionina. Una vez completada la reacción, la cantidad residual de metilmercaptano era inferior a 0,1 g/l.
Dado que durante la reacción, cada vez que se produce 1 mol de metionina se produce 1 mol de ácido acético reduciendo el pH, el pH de la reacción se mantuvo a 6,5 añadiendo gas amoníaco para elevar el pH cada vez que bajaba a 6,48. La velocidad de reacción puede determinarse midiendo la pendiente de la disminución del pH, y la terminación de la reacción se puede determinar cuando la disminución del pH es lenta.
La reacción se llevó a cabo durante 6 horas mientras se añadía metilmercaptano a la reacción. Los cambios en las concentraciones de O-acetilhomoserina y L-metionina a lo largo del tiempo se analizaron por HPLC y los resultados se muestran en la figura 5.
El perfil de cambio del pH durante la reacción se muestra en la figura 4 y el gráfico de conversión de metionina por la reacción se muestra en la figura 5.
En general, se confirmó que incluso cuando se usaba metilmercaptano gaseoso en la reacción de conversión enzimática de un medio de O-acetilhomoserina en L-metionina usando una solución de enzima metZ-rsp en un reactor discontinuo de 30 l, podía obtenerse una conversión de metionina con una tasa de conversión molar de un 98 % durante 6 horas.
Ejemplo 8: Mejora de la actividad enzimática de metZ-rsp aplicando mutación
En el presente ejemplo, se realizó una PCR propensa a errores para inducir mutagénesis aleatoria en una metZ-rsp natural, y para este experimento se utilizó un kit de mutagénesis aleatoria por PCR diversificada (CLONTECH, EE. UU.). Para encontrar las condiciones óptimas para establecer una tasa de mutación diana, se realizó PCR propensa a errores en las siguientes dos condiciones a varias concentraciones de MnS04 y dGTP. El pCL-Pcji:metZ-rsp clonado en el ejemplo 1-2 se usó como plantilla de ADN en la que se deben introducir las mutaciones.
[Tabla 7]
- Condición 1 (µl)
- Condición 2 (µl)
- Tampón Titanium Taq 10x
- 5 5
- MnSO4 (8 mM)
- 2 4
- dGTP (2 mM)
- 1 2
- Mezcla de dNTP 50x
- 1 1
- Polimerasa Titanium Taq
- 1 1
- Cebador directo
- 2 2
- Cebador inverso
- 2 2
- ADN plantilla
- 1 1
- dH2O
- 35 32
- Total
- 50 50
- Condición de PCR propensa a errores
- 94 ºC: 30 segundos
- Condición de PCR propensa a errores
- 25 ciclos a 94 ºC: 30 segundos 55 ºC: 30 segundos 68 ºC: 60 segundos
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Los productos de la PCR propensa a errores llevada a cabo en las condiciones de la tabla 7 se escindieron con Ncol/HindIII, y se clonaron en el vector pCL-PCJ1que se digirió con las mismas enzimas. La biblioteca de mutantes clonados se transformó en células de Escherichia coli K12, que luego se cultivaron en una placa de medio LB que contenía 50 μg/l de pectinomicina. Después de cultivarlas, se seleccionaron 50 colonias y luego se realizó un análisis de secuenciación para determinar la tasa de mutación y comprobar la aparición de mutación en varias localizaciones. Los resultados del análisis de secuenciación demostraron que la tasa de mutación era de 2,4 kb-1 en la condición 1 y de 2,9 kb-1 en la condición 2. Basándose en estos resultados, se determinó que ambas condiciones 1 y 2 podían producir una tasa de mutación adecuada para generar una biblioteca de mutantes y, por tanto, se realizó un cribado de las mutaciones válidas usando las bibliotecas producidas en las condiciones anteriores.
Las células resultantes se cultivaron en una primera placa de 96 pocillos profundos y se trataron con solución BugBuster en una proporción de 1:1 (MERCK, EE. UU.) para obtener el homogenado celular. A continuación, se recogieron 50 µl del homogenado celular y se mezclaron con 50 μl de mezcla de reacción que comprendía Oacetilhomoserina 300 mM y sustrato de L-cisteína 1 mM. La mezcla de reacción resultante se hizo reaccionar durante 60 minutos a temperatura ambiente mientras se añadían 50 μl de solución de DTNB en los momentos indicados. Los valores de DO se midieron a 415 nm después de la formación de color y los resultados se muestran en la tabla 8.
[Tabla 8]
- Tiempo (minutos)
- 0 5 10 15 30 60
- DO415
- 2,17 1,19 0,65 0,50 0,37 0,30
- DO compensada
- 2,01 1,00 0,40 0,23 0,05 0,00
- Señal de fondo, 415 nm
- 0,16 0,19 0,25 0,27 0,32 0,30
En el diagrama del nivel de color de DTNB en el tiempo, los valores de DO de L-cisteína residual son de 1,19 y 0,65 a los 5 minutos y 10 minutos después de la reacción, respectivamente. En el cribado real, se seleccionaron los mutantes con un nivel de color de DTNB menor de 1,0 de la cisteína residual después de 5 minutos de reacción enzimática.
Los mutantes candidatos que mostraron un aumento significativo de actividad se seleccionaron utilizando el procedimiento de cribado anterior. Posteriormente, se realizó la alineación de la secuencia de nucleótidos para cribar la mutación válida en los mutantes candidatos. Finalmente, se seleccionaron los mutantes que comprendían 4 tipos de mutaciones tales como 13N (SEQ ID NO: 15), F65Y (SEQ ID NO: 16), V104A (SEQ ID NO: 17) y E182G. Finalmente se introdujeron las mutaciones seleccionadas como mutación candidata y, al introducir cada tipo de las mutaciones candidatas individualmente en un vector estándar pCL-PCJ1:metZ-rsp, se validó la actividad aumentada. Para generar los vectores en los que se introdujo con cada tipo de las mutaciones candidatas, se produjo el vector de expresión metZ-rsp en el que se introdujo cada mutación candidata usando los cebadores de las SEQ ID NO: 5 y 6 para la mutación 13N, los cebadores de las SEQ ID NO: 7 y 8 para la mutación F65Y, los cebadores de las SEQ ID NO: 9 y 10 para la mutación 104A y los cebadores de las SEQ ID NO: 11 y 12 para la mutación E182G. La introducción exitosa de la mutación se confirmó mediante análisis de secuenciación (Macrogen, Corea). El vector mutante generado se transformó en E. coli K12 y se cultivó en un matraz de medio LB a 33 ºC y 200 rpm durante 15 horas. A continuación, se analizaron las muestras cultivadas para validar cada mutación candidata. Los resultados se muestran en la tabla 9.
[Tabla 9]
- Mutación
- DO56 2 nm Actividad Unidad Actividad específica Unidad específica
- Natural
- 9,18 1,63 32,67 0,18 3,56
- I3N
- 8,93 1,89 37,73 0,21 4,22
- F65Y
- 8,83 2,00 39,93 0,23 4,52
- V104A
- 8,60 1,88 37,67 0,22 4,38
- E182G
- 9,53 1,43 28,60 0,15 3,00
La evaluación del matraz después de introducir cada mutación candidata demostró que 13N (SEQ ID NO: 15), F65Y (SEQ ID NO: 16) y V104A (SEQ ID NO: 17) son la mutación válida que muestra mayor actividad en comparación con
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