ES2534375T3 - Composiciones y procedimientos de producción de metionina - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido aislado con actividad de homoserina O-succiniltransferasa, que muestra una sensibilidad reducida ante la inhibición por retroalimentación por L-metionina en comparación con un polipéptido de homoserina O-succiniltransferasa de tipo silvestre derivado de E. coli, y que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2.

Description

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molécula de ácido nucleico en dicha célula, incluyendo pero sin limitación, transfección con vectores víricos, conjugación, transformación con vectores de plásmido e introducción de ADN desnudo por electroporación, lipofección y aceleración por pistola de partículas.
Actividad de transulfuración: Una actividad que producen metionina o SAMe a través del intermedio cistationina. Los péptidos que tienen esta actividad incluyen cistationina -sintasa (EC 2.5.1.48) y cistationina -liasa (EC 4.4.1.8), estos péptidos están codificados por los genes metB y metC, respectivamente. Puede usarse cualquier combinación de péptidos de cistationina sintasa (EC 4.2.99.9) y cistationina -liasa (EC 4.4.1.8) para permitir que un microorganismo posea actividad de transulfuración.
En condiciones que permitan la producción de producto: Cualquier condición de fermentación que permita que un microorganismo produzca un producto deseado, tal como metionina o SAMe. Las condiciones incluyen habitualmente temperatura, aireación y medio. El medio puede ser un caldo o un gel. Generalmente, el medio incluye una fuente de carbono tal como glucosa, fructosa, celulosa o similar que puede metabolizarse por el microorganismo directamente, o pueden usarse enzimas en el medio para facilitar el metabolismo de la fuente de carbono. Para determinar si las condiciones de cultivo permiten la producción de producto, puede cultivarse el microorganismo durante 24, 36 o 48 horas y tomarse una muestra. Puede ensayarse entonces en las células de la muestra la presencia del producto deseado. Por ejemplo, cuando se ensaya la presencia de metionina o SAMe, pueden usarse los ensayos proporcionados en la sección de ejemplos.
Vector: Una molécula de ácido nucleico introducida en una célula, produciendo así una célula transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permitan replicar en la célula, tal como un origen de replicación. Un vector puede incluir también uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la materia.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
I. Rutas de producción de metionina
Como se muestra en la FIG. 1, pueden usarse muchas rutas biosintéticas para producir metionina o sus intermedios tales como fosfato de aspartilo, semialdehído aspártico, homoserina, O-succinilhomoserina (OSHS), Oacetilhomoserina (OAHS), cistationina, homocisteína, metionina y S-adenosilmetionina (SAMe). Con los fines de esta divulgación, puede hacerse referencia a un intermedio como un reactante o un producto, dependiendo del contexto. Por ejemplo, cuando se discute la conversión de aspartato en fosfato de aspartilo usando una aspartato cinasa, el aspartato es el reactante y el fosfato de aspartilo es el producto. De forma similar, cuando la descripción describe la conversión de fosfato de aspartilo en semialdehído aspártico usando una semialdehído aspártico deshidrogenasa, el fosfato de aspartilo es el reactante y el semialdehído aspártico es el producto. Un especialista en la materia apreciará que la FIG. 1 muestra muchas rutas biosintéticas porque en cada clase de enzima proporcionada hay muchas enzimas que pueden usarse para convertir un reactante en un producto y, por lo tanto, realizar una ruta. Además, estas reacciones pueden llevarse a cabo in vivo, in vitro o mediante una combinación de reacciones in vivo y reacciones in vitro, tales como reacciones in vitro que incluyen reacciones químicas no enzimáticas.
El microorganismo hospedador puede proporcionar también intermedios a la ruta al incluir los intermedios en la materia prima de la fermentación. Por tanto, si la ruta biosintética produce menos de la cantidad deseada de un intermedio dado, ese intermedio puede añadirse a la materia prima. Esto puede hacerse en un ajuste de fermentación continua o en un ajuste de fermentación por lotes.
Los especialistas en la materia reconocerán que un hospedador de producción usa fuentes de carbono distintas de glucosa. Las fuentes de carbono alternativas incluyen, por ejemplo, sacarosa, fructosa, celulosa, hemicelulosa, almidón o glicerol. Cuando se usan fuentes de carbono alternativas, puede ser necesario incluir enzimas que modifiquen la fuente de carbono en el medio de fermentación.
A. Glucosa a aspartato
Los microorganismos producen generalmente aspartato a partir de glucosa. Un especialista en la materia apreciará que existen muchos procedimientos para aumentar la concentración de aspartato en cepas de producción. Por ejemplo, aumentar la expresión de las enzimas piruvato carboxilasa y fosfoenolpiruvato carboxilasa, alterar la desviación de glioxilato o eliminar el consumo de piruvato en otros productos tales como acetato o etanol.
Como alternativa, el aspartato puede incluirse en la materia primera de fermentación, tomarse por el microorganismo, y usarse como reactantes en la ruta biosintética de metionina.
El aspartato sirve también como intermedio en las rutas biosintéticas de lisina, treonina y asparagina. Por lo tanto, puede ser deseable atenuar o retirar (desactivar) estas rutas, permitiendo por tanto usar más aspartato en la ruta de producción de metionina.
B. Aspartato a fosfato de aspartilo
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OSHS. Adicionalmente, un especialista en la materia apreciará que algunos péptidos de homoserina Osucciniltransferasa catalizarán otras reacciones también, por ejemplo, algunos péptidos de succinilCoA homoserina aciltransferasa aceptarán otros sustratos además de la homoserina. Por lo tanto, se incluyen también dichos péptidos de succinilCoA homoserina aciltransferasa no específicos. Las secuencias peptídicas de homoserina Osucciniltransferasa están públicamente disponibles. Por ejemplo, el nº de acceso a GenBank: NZ_AAWW01000055 da a conocer una secuencia de ácido nucleico de homoserina O-succiniltransferasa y el nº de acceso a GenBank: AAC76983 da a conocer una secuencia de péptido de homoserina O-succiniltransferasa. Son bien conocidos en la materia ensayos para caracterizar la actividad de succinilCoA homoserina aciltransferasa. Por ejemplo, el ensayo descrito por Lawrence, J. Bacteriol., 109: 8-11, 1972, puede usarse para caracterizar la actividad de un péptido específico. Se hace referencia también a los genes que codifican péptidos de succinilCoA homoserina aciltransferasa en la presente memoria como metA.
F. Homoserina a O-acetilhomoserina (OAHS)
Los hospedadores de producción pueden genomanipularse usando polipéptidos para producir O-acetilhomoserina (OAHS), o sobreproducir OAHS. Es un procedimiento de aumento de la producción de productos en la ruta biosintética de metionina mediante sobreexpresión o expresión de una forma más activa de péptidos de homoserina O-acetiltransferasa (EC 2.3.1.31).
Como se usa en la presente memoria, la homoserina O-acetiltransferasa incluye péptidos de homoserina Oacetiltransferasa (EC 2.3.1.31), así como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión en OAHS. Adicionalmente, un especialista en la materia apreciará que algunos péptidos de homoserina O-acetiltransferasa catalizarán otras reacciones también, por ejemplo algunos péptidos de homoserina O-acetiltransferasa aceptarán otros sustratos además de la homoserina. Por lo tanto, se incluyen también dichos péptidos de homoserina Oacetiltransferasa no específicos. Las secuencias de péptidos de homoserina O-acetiltransferasa están públicamente disponibles. Por ejemplo, los nº de acceso a GenBank: Y10744 REGIóN: 2822..3961, NZ_AAAH02000004 REGIÓN: 166057..167193 y NZ_AAAY02000081 REGIÓN: complemento (11535..12605) dan a conocer secuencias de ácido nucleico de homoserina O-acetiltransferasa y los nº de acceso a GenBank: CAA71733, ZP_00766367 y ZP_00107218 dan a conocer secuencias de péptido de homoserina O-acetiltransferasa. Son bien conocidos en la materia ensayos para caracterizar la actividad de homoserina O-acetiltransferasa. Por ejemplo, puede usarse el ensayo descrito por Lawrence, J. Bacteriol., 109: 8-11, 1972, para caracterizar la actividad de un péptido específico. Se hace referencia también en la presente memoria a los genes que codifican péptidos de homoserina Oacetiltransferasa como metX.
G. Sulfhidrilación
Se lleva a cabo la producción de homocisteína por sulfhidrilación directa mediante enzimas homocisteína sintasa, algunas de estas enzimas utilizan OSHS como sustrato, y algunas utilizan OAHS como sustrato. Adicionalmente, algunas de las enzimas pueden utilizar OSHS u OAHS como sustratos.
1. O-Succinilhomoserina (OSHS) a homocisteína
Los hospedadores de producción pueden genomanipularse usando polipéptidos conocidos para producir homocisteína, o sobreproducir homocisteína. Es un procedimiento de aumento de la producción de productos en la ruta biosintética de metionina mediante sobreexpresión o expresión de una forma más activa de péptidos de homocisteína sintasa (EC 4.2.99.-).
Como se usa en la presente memoria, la homocisteína sintasa incluye péptidos de homocisteína sintasa (EC 4.2.99.-), así como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión de O-succinilhomoserina (OSHS) en homocisteína. Se hace referencia a la conversión de OSHS en homocisteína mediante reacción con sulfuro en la presente memoria como sulfhidrilación directa. Adicionalmente, un especialista en la materia apreciará que algunos péptidos de homocisteína sintasa catalizarán otras reacciones también, por ejemplo algunos péptidos de homocisteína sintasa aceptarán otros sustratos además de la OSHS. Por lo tanto, dichos péptidos de homocisteína sintasa se incluyen también. Las secuencias de péptidos de homocisteína sintasa están públicamente disponibles. Por ejemplo, el nº de acceso a GenBank: AE004091 da a conocer secuencias de ácido nucleico de homocisteína sintasa (O-succinil-L-homoserina sulfhidrilasa) y el nº de acceso a GenBank: AAG06495 da a conocer una secuencia aminoacídica de homocisteína sintasa (O-succinil-L-homoserina sulfhidrilasa). Son bien conocidos en la materia ensayos para caracterizar la actividad de homocisteína sintasa de un péptido particular. Por ejemplo, puede usarse el ensayo descrito por Yamagata, Methods in Enzymology, 143: 478, 1987, con el sustrato apropiado, para caracterizar la actividad de un péptido específico. Se hace referencia también en la presente memoria a genes que codifican homocisteína sintasa como metZ.
2. O-Acetilhomoserina (OAHS) a homocisteína
Los hospedadores de producción pueden genomanipularse usando polipéptidos conocidos para producir homocisteína, o sobreproducir homocisteína. Es un procedimiento de aumento de la producción de productos en la ruta biosintética de metionina mediante sobreexpresión o expresión de una forma más activa de péptidos de homocisteína sintasa (EC 2.5.1.49).
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Como se usa en la presente memoria, la homocisteína sintasa incluye péptidos de homocisteína sintasa (EC 2.5.1.49), así como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión de O-succinilhomoserina (OAHS) en homocisteína. Se hace referencia a la conversión de OAHS en homocisteína mediante reacción con sulfuro en la presente memoria como sulfhidrilación directa. Adicionalmente, un especialista en la materia apreciará que algunos péptidos de homocisteína sintasa catalizarán otras reacciones también, por ejemplo, algunos péptidos de homocisteína sintasa descritos en el ejemplo 2 siguiente, aceptan OAHS o OSHS como sustrato, por lo tanto, se incluyen también dichos péptidos de homocisteína sintasa no específicos. Las secuencias de péptidos de homocisteína sintasa están públicamente disponibles. Por ejemplo, los nº de acceso a GenBank: AE004091 REGIÓN: 5655648..5656925, Y10744 REGIÓN: 1485..2813, NZ_AAAH02000004 REGIÓN: 164536..165990 yNZ_AAAY02000081 REGIÓN: complemento (12750..14054) dan a conocer secuencias de ácido nucleico de homocisteína sintasa (O-acetil-L-homoserina sulfhidrilasa) y los nº de acceso a GenBank: AAG08410, CAA71732, ZP_00766366 y ZP_00107219 dan a conocer secuencias aminoacídicas de homocisteína sintasa (O-acetil-Lhomoserina sulfhidrilasa). Son bien conocidos en la materia ensayos para caracterizar la actividad de homoserina sintasa de un péptido particular. Por ejemplo, puede usarse el ensayo descrito por Yamagata, Methods in Enzymology, 143: 478, 1987, con el sustrato apropiado, para caracterizar la actividad de un péptido específico. Se hace también referencia en la presente memoria a los genes que codifican péptidos de homocisteína sintasa como
metY.
H. Transulfuración
1. O-Succinilhomoserina (OSHS) o acetilhomoserina (OAHS) a cistationina
Los hospedadores de producción pueden genomanipularse usando polipéptidos conocidos para producir cistationina, o sobreproducir cistationina. Es un procedimiento de aumento de la producción de productos en la ruta biosintética de metionina mediante sobreexpresión o expresión de una forma más activa de péptidos de cistationina -sintasa (EC 2.5.1.48).
Como se usa en la presente memoria, la cistationina -sintasa incluye péptidos de cistationina -sintasa (EC 2.5.1.48), así como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión de OSHS o OAHS en cistationina. Adicionalmente, un especialista en la materia apreciará que algunos péptidos de cistationina -sintasa catalizarán otras reacciones también, por ejemplo, algunos péptidos de cistationina -sintasa aceptarán otros sustratos además de OSHS u OAHS. Por lo tanto, se incluyen también dichos péptidos de cistationina -sintasa no específicos. Las secuencias de péptidos de cistationina -sintasa están públicamente disponibles. Por ejemplo, los nº de acceso a GenBank NC_006958, NZ_AAWW01000006 y NC_004129 dan a conocer secuencias de ácido nucleico de cistationina -sintasa y los nº de acceso a GenBank: NP_418374, YP_348978 y NP_601979 dan a conocer secuencias de péptido de cistationina -sintasa. Son bien conocidos en la materia ensayos para caracterizar la actividad de cistationina -sintasa de un péptido particular. Por ejemplo, puede usarse el ensayo descrito en Methods in Enzymology, 17: 425-433, 1971 para caracterizar la actividad de un péptido específico. Se hace también referencia en la presente memoria a los genes que codifican péptidos de cistationina -sintasa como metB.
2. Cistationina a homocisteína
Los hospedadores de producción pueden genomanipularse usando polipéptidos conocidos para producir homocisteína, o sobreproducir homocisteína. Es un procedimiento de aumento de la producción de productos en la ruta sintética de metionina mediante sobreexpresión o expresión de una forma más activa de péptidos de cistationina -liasa (EC 4.4.1.8).
Como se usa en la presente memoria, cistationina -liasa incluye péptidos de cistationina -liasa (EC 4.4.1.8), así como cualquier otro péptido capaz de catalizar la conversión de cistationina en homocisteína. Adicionalmente, un especialista en la materia apreciará que algunos péptidos de cistationina -liasa catalizarán otras reacciones también, por ejemplo, algunos péptidos de cistationina -liasa aceptarán otros sustratos además de la cistationina. Por lo tanto, se incluyen también dichos péptidos de cistationina -liasa no específicos. Las secuencias de péptidos de cistationina -liasa están públicamente disponibles. Por ejemplo, los nº de acceso a GenBank NZ_AAWW01000001, NC_006958 y NZ_AAVY01000004 dan a conocer secuencias de ácido nucleico de cistationina -liasa y los nº de acceso a GenBank: NP_746463, YP_226552 y NP_417481 dan a conocer secuencias de péptido de cistationina -liasa. Son bien conocidos en la materia ensayos para caracterizar la actividad de cistationina -liasa de un péptido particular. Por ejemplo, puede usarse el ensayo descrito en Methods in Enzymology, 143: 483-486, 1987, para caracterizar la actividad de un péptido especifico. Se hace también referencia en la presente memoria a los genes que codifican péptidos de cistationina -liasa como metC.
I. Homocisteína a metionina
Los hospedadores de producción pueden genomanipularse usando polipéptidos conocidos para producir metionina, o sobreproducir metionina. Es un procedimiento de aumento de la producción de productos tales como metionina o SAMe en la ruta biosintética de metionina mediante sobreexpresión o expresión de una forma más activa de péptidos de homocisteína metilasa (EC 2.1.1.14 y 10 2.1.1.13).
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in vitro, la O-succinilsulfhidrilasa tenía una baja afinidad por sulfuro. Mediante evolución dirigida, es posible desarrollar O-succinilsulfhidrilasas mejoradas con mayor afinidad por sulfuro y también mayor actividad. Una Osuccinilsulfhidrilasa altamente activa podría reemplazar a metB y metC en la ruta de metionina, o podría complementar la ruta para aumentar el flujo de carbono a la metionina.
[Tabla 1]
Complementación del crecimiento y producción de metionina en TF4076BFJ-ΔBC
TF4076BFJ-ΔBC
DO Glucosa usada (g/l) Intermedio met (mg/l) GA y HS (g/l)
OSH
Met HS GA
Vector vacío
2,5 10,0 3867 0,0 0,0 0,4
pCL-metB
20,9 38,1 0,0 0,0 0,6 0,2
pCL-metB-metC
9,7 40,0 0,0 670 4,36 2,4
pPro-metZ
13,0 40,0 0,0 101 3,1 4,3
pCL-metB: metB con su propio promotor en pCL1920
pCL-metB-metC: metB y metC con sus propios promotores en pCL1920
pPro-Z: metZ de Pseudomonas aeruginosa en el vector pProLar (ClonTech)
B. Construcción de un microorganismo que tiene tanto metABC (transulfuración) como metXY (sulfhidrilación directa)
Este ejemplo muestra la producción de metionina simultánea a partir de dos rutas en E. coli. Una ruta es la ruta de metABC endógena y la segunda ruta permite la sulfhidrilación directa mediante la expresión de metY y metX de diversos organismos.
Como se muestra en la FIG. 1, E. coli produce metionina endógenamente usando los genes de la ruta de transulfuración metA, metB y metC pasando por OSHS. Se usó genomanipulación para añadir una ruta adicional a
E. coli mediante clonación y expresión de los genes metX y metY en E. coli, que dieron como resultado un organismo hospedador que prepara metionina tanto mediante transulfuración como sulfhidrilación directa simultáneamente.
Los genes metY y metX usados para construir la ruta heteróloga se clonaron a partir de ADN de Leptospira meyeri, Deinococcus radiodurans, Chloroflexus aurantiacus, Brevibacterium linens, Nostoc punctiforme y Pseudomonas aeruginosa como se describe a continuación, y se construyeron varias cepas diferentes para analizar el impacto de la adición de estos genes sobre la producción de metionina. Se clonaron y ensayaron también la homocisteína sintasa de Corynebacterium glutamicum y Saccharomyces cerevisiae. Se demostró que ambas rutas funcionan simultáneamente y se mejoró la producción de metionina con esta adición.
Para evaluar si la enzimas de metX y metY de L. meyeri podían complementar el crecimiento de un auxótrofo de metionina de E. coli, se amplificó el agrupamiento génico metYX de L. meyeri del plásmido metXY-pCR2.0-TOPO y se clonó en el vector pPRO-Nde-del. Se inició la transcripción de los genes metYX en este plásmido mediante un promotor lac/ara localizado en el vector.
Se evaluaron cuatro cepas de E. coli incluyendo W3110 ΔmetA (producción detenida de OSHS), TF4076BJF (producción aumentada de homoserina), TF4076BJF ΔmetA (producción detenida de OSHS) y TF4076BJF ΔmetAmetB (producción detenida de OSHS y cistationina a partir de OAHS o OSHS). La cepa TF4076BJF es un auxótrofo de treonina, desrregulada para la producción de metionina con un aumento del flujo de carbono hacia homoserina, que es capaz de producir metionina mediante la ruta natural de E. coli.
Se transformaron las cepas con el vector de clonación y se plásmido que contiene metYX, respectivamente. Se sembraron en estrías entonces los transformantes sobre placas de medio mínimo M9 que contiene glucosa (2 g/l), isoleucina (0,15 g/l), treonina (0,3 g/l), kanamicina (50 mg/l) e IPTG. El agrupamiento génico metYX de Leptospira meyeri complementaba el crecimiento de W3110 ΔmetA a las 24 horas. La cepa W3110ΔmetA que expresa solo metX no era capaz de crecer en la placa de medio mínimo M9. Por lo tanto, W3110 de E. coli carece de una enzima eficaz para usar O-acetil-L-homoserina como precursor de la biosíntesis de metionina. La cepa W3110ΔmetA transformada con el vector vacío de control, pPRO-Nde-del como se describe en el documento W02006113897, no crecía al cabo de 48 horas. La cepa TF4076BJF crecía sobre las placas de medio mínimo cuando se transformaba con el vector de clonación o el plásmido que contenía metYX de L. meyeri.
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Se ensayó también en genes alternativos de metYX la complementación del crecimiento en medio mínimo. En la clonación de los genes metYX de D. radiodurans, C. aurantiacus, B. linens y N. punctiforme, se acopló la traducción del gen metX con la traducción del gen metY iniciada por un rbs localizado en el vector, debido a la ausencia de un sitio de unión ribosómico (rbs) de E. coli eficaz adyacente al gen en dirección 3’, metX.
Los agrupamientos génicos metYX de L. meyeri, D. radiodurans y C. aurantiacus fueron los más eficaces en la complementación del crecimiento de las cepas auxotróficas de metionina. Se observó también la complementación del crecimiento en auxótrofo de metionina cuando se reemplazó metY (L. meyeri) por metY (P. aeruginosa) en el agrupamiento génico metYX de L. meyeri. Estas células mostraron una tasa de crecimiento relativo reducida respecto al mismo auxótrofo de metionina que expresa metYX de L. meyeri.
Se determinó la producción de metionina usando el protocolo de matraz agitado descrito en el ejemplo 3. Brevemente, se hicieron crecer cultivos a 30 ºC durante 50 horas en medio suplementado con metionina 150 mg/l (para mejorar el crecimiento inicial) y se midió la metionina por HPLC. La Tabla 2 muestra que la producción de metionina era mayor en las cepas que portaban ambas rutas en comparación con aquellas donde estaba disponible solo la transulfuración o la sulfhidrilación directa.
[Tabla 2]
Producción de metionina
Cepa
DO Glucosa usada Metionina producida (final-inicial)
g/l
mg/l
TF4076BJF
8,2 40,0 439
TF4076BJF metYX(Lm)
10,2 36,5 984
TF4076BJF metY(Pa)metX(Lm)
9,2 29,1 299
TF4076BJF metYX(Dr)
8,8 40,0 510
TF4076BJF metYX(Ca)
12,1 40,0 740
TF4076BJF ΔmetA metYX(Lm)
5,8 23,6 368
TF4076BJF ΔmetA metY(Pa)metX(Lm)
6,6 21,1 79
TF4076BJF ΔmetAB metYX(Lm)
6,2 23,7 280
TF4076BJF ΔmetAB metYX(Dr)
6,6 32,6 140
Los genes metA y metB son necesarios para la síntesis de metionina en cepas de E. coli. Cuando cualquiera de los genes está inactivado, E. coli pierde la capacidad de producción de metionina de novo. Los datos anteriores indican que la adición del operón metYX restaura la producción de metionina a niveles similares a los obtenidos con un protótrofo de metionina. La producción de metionina era en algunos casos más del doble cuando ambas rutas están disponibles para la célula. Estos resultados demuestran que las rutas no son mutuamente excluyentes y que la homoserina se convierte en metionina por ambas rutas.
Para demostrar adicionalmente los beneficios de una ruta dual, se compararon las cepas en recipientes de fermentación de 5 l usando el protocolo de fermentación descrito en el ejemplo 3. La acumulación de metionina comenzó después de aproximadamente 24 horas y continuó hasta que se detuvo la alimentación. La enzima codificada por el gen metY de la mayoría de organismos se inhibe por retroalimentación a altas concentraciones de metionina. En algunos casos, la enzima codificada por el gen metX se inhibe también por retroalimentación. Como resultado, se observó una acumulación significativa de homoserina y OAHS en estas fermentaciones. Se muestra en la FIG. 2 una comparación de la producción de metionina en fermentadores y se resumen los datos en la Tabla 3. Estos resultados confirmaban la observación realizada en los matraces de que la producción de metionina podía potenciarse significativamente mediante la adecuada expresión de una ruta de sulfhidrilación directa heteróloga, y que esta ruta podía ser responsable de la mayoría de la producción de metionina si las enzimas se expresaban apropiadamente.
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Deleción de thrB
Se eliminó thrB usando un módulo de loxP-cloranfenicol (loxP-Cm) (Gene 2000 vol. 247, p255-264). Se clonó el gen thrB por PCR usando las secuencias cebadoras 1 y 2 (SEQ ID NO: 5 y 6) usando el cromosoma de K12 de E. coli como molde. Se usaron condiciones de PCR de 94 ºC durante 30 segundos, entonces 25 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 3 minutos, y 72 ºC durante 7 minutos con premezcla de PCR HL (Bioneer Co, Corea). Se eluyeron en gel los productos de PCR, se clonaron en el kit de clonación pCR2.1-topo (Invitrogen, EE.UU.) y se denominaron pCR-thrB. Se digirió pCR-thrB usando pflMI y se insertó el módulo loxP-Cm. A partir de este plásmido, se amplificó por PCR el gen thrB que contiene el módulo loxP-Cm usando los cebadores 1 y 2 (SEQ ID NO: 11 y 12). Se purificaron en gel los productos de PCR. Se sometieron a electroporación los fragmentos de PCR en la cepa TF4076, se seleccionaron las colonias resistentes a cloranfenicol y se confirmó la deleción de thrB. Se retiró el marcador de cloranfenicol de una colonia identificada y se denominó la cepa final obtenida TF4076B. Esta cepa no crecía en medio mínimo M9 (DIFCO) sin treonina, indicando que esta cepa es auxótrofa de treonina.
1.
thrB SEQ ID NO: 11
2.
thrB SEQ ID NO: 12
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Deleción de metJ
Para eliminar el gen metJ represor global de metionina, se usó el procedimiento de deleción en una etapa FRT (Datsenko y Wanner PNAS 97: 6640-6645, 2000). Se amplificaron los fragmentos de PCR usando las secuencias cebadoras 3, 4 (SEQ ID NO: 13 y 14) y el molde pKD3 (véase Datsenko yd Wanner, PNAS 97: 6640-6645, 2000). Las condiciones de PCR usadas fueron 94 ºC durante 30 segundos, seguido de 25 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 1 minuto; entonces 72 ºC durante 7 minutos, con premezcla de PCR HL (Bioneer Co., Corea). Se seleccionaron las colonias resistentes a cloranfenicol y se confirmó la deleción del gen metJ usando las secuencias cebadoras de PCR 5 y 6 (SEQ ID NO: 15 y 16). Usando la transformación del plásmido pCP20, se retiró el gen marcador de cloranfenicol y se confirmó la retirada usando PCR. Se denominó la cepa obtenida TF4076BJ.
3.
metJ + cloranfenicol SEQ ID NO: 13
4.
metJ + clorafenicol SEQ ID NO: 14
5.
metJ SEQ ID NO: 15
6.
metJ SEQ ID NO: 16
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Integración de metF
Para complementar la auxotrofia de metionina de TF4076BJ, se expresó el gen metF en la cepa TF4076BJ. Se amplifico el gen metF usando las secuencias cebadoras 7 y 8 (SEQ ID NO: 17 y 18) y el cromosoma de la cepa K12 de E. coli como molde. Se usaron condiciones de PCR de 94 ºC durante 30 segundos, entonces 25 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 1 minuto y entonces 72 ºC durante 7 minutos y premezcla de PCR HL (Bioneer Co., Corea). Se eluyeron en gel los fragmentos de PCR y se insertaron en los sitios NheI y Sad en el vector pSE380 (Invitrogen Co.). Se denominó el plásmido pSE380-metF. Se transformó pSE380metF en la cepa TF4076BJ. El transformante crecía en medio mínimo M9 (Difco) que contenía treonina e isoleucina, indicando la complementación de la auxotrofia de metionina.
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Se determinó el nivel de expresión del gen metF bajo el control de dos promotores diferentes. Los promotores eran el promotor pCJ1 (documento PCT/KR2005/004338) y el promotor pThreonine. Se amplificó el gen metF usando las secuencias cebadoras 9 y 10 (SEQ ID NO: 19 y 20) y el cromosoma de la cepa K12 de Escherichia coli como molde. Se usaron condiciones de PCR de 94 ºC durante 30 segundos, entonces 25 ciclos de 94 ºC durante 30 s, 55 ºC durante 30 s, 72 ºC durante 1 min y entonces 72 ºC durante 7 min y premezcla de PCR HL (Bioneer Co., Corea). Se eluyeron los fragmentos de PCR en gel y se ligaron en los sitios PvuII e HindIII en el vector pCL1920 (Lerner e Inouye, Nucleic Acids Research 18: 4631, 1990) que contenía el promotor pCJ1 o el promotor pThreonine. Se amplificó por PCR el promotor pCJ1 usando las secuencias cebadoras 11 y 12 (SEQ ID NO: 21 y 22) y se amplificó el promotor pThreonine del cromosoma K12 de E. coli usando las secuencias cebadoras 13 y 14 (SEQ ID NO: 23 y 24). Se eluyeron en gel los fragmentos de PCR y se integraron en los sitios KpnI y EcoRV en el vector pCL1920. Las condiciones de PCR usadas fueron las mismas que anteriormente. El plásmido que contiene el gen metF bajo el control del promotor pCJ1r se denominó pCL-pCJ1-metF y el plásmido que contiene el gen metF bajo el control del promotor pThreonine se denominó pCL-pThr-metF. Se transformó cada plásmido en la cepa TF4076BJ y se midió la producción de metionina.
Se usó un protocolo de cultivo en matraz agitado para ensayar las cepas como sigue: se incubó un cultivo semilla a 31 ºC durante 6 horas en medio consistente en (en 1 l): 10 g de extracto de levadura, 6 g de Na2HPO4·12H2O, 0,5 g de NaCl, 3 g de KH2PO4, 2 g de glucosa, 0,49 g de MgSO4·7H2O, 0,015 g de CaCl2·2H2O. Se usó entonces para inocular matraces con el siguiente medio (1 l): 17 g de (NH4)2SO4, 1 g de MgSO4·7H20, 2 g de extracto de levadura, 0,3 g de L-treonina, 10 mg de MnSO4·7H2O, 10 mg de FeSO4·7H2O, 10 mg de ZnSO4, 30 g de CaCO3, 40 g de glucosa y 2 g de KH2PO4 pH 7,2. Se incubaron los matraces durante 64 a 72 horas a 31 ºC con agitación a 250 rpm. Después de la centrifugación, se aisló el sobrenadante de cultivo y se usó para análisis de metionina.
Para el cultivo de células que contienen el plásmido pSE380-metF, se añadió ampicilina 100 µg/l e IPTG 0,5 mM al medio. El gen metF bajo el control del promotor pCJ1 era el que producía más metionina como se muestra en la Tabla 4.
[Tabla 4]
Producción de metionina en células que contienen diversos módulos de expresión de metF
DO
Glucosa usada (g/l) Metionina (mg/l)
TF4076BJ
7,8 34 0
TF4076BJ/pSE380-metF
5,4 29 130
TF4076BJ/pCL-pCJ1-MetF
7,4 35 206
TF4076BJ/pCL-pthr-MetF
22 40 136
Para expresar el gen metF más establemente, se integraron genes metF bajo el control de promotores pTrc, pCJ1 y pThreonine en el locus lacZ del cromosoma de TF4076BJ. Se amplificó por PCR cada gen metF a partir de cada plásmido y se insertó en el sitio NsiI en el vector pBrint (Borgne et al., Gene 223: 213-219, 1998). Se transformaron los vectores en la cepa TF4076BJ, se seleccionó un transformante que crecía en medio que contiene cloranfenicol a 37 ºC y se confirmó la integración del gen metF en el locus LacZ del cromosoma. Se transformaron las colonias seleccionadas con pJW168 y se eliminó el marcador de cloranfenicol. No pudieron obtenerse células que contenían el gen pCJ1-metF y el transformante que contenía el módulo pThr-metF no crecía bien. Solo las células que contenían el gen pTrc-metF en el locus LacZ crecían bien. El cultivo en matraz de esta cepa mostró una producción de ~600 mg/l de metionina en presencia de IPTG 0,5 mM en el medio. La cepa final que contiene el gen pTrc-metF se denominó TF4076BJF y se analizó adicionalmente.
En resumen, se derivó la cepa TF4076BJF de la cepa TF4076 productora de treonina, que se modificó mediante la deleción de thrB y metJ y la inserción de metF bajo el control del promotor pTrc. La Tabla 5 muestra la producción de homoserina y metionina por TF4076BJF.
[Tabla 5]
Producción de metionina de la cepa TF4076BJF
Cepa
DO Glucosa usada (g/l) Producción de homoserina (g/l) Producción de metionina (g/l)
TF4076BJ
15,3 24,7 0,62 0
TF4076BJF
10,6 34,7 4,2 0,64
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7.
metF SEQ ID NO: 17
8.
metF SEQ ID NO: 18
9.
metF SEQ ID NO: 19
10.
metF SEQ IDNO: 20
11.
promotor CJ1 SEQ ID NO: 21
12.
promotor CJ1 SEQ ID NO: 22
13.
promotor de treonina SEQ ID NO: 23
14.
promotor de treonina SEQ ID NO: 24
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Se hizo crecer la cepa TF4076BJF en fermentadores de 5 l según el protocolo descrito a continuación, y se obtuvo una producción de aproximadamente 2,2 g/l de metionina en 96 h.
Se efectuaron fermentaciones de 5 l usando el siguiente protocolo. Para comparar el efecto de los diferentes genes clonados en la cepa de E. coli, se usó un protocolo de fermentación básico para jarras de 5 litros. Se hizo crecer el inóculo en 25 ml de medio consistente en 10,0 g de extracto de levadura, 4,49 g de Na2HPO4·7H2O, 0,5 g de NaCl, 3,0 g de KH2PO4, 0,49 g de MgSO4·7H2O, 0,015 g de CaCl2.2H2O y glucosa 2 g/l en un volumen de 1 l. Se usaron 50 mg/l del antibiótico apropiado dependiendo de la resistencia de la cepa que se está ensayando. Después de incubar con agitación a 31 ºC y 250 rpm durante 8 -24 horas, se transfirió el cultivo a 200 ml del mismo medio y se incubó en las mismas condiciones durante 16 a 20 horas. Se usó este cultivo para inocular fermentadores con 2,5 l de medio.
El medio de fermentación consistía en: (NH4)2SO4 17,0 g/l, extracto de levadura 2,0 g/l, KH2PO4 2 g/l, L-treonina 1 g/l, isoleucina 0,3 g/l, MnSO4-H2O 0,01 g/l, FeSO4-7H2O 0,01 g/l, ZnSO4-7H20 0,01 g/l, MgSO4-7H2O 1 g/l, piridoxal 2 mg/l, vitamina B12 2 mg/l y glucosa 40 g/l. Se añadieron antibióticos e IPTG dependiendo de la cepa que se haga crecer. Se mantuvo la temperatura de fermentación a 31 ºC, el oxígeno disuelto por encima del 30 % de saturación y se controló inicialmente el pH con NH4OH al 28 %. Después de agotar la glucosa, el pH se elevó. En ese punto, se inició una alimentación fija continua, o se añadieron alícuotas de 100-150 ml de alimentación cada vez, basándose en los aumentos del pH. La alimentación consistía en extracto de levadura 4,0 g/l, (NH4)2SO4 33 g/l, KH2PO4 3 g/l, Ltreonina 1,5 g/l, MgSO4-7H2O 1 g/l, vitamina B12 2 mg/l y glucosa 400 g/l. Se introdujeron algunas variaciones menores en el medio y la alimentación dependiendo de la cepa. La fermentación prosiguió durante un total de 72 a 96 horas. Se midió la concentración de metionina a lo largo de la misma, así como el crecimiento celular por densidad óptica y la utilización de glucosa.
B. Generación de homoserina succiniltransferasas resistentes a retroalimentación para la producción de metionina
Se construyó una cepa de E. coli con los genes metA y metB eliminados. Esta cepa mostraba acumulación de homoserina debido a la pérdida de la actividad de MetA. Cuando se expresó el módulo metA de tipo silvestre en esta cepa, se produjo OSHS por la actividad de MetA en ausencia de metionina. Sin embargo, cuando se añadió metionina al medio, la cepa con el módulo wt-metA acumuló homoserina de nuevo debido a la inhibición por
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retroalimentación de la actividad de MetA. Por tanto, los genes metA resistentes a retroalimentación pueden identificarse ensayando la acumulación de O-succinilhomoserina en presencia de metionina. El mutante productor de más OSHS en presencia de una alta cantidad de metionina en el medio contiene el metA más resistente a la inhibición por retroalimentación.
Se proporciona en la FIG. 3 una representación esquemática de la metodología de cribado.
Construcción del mutante de deleción de metB
Para preparar un mutante de deleción de metE en TF4076BJF, se usó el procedimiento de deleción en una etapa FRT (Datsanko y Wanner, PNAS 97: 6640-6645, 2000). Se amplificaron los fragmentos de PCR usando las secuencias cebadoras 15 y 16 (SEQ ID NO: 25 y 26) y se sometió a electroporación el molde pKD3 en células TF4073BJF. Se usaron condiciones de PCR de 94 ºC durante 30 segundos, 25 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 1 minuto y entonces 72 ºC durante 7 min y premezcla de PCR HL (Corea, Bioneer Co). Se seleccionaron las colonias resistentes a cloranfenicol y se confirmó la deleción del gen metB usando PCR. Se retiró el gen marcador de cloranfenicol usando transformación con el plásmido pCP20 y se confirmó la retirada por PCR. Se denominó la cepa obtenida mediante este procedimiento TF4076BJF-B.
15.
metB + cloranfenicol SEQ ID NO: 25
16.
metE + cloranfenicol SEQ ID NO: 26
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Construcción del mutante de deleción de metA
Para preparar un mutante de deleción de metA en TF4076BJF-B, se usó el procedimiento de deleción en una etapa FRT (PNAS, 97: 6640-6645, 2000). Se amplificaron los fragmentos de PCR usando las secuencias cebadoras 17, 18 (SEQ ID NO: 27 y 28) y se sometió a electroporación el molde pKD3 en células TF4073BJF-B. Se usaron condiciones de PCR de 94 ºC durante 30 segundos, 25 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 1 minuto y entonces 72 ºC durante 7 minutos y premezcla de PCR HL (Corea, Bioneer Co). Se seleccionaron las colonias resistentes a cloranfenicol y se confirmó la deleción del gen metA usando PCR. Se retiró el gen marcador de cloranfenicol usando transformación con el plásmido pCP20, y se confirmó la retirada por PCR. Se denominó la cepa obtenida mediante este procedimiento TF4076BJF-BA.
17.
metA + cloranfenicol SEQ ID NO: 27
18.
metA + cloranfenicol SEQ ID NO: 28
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Construcción de un vector de expresión de metA
Para preparar una colección de metA, se construyó un vector de expresión de metA. Se amplificó el gen metA usando las secuencias cebadoras 19 y 20 (SEQ ID NO: 29 y 30) con el cromosoma de la cepa K12 de E. coli como molde. Se usaron condiciones de PCR de 94 ºC durante 30 segundos, 25 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 1 minuto y entonces 72 ºC durante 7 minutos y premezcla de PCR HL (Corea, Bioneer Co.). Se eluyeron en gel los fragmentos de PCR y se ligaron en pCL1920 en el sitio SmaI. Se denominó el plásmido pA-CL. Se transformó el plásmido pA-CL en la cepa TF4076BJF-AB y se efectuó el cultivo en
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matraz con y sin metionina. Se midieron OSHS y homoserina mediante el mismo procedimiento que se describe anteriormente para la metionina. Como se muestra en la Tabla 6, las células que contienen el plásmido pA-CL en ausencia de metionina producían OSHS 3,8 g/l con homoserina 0,24 g/l. Sin embargo, en presencia de metionina 1 g/l, las células producían OSHS 5,8 g/l con homoserina 4,9 g/l. El aumento de la cantidad de OSHS es debido al aumento del crecimiento por la adición de metionina, mientras que el aumento de homoserina es debido a la inhibición por retroalimentación de la actividad de metA por la metionina.
[Tabla 6]
Producción de O-succinilhomoserina y homoserina en la cepa TF4076BJF-AB que contiene el plásmido pA-CL
Adición de metionina
Cepa DO Glucosa usada (g/l) Producción de OSH (g/l) Producción de HS (g/l)
0 g/l
TF4076BJF-AB /pCl1920 2,2 14,2 0 1,42
0 g/l
TF4076BJF-AB /pA-CL 2,1 13,1 3,8 0,24
1 g/l
TF4076BJF-AB /pCl1920 4,7 39,8 0 5,7
1 g/l
TF4076BJF-AB /pA-CL 6,4 37,4 5,9 4,9
19: metA SEQ ID NO: 29
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20: metA SEQ ID NO: 30
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Construcción de la colección de mutantes de pA -CL
Para preparar una colección de mutantes de pA-CL, se efectuó una PCR con tendencia a error. Se realizó la PCR con tendencia a error usando las secuencias cebadoras 21 y 22 (SEQ ID NO: 31 y 32) con el plásmido pA-CL como molde. Se usaron condiciones de PCR de 94 ºC durante 30 segundos, 25 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos, 68 ºC durante 2 minutos y entonces 72 ºC durante 7 minutos y el kit de mutagénesis por PCR BD Diversify (BD, EE.UU.). Se digirieron los fragmentos de PCR con BamHI y XbaI y se ligaron en pCL1920. Se transformó la colección en la cepa TF4076BJF-AB y se recogieron ~30.000 transformantes para análisis adicional.
21: pCL1920 SEQ ID NO: 31
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22: pCL1920 SEQ ID NO: 32
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Preparación de extracto bruto de enzima MetB
Para medir el OSHS mediante un procedimiento enzimático, se usó la enzima MetB de E. coli. La enzima MetB reacciona con OSHS y cisteína en relación 1:1 y produce cistationina. El reactivo DTNB (ácido 5,5-ditiobis-(2nitrobenzoico) Sigma D8130) reacciona con el grupo SH libre de la cisteína y da un color amarillo que puede medirse a 415 nm. Antes de la reacción con MetB, la cisteína reacciona con DTNB y se vuelve de color amarillo. Después de la reacción con MetB, la cisteína se vuelve cistationina, que no puede unirse a DTNB. Mediante la reducción de la DO a 415 nm después de la reacción puede medirse la cantidad de OSHS en la mezcla de reacción.
Para la sobreexpresión de enzima MetB, se digirió con BamHI y HindIII el gen metB amplificado por PCR a partir del cromosoma de K12 de E. coli y se clonó en el vector pCDF-Duet (Novagene, EE.UU.). Se efectuó una reacción PCR usando las secuencias cebadoras 23 y 24 (SEQ ID NO: 33 y 34) y el cromosoma de K12 de E. coli como molde. Se usaron condiciones de PCR de 94 ºC durante 30 segundos, 25 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 1 minuto y entonces 72 ºC durante 7 minutos y premezcla HL (Bioneer, Corea). Se transformó el plásmido que contiene el gen metB en E. coli usando una célula Tuner (Novagen, EE.UU.) y se hizo crecer el transformante durante una noche en medio LB que contenía espectinomicina 50 µg/ml. Se diluyó el caldo de cultivo de una noche en medio LB que contenía espectinomicina 50 µg/ml y se incubó a 37 ºC hasta que alcanzó
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una DO a 600 nm de 0,6, en cuyo punto se añadió IPTG a una concentración final de 0,2 mM y se incubó el cultivo durante 4 horas a 30 ºC. Se recogieron las células mediante centrifugación a 12.000 rpm, se resuspendieron en tampón fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,5) y se fragmentaron mediante sonicación (5 x 30 segundos). Se consiguió extracto celular bruto por centrifugación durante 20 min a 12.000 rpm y se usó entonces el sobrenadante para el ensayo enzimático.
23: metB SEQ ID NO: 33
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24: metB SEQ ID NO: 34
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Cribado de metA resistente a retroalimentación
Se identificaron las mutaciones de metA resistentes a retroalimentación inoculando la cepa TF4076BJF-AB que contiene mutantes de pA-CL en placas de 96 pocillos que contienen medio de microfermentación y cultivando durante 48 h a 31 ºC con agitación. El medio de microfermentación es 1 volumen de medio de matraz agitado como se describe en el ejemplo 3 y 1 volumen de tampón fosfato de potasio 0,05 M pH 6,5, con L-metionina 5 g/l.
Se centrifugaron entonces las placas de 96 pocillos durante 10 min a 3.000 rpm y se midió el OSHS en el sobrenadante mediante el procedimiento enzimático descrito anteriormente (Preparación del extracto bruto de MetB). Se mezclaron 50 µl del sobrenadante de cultivo con 50 µl de tampón de reacción (tampón de reacción: tampón de fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,5) + cisteína 2,5 mM + PLP (5’-fosfato de piridoxal hidratado, Sigma P9255) 10 mM 1/500 + extracto bruto de MetB 1/100 (5 mg/ml)). Se incubó la reacción durante 10 minutos a 37º C. Se añadieron 100 µl de DTNB (4 mg/10 ml de tampón de fosfato de potasio 0,1 M, pH 7,5) y se tomó la DO a 415 nm. Se seleccionaron una o dos colonias que mostraban la menor absorbancia a 415 nm de cada placa de 96 pocillos y se sembraron en estrías sobre medio LB que contenía espectinomicina 50 µg/ml. Se inocularon las colonias resultantes sobre otra placa de 96 pocillos que contenía medio de microfermentación y se efectuó una segunda ronda de cribado. Se ensayaron entonces las cepas seleccionadas en las condiciones de cultivo en matraz agitado descritas anteriormente con la adición de metionina 5 g/l al medio, y se midió la producción de Osuccinilhomoserina.
Se seleccionaron 24 mutantes de las 12.000 colonias para cultivo en matraz y se seleccionaron 14 mutantes para secuenciación. A partir de estos, se identificaron 5 nuevos mutantes. Los otros 9 mutantes restantes poseían las mismas mutaciones que se habían reseñado anteriormente. Se muestra en la Tabla 7 la acumulación de OSHS y homoserina en el cultivo de matraz agitado para los 14 mutantes, y se muestran en la Tabla 8 los cambios de aminoácido en las secuencias de metA de los mutantes seleccionados.
[Tabla 7]
Rendimiento en matraz agitado de mutantes seleccionados
Nº de cepa
DO Glucosa usada (g/l) Producción de OSH (g/l) Producción de HS (g/l)
Control (TF4076BJF-AB/pA-Cl)
6,0 40 4,9 5,5
Nº 7
4,9 40 9,2 2,9
Nº 8
4,6 40 5,4 3,8
Nº 10
4,7 40 8,8 3,0
Nº 11
4,7 40 9,1 2,8
Nº 32
5,8 40 10,7 1,6
Nº 34
5,6 40 10,1 2,4
Nº 36
5,6 40 10,4 2,2
Nº 37
5,9 40 9,6 1,6
Nº 39
7,0 40 9,2 1,0
Nº 22
4,8 40 9,4 1,4
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Nº 23
4,6 40 9,6 1,4
Nº 41
5,6 40 11,8 2,1
Nº 43
6,1 40 11,2 2,3
Nº 47
6,0 40 11,2 2,2
Nº 49
5,6 40 11,5 2,1
[Tabla 8] Análisis de secuencia de mutantes seleccionados
Posición
Wt 32 SEQ ID NO 2 37 SEQ ID NO 4 10 SEQ ID NO 6 11 SEQ ID NO 8 42 SEQ ID NO 10
24
T S (A70T)
29
S P (T85C)
79
N S (236G)
114
E G (A341G)
140
F S (T419C) I (T418A)
163
K Q (A487C)
222
F L (T666A)
275
A E (C824A)
290
N H (A868C)
291
N N (T871A)
295
Q R (A884G)
297
T A (A889G)
304
M L (A910T)
305
N Y (A913T)
Sin cambio de aminoácido
A105G, A597T C222T T450C T915C T573C
5 Resistencia a la retroalimentación de metA mutante
Puesto que todas las metA resistentes a la inhibición por retroalimentación producían cantidades similares de OSHS en presencia de metionina 5 g/l en el cultivo en matraz, se añadieron mayores concentraciones de metionina al medio de cultivo en matraz y se determinó la producción de OSHS. Después de 64 h de cultivo con L-metionina 30 g/l se redujo la producción de OSHS solo en la muestra mutante nº 37, y todas las demás mostraron niveles de
10 producción de OSHS similares que en presencia de metionina 5 g/l. Estos resultados, presentados en la Tabla 9, indicaban que las metA resistentes a la inhibición por retroalimentación eran resistentes a concentraciones de metionina del orden de 30 g/l.
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retenía un 55 % de su actividad específica. Por tanto, los mutantes metA nº 10 y nº 11 pueden usarse en un microorganismo productor de metionina.
Producción de metionina con metA resistente a la inhibición por retroalimentación
Se clonaron individualmente metA nº 10 y metA nº11 en la cepa productora de metionina TF4076BJF. Se clonó también MetA nº 10 junto con metYX de L. meyeri. Se ensayaron los clones siguiendo el protocolo de fermentación descrito en el ejemplo 3A. Se valoraron las concentraciones de metionina después de 78 horas de fermentación y se muestran los resultados en la Tabla 11. No había acumulación de O-succinilhomoserina en ninguna de las fermentaciones. Se muestran en la FIG. 4 los cursos temporales de producción de metionina.
[Tabla 11]
Acumulación de metionina
Cepa
Valoración final de metionina (g/l)
TF4076BJF
2,1
TF4076BJF metA nº 10
6,3
TF4076BJF metA nº 11
4,5
TF4076BJF metA nº 10 + metYX (Lm)
6,6
Estos resultados muestran que la expresión de metA resistentes a la inhibición por retroalimentación aumentaba la producción de metionina y que la combinación de una ruta de sulfhidrilación directa y una ruta de metABC resistente a la inhibición por retroalimentación mostraba menos sinergia que la observada con la MetA nativa. La menor sinergia observada indica que la acumulación de metionina puede estar inhibiendo MetY. Para aumentar adicionalmente la producción de metionina, puede usarse una MetY resistente a la inhibición por retroalimentación.
C. Estrategias para la atenuación de la actividad de MetK en E. coli
Como se describe anteriormente, la formación de SAMe disminuye la concentración de metionina y reduce la
actividad de la ruta biosintética de metionina a través de la inhibición por retroalimentación de metA. El aislamiento de mutantes del gen metK se facilita por la observación de que algunos mutantes resistentes a metionina tienen niveles reducidos de metK y sobreproducen metionina. La Tabla 12 enumera diversas mutaciones de metK que se ha descrito que causan una disminución de la actividad de MetK. Estos mutantes se construyeron como se describe a continuación.
Se clonó el gen metK de E. coli (número de acceso AP_003499 o BAE77005) y se sobreexpresó con un marcador de His N-terminal o C-terminal en el vector pET28b. Se efectuó una mutagénesis dirigida a sitio usando el clon metK marcado con His C-terminal para generar los mutantes deseados. Se confirmó la expresión de las proteínas MetK mutantes.
Se purificaron los mutantes de MetK (usando el marcador de His C-terminal) y se ensayaron in vitro. Se usó la proteína MetK marcada con His C-terminal de tipo silvestre como control. Se ensayaron los mutantes usando un ensayo radiactivo. Las condiciones de ensayo fueron como sigue:
Mezcla de ensayo: 1,0 ml de HEPES/KOH 0,5 M, pH 8,0 0,5 ml de KCl 1,0M 0,2 ml de MgCl2 1,0 M 1,0 ml de ATP 100 mM (sal disódica, pH 8,0 con KOH) 0,1 ml de metionina 50 mM 0,1 ml de NEN [metil-14C]metionina 6,6 ml de H2O EDTA 25 mM, pH 8,0, detención de los ensayos.
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Se añadieron 45 µl de mezcla de ensayo a un tubo Eppendorf y 5 µl de enzima (datos normalizados mostrados en la Tabla 13). Se detuvo la reacción con la adición de 150 µl de EDTA 25 mM. Se puntearon 100 µl de la reacción sobre un círculo de filtro de fosfocelulosa Whatman P-81 de 2,5 cm de diámetro (marcado a lápiz). Se lavaron los filtros con 3 l de agua destilada, se secaron al aire y se dispusieron en viales de centelleo con Aquasol. Se contaron las emisiones usando una ventana que se extiende de 14C hasta aproximadamente 0. Se determinaron los niveles de eficacia de ensayo e inactivación añadiendo una cantidad conocida de cuentas de 14C-SAM pura y procesando a lo largo de todo el procedimiento. Los fondos son típicamente < 100 cpm (cuentas totales aprox. 105 cpm por reacción).
[Tabla 12]
Actividad normalizada
Residuo
Posición Reemplazo Efecto esperado sobre la síntesis de SAM Referencia Actividad (CPM de SAMe/µg de proteína purificada/min)**
His
14 Asn Actividad reducida ~104 veces J. Biol. Chem. 2000 7,7
Asp
16 Asn Reducción de kcat ~103 veces J. Biol. Chem. 1999 2,5
Gly
77 Val Disminución esperada de la actividad de MetK Comunicación personal de Markham 6,9
Cys
90 Ala Solo un 10 % de la actividad WT J. Biol. Chem. 1995 Igual que WT
Cys
90 Ser Solo un 10 % de la actividad WT J. Biol. Chem. 1995 23,2
Asp
118 Asn Reducción de kcat ~103 veces J. Biol. Chem. 1999 1,3
Val
185 Glu Aumento de 6,4 veces de la Met excretada frente al control AEM 2005 4,9
Asp
238 Asn Reducción de kcat ~103 veces J. Biol. Chem. 1999 1,9
Cys
239/240 Ala* Solo un 10 % de la actividad WT J. Biol. Chem. 1995 Igual que WT
Lys
245 Met Actividad 42.000 veces menor que WT J. Biol. Chem. 2000 2,5
Asp
271 Ala Reducción de kcat ~103 veces J. Biol. Chem. 1999 0,4 (no duplicado)
WT de control*
Ninguno Cargill BioTDC 995,4
WT
No marcado Ninguno Markham Lab 5600
10 * La proteína MetK de control WT estaba también marcada con His C-terminal para comparación con las proteínas metK mutantes marcadas. Se observó una reducción de aproximadamente 6 veces de la actividad con la proteína MetK WT marcada en comparación con la actividad de la proteína MetK no marcada.
** actividad reseñada para un tiempo de reacción de 5 minutos
El producto de la reacción de MetK, SAMe, es un inhibidor no competitivo de MetK. Por lo tanto, la cinética de la
15 reacción es complicada de analizar y se espera que la diferencia entre las actividades del tipo silvestre y los mutantes sea aún mayor. Al comprender la actividad de las diversas enzimas MetK mutantes, puede diseñarse un hospedador de producción adecuado.
D. Regulación del transportador de SAMe
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