KR20120070411A

KR20120070411A - 신규 ｏ-아세틸호모세린 설피드릴라제 또는 변이체 및 이를 이용한 메치오닌 전환 방법

Info

Publication number: KR20120070411A
Application number: KR1020100131954A
Authority: KR
Inventors: 김소영; 신용욱; 서창일; 손성광; 허인경; 이한진; 김주은; 김현아; 배지연; 나광호
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2010-12-21
Publication date: 2012-06-29
Also published as: RU2013133636A; BR112013015992A2; EP2657249A2; EP2657249B1; DK2657249T3; US20130273614A1; EP2657249A4; PL2657249T3; BR112013015992B1; JP5907993B2; KR101250651B1; WO2012087038A3; ES2627792T3; US9080155B2; WO2012087038A2; RU2573928C2; CN103328498B; JP2014506129A; CN103328498A

Abstract

본 발명은 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 활성을 가지는 폴리펩티드, 이의 변이형 폴리펩티드, 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 재조합 균주 및 상기 재조합 균주를 이용하여 L-메치오닌 및 아세트산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생산방법은 기존의 방법보다 높은 전환율 및 반응시간 단축을 통하여 경제적으로 L-메치오닌 및 아세트산을 생산할 수 있는 이점이 있으며, 상기 변이형 폴리펩티드를 이용하는 경우 효소 파쇄액의 투입량을 최소화하여 L-메치오닌 및 아세트산을 고수율로 용이하게 생산할 수 있다.

Description

신규 Ｏ-아세틸호모세린 설피드릴라제 또는 변이체 및 이를 이용한 메치오닌 전환 방법{New O-acetylhomoserine sulfhydrylase or mutants, and L-methionine conversion method uging the enzyme}

본 발명은 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 활성을 가지는 폴리펩티드, 이의 변이형 폴리펩티드, 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 재조합 균주 및 상기 재조합 균주를 이용하여 L-메치오닌 및 아세트산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-메치오닌(methionine)은 생체내의 필수 아미노산의 한 종류로 대부분의 단백질 속에 함유되어 있으며, 조미료인 간장에는 유리상태로 함유되어 있다. 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되고 있으며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다. 메치오닌은 생체 내에서 메틸기 전이반응에 관여하는 중요한 아미노산으로, 먼저 AT와 반응하여 δ-아데노실메치오닌(δ-adenosylmethionine)이 되고, 이것이 각종 수용체에 메틸기를 준 다음, 호모시스테인(homocysteine) 및 시스타티오닌(cystathionine)을 거쳐 시스테인(cysteine)이 된다. 붉은빵 곰팡이는 시스테인에서 메치오닌을 합성한다. 간장이나 치즈 등 발효식품의 향기는 메치오닌에서 유도된 알데히드, 알코올, 및/또는 에스테르 등에 의한 것이 많다.

또한, 메치오닌은 콜린(choline)(레시틴, lecithin) 및 크레아틴과 같은 화합물의 전구체로 작용하고, 시스테인과 타우린의 합성원료로도 쓰이며, 황을 제공하는 역할을 한다. 또한, 메치오닌은 뇌의 다양한 신경전달물질(neurotransmitter) 합성에 관련되어 있다. 메치오닌 및/또는 S-아데노실-L-메치오닌(SAM)은 생체 내에서 간 및 동맥에서 지방축적을 억제하고, 우울, 염증, 간질환, 근육통을 완화하는 등의 다양한 역할을 한다. 또한 메치오닌 및/또는 S-아데노실-L-메치오닌은 지방대사를 촉진하는 간과 동맥에서 지방 침착을 억제하며, 뇌, 심장, 신장의 혈류를 증진시키고, 소화를 촉진시키며, 독성물질의 해독과 배설을 촉진, 납과 같은 중금속의 배설을 촉진시키는 역할을 한다. 메치오닌을 하루 매일 800-1,600 mg 투여시 뛰어난 항우울 효과, 간질환에서 간기능 향상 작용, 특히 알코올에 의한 간질환에 유용한 효과, 골 관절질환에 뛰어난 항염증 효과 및 관절회복의 촉진효과를 가지고 있음이 보고되었고, 또한 머리카락에 필수영양소로서 잘 부서지는 머리카락에 영양을 공급하고 탈모를 방지하는 효과 등의 생체 내 역할이 보고되어 있다.

메치오닌의 화학합성은 주로 5-(β-메틸머캅토에틸)하이단토인(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)을 가수분해시키는 반응을 통하여 L-메치오닌을 생산하는 방법을 이용한다. 그러나 이런 화학합성을 통하여 생산된 메치오닌은 L-형과 D-형이 혼합된 형태로 생산된다는 단점이 있다. 이에 생물학적 방법을 이용하여 L-메치오닌을 선택적으로 생산할 수 있는 기술에 대한 특허가 개시되어 있다(WO2008/013432). 이 방법은 간편하게 2단계 공법으로 명명하며, 발효에 의한 L-메치오닌 전구체 생산 공정 및 상기 L-메치오닌 전구체를 효소에 의하여 L-메치오닌으로 전환하는 공정으로 구성되어 있다. 상기의 L-메치오닌 전구체는 바람직하게 O-아세틸호모세린과 O-숙시닐 호모세린을 포함한다. 이러한 2단계 공법을 개발함으로써 기존에 문제가 되었던 황화물 특유의 기질 독성 문제, 메치오닌과 SAM에 의한 균주의 피드백 조절 문제, 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase), O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제(O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 특유의 중간 산물 분해 활성 문제를 모두 해결할 수 있었다. 또한 L-메치오닌만을 선택적으로 생산할 수 있어 DL-메치오닌을 동시에 생산하는 기존의 화학 합성 공정에 비하여 우수한 공정이며, 추가적으로 동일한 반응을 통하여 부산물로서 유기산, 보다 구체적으로는 숙신산, 아세트산을 동시에 생산할 수 있는 우수한 공정이다.

2단계 공정의 효소 전환 공정에서는 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase), O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제(O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)의 활성을 가진 효소를 이용하며, L-메치오닌의 전구체인 O-아세틸 호모세린 혹은 O-숙시닐 호모세린을 메칠머캅탄과 혼합하면서 효소 반응을 일으킴으로써 L-메치오닌과 유기산을 생산한다.

L-메치오닌의 전구체인 O-아세틸 호모세린(O-acetyl homoserine)으로부터 L-메치오닌을 생산하기 위한 효소 전환 반응에 다양한 미생물 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라제를 사용할 수 있다. 하지만 산업적인 전환효소로 사용하기 위해서는 몇 가지 특성을 만족해야 경제적 가치를 최대화할 수 있다. 첫째, 높은 활성, 높은 전환률 그리고 대장균에서 과발현이 가능한 특성을 가져야 한다. 일반적인 정제된 효소를 이용한 반응에서는 효소의 활성, 반응 속도, 기질에 대한 높은 친화도가 필요하지만 효소 파쇄액을 반응에 직접 투입하는 경우는 높은 활성을 가져야 하는 것은 물론이고 단위 세포당 효소의 과발현이 가능하여야 소량의 파쇄액 첨가로도 반응을 진행시킬 수 있다. 둘째, 고농도의 O-아세틸호모세린에서의 높은 반응 속도를 유지해야 하고, 최종산물인 L-메치오닌과 아세트산이 고농도로 축적되는 시점에서 활성 저해가 낮아야 한다. 마지막으로 1~5시간 동안 반응이 진행되는 동안 활성을 잃지 않기 위해서 열안정성을 지녀야 한다. 상기의 특성을 고려할 때 기공지된 하이포모나스 넵튜니움 유래 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제도 효소적 관점에서는 우수하지만 메치오닌 2단계 공법의 경제적 가치를 최대화하기 위해서는 상기 3가지 특성이 더욱 강화된 효소 탐색이 필요하였다.

이에 본 발명자들은 다양한 미생물 소스로부터 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 유전자를 획득하여 실험을 통해 최종적으로 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래 O-아세틸호모세린 설피드릴라제를 선별하여 전환반응에 이용한 결과 메치오닌 2단계 공법에 적용하기에 경제적으로 유용한 전환 효소임을 확인하였다. 뿐만 아니라 추가적인 변이도입 실험을 통해서 효소를 개량하여 경제성을 더욱 확고히 하였다.

본 발명의 목적은 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-Acetyl homoserine sulfhydrylase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성이 강화된 변이형 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 야생형 또는 변이형 폴리펩티드를 이용하여 O-아세틸호모세린 및 메칠머캅탄 전구체로부터 메치오닌 및 아세트산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-Acetylhomoserine sulfhydrylase)의 활성을 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다.

상기 폴리펩티드는 로드박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 폴리펩티드가 바람직하다.

본 발명에서 용어, “O-아세틸호모세린”은 161.16의 분자량을 갖으며, 미생물에서 볼 수 있는 메치오닌 생합성에서 최초의 특이적 중간체이고, 장내박테리아에서는 O-아세틸호모세린 대신에 O-숙시닐호모세린이, 고등식물에서는 O-포스포호모세린이 중간체가 되는 물질로, 트레오닌 생합성과의 분기점에서 L-호모세린과 아세틸CoA에서 호모세린아세틸전달효소에 의해 촉매되어 생성된다.

본 발명에서 용어, “폴리펩티드”는 아미노산의 중합체를 의미하며, 보통 소수의 아미노산이 연결된 형태를 펩티드라 부르고 많은 아미노산이 연결되면 단백질로 부른다. 단백질을 이루고 있는 약 20 종류의 아미노산들이 화학결합을 통해 서로 연결되어 폴리펩티드를 만든다. 본 발명에서는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제의 활성을 갖는 아미노산이 결합된 형태일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 13의 폴리펩티드일 수 있으며, 서열번호 15, 16, 17 및 18의 변이형 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명에서 용어, “전구체”는 L-메치오닌 전구체 생산 균주에 의해 생산되는 메치오닌 특화 대사 경로의 일부분인 대사물질 또는 이 대사물질에서 파생된 물질을 말한다. 특히 본 발명에서 L-메치오닌 전구체는 O-숙시닐호모세린 또는 O-아세틸호모세린을 의미한다.

본 발명에서 용어,“L-메치오닌 전구체 생산 균주”란 L-메치오닌 전구체를 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서, 본 발명에 따른 조작에 의해 L-메치오닌 전구체를 축적할 수 있는 균주를 말한다. 예를 들어, 균주는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 세라티아 속(Serratia sp.), 프로비덴시아 속(Providencia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteria sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 렙토스피라 속(Leptospira), 살모넬라 속(Salmonellar sp.), 브레비박테리아 속(Brevibacteria sp.), 하이포모나스 속(Hypomononas sp.), 크로모박테리움 속(Chromobacterium sp.) 및 노카디아 속(Norcardia) 또는 곰팡이류(fungi) 또는 효모류(yeast)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 에스케리치아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속의 미생물 균주와 효모이다. 더 바람직하게는, 에스케리치아 속의 미생물 균주이고, 가장 바람직하게는, 대장균(E.coli)이다.

공개특허 WO2008/013432에서 2단계 공법을 이용하여 L-메치오닌을 생산함에 있어 전구체인 O-아실호모세린(O-Acylhomoserine)은 O-숙시닐호모세린(O-Succinylhomoserine)과 O-아세틸호모세린(O-Acetylhomoserine) 두 가지가 있다. O-숙시닐호모세린을 이용하여 효소전환으로 메치오닌을 생성할 수 있는 효소는 시스타치오닌 감마 신타아제와 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제가 있다. 통상적으로 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase)를 암호화하는 유전자를 통칭 metB, O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제를 암호화하는 유전자를 통칭 metZ라고 표기한다. 이 효소가 가지는 활성은 다음 3가지이다.

L-시스테인 + O-숙시닐호모세린 => 숙신산 + 시스타치오닌

설파이드(HS^-) + O-숙시닐호모세린 => 숙신산+ 호모시스테인

메칠머캅탄 + O-숙시닐호모세린 => 숙신산 + L-메치오닌

상기의 또 다른 전구체인, O-아세틸호모세린을 이용하여 L-메치오닌을 생성할 수 있는 효소는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제가 있다. 통상적으로 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 암호화하는 유전자를 통칭 metY라고 표기한다. 이 효소가 가지는 활성은 다음 3가지이다.

L-시스테인 + O-아세틸호모세린 => 아세트산 + 시스타치오닌

설파이드(HS^-) + O-아세틸호모세린 => 아세트산 + 호모시스테인

메칠머캅탄 + O-아세틸호모세린 => 아세트산 + L-메치오닌

두 가지 L-메치오닌 전구체를 생산함에 있어 포도당, 원당과 같은 탄소 소스를 덜 필요로 하는 O-아세틸호모세린을 이용하여 L-메치오닌을 생산하는 것이 비용적인 면에서 유리하다. 하지만 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제인 metZ 효소는 산물인 L-메치오닌에 의해서 피드백저해를 받지 않는 반면 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제인 metY 효소는 산물인 L-메치오닌에 의한 활성저해 현상이 있어서 효소 반응적인 측면에서는 이용이 어렵다.

본 발명의 일 실시예에서는 다양한 metZ 유전자의 활성을 테스트하여 O-숙시닐호모세린 설피드릴라제로 추정되었지만 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 metZ 유전자를 선별하였고 L-메치오닌에 의한 피드백저해 현상 역시 없음을 확인하였다. 획득한 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 폴리펩티드는 서열 번호 13의 아미노산 서열일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 하이포모나스속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 및 로도박터속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 이용하여 기질특이성, 전환효소의 발현량 및 전환효소의 활성을 비교한 결과, 로도박터속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 변이체를 이용하여 L-메치오닌을 생산하는 경우, 높은 기질특이성을 보였고(표 1), 반응 초기 효소 활성, 효소 반응 속도 및 L-메치오닌 전환율이 향상된 것을 확인하였다(표 2). 또한, 상기 두 균주 유래의 재조합 변이체를 이용하여 반응산물에 의한 저해 정도를 비교한 결과, 로도박터속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 이용하여 L-메치오닌을 생산하는 경우 생성물에 의한 저해현상에도 높은 활성을 갖는 것을 확인하였다(표 3). 반응 온도에 따른 효소의 열 안정성을 비교한 결과에서도 로도박터속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 변이체가 하이포모나스속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 변이체보다 열안정성이 우수한 것을 확인할 수 있었다(표 4).

따라서 본 발명의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 폴리펩티드는 산업적인 전환효소로 사용하기 위한 높은 활성, 높은 전환률, 대장균에서의 과발현, 최종산물이 축적되는 시점에서 낮은 활성저해 및 열안정성 유지 요건을 모두 갖추었으므로 이를 이용하여 빠르고 높은 효율로 L-메치오닌 및 아세트산을 생산할 수 있다.

다른 양태로서 본 발명은 상기의 아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “폴리뉴클레오티드”란 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일반적으로 일정한 길이 이상의 DNA(deoxyribonucleic acid)나 RNA(ribonucleic acid) 가닥을 의미하며 본 발명에 있어서는 상기 기술된 변이를 포함한 폴리펩티드를 암호화한 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 단편은 공지된 아세틸호모세린 설피드릴라아제의 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 단편의 서열에 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 바람직하게는 서열번호 14로 개시된 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다.

본 발명에서 용어, “상동성”은 두 개의 폴리뉴클레오티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상응성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 또한, 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에서 용어. “상동”은 모든 문법적 형태나 스펠링 변이 형태는 슈퍼패밀리 유래 단백질(예, 면역글로불린 슈퍼패밀리) 및 다른 종 유래의 상동 단백질(예, 미오신 경쇄 등)을 포함하며, "공통 진화 기원"을 갖는 단백질 간의 관계를 말한다. 그러한 단백질(및 그들의 코딩 유전자)은 높은 정도의 서열 유사성에 의해 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 일반적 사용과 본 발명에서 "상동"은 "매우 높은"과 같은 형용상에 의해 수식될 경우에는 서열 유사성을 말하는 것이고 공통 진화 기원을 의미하는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "서열 유사성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 하지 않을 수 있는 단백질의 염기 서열이나 아미노산 서열 간의 동일성이나 상응성 정도를 말한다. 하나의 구체예에서, 두 개의 아미노산 서열이 아미노산 서열의 소정의 길이에 대해 폴리펩티드 매치가 적어도 21%(바람직하게 적어도 약 50%, 가장 바람직하게 약 75%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 99%)일 때, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동인 서열은 데이터 은행에서 사용되는 표준 소프트웨어를 사용하거나, 예를 들면 특정한 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이다(예. Sambrook et al., 1989, infra 참고).

또 다른 양태로서 본 발명은 또한 효소의 활성 및 전환율을 높이기 위해서 폴리펩티드에 추가적으로 변이를 도입한 폴리펩티드를 제시한다.

본 발명에서 용어, "변이" 또는 “변이체”는 유전적 또는 비유전적으로 하나의 안정적인 표현형적 변화를 나타내는 배양물이나 개체를 뜻하며, 바람직하게 본 발명에서는 로도박터 스페로이드 유래 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-Acetylhomoserine sulfhydrylase)의 유전자 하나 또는 그 이상이 변이되어 그 활성이 야생형과 비교하여 효율적으로 증가될 수 있는 변이체를 의미한다. 이러한 변이체의 서열은 야생형 서열에 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게 상기 폴리펩티드는 서열번호 13의 아미노산 서열로 표기되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 3번째 아미노산이 이소루신 이외의 다른 아미노산으로, 65번째 아미노산이 페닐알라닌 이외의 다른 아미노산으로, 104번째 아미노산이 발린 이외의 아미노산으로 바뀐 변이 또는 상기 3종의 아미노산 변이 중 1종 이상이 복합되어 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성이 강화된 변이체일 수 있다. 더욱 바람직하게는, N-말단으로부터 3번째 아미노산인 이소루신이 아스파라진으로, 65번째 아미노산인 페닐알라닌이 타이로신으로, 104번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 변이된 변이체일 수 있다. 상기 변이체의 아미노산 서열은 바람직하게 서열번호 15, 16, 17 및 18로 이루어진 그룹 중 선택된 변이형 폴리펩티드일 수 있다.

구체적으로, 서열번호 15의 아미노산으로 표기되는 변이형 폴리펩티드는 서열번호 13의 아미노산 서열로 표기되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 3번째 아미노산인 이소루신이 아스파라진으로 변이된 것이다.

서열번호 16의 아미노산으로 표기되는 변이형 폴리펩티드는 서열번호 13의 아미노산 서열로 표기되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 65번째 아미노산인 페닐알라닌이 타이로신으로 변이된 것이다.

서열번호 17의 아미노산으로 표기되는 변이형 폴리펩티드는 서열번호 13의 아미노산 서열로 표기되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 104번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 변이된 것이다.

또한 서열번호 18의 아미노산으로 표기되는 변이형 폴리펩티드는 서열번호 13의 아미노산 서열로 표기되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 3번째 아미노산인 이소루신이 아스파라진으로, 65번째 아미노산인 페닐알라닌이 타이로신으로, 104번째 아미노산인 발린이 알라닌으로 변이된 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기에서 확인한 결과를 토대로 로도박터속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 변이체의 효소활성이 개량된 I3N, F65Y, V104A 및 E182G의 4가지 변이주를 제작하였고, 상기 변이주의 활성을 측정하여 I3N, F65Y 및 V104A의 3가지 유효한 변이주를 선정하였다. 상기 유효 변이주 3종을 복합하여 이를 포함하는 벡터를 제작하고 대장균을 이용하여 형질전환한 후 각각의 활성을 측정한 결과, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 변이체 자체의 활성에 비해 1.75배 정도 증가된 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다(표 9).

또 다른 양태로서 본 발명은 상기의 변이형 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

상기의 폴리뉴클레오티는 바람직하게 서열번호 19, 20, 21 및 22로 이루어진 그룹 중 선택된 폴리뉴클레오티드로 개시할 수 있다. 서열번호 19, 20, 21 및 22로 표시되는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15, 16, 17 및 18로 표시되는 각 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다.

또 다른 양태로서 본 발명은 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 활성이 강화된 변이형 폴리뉴클레오티드가 작동하게 연결된 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “작동 가능하게 연결된”이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 용어, “벡터”는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다(예를 들면, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64) 참조. 용어 "벡터"는 또한 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL1920, pECCG117, pUC19, pBR322 및 pMW118 벡터 등을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 pCL1920 벡터에 CJ1 promoter(공개특허 KR20060068505)를 삽입한 pCL_P_CJ1 를 사용하였다.

또한, 상기 재조합 벡터는 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자, 가나마이신(kanamycin) 저항성 유전자 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyl transferase) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 발명에서 항생제 저항성 유전자는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 스펙티노마이신 저항 유전자일 수 있다.

또 다른 양태로서 본 발명은 상기의 폴리뉴클레오티드 자체를 함유하거나 재조합 벡터 형태로 형질전환된 미생물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어,“형질전환”은 유전자를 숙주세포 내에 도입 후 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 등이 있고, 이로 제한되지 않는다.

형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함한다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명에서 용어, “재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터로 형질감염된 세포를 말하며, 본 발명에 있어서, 상기의 재조합 벡터를 형질 전환하여 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제을 생산할 수 있는 야생형 또는 변이형 폴리펩티드를 포함한 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함된다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium)속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 바람직하게는 대장균을 들 수 있다.

또 다른 양태로서 본 발명은 상기의 미생물로부터 획득된 폴리펩티드 또는 이를 포함한 미생물을 첨가하여 O-아세틸호모세린 및 메칠머캅탄을 반응하여 메치오닌 및 아세트산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기의 O-아세틸호모세린은 정제된 형태 또는 O-아세틸호모세린을 함유한 미생물 발효액을 의미한다. 또한 상기의 메칠머캅탄은 액상의 소디움메칠머캅탄(sodium methyl mercaptan, CH3S-Na) 형태, 가스 또는 액화 상태의 메칠머캅탄(CH3SH) 뿐만 아니라 공개특허 WO2010/098629에 언급된 형태로 디메칠설파이드(DMS, Dimethylsulfide)를 포함한 메칠머캅탄 모두를 의미한다. L-메치오닌 전환반응은O-아세틸 호모세린 발효액에 상기의 폴리펩티드를 포함한 미생물의 파쇄액 5~10%(반응 부피대비)을 첨가하고 pH 6~8 조건에 15% Na-메칠머캅탄을 첨가하여 반응을 개시하고, 2 시간 경과 후 발효액을 회수하여 세포를 제거한 후 HPLC를 통하여 메치오닌 생성을 확인하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 변이체를 이용하여 메치오닌을 생산하는 경우, 기존의 생산 균주에 비해 효소 전환 반응 및 활성이 우수하며, 반응 산물에 의한 반응 저해 현상이 최소화되고, 변이체의 열안정성이 우수하므로 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 메칠머캅탄(CH3SH)을 기질로 하여 L-메치오닌 및 아세트산을 생산하는데 필수적인 로도박터스페로이드 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 제공하는바, 상기 폴리펩티드를 이용하면 기존의 하이포모나스 넵튜니움 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 이용한 방법보다 높은 전환율 및 반응시간 단축을 통하여 경제적으로 L-메치오닌 및 아세트산을 생산할 수 있는 이점이 있다. 또한, 본 발명의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 효소의 활성이 증가된 변이체를 이용하는 경우 효소파쇄액의 투입량을 최소화하여 L-메치오닌 및 아세트산을 고수율로 용이하게 생산할 수 있다.

도 1은 pCL-P_CJ1-MetZhne 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 2는 O-아세틸 호모세린 발효액에 상기의 폴리펩티드를 포함한 미생물의 파쇄액 5~10%(반응 부피대비)을 첨가하고 pH 6~8 조건에 15% Na-메칠머캅탄을 첨가하여 반응을 개시하고, 2시간 경과 후 발효액을 회수하여 세포를 제거한 후 HPLC를 통하여 메치오닌 생성을 나타내는 결과이다.
도 3은 하이포모나스속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(MetZ-hne)와 로도박터속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(MetZ-rsp)의 세포파쇄액 10ul, 5ul, 2.5ul에서 전환효소의 발현량을 비교한 결과를 나타내는 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 메치오닌 전환효소의 생산

1-1) 하이포모나스속 유래의 O- 아세틸호모세린 설피드릴라아제

메치오닌 전구체인 O-아세틸호모세린을 메치오닌으로 전환하는 하이포모나스 넵튜니움(Hyphomonas Neptunium) 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 유전자 서열은 KEGG website(www.kegg.com)로부터 획득하여 프라이머를 제작하였고, 하이포모나스 넵튜니움의 크로모좀은 ATCC (미국)으로부터 구매하여 사용하였다. 상기의 크로모좀을 주형으로 하고, 서열번호 1과 서열번호2의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 바이오니아 (한국) 사의 HL PCR premix kit를 이용하였다.

상기 PCR 반응으로 획득한 DNA 절편을 NcoI/HindIII로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-P_CJ1 벡터에 클로닝하였다. 최종 제작된 벡터를 pCL-P_CJ1-MetZhne이라 명명하였으며, 모식도는 도 1과 같았다. 클로닝된 벡터를 대장균(Escherichia coli) K12 세포에 형질전환시키고, 50 μg/L의 스펙티노마이신이 포함된 LB 평판배지에서 배양한 후 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 50 μg/L의 스펙티노마이신이 포함된 LB 배지 3ml에 접종하여 37℃, 200rpm 조건으로 16시간 배양하였다. 이를 다시 새로운 25ml LB 액체배지(250ml 용량의 플라스크)에 재접종하여 OD₆₀₀ 이 0.5~0.6 되도록(2~3시간) 동일 배양 조건에서 키운 직후, 포도당 4%가 첨가된 LB배지 500ml(1L jar)를 포도당이 고갈되는 시점까지 배양하였다. 효소균 배양액 1ml을 회수하고 원심분리기를 이용하여 상등액을 제거한 후 획득한 세포를 0.1M 포타슘포스페이트 완충액(potassium phosphate, pH7.5)으로 세척하였다. 이를 다시 1ml의 포타슘포스페이트 완충액에 현탁하고, 초음파를 이용하여 30초 간격으로 세포를 5회 파쇄하였다. 파쇄된 세포파쇄액을 취하여 Bio-Rad 단백질 정량액(미국 BIO-Rad 사)을 이용하여 단백질 총량을 정량하였다. 또한 SDS-PAGE법을 이용하여 단백질의 발현을 확인하였다. 이 후, 회수된 세포파쇄액을 효소 전환 반응에 사용하였다.

1-2) 로도박터속 유래의 O- 아세틸호모세린 설피드릴라아제

메치오닌 전구체인 O-아세틸호모세린을 메치오닌으로 전환하는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 암호화하는 metZ 유전자를 클로닝하였다.

로도박터 스페로이드의 크로모좀을 주형으로 하고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하였다.

상기 PCR 반응으로 획득한 DNA 절편을 BamHII/HindIII으로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-P_CJ1 벡터 (한국, CJ사)에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포파쇄액을 회수하고, 이를 효소 전환반응에 사용하였다.

실시예 2: 전환효소의 발현량 비교, 기질특이성 및 전환효소의 활성 비교

상기의 1-1)에서 1-2)의 방법으로 획득한 각각의 세포파쇄액을 이용하여 하이포모나스속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 및 로도박터속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제의 발현량 및 활성을 비교하였다.

일반적으로 단백질양은 1-1)에서 언급한 것과 같이 BIO-Rad사 단백질 정량액을 이용하지만 효소파쇄액과 같은 대장균 단백질들과 혼합형태로 사용하는 경우는 단백질 정량법으로 특정효소들의 발현 비교를 하기는 어렵다. 따라서 상기 1-1), 1-2)에서 얻은 세포파쇄액에서 전환효소의 발현양을 비교하기 위하여 SDS-PAGE를 이용하였다. 두 세포파쇄액을 10ul, 5ul, 2.5ul를 사용하여 하이포모나스속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(MetZ-hne)와 로도박터속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(MetZ-rsp)를 비교한 결과, metZ-hne에 비해서 MetZ-rsp가 4배 내외로 발현량이 많은 것을 알 수 있었다(도 3).

그리고 두 효소의 기질특이성을 파악하기 위해서 O-아실호모세린(O-acylhomoserine)을 3 mM의 농도로 0.1M 포타슘포스페이트 완충액(pH7.5)에 용해하였다. 또한 상기 반응액에 보조인자(cofactor)로 사용되는 피리독살포스페이트 (pyridoxal: 5'-포스페이트, 미국 Sigma 사)를 최종농도 10 μM이 되도록 첨가하였다. 반응액에 또 다른 기질로서 사용되는 메칠머캅탄(Methyl mercaptan, 일본 동경 화성공업주식회사)을 최종농도 2mM로 첨가하였다. 상기 반응액 1ml을 37℃에 위치한 후, 각 효소추출액을 단백질 농도 5mg/ml로 맞추어서 10μl씩 첨가하였다. 반응의 진행 여부는 반응 시작 후 100μl의 반응액을 회수하여 4mg/ml의 DTNB (5,5-dithiobis(2-nitro-benzoic acid, 미국 sigma사) 용액 900μl에 첨가한 후, 415 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 확인하였다.

DTNB는 반응액 중에 잔존하는 메칠머캅탄의 -SH 그룹과 반응하여 노란색의 물질을 합성한다. 따라서, 반응액상의 메칠머캅탄이 반응에 의해 메치오닌으로 전환됨에 따라 반응액의 노란색이 사라지는 것으로써 반응의 진행을 확인할 수 있다. 그리고 반응전후의 DTNB 흡광도의 차이값(ΔOD415)이 크면 강한 활성을 가짐을 알 수 있다.

O-아실호모세린 반응액 및 효소액을 이용하여 반응시킨 결과, 하이포모나스 넵튜니움 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제와 로도박터 스페로이드 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 모두 O-숙시닐호모세린보다 O-아세틸호모세린에 대하여 높은 기질특이성을 보였다. 그리고 각 효소의 기질에 대한 기질특이성을 표 1에서 '+'의 개수로 간략히 표현하였다. 그 결과, 상기 두 균주 모두 O-숙시닐호모세린과 비교하여 O-아세틸호모세린에 더 높은 기질 특이성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 고농도 O- 아세틸호모세린 배양액에서 MetZ - hne 와 MetZ - rsp 반응 초기활성 비교

고농도의 O-아세틸호모세린에서 MetZ-hne 및 MetZ-rsp 효소의 전환율 특성을 비교하기 위하여 80g/L의 O-아세틸호모세린 농도에서 메치오닌 전환 실험을 진행하였다. 1 mL 튜브 스케일에서 O-아세틸호모세린 80 g/L의 효소전환 시 하이포모나스 넵튜니움 유래 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(MetZ-hne)와 로도박터 스페로이드 유래 O-아세틸호모세린 설피드릴라제(MetZ-rsp)에 의한 메치오닌 생성을 시간 경과에 따라 상대적으로 비교하였다. O-아세틸호모세린 설피드릴라제의 반응속도는 반응 생성물인 메치오닌의 농도로 비교할 수 있다. 보다 구체적으로, 효소 전환반응의 조건은 80 g/L의 O-아세틸호모세린 1 mL에 메치오닌을 생성하기 위해 필요한 다른 하나의 기질인 소디움메칠머캅탄(15%, w/v) 0.01 mL, O-아세틸호모세린 설피드릴라제 0.01 mL, 효소보조인자인 피리독살포스페이트(pyridoxal : 5'-phosphate)을 0.1 mM 농도로 투입하여 800 rpm 교반 하에 33℃에서 반응을 수행하였다. 효소 추출액은 각각 5mg/ml의 단백질 농도가 되도록 조절하여 투입하였다. 메치오닌 및 O-아세틸호모세린의 농도 분석은 HPLC를 이용하였다. 메치오닌 전환율은 반응에 투입한 메칠머캅탄 1 몰에서 생성된 메치오닌의 몰수로 계산하였다.

그 결과는 표 2에 나타난 것과 같이 로도박터 스페로이드 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제가 하이포모나스 넵튜니움 유래 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 보다 고농도의 O-아세틸호모세린에서도 높은 초기 반응속도 및 전환율을 보였다.

실시예 4: 반응 산물인 메치오닌과 아세트산의 의한 반응 저해정도 비교

2단계 공법에서 효소반응이 진행되면 L-메치오닌과 아세트산이 생성되는데 고농도의L-메치오닌은 효소 반응속도를 저하시키고, 아세트산은 단백질변형으로 효소의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다.

산업적으로 고농도의 O-아세틸호모세린을 L-메치오닌과 아세트산으로 효소전환하기 위해서는 상기에서 설명한 효소활성 저해현상에서도 효소는 높은 활성을 가져야 한다. 고농도의 L-메치오닌, 아세트산 존재하에서 MetZ-hne 및 MetZ-rsp 두 효소의 활성을 비교하였다. 구체적으로, 0.3M의 L-메치오닌(약 45g/L) 및 0.3M 아세트산 존재하에, 실시예 2에 언급한 DTNB방법으로 활성을 비교하였다. 반응에 사용된 세포파쇄액량은 5mg/ml농도액으로 25ul을 사용하였다. 그 결과 잔존 활성은 MetZ-hne는 42%였고 MetZ-rsp는 50%을 보임으로써 MetZ-rsp는 고농도의 L-메치오닌, 아세트산이 존재하여도 효소 활성 저해정도가 낮음을 확인할 수 있었다.[표 3]

또한 각각 0.3M L-메치오닌과 아세트산에서 두 효소의 전환 반응을 확인한 결과, 표 4와 같은 결과가 나왔다.

실시예 5 : MetZ - hne 와 MetZ - rsp 효소의 열 안정성 비교

산업적으로 효소를 이용한 전환공정에서는 33~37℃의 온도로 1~6시간 내외로 반응이 진행되게 된다. 반응산물에 의한 저해현상뿐만 아니라 열안정성이 낮은 효소는 전환 반응이 진행됨에 따라서 효소의 활성 역시 낮아진다. 효소의 열안정성은 산업적, 경제적 측면에서 중요한 사항이다. 이러한 효소의 열안정성 비교를 위해서 실시예 1의 1-1)에서 1-2)의 방법으로 획득한 각각의 세포파쇄액을 50℃에서 10, 30, 60, 120, 240분 열처리한 후 실시예 2의 DTNB방법을 이용하여 효소잔존활성을 비교하였다.

표 5에 나타난 것과 같이, 로도박터 스페로이드 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제의 경우는 45℃로 열처리한 후 240분이 경과한 시점에서 열처리 전과 활성비교를 했을 때 95%의 잔존활성을 보였다. 반면, MetZ-hne는 75%의 잔존활성을 보여, MetZ-rsp의 열안정성이 더 우수한 것을 확인하였다.

실시예 6 : metZ - rsp 를 이용한 회분식 반응기에서의 O- 아세틸호모세린 배양액으로부터 L-메치오닌으로의 효소전환반응

본 실시예는 튜브스케일에서 확인한 metZ-rsp의 O-아세틸호모세린 셀피드릴라아제의 전환활성을 반응기 시스템에서 평가할 목적으로 최적이 1L인 회분식 반응기를 이용하였다. 효소전환 반응시 필요한 기질인 O-아세틸호모세린은 기존의 특허에 명기된 미생물 균주를 발효하여 생산하였으며, 배양한 발효액으로부터 원심분리기를 이용하여 세포를 제거하고, 약 70g/L 농도의 배양액을 500mL 사용하였다(WO2008/013432). 메칠머캅탄은 상온에서 기체상으로 존재하기 때문에 가성소다액에 메칠머캅탄을 첨가하여 액상으로 존재하는 소디움메칠머캅탄(sodium methyl mercaptan, CH₃S-Na, 4.7M, 33%, 프랑스 Arkema) 용액을 이용하여 실험을 진행하였다. 소디움메칠머캅탄은 효소전환반응시 약 50mL가 사용되었다. 효소액의 경우 실시예 1에서 설명한 방법으로 생산된 metZ-rsp 세포파쇄액 50mL을 투입하였으며 보조인자인 피리독살포스페이트(pyridoxal: 5'-phosphate, 미국 Sigma)는 0.1mM 농도로 투입하였다. 효소전환반응은 pH7.0, 33℃, 교반은 700 rpm으로 설정하였다. 반응시간은 소디움메칠머캅탄을 공급하며 3시간 동안 수행하였다. O-아세틸호모세린과 L-메치오닌의 시간별 농도는 표 6과 같으며 분석은 HPLC를 이용하여 수행하였다.

결과적으로 1L 회분식 반응기에서 O-아세틸호모세린 배양액으로부터 metZ-rsp 효소액을 이용한 L-메치오닌 효소전환반응은 반응이 빠르고, 전환율(97% mol전환율)이 높음을 확인하였다.

실시예7 : 돌연변이를 이용한 metZ - rsp 효소 활성 개량

본 실시예는 야생형 metZ-rsp에 임의돌연변이 유발시스템(random mutagenesis)를 위해 에러유발 PCR(error-prone PCR)을 수행하였으며, 에러유발 PCR 수행 시 diversify PCR random mutagenesis kit(미국 CLONTECH)를 사용하였다. 변이 발생 비율(mutation rate) 조건 선정을 위해 MnSO₄와 dGTP 농도에 따라 아래와 같이 두 가지 조건으로 에러유발 PCR을 수행하였다. 변이를 도입할 DNA 주형(template)은 실시예 1-2) 클로닝된 pCL-P_CJ1:metZ-rsp를 대상으로 진행하였다.

상기 표 7 조건으로 수행한 에러유발 PCR 산물을 NcoI/HindIII로 절단하여, 동일하게 절단한 pCL-P_CJ1 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 변이 라이브러리(mutant library)는 대장균(Escherichia coli) K12 세포에 형질전환시키고, 50 μg/L의 스펙티노마이신이 포함된 LB 평판배지에서 배양한 후 50개의 콜로니를 선별하여 변이 발생 비율(mutation rate) 및 다양한 위치에 변이 발생유무를 판단하기 위해 시퀀싱(sequencing)을 진행하였다. 시퀀싱 결과 case#1 조건의 변이 발생 비율은 2.4 kb^-1, case#2 조건에서는 2.9 kb^-1 이였다. Case #1, 2 모두 돌연변이체 라이브러리(mutant library) 확보에 적합한 변이 발생 비율을 충족시킨다고 판단하여 위의 조건에서 제작된 라이브러리를 이용하여 유효변이 선별 작업을 수행하였다.

최초 96 딥-웰 플레이트(deep-well plate)에서 배양 후 세포파쇄를 위해 BugBuster(미국 MERCK) 용액을 1:1로 처리하여 세포 파쇄액를 얻었다. 이 중 50uL를 취하여 O-아세틸호모세린 300mM, 및 L-시스테인 1mM 기질을 혼합한 반응액 50uL과 혼합하였다. 혼합 후 상온에서 60분간 반응시키면서 시간대별로 DTNB 용액을 50uL 혼합하였고, 발색 후 OD값을 415nm에서 읽은 후 하기 표 8과 같은 결과를 얻었다.

시간에 따른 DTNB 발색을 plot해보면 위와 같이 5, 10분 반응 후 잔존 L-시스테인에 의한 OD 값이 각각 1.19와 0.65로 실제 변이 선별 시 5분 효소반응 후 잔존 시스테인의 DTNB 발색 정도가 1.0 이하가 되는 변이주를 선별하기로 하였다.

위의 선별 방법으로 유효한 활성 증가를 보인 후보 변이주를 선정하였다. 이후 후보 변이주의 유효 변이를 선별하기 위해 염기서열 정렬과정을 거쳤으며 최종적으로 I3N (서열번호 15), F65Y (서열번호 16), V104A (서열번호 17) 및 E182G 4종의 변이를 포함한 변이주를 선정하였다. 최종 선정된 변이를 후보 변이로 하여 pCL-P_CJ1:metZ-rsp 기본 벡터에 후보 변이를 1종씩 개별 도입하여 활성 증가에 대한 유효성을 검증하고자 하였다. 후보 변이를 개별 도입한 벡터를 제작하기 위해 I3N변이는 서열번호 5, 6의 프라이머를, F65Y변이는 서열번호 7, 8의 프라이머, V104A변이는 서열번호 9, 10의 프라이머, E182G변이는 서열번호 11, 12의 프라이머를 사용하여 개별로 변이가 도입된 metZ-rsp 발현 벡터를 제작하였으며, 변이 도입 여부는 시퀀싱(macrogen,한국)을 통해 확인하였다. 제작된 변이벡터를 대장균 K12 에 형질전환하여 플라스크에서 LB 배지로 33℃, 200 rpm, 15시간 조건에서 배양한 후 샘플링하여 각 후보 변이의 개별 유효성 여부에 대한 평가를 진행하였다. 그 결과는 표 9과 같다.

후보 변이 개별 도입 후 플라스크평가 결과 I3N(서열번호 15), F65Y(서열번호 16) 및 V104A(서열번호 17)는 기존 대조군 rsp-metZ에 비해 활성 증가에 유효한 변이임을 확인할 수 있었다. 반면 E182G 변이는 개별로 도입 시 활성 증가에 유효하지 못한 변이로 판단하여 차후 진행 과정에서 배제하였다.

활성 증가에 대한 개별 유효성이 최종 확인된 I3N, F65Y 및 V104A 3종 유효 변이에 대해 기본 pCL-P_CJ1:metZ-rsp vector에 3종 변이가 모두 도입된 벡터를 제작(pCL-P_CJ1:metZ-rsp M3명명)하여 활성을 더욱 강화하고자 하였다. 3종 변이는 상기 프라이머를 이용하여 단계별로 벡터에 추가적으로 도입되는 과정을 거쳤으며 각 3종 변이 도입 발현 벡터에 대한 활성 평가는 대장균 K12 에 형질전환 후 다시 플라스크에서 배양 후 평가하였으며 결과는 하기 표 10과 같다.

위의 결과와 같이 유효 변이 3종이 모두 도입된 pCL-P_CJ1:metZ-rsp M3가 기존 pCL-P_CJ1:metZ-rsp 대비 1.75배로 활성이 증가됨을 확인할 수 있었다.

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> New O-acetylhomoserine sulfhydrylase or mutants, and L-methionine conversion method using the enzyme <130> PA100785KR <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for neptunium chromosome <400> 1 aattccatgg cggatgcacc cgg 23 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Hyphomonas neptunium <400> 2 aattaagctt tcacaagctg ttaagcgaag 30 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Rhodobacter sphaeroides chromosome <400> 3 aattccatgg gtatcgcgtt tcgtga 26 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Rhodobacter sphaeroides chromosome <400> 4 aattaagctt tcagatcacc gcgagcgc 28 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for I3N mutants <400> 5 aaaaggagat ataccatggg taacgcgttt cgtgaaggac ggac 44 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for I3N 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Claims

O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)의 활성을 가지는, 서열 번호 13의 아미노산 서열로 표기되는 폴리펩티드.
제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 14로 표기되는 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 13의 아미노산 서열로 표기되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 3번째 아미노산이 이소루신 이외의 다른 아미노산으로, 65번째 아미노산이 페닐알라닌 이외의 다른 아미노산으로, 104번째 아미노산이 발린 이외의 다른 아미노산으로 바뀐 변이 또는 상기 3종의 아미노산 변이 중 1종 이상의 변이가 복합되어 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성이 강화된 변이형 폴리펩티드.
제4항에 있어서, N-말단으로부터 3번째 아미노산이 아스파라진으로, 65번째 아미노산이 타이로신으로, 104번째 아미노산이 알라닌으로의 변이 또는 상기 3종의 아미노산 변이 중 1종 이상의 변이가 복합되어 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 활성이 강화된 변이형 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 서열 번호 15, 16, 17 및 18로 이루어진 그룹 중 선택된 변이형 폴리펩티드.
제6항의 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 19, 20, 21 및 22로 이루어진 그룹 중 선택된 폴리뉴클레오티드.
제2항 또는 제7항의 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터.
제9항의 재조합 벡터로 형질전환되어 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 생산할 수 있는 에스케리아속 미생물.
제10항에 있어서, 상기 에스케리아속 미생물은 대장균인 것인 미생물.
제1항 또는 제4항의 폴리펩티드, 또는 이를 생산하는 미생물을 O-아세틸호모세린 및 메칠머캅탄의 혼합물에 첨가하여 반응시킨 뒤 메치오닌 또는 아세트산을 생산하는 방법.