ES2575082T3

ES2575082T3 - Composiciones y métodos de producción de metionina

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Publication number: ES2575082T3
Application number: ES14173993.8T
Authority: ES
Inventors: Brian Brazeau; Yong-Uk Shin; Hyewon Um; Jin-Sook Chang; Kwang Myung Cho; Young Wook Cho; Mervyn Desouza; Holly J. Jessen; So-Young Kim; Wei Niu; Fernando A. Sanchez-Riera
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2007-04-11
Filing date: 2007-04-11
Publication date: 2016-06-24
Anticipated expiration: 2027-04-11
Also published as: ES2534375T3; EP2808382A1; US20130260424A1; EP2808382B1; ES2400261T3; JP5497628B2; US9150893B2; EP2808381A1; EP2520645A3; EP2808381B1; ES2575906T3; EP2132306A1; KR20100019417A; EP2520645A2; EP2132306B1; JP2010523145A; PL2132306T3; US20160024541A1; CN101688190B; KR101140906B1

Abstract

Polipéptido aislado con actividad homoserina O-succiniltransferasa, que muestra una sensibilidad reducida a la inhibición por retroalimentación por L-metionina en comparación con un polipéptido de homoserina Osucciniltransferasa silvestre derivado de E. coli, y que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Description

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Los huéspedes de producción pueden modificarse por ingeniería genética usando polipéptidos conocidos para producir aspartato semialdehído, o para sobreproducir aspartato semialdehído. Un método de aumento de la producción de productos en la ruta de biosíntesis de metionina es a través de sobreexpresión o la expresión de una forma más activa de aspartato semialdehído deshidrogenasa.

Tal como se usa en el presente documento, aspartato semialdehído deshidrogenasa incluye péptidos de aspartato semialdehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.11), así como cualquier otro péptido que pueda catalizar la conversión de aspartilfosfato en aspartato semialdehído. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos péptidos de aspartato semialdehído deshidrogenasa catalizarán otras reacciones también. Por ejemplo, algunos péptidos de aspartato semialdehído deshidrogenasa aceptarán otros sustratos además de aspartilfosfato, y por tanto, también se incluyen tales péptidos de aspartato semialdehído deshidrogenasa no específicos. Las secuencias de aspartato semialdehído deshidrogenasa están disponibles públicamente. Por ejemplo, los n.os de registro de GenBank: NC_006958, NZ_AAVY01000015 y NZ_AAWW01000010 dan a conocer secuencias de ácido nucleico de aspartato semialdehído deshidrogenasa y los n.os de registro de GenBank: NP_417891, NP_599505 y ZP_0164))72 dan a conocer secuencias de péptido de aspartato semialdehído deshidrogenasa. Se conocen bien en la técnica ensayos para caracterizar la actividad aspartato semialdehído deshidrogenasa de un péptido particular. Por ejemplo, el ensayo descrito por Cohen, GN., Methods in Enzymology, 113:600-602, 1985, puede usarse para caracterizar la actividad de un péptido específico.

D. De aspartato semialdehído a homoserina

Pueden modificarse por ingeniería genética huéspedes de producción usando polipéptidos conocidos para producir homoserina, o para sobreproducir homoserina. Un método de aumento de la producción de productos en la ruta de biosíntesis de metionina es a través de la sobreexpresión o la expresión de una forma más activa de aspartato semialdehído deshidrogenasa.

Tal como se usa en el presente documento, homoserina deshidrogenasa incluye péptidos de homoserina deshidrogenasa (EC 1.1.1.3), así como cualquier otro péptido que pueda catalizar la conversión de aspartato semialdehído en homoserina. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos péptidos de homoserina deshidrogenasa catalizarán otras reacciones también, por ejemplo algunos péptidos de homoserina deshidrogenasa aceptarán otros sustratos además de aspartato semialdehído. Por tanto tales péptidos de homoserina deshidrogenasa no específicos se incluyen también. Las secuencias de péptidos de homoserina deshidrogenasa están disponibles públicamente. Por ejemplo, los n.os de registro de GenBank: NC_006958, NZ_AAVY01000013 y NZ_AAWW01000033 dan a conocer secuencias de ácido nucleico de homoserina deshidrogenasa y los n.os de registro de GenBank: NP_414543, ZP_01639819 y NP_600409 dan a conocer secuencias de péptidos de homoserina deshidrogenasa. Se conocen bien en la técnica ensayos para caracterizar la actividad homoserina deshidrogenasa de un péptido particular. Por ejemplo, puede usarse el ensayo descrito por Patte et al., Biochem. Biophys. Acta 128:426-439, 1966, para caracterizar la actividad de un péptido específico.

E. De homoserina a O-succinilhomoserina (OSHS)

Pueden modificarse por ingeniería genética huéspedes de producción usando polipéptidos conocidos para producir O-succinilhomoserina (OSHS), o para sobreproducir OSHS. Un método de aumento de la producción de productos en la ruta de biosíntesis de metionina es a través de la sobreexpresión o la expresión de una forma más activa péptidos de homoserina O-succiniltransferasa, o usando una forma insensible a la inhibición por retroalimentación de péptidos de homoserina O-succiniltransferasa.

Tal como se usa en el presente documento, succinilCoA homoserina aciltransferasa incluye péptidos de homoserina O-succiniltransferasa (EC 2.3.1.46), así como cualquier otro péptido que pueda catalizar la conversión de homoserina en OSHS. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos péptidos de homoserina O-succiniltransferasa catalizarán otras reacciones también, por ejemplo algunos péptidos de succinilCoA-homoserina aciltransferasa aceptarán otros sustratos además de homoserina. Por tanto, tales péptidos de succinilCoA-homoserina aciltransferasa no específicos se incluyen también. Las secuencias de péptidos de homoserina O-succiniltransferasa están disponibles públicamente. Por ejemplo, el n.º de registro de GenBank: NZ_AAWW01000055 da a conocer una secuencia de ácido nucleico de homoserina O-succiniltransferasa y el n.º de registro de GenBank: AAC76983 da a conocer una secuencia de péptido de homoserina O-succiniltransferasa. Se conocen bien en la técnica ensayos para caracterizar la actividad succinilCoA-homoserina aciltransferasa. Por ejemplo, puede usarse el ensayo descrito por Lawrence, J. Bacteriol., 109:8-11, 1972, para caracterizar la actividad de un péptido específico. Los genes que codifican péptidos de succinilCoA-homoserina aciltransferasa también se denominan en el presente documento metA.

F. De homoserina a O-acetilhomoserina (OAHS)

Pueden modificarse por ingeniería genética huéspedes de producción usando polipéptidos conocidos para producir O-acetilhomoserina (OAHS), o para sobreproducir OAHS. Un método de aumento de la producción de productos en la ruta de biosíntesis de metionina es a través de la sobreexpresión o la expresión de una forma más activa de péptidos de homoserina O-acetiltransferasa (EC 2.3.1.31).

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H. Trans-sulfuración

1. De O-succinilhomoserina (OSHS) o acetilhomoserina (OAHS) a cistationina

Pueden modificarse por ingeniería genética huéspedes de producción usando polipéptidos conocidos para producir cistationina, o para sobreproducir cistationina. Un método de aumento de la producción de productos en la ruta de biosíntesis de metionina es a través de la sobreexpresión o la expresión de una forma más activa de péptidos de cistationina -sintasa (EC 2.5.1.48).

Tal como se usa en el presente documento, cistationina -sintasa incluye péptidos de cistationina -sintasa (EC 2.5.1.48), así como cualquier otro péptido que pueda catalizar la conversión de OSHS u OAHS en cistationina. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos péptidos de cistationina -sintasa catalizarán otras reacciones también, por ejemplo algunos péptidos de cistationina -sintasa aceptarán otros sustratos además de OSHS u OAHS. Por tanto, tales péptidos de cistationina -sintasa no específicos se incluyen también. Las secuencias de péptidos de cistationina -sintasa están disponibles públicamente. Por ejemplo, los n.os de registro de GenBank: NC_006958, NZ_AAWW01000006 y NC_004129 dan a conocer secuencias de ácido nucleico de cistationina -sintasa y los n.os de registro de GenBank: NP_418374, YP_348978 y NP_601979 dan a conocer secuencias de péptidos de cistationina -sintasa. Se conocen bien en la técnica ensayos para caracterizar la actividad cistationina -sintasa de un péptido particular. Por ejemplo, puede usarse el ensayo descrito en Methods in Enzymology, 17:425-433, 1971, para caracterizar la actividad de un péptido específico. Los genes que codifican péptidos de cistationina -sintasa también se denominan en el presente documento metB.

2. De cistationina a homocisteína

Pueden modificarse por ingeniería genética huéspedes de producción usando polipéptidos conocidos para producir homocisteína, o para sobreproducir homocisteína. Un método de aumento de la producción de productos en la ruta de biosíntesis de metionina es a través de la sobreexpresión o la expresión de una forma más activa de péptidos de cistationina -liasa (EC 4.4.1.8).

Tal como se usa en el presente documento, cistationina -liasa incluye péptidos de cistationina -liasa (EC 4.4.1.8), así como cualquier otro péptido que pueda catalizar la conversión de cistationina en homocisteína. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos péptidos de cistationina -liasa catalizarán otras reacciones también, por ejemplo algunos péptidos de cistationina -liasa aceptarán otros sustratos además de cistationina. Por tanto, tales péptidos de cistationina -liasa no específicos se incluyen también. Las secuencias de péptidos de cistationina -liasa están disponibles públicamente. Por ejemplo, los n.os de registro de GenBank: NZ_AAWW01000001, NC_006958 y NZ_AAVY01000004 dan a conocer secuencias de ácido nucleico de cistationina -liasa y los n.os de registro de GenBank: NP_746463, YP_226552 y NP_417481 dan a conocer secuencias de péptidos de cistationina -liasa. Se conocen bien en la técnica ensayos para caracterizar la actividad cistationina -liasa de un péptido particular. Por ejemplo, puede usarse el ensayo descrito en Methods in Enzymology, 143:483-486, 1987, para caracterizar la actividad de un péptido específico. Los genes que codifican péptidos de cistationina -liasa también se denominan en el presente documento metC.

I. De homocisteína a metionina

Pueden modificarse por ingeniería genética huéspedes de producción usando polipéptidos conocidos para producir metionina, o para sobreproducir metionina. Un método de aumento de la producción de productos, tales como metionina o SAMe en la ruta de biosíntesis de metionina es a través de la sobreexpresión o la expresión de una forma más activa de péptidos de homocisteína metliasa (EC 2.1.1.14 y 2.1.1.13).

Tal como se usa en el presente documento, homocisteína metliasa incluye péptidos de homocisteína metliasa (EC 2.1.1.14, y 2.1.1.13), así como cualquier otro péptido que pueda catalizar la conversión de homocisteína en metionina. Adicionalmente, un experto habitual en la técnica apreciará que algunos péptidos de homocisteína metliasa catalizarán otras reacciones también, por ejemplo algunos péptidos de homocisteína metliasa aceptarán otros sustratos además de homocisteína. Por tanto, tales péptidos de homocisteína metliasa no específicos se incluyen también. Las secuencias de péptidos de homocisteína metliasa están disponibles públicamente. Por ejemplo, los n.os de registro de GenBank: NC_004129, NC_006958 y NC_000913 dan a conocer secuencias de ácido nucleico de homocisteína metliasa y los n.os de registro de GenBank: AP_004520, YP_225791 y CAK16133 dan a conocer secuencias de péptidos de homocisteína metliasa. Se conocen bien en la técnica ensayos para caracterizar la actividad homocisteína metliasa de un péptido particular. Por ejemplo, puede usarse el ensayo descrito en Analytical Biochemistry, 228, 323-329, 1995, para caracterizar la actividad de un péptido específico. Los genes que codifican péptidos de homocisteína metliasa se denominan también en el presente documento metH o metE.

J. De metionina a S-adenosilmetionina

Pueden modificarse por ingeniería genética huéspedes de producción usando polipéptidos conocidos para producir S-adenosilmetionina (SAMe), o para sobreproducir SAMe. Un método de aumento de la producción de productos, en

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compuesto por tres componentes de la membrana citoplasmática y una proteína de unión específica de sustrato ubicada en el espacio periplásmico. Los tres componentes de la membrana de la sulfato permeasa están codificados por los genes cysT, cysW y cysA (locus cysA). Los productos del locus cysA se regulan conjuntamente con el resto de la ruta de asimilación de sulfato como parte del regulón cys. Entonces se activa el sulfato mediante acoplamiento a un nucleósido para producir fosfosulfatos de nucleósidos de alta energía por medio de una ruta que parece ser similar en la mayoría de los organismos.

Tal como se muestra en la figura 6, un microorganismo tal como E. coli utiliza una ruta que convierte el sulfato en adenililsulfato (APS) usando un péptido de sulfato adenilil transferasa (EC 2.7.7.4 codificado por cysNcysD). El APS se convierte entonces en PAPS mediante APS cinasa (EC 2.7.1.25 codificada por cysC). Esta etapa requiere un ATP. PAPS se convierte en sulfito mediante una PAPS reductasa (EC 1.8.4.8 codificada por cysH) y el sulfito se reduce a sulfuro mediante NADPH-sulfito reductasa (EC 1.8.1.2 codificada por cysIcysJcysG). La ruta alternativa, mostrada en el lado derecho de la figura 6, convierte APS directamente en sulfito usando una adenililsulfato reductasa (EC 1.8.9.92 ó 1.8.4.9). Un experto habitual en la técnica apreciará que funcionará cualquier adenililsulfato reductasa que pueda convertir APS en sulfito. Por ejemplo, la adenililsulfato reductasa de Bacillus subtilis (número de registro CAA04409), o de Pseudomonas aeruginosa (número de registro NP_250447).

Pueden introducirse secuencias de ácido nucleico que codifican adenililsulfato reductasa en cualquier microorganismo usado para producir metionina. Por ejemplo las cepas descritas en el presente documento, así como las cepas descritas en los documentos WO2005/108561 y WO2006138689 de Metabolic Explorer, y las descritas por Kumar y Gomes, Biotechnology Advances 23:41-61, 2005, pueden beneficiarse de la ruta dada a conocer que sortea PAPS y por tanto requiere una molécula de ATP menos para la asimilación del sulfato.

Ejemplos

Ejemplo 1: Rutas de producción de metionina múltiples, una de las cuales usa sulfhidrilación directa, usando secuencias de ácido nucleico expresadas de manera exógena

A. Construcción de un microorganismo que tiene tanto metABC (trans-sulfuración) como metAZ (sulfhidrilación directa)

Tal como se describió anteriormente, la producción endógena de metionina en E. coli se produce principalmente a través de la reacción de transulfuración. Este ejemplo describe la modificación por ingeniería genética de E. coli para aumentar la sulfhidrilación directa al tiempo que también se mantiene la ruta de metABC endógena.

Se aumentó la sulfhidrilación directa clonando O-succinilsulfhidrilasa (EC 4.2.99.-) que convierte Osuccinilhomoserina en homocisteína mediante reacción con sulfuro de hidrógeno. Esta enzima se codifica por metZ y puede encontrarse en algunas especies de Pseudomonas (Vermeij y Kertesz, J Bacteriol. 181:5833-5837, 1999 e Inoue et al., J. Bacteriol. 179:3956-3962, 1997).

Más específicamente, se clonó metZ de Pseudomonas aeruginosa en auxótrofos de metionina de la cepa TF4076BJF, que se derivó de la cepa de producción de treonina TF4076 (modificada adicionalmente mediante la deleción de thrB y metJ, y la inserción de metF bajo el control del promotor pTrc, descrito adicionalmente en el ejemplo 3, más adelante). Estos auxótrofos tienen una deleción de los genes o bien metB o bien metB y metC. metZ de Pseudomonas aeruginosa potenció el crecimiento de los mutantes por deleción de metB y metBC en medio mínimo. Aun cuando en cultivos en frasco la producción de metionina no se recuperaba completamente, la expresión de metZ induce la producción de metionina hasta 100 mg/l en el mutante por deleción de metBC, tal como se muestra en la tabla 1. Esto indica que metZ es responsable de la producción de homocisteína en la célula.

La baja producción de metionina de los mutantes por deleción transformados con metZ puede deberse a la limitación de sulfuro en la fracción intracelular (a continuación se proporcionan métodos de aumento de la concentración de sulfuro). Esto está apoyado por el hallazgo de que el crecimiento de la cepa por deleción de metBC transformada con metZ se potenció en medios M9 en presencia de sulfuro de sodio 2 mM. En ensayos in vitro, la Osuccinilsulfhidrilasa tenía una baja afinidad por sulfuro. A través de evolución dirigida, es posible desarrollar Osuccinilsulfhidrilasas mejoradas con mayor afinidad por sulfuro y también mayor actividad. Una Osuccinilsulfhidrilasa altamente activa puede reemplazar a metB y metC en la ruta de metionina, o puede complementar la ruta para aumentar el flujo de carbono a la metionina.

[Tabla 1]

Complementación del crecimiento y producción de metionina en TF4076BFJ-BC

TF4076BJF-BC: DO glucosa producto intermedio de met (mg/l) GA y HS (g/l)

usada (g/l): OSH met HS GA

vector vacío: 2,5 10,0 3867 0,0 0,0 0,4

pCL-metB: 20,9 38,1 0,0 0,0 0,6 0,2

pCL-metB-metC: 9,7 40,0 0,0 670 4,36 2,4

pPro-metZ: 13,0 40,0 0,0 101 3,1 4,3

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4.: metJ+ cloranfenicol SEQ ID NO: 14

5’-gtattcccac gtctccgggt taatccccat ctcacgcatg atctccatat gaatatcctc cttag-3’

5.: metJ SEQ ID NO: 15

5’-gggctttgtc ggtgaaatg-3’

6.: metJ SEQ ID NO: 16

5’-actttgcgat gagcgagag-3’

Integración de metF

Para complementar la auxotrofía de metionina de TF4076BJ, se expresó el gen metF en la cepa TF4076BJ. Se amplificó el gen metF usando las secuencias de cebador 7 y 8 (SEQ ID NO: 17 y 18) y el cromosoma de la cepa de

E. coli K12 como molde. Se usaron condiciones de PCR de 94ºC durante 30 segundos, luego 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto, y luego 72ºC durante 7 minutos y premezcla de PCR HL (Bioneer Co., Corea). Se eluyeron en gel los fragmentos de PCR y se insertaron en los sitios NheI y SacI en el vector pSE380 (Invitrogen Co.). El plásmido se nombró pSE380-metF. Se transformó pSE380metF en la cepa TF4076BJ. El transformante crecía sobre medio mínimo M9 (Difco) que contenía treonina e isoleucina indicando la complementación de la auxotrofía de metionina.

Se determinó el nivel de expresión del gen metF bajo el control de dos promotores diferentes. Los promotores fueron el promotor pCJ1 (documento PCT/KR2005/004338) y el promotor pThreonine. Se amplificó el gen metF usando las secuencias de cebador 9 y 10 (SEQ ID NO: 19 y 20) y el cromosoma de la cepa de Escherichia coli K12 como molde. Se usaron condiciones de PCR de 94ºC durante 30 segundos, luego 25 ciclos de 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s, 72ºC durante 1 min, y luego 72ºC durante 7 min y premezcla de PCR HL (Bioneer Co., Corea). Se eluyeron en gel los fragmentos de PCR y se ligaron en los sitios PvuII y HindIII en el vector pCL1920 (Lerner y Inouye, Nucleic Acids Research 18:4631, 1990) que contenía el promotor pCJ1 o el promotor pThreonine. Se amplificó por PCR el promotor pCJ1 usando las secuencias de cebador 11 y 12 (SEQ ID NO: 21 y 22) y se amplificó el promotor pThreonine a partir del cromosoma de E. coli K12 usando las secuencias de cebador 13 y 14 (SEQ ID NO: 23 y 24). Se eluyeron en gel los fragmentos de PCR y se integraron en los sitios KpnI y EcoRV en el vector pCL1920. Las condiciones de PCR usadas fueron las mismas que anteriormente. El plásmido que contenía en el gen metF bajo el control del promotor pCJ1 se nombró pCL-pCJ1-metF y el plásmido que contenía el gen metF bajo el control del promotor de pThreonine se nombró pCL-pThr-metF. Se transformó cada plásmido en la cepa TF4076BJ y se midió la producción de metionina.

Se usó un protocolo de cultivo en frasco de agitación para someter a prueba las cepas tal como sigue: se incubó un cultivo simiente a 31ºC durante 6 h en medio que consistía en (en 1 l): 10 g de extracto de levadura, 6 g de Na2HPO4·12H2O, 0,5 g de NaCl, 3 g de KH2PO4, 2 g de glucosa, 0,49 g de MgSO4·7H2O, 0,015 g de CaCl2·2H2O. Entonces se usó para inocular frascos con el siguiente medio: (1 l): 17 g de (NH4)2SO4, 1 g de MgSO4·7H2O, 2 g de extracto de levadura, 0,3 g de L-treonina, 10 mg de MnSO4·7H2O, 10 mg de FeSO4·7H2O, 10 mg de ZnSO4, 30 g de CaCO3, 40 g de glucosa y 2 g de KH2PO4 pH 7,2. Se incubaron los frascos durante de 64 a 72 horas a 31ºC con agitación a 250 rpm. Tras la centrifugación, se aisló el sobrenadante de cultivo y se usó para el análisis de metionina.

Para el cultivo de células que contenían el plásmido pSE380-metF, se añadieron ampicilina 100 g/l e IPTG 0,5 mM a los medios. El gen metF bajo el control del promotor pCJ1 produjo la mayor cantidad de metionina tal como se muestra en la tabla 4.

[Tabla 4]

Producción de metionina en células que contienen diversos casetes de expresión de metF

DO: Glucosa usada (g/l) Metionina (mg/l)

TF4076BJ: 7,8 34 0

TF4076BJ/pSE380-metF: 5,4 29 130

TF4076BJ/pCL-pCJ1-MetF: 7,4 35 206

TF4076BJ/pCL-pthr-MetF: 22 40 136

Para expresar el gen metF de manera más estale, se integraron los genes metF bajo los promotores pTrc, pCJ1 y pThreonine en el locus lacZ del cromosoma de TF4076BJ. Se amplificó por PCR cada gen metF a partir de cada

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30% de saturación y se controló inicialmente el pH con NH4OH al 28%. Tras agotarse la glucosa, el pH se aumentó. En ese momento, se inició una alimentación fija continua, o se añadieron alícuotas de 100 -150 ml de alimentación de una vez, basándose en los aumentos en el pH. La alimentación consistía en extracto de levadura 4,0 g/l, (NH4)2SO4 33 g/l, KH2PO4 3,0 g/l, L-treonina 1,5 g/l, MgSO4-7H2O 1,0 g/l, vitamina B12 2 mg/l y glucosa 400 g/l. Se introdujeron algunas variaciones menores en el medio y la alimentación dependiendo de la cepa. La fermentación se realizó durante un total de 72 a 96 horas. Se midió la concentración de metionina a lo largo de todo el procedimiento, así como el crecimiento celular mediante densidad óptica y el uso de glucosa.

B. Generación de homoserina succiniltransferasas resistentes a la retroalimentación para la producción de metionina

Se construyó una cepa de E. coli con los genes metA y metB delecionados. Esta cepa mostró acumulación de homoserina debido a la pérdida de la actividad MetA. Cuando se expresó el casete de metA silvestre en esta cepa, se produjo OSHS por la actividad MetA en ausencia de metionina. Sin embargo, cuando se añadió metionina en los medios, la cepa con el casete de metA silvestre acumuló homoserina de nuevo debido a la inhibición por retroalimentación de la actividad MetA. Por tanto, pueden identificarse genes metA resistentes a la retroalimentación mediante pruebas para detectar la acumulación de O-succinilhomoserina en presencia de metionina. El mutante que produce más OSHS en presencia de una alta cantidad de metionina en los medios contiene el metA más resistente a la inhibición por retroalimentación.

En la figura 3 se proporciona una representación esquemática de la metodología de examen.

Construcción del mutante por deleción de metB

Para preparar un mutante por deleción de metB en TF4076BJF, se usó el método de deleción en una etapa FRT (Datsanko y Wanner, PNAS 97:6640-6645, 2000). Se amplificaron fragmentos de PCR usando las secuencias de cebador 15 y 16 (SEQ ID NO: 25 y 26) y se introdujo por electroporación el molde pKD3 en células TF4073BJF. Se usaron las condiciones de PCR de 94ºC durante 30 segundos, 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto, luego 72ºC durante 7 min y premezcla de PCR HL (Corea, Bioneer Co). Se seleccionaron colonias resistentes a cloranfenicol y se confirmó la deleción del gen metB usando PCR. Se eliminó el gen marcador de cloranfenicol usando transformación con el plásmido pCP20, y se confirmó la eliminación mediante PCR. La cepa obtenida mediante este procedimiento se nombró TF4076BJF-B.

15.: metB + cloranfenicol SEQ ID NO: 25

16.: metB + cloranfenicol SEQ ID NO: 26

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Construcción del mutante por deleción de metA

Para preparar un mutante por deleción de metA en TF4076BJF-B, se usó el método de deleción en una etapa FRT (PNAS .97:6640-6645, 2000). Se amplificaron fragmentos de PCR usando las secuencias de cebador 17, 18 (SEQ ID NO: 27 y 28) y se introdujo por electroporación el molde pKD3 en células TF4073BJF-B. Se usaron las condiciones de PCR de 94ºC durante 30 segundos, 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto, luego 72ºC durante 7 minutos y premezcla de PCR HL (Corea, Bioneer Co). Se seleccionaron colonias resistentes a cloranfenicol y se confirmó la deleción del gen metA usando PCR. Se eliminó el gen marcador de cloranfenicol usando transformación con el plásmido pCP20, y se confirmó la eliminación mediante PCR. La cepa obtenida mediante este procedimiento se nombró TF4076BJF-BA.

17.: metA + cloranfenicol SEQ ID NO: 27

18.: metA + cloranfenicol SEQ ID NO: 28

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Construcción del vector de expresión de metA

Para preparar una biblioteca de metA, se construyó un vector de expresión de metA. Se amplificó el gen metA usando las secuencias de cebador 19 y 20 (SEQ ID NO: 29 y 30) con el cromosoma de la cepa de E. coli K12 como molde. Se usaron las condiciones de PCR de 94ºC durante 30 segundos, 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto, luego 72ºC durante 7 minutos y premezcla de PCR HL (Corea, Bioneer Co). Se eluyeron en gel los fragmentos de PCR y se ligaron en pCL1920 en el sitio SmaI. El plásmido se nombró pA-CL. Se transformó el plásmido pA-CL en la cepa TF4076BJFAB y se realizó el cultivo en frasco con y sin metionina. Se midieron OSHS y homoserina mediante el mismo método que se describió anteriormente para metionina. Tal como se muestra en la tabla 6, las células que contenían el plásmido pA-CL en ausencia de metionina produjeron OSHS 3,8 g/l con homoserina 0,24 g/l. Sin embargo, en presencia de metionina 1 g/l las células produjeron OSHS 5,8 g/l con homoserina 4,9 g/l. El aumento de la cantidad de OSHS se debe al aumento de crecimiento por la adición de metionina, mientras que el aumento de homoserina se debe a la inhibición por retroalimentación de la actividad metA por metionina.

[Tabla 6]

Producción de O-succinilhomoserina y homoserina en la cepa TF4076BJF-AB que contiene el plásmido pA-CL

Adición de metionina: Cepa DO Glucosa usada (g/l) Producción de OSH (g/l) Producción de HS (g/l)

0 g/l: TF4076BJFAB/pC11920 2,2 14,2 0 1,42

0 g/l: TF4076BJF-AB/pACL 2,1 13,1 3,8 0,24

1 g/l: TF4076BJF-AB/pC11920 4,7 39,8 0 5,7

1 g/l: TF4076BJF-AB/pACL 6,4 37,4 5,9 4,9

19: metA SEQ ID NO: 29 5’-aatggatccTGCCGTGAGCGGCGAATAC-3’

20: metA SEQ ID NO: 30 5’-agctctagaCTGCTGAGGTACGTTTCGG-3’

Construcción de la biblioteca de mutantes de pA-CL

Para preparar una biblioteca de mutantes de pA-CL, se realizó PCR propensa a errores. Se realizó la PCR propensa a errores usando las secuencias de cebador 21 y 22 (SEQ ID NO: 31 y 32) con el plásmido pA-CL como molde. Se usaron las condiciones de PCR de 94ºC durante 30 segundos, 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 2 minutos, luego 72ºC durante 7 minutos y el kit de mutagénesis por PCR Diversify de BD (BD, EE.UU.). Se digirieron los fragmentos de PCR mediante BamHI y XbaI y se ligaron en pCL1920. Se transformó la biblioteca en la cepa TF4076BJF-AB y se recogieron 30.000 transformantes para su análisis adicional.

21: pCL1920 SEQ ID NO: 31 5’-CGAAGTAATCGCAACATCCG-3’

22: pCL1920 SEQ ID NO: 32 5’-GTCTGCTATGTGGTGCTATC-3’

Preparación del extracto en bruto de enzima MetB

Para medir la OSHS mediante el método enzimático, se usó la enzima MetB de E. coli. La enzima MetB reacciona con OSHS y cisteína en una razón 1:1 y produce cistationina. El reactivo DTNB (ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoico) Sigma D8130) reacciona con el grupo SH libre de cisteína y produce un color amarillo que puede medirse a 415 nm. Antes de la reacción de MetB, la cisteína reacciona con DTNB y se vuelve de color amarillo. Tras la reacción de MetB, la cisteína se convierte en cistationina que no puede unirse a DTNB. Mediante la disminución de la DO a 415 nm tras la reacción, puede medirse la cantidad de OSHS en la mezcla de reacción.

Para la sobreexpresión de la enzima MetB, se digirió el gen metB amplificado por PCR a partir del cromosoma de E.

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N.º 47: 6,0 40 11,2 2,2

N.º 49: 5,6 40 11,5 2,1

[Tabla 8] Análisis de secuencia de mutantes seleccionados

Posición: Silvestre 32 SEQ ID NO: 2 37 SEQ ID NO: 4 10 SEQ ID NO: 6 11 SEQ ID NO: 8 41 SEQ ID NO: 10

24: T S (A70T)

29: S P (T85C)

79: N S (A236G)

114: E G (A341G)

140: F S (T419C) I (T418A)

163: K Q (A487C)

222: F L (T666A)

275: A E (C824A)

290: N H (A868C)

291: Y N (T871A)

295: Q R (A884G)

297: T A (A889G)

304: M L (A910T)

305: N Y (A913T)

Sin cambio de aminoácido: A105G, A597T C222T T450C T915C T573C

Resistencia a la retroalimentación de metA mutante

Puesto que todos los metA resistentes a la inhibición por retroalimentación producían cantidades similares de OSHS

5 en presencia de metionina 5 g/l en el cultivo en frasco, se añadieron concentraciones de metionina superiores en los medios de cultivo en frasco y se determinó la producción de OSHS. Tras 64 h de cultivo con L-metionina 30 g/l, la producción de OSHS disminuyó sólo en la muestra de mutante n.º 37, y todas las otras mostraron niveles similares de producción de OSHS que en presencia de metionina 5 g/l. Estos resultados, presentados en la tabla 9, indicaron que los metA con resistencia a la inhibición por retroalimentación eran resistentes a concentraciones de hasta

10 metionina 30 g/l.

[Tabla 9]

Producción de OSHS de metA mutantes en presencia de metionina 30 g/l

Cepa: DO Glucosa usada (g/l) Producción de OSH (g/l) Producción de HS (g/l)

Control (TF4076BJF-AB/pA-Cl): 4,36 38,6 2,7 1,1

N.º 10: 3,3 33,1 10,6 0,44

N.º 11: 3,5 36,6 11,5 0,22

N.º 32: 3,1 30,2 10,7 0,23

N.º 37: 2,0 22,0 6,2 0,05

N.º 41: 4,4 40,0 10,5 No analizado

Caracterización in vitro de proteínas de metA mutantes

Se usó PCR para amplificar y luego clonar los cinco genes mutantes metA identificados como pCL-A n.º 10, pCL-A

15 n.º 11, pCLA n.º 32, pCL-A n.º 37 y pCL-A n.º 41, en el vector pET30a. Se sometieron todos los constructos a análisis de secuencia de ADN para confirmar la presencia de mutaciones. Se clonaron los genes con una etiqueta de His en el extremo C-terminal para la purificación de la enzima. Se sobreexpresaron las enzimas, se purificaron y se midió la actividad en presencia de diferentes niveles de metionina y SAMe, tal como se describe por Lawrence, J. Bacteriol., 109:8-11, 1972. Las únicas modificaciones en el ensayo fueron que se tomaron múltiples puntos y que la

20 reacción se extinguió con guanidina. La tabla 10 proporciona un resumen de la actividad de los diversos mutantes, y muestra claramente que todos los mutantes eran resistentes a la inhibición por retroalimentación en comparación con la enzima silvestre y que los mutantes n.º 10 y n.º 11 eran los más resistentes a la inhibición tanto con metionina como con SAM.

[Tabla 10]

25 Caracterización de enzimas MetA mutantes y silvestres

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un ensayo radiactivo. Las condiciones de ensayo fueron las siguientes: Mezcla de ensayo: 1,0 ml de KOH/HEPES 0,5 M, pH 8,0 0,5mlde KCl 1,0 M

5 0,2 ml de MgCl2 1,0 M 1,0 ml de ATP 100 mM (sal de disodio, pH 8,0 con KOH) 0,1 ml de metionina 50 mM 0,1 ml de NEN [metil-14C]metionina 6,6 ml de H2O

10 EDTA 25 mM pH 8,0 para detener los ensayos. Se añadieron 45 l de mezcla de ensayo a un tubo Eppendorf y 5 l de enzima (datos normalizados mostrados en la tabla 13). Se incubó la reacción a temperatura ambiente (o 25ºC) durante un periodo deseado (de 1 a 10 minutos). Se detuvo la reacción con la adición de 150 l de EDTA 25 mM. Se colocaron 100 l de la reacción sobre un círculo de filtro de fosfocelulosa Whatman P-81 de 2,5 cm de diámetro (marcado con un lápiz). Se lavaron los filtros con 3 l 15 de agua destilada, se secaron al aire y se colocaron en viales de centelleo con Aquasol. Se contaron las emisiones usando una ventana que se extiende desde 14C hasta aproximadamente 0. Se determinaron la eficacia del ensayo y

los niveles de extinción añadiendo una cantidad conocida de cuantas de 14C-SAM pura y procesando a lo largo de todo el procedimiento. El fondo era normalmente < 100 cpm (cuentas totales de aprox. 105 cpm por reacción). [Tabla 12]

20 Actividad normalizada

Residuo: Posición Reemplazo Efecto esperado sobre la síntesis de SAMe Referencia Actividad (CPM de SAMe/g de proteína purificada/min) **

His: 14 Asn Actividad reducida 104 veces J. Biol Chem 2000 7,7

Asp: 16 Asn Reducción de kcat de 103 veces J. Biol Chem 1999 2,5

Gly: 77 Val Disminución esperada en la actividad MetK Comunicación personal de Markham 6,9

Cys: 90 Ala Sólo el 10% de la actividad silvestre J. Biol Chem 1995 Igual que la silvestre

Cys: 90 Ser Sólo el 10% de la actividad silvestre J. Biol Chem 1995 23,2

Asp: 118 Asn Reducción de kcat de 103 veces J. Biol Chem 1999 1,3

Val: 185 Glu Aumento de 6,4X en Met excretada con respeto al control AEM 2005 4,9

Asp: 238 Asn Reducción de kcat de 103 veces J. Biol Chem 1999 1,9

Cys: 239/240 Ala* Sólo el 10% de la actividad silvestre J. Biol Chem 1995 Igual que la silvestre

Lys: 245 Met Actividad 42.000 veces menor que la enzima silvestre J. Biol Chem 2000 2,5

Asp: 271 Ala Reducción de kcat de 103 veces J. Biol Chem 1999 0,4 (no duplicado)

Control silvestre*: Ninguno Cargill BioTDC 995,4

Silvestre: Sin etiqueta Ninguno Laboratorio Markham 5600

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* La proteína MetK control silvestre también estaba etiquetada con His C-terminal para la comparación con las proteínas de metK mutantes etiquetadas. Se observó una disminución de aproximadamente 6 veces en la actividad con la proteína MetK silvestre etiquetada en comparación con la actividad de la proteína MetK no etiquetada.

** Actividad durante un tiempo de reacción de 5 minutos notificada

El producto de la reacción de MetK, SAMe, es un inhibidor no competitivo de MetK. Por tanto, la cinética de reacción es complicada de analizar y se espera que la diferencia entre las actividades de la enzima silvestre y los mutantes sea incluso superior. Entendiendo la actividad de las diversas enzimas MetK mutantes, puede diseñarse un huésped de producción adecuado.

D. Regulación del transportador de SAMe

S-AdenosilMet (SAMe) sirve como donador de grupos metilo principal en todos los organismos, está implicado en la biosíntesis de poliamina y es esencial para el crecimiento celular. S-adenosiltransferasa (MetK, EC 2.5.1.6) cataliza la única ruta conocida para la biosíntesis de SAMe en E. coli, ya que este organismo no puede captar SAMe del medio de crecimiento. Una alternativa para la regulación por disminución de metK tal como se describió anteriormente es dotar a E. coli de la capacidad de captar SAMe y simultáneamente desactivar el gen metK, para reducir o evitar el uso de metionina por medio de esa ruta. Entonces puede controlarse el crecimiento celular mediante la adición de SAMe al medio de fermentación.

Se ha identificado un sistema de transporte de SAMe de alta afinidad en Rickettsia (Tucker et al., J. Bact. 185: 30313035, 2003). Este transportador de SAMe tiene valores de KT de 2-8 M que son comparables a los valores para el transportador de S. cerevisiae (3,3 M), P. carnii (4,5 M) e hígado de rata (8,9 M). Además, se ha notificado que el sistema de transporte de SAMe de Rickettsia puede complementar un mutante por deleción de metK de E. coli (Driskell et al., J. Bact. 187:5719-5722, 2005).

Se transformaron las cepas W3110 y TF4076BJF con un plásmido que contenía el transportador de SAM mencionado anteriormente. Se desactivó el gen metK de W3110 y se verificó mediante PCR. Según estas modificaciones, la nueva cepa debe poder crecer sólo en presencia de SAM, pero no sin ella. Sin embargo, siguió creciendo tanto en ausencia como en presencia de SAM exógena.

E. Desactivación de transportadores de captación de metionina para aumentar la metionina en el medio de fermentación

Se han identificado dos transportadores de L-metionina en E. coli, uno con una afinidad muy alta (Km = 0,1-0,13 M) y un segundo con menor afinidad (Km = 20-40 M). El locus para el sistema de transportador de alta afinidad se designa metD puesto que los mutantes de metD no pueden transportar D-metionina y usarla como fuente de metionina. El locus metD corresponde a los genes abc (metN), yaeE (metI) y yaeC (metQ) que codifican un transportador ABC necesario para la captación de L-metionina y D-metionina. metN codifica la ATPasa supuesta y metI codifica la región que se extiende por la membrana del transportador ABC metD. Se espera que el tercer componente, metQ, codifique para el dominio de unión a sustrato. Puesto que los mutantes por deleción de metI, metN y metQ todavía pueden crecer en presencia de L-metionina, se toma como una evidencia indirecta de la presencia del sistema de metP de baja afinidad.

Tal como se ilustra en la figura 5, metD importa D-y L-metionina, mientras que el transportador no caracterizado genéticamente metP importa sólo L-metionina. MetD se representa como un transportador ABC típico con sus tres componentes: A, E y C representan abc (ATPasa), yaeE (permeasa) y yaeC (proteína de unión a D-metionina), respectivamente. (Merlin et al., J. Bacteriol. 184: 5513-5517, 2002).

Se mostró que metJ, la proteína represora de metionina global, controlaba negativamente la expresión del operón que codifica el locus metD. La transcripción de los genes metD aumenta tras la privación de metionina, que es un correpresor de metJ. En células con una deleción de metJ, los transportadores se expresan más altamente y no se reprimen por metionina (Merlin et al., J. Bacteriol. 184: 5513-5517, 2002). Las cepas de producción de metionina tienen generalmente secuencias de metJ atenuadas o deleciones de metJ de modo que, para aumentar la producción, puede ser particularmente importante reducir la actividad de importación de metionina. Las cepas pueden modificarse desactivando el sistema de captación de metionina de metD. Esto impedirá la captación de metionina y evitará el posible ciclo inútil de desperdicio de energía de captación/excreción.

La desactivación de metD dio como resultado un aumento del 25% en la acumulación de metionina en el caldo de fermentación, tal como se mide mediante el protocolo de frasco de agitación descrito en el ejemplo 3, anteriormente.

F. Sobreexpresión de metH

El aumento en el flujo de carbono a través de la ruta de metionina debido a las modificaciones en las cepas descritas en el presente documento, puede conducir a una acumulación de homocisteína dentro de la célula. La homocisteína es muy tóxica para la célula. Para evitar cualquier acumulación y convertir la homocisteína en metionina, es muy importante tener una actividad homocisteína metilasa (EC 2.1.1.13 y 2.1.1.14) muy activa que se codifican por metE

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y metH, respectivamente. Un modo de lograr esto es sobreexpresar estos genes o bien en un sistema de plásmido o bien colocando la copia cromosómica bajo el control de un promotor fuerte.

Se sobreexpresó el gen metH nativo de E. coli bajo varios promotores diferentes en una cepa que contenía las rutas dobles metABC y metXY, y se midió la producción de metionina en el protocolo de frasco de agitación convencional. Los tres vectores usados para la sobreexpresión de metH fueron pCL-P(cysK), pCL-P(pro) y pCL-P(CJ-1) que se modificaron respectivamente a partir del plásmido disponible comercialmente pCL1920 reemplazando el promotor Plac por el promotor del gen cysK de E. coli, el promotor del vector comercial pPROLar y el promotor CJ1 propiedad de CJ Corporation. Se situó el ORF del gen metH de E. coli justo en el sentido de 3’ de los promotores. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 13, a continuación. Quedó claro que incluso a los niveles relativamente bajos de metionina acumulada en el protocolo de frasco de agitación, la presencia de una alta concentración de la homocisteína metilasa tuvo un efecto positivo muy significativo sobre la producción de metionina. El efecto fue incluso más pronunciado en fermentadores.

[Tabla 13]

Efecto de la sobreexpresión de metH sobre la producción de metionina

Cepas: DO Glucosa usada Metionina producida

g/l: mg/l

TF4076BJF met YX Lm: 7,4 40,0 868

TF4076BJF met YX Lm pcL-P(cysK) met H: 11,7 33,9 1289

TF4076BJF met YX Lm pcL-P (pro) met H: 7,5 32,8 1062

TF4076BJF met YX Lm pcL-P (CJ-1) met H: 12,4 40,0 1337

TF4076BJF met YX Dr: 10 38,2 569

TF4076BJF met YX Dr pcL-P (cysK) met H: 15,4 40,0 896

TF4076BJF met YX Dr pcL-P (pro) met H: 12,5 40,0 786

TF4076BJF met YX Dr pcL-P (CJ-1) met H: 15 40,0 856

G. Mejora de la captación de sulfato y aumento de la reserva de APS en organismos productores de metionina

Este ejemplo describe un método de modificación por ingeniería genética de E. coli para sortear el producto intermedio, PAPS, en su ruta de asimilación de azufre endógena. La nueva ruta creada requiere una molécula de ATP menos por cada molécula de sulfato reducida a sulfuro, por tanto, es más eficiente desde el punto de vista energético (véase la figura 6).

Tal como se describió anteriormente, la figura 6 muestra dos modos para aprovechar rutas de asimilación de azufre alternativas. Un modo es clonar el gen de adenililsulfato reductasa, cysH (EC 1.8.4.9) de Bacillus o P. aeruginosa yo bien incorporarlo en el genoma de E. coli o bien expresarlo a partir de un plásmido. Esto permite que APS se convierta en sulfito en una única etapa, evitando así la conversión de APS en PAPS catalizada por APS cinasa (cysC) de E. coli. El segundo modo sería mutar el gen de PAPS reductasa de E. coli, basándose en los homólogos de cysH bacterianos, de modo que su especificidad de sustrato se cambia de PAPS a APS.

Se clonaron los genes cysH de Bacillus subtilis 168 (número de registro AJ000974 región: 548..1249) y Pseudomonas aeruginosa PA01 (número de registro NC_002516 región: 1895692..1896495) en plásmidos y se sometieron a prueba para determinar si podían complementar mutantes deficientes en cysC o cysH de E. coli, que son auxótrofos tanto para cisteína como para metionina.

En resumen, se transformaron los genes cysH de Bacillus subtilis 168 y Pseudomonas aeruginosa PA01 en BL21(DE3)cysH, un mutante deficiente en cysH de BL21(DE3), para someter a prueba la complementación. Se usaron colonias individuales a partir de las cuatro cepas siguientes para inocular cultivos de 5 ml que contenían el medio Overnight Express (OnEX: medio definido complementado con aminoácidos pero sin cisteína ni metionina) de Novagen.

Se incubaron los cultivos durante 48 h a 30ºC con agitación constante. Los resultados, presentados en la tabla 14, indican que tanto el gen cysH de B. subtilis como de P. aeruginosa podían complementar la desactivación de cysH en E. coli y mantener el crecimiento.

[Tabla 14]

Densidad óptica a 600 nm de experimentos de complementación de cysH

Cepa: DO600

BL21(DE3) (cepa silvestre): 5,2

BL21 (DE3)cysH (con deleción de cysH): 0

BL21(DE3)cysH + pET23BscysH (adición de cysH de Bacillus): 7,2

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BL21(DE3)  cysH + pET23PacysH (adición de cysH de Pseudomonas) 6,8

De manera similar, se usó una cepa que tenía el gen cysC desactivado para someter a prueba la complementación mediante los genes cysH de B. subtilis y P. aeruginosa. Se transformó la cepa BL21(DE3) cysC con los plásmidos pET23a, pET23a+cysH (B. subtilis) y pET23a+cysH (P. aeruginosa), respectivamente. Se inocularon colonias individuales de las tres cepas anteriores junto con BL21(DE3) en 5 ml de medio OnEx que contenía aminoácidos excepto L-cisteína y L-metionina. Se cultivaron las células a 37ºC con agitación durante 48 h y se midió el crecimiento mediante DO600 nm. Los resultados, mostrados en la tabla 15, indicaron que APS reductasa codificada por cysH tanto de B. subtilis como de P. aeruginosa podía complementar la mutación de cysC en BL21(DE3), lo que demostró que era posible sortear la formación de PAPS.

[Tabla 15]

Densidad óptica a 600 nm de experimentos de complementación de cysC

Cepa DO600 nma BL21(DE3) 4,5 BL21(DE3) cysC +pET23a 0,0 BL21(DE3) cysC +pET23a +cysH (B. subtilis) 2,5 BL21(DE3) cysC +pET23a +cysH (P. aeruginosa) 4,2

a. Los resultados son el promedio de tres cultivos.

Sobreexpresión de enzimas en la ruta de asimilación de azufre

Tal como se describió anteriormente, para aumentar la producción de metionina puede ser útil tener una ruta de asimilación de azufre muy eficaz. Para facilitar la sulfhidrilación directa del precursor de acilhomoserina, la disponibilidad de SH2 es esencial. Se clonaron todos los genes principales de la ruta de asimilación de azufre y se sobreexpresaron en la cepa de producción de metionina TF4076BJF. Los genes sobreexpresados fueron:

cys PUWA: sulfato permeasa cysDN: ATP sulfurilasa (EC 2.7.7.4) CysCCysH: APS cinasa y PAPS sulfotransferasa (EC 2.7.1.25 y EC 1.8.4.8) CysIJCysG: NADPH-sulfito reductasa (EC 1.8.1.2) CysB: activador de la transcripción Se sobreexpresaron estos genes en una cepa que contenía las rutas dobles metABC y metXY, y se midió la

producción de metionina en el protocolo de frasco de agitación convencional. Se clonaron respectivamente los cinco grupos mencionados anteriormente de genes de asimilación de sulfato en el vector pCL-(Prmf) que se construyó reemplazando el promotor Plac del plásmido pCL1920 por el promotor del gen rmf de E. coli. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 16 a continuación:

[Tabla 16] Resultados de la sobreexpresión de diversas enzimas de la ruta de asimilación de azufre

Cepas: DO Met Met/DO

mg/l

TF4076BJF metYX (Lm): 8,0 934 116

TF4076BJF metYX (Lm) cysPUWA: 4,2 206 49

TF4076BJF metYX (Lm) cysDN: 10,3 1271 123

TF4076BJF metYX (Lm) cysCcysH: 9,9 1348 136

TF4076BJF metYX (Lm) cysJIcysG: 7,7 1038 134

TF4076BJF metYX (Lm) cysB: 9,4 425 45

La sobreexpresión de las enzimas de transporte así como el regulador de la transcripción dio como resultado una producción de metionina inferior y una disminución significativa en la cantidad de metionina por unidad de masa celular. El aumento de la actividad de la sulfurilasa, la APS cinasa y la sulfotransferasa, dio todo como resultado un aumento de la producción de metionina por unidad de células así como la metionina total producida. Dado que estos aumentos se observan en una cepa que alberga dos plásmidos diferentes, puede esperarse que los resultados mejorarán mucho más una vez que se ajuste y se optimice la expresión de las enzimas.

Ejemplo 4: Producción a modo de ejemplo de cepas de metionina

Tal como se describió anteriormente, las diversas modificaciones genéticas descritas en el presente documento

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11.: Microorganismo según la disposición 1, que comprende además un péptido de homoserina O-succiniltransferasa que comprende SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10.

12.: Microorganismo según la disposición 1, que comprende además una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica una adenililsulfato reductasa (EC 1.8.99.2).

13.: Microorganismo según la disposición 1, en el que se atenúa al menos un gen seleccionado de metD, metK, metJ, thrB, serA o combinaciones de los mismos.

14.: Microorganismo según la disposición 1, en el que se sobreexpresa al menos un gen seleccionado de metA, metB, metC, metE, metY, metZ, metX, metH, cysPWUA, cysD, cysN, cysC, cysH, cysI, cysJ, cysG, csyK, cysM, y combinaciones de los mismos.

15.: Método de preparación de metionina que comprende:

cultivar el microorganismo según la disposición 1 en condiciones que permiten la producción de metionina; y

aislar la metionina.

16.: Método según la disposición 15, en el que el primer péptido que tiene actividad de sulfhidrilación directa está codificado por metZ, metY o combinaciones de los mismos.

17.: Método según la disposición 15, en el que el microorganismo es E. coli.

18.: Método según la disposición 16, en el que al menos el 10% de la metionina se produce a partir del primer péptido y en el que el primer péptido está codificado por metZ, metY o combinaciones de los mismos.

19.: Método según la disposición 15, en el que al menos el 10% de la metionina se produce a partir del segundo péptido y en el que el segundo péptido está codificado por metB, metC o combinaciones de los mismos.

20.: Método según la disposición 15, en el que la actividad de trans-sulfuración endógena está codificada por metB, metC o combinaciones de los mismos.

21.: Método según la disposición 1, en el que al menos el 10% de la metionina producida se produce a partir del primer péptido y en el que el primer péptido está codificado por un gen metZ.

22.: Microorganismo según la disposición 1, en el que el primer péptido es un péptido de MetX que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con los números de registro CAA71733, ZP_00766367 o ZP_00107218.

23.: Microorganismo según la disposición 1, en el que el primer péptido es un péptido de MetX que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con los números de registro CAA71733, ZP_00766367 o ZP_00107218.

24.: Método según la disposición 15, en el que el primer péptido es un péptido de MetY que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con los números de registro AAG08410, CAA71732, ZP_00766366 o ZP_00107219.

25.: Método según la disposición 15, en el que el primer péptido es un péptido de MetY que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con los números de registro AAG08410, CAA71732, ZP_00766366 o ZP_00107219.

26.: Método según la disposición 15, en el que el segundo péptido es un péptido de MetZ que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de al menos el 70% con el número de registro AAG06495.

27.: Método según la disposición 15, en el que el segundo péptido es un péptido de MetZ que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de al menos el 90% con el número de registro AAG06495.

28.: Método según la disposición 15, en el que el microorganismo comprende además un gen atenuado seleccionado de metD, metK, metJ, thrB, serA o combinaciones de los mismos.

29.: Método según la disposición 15, en el que el microorganismo comprende además cambios adicionales en la secuencia de ácido nucleico modificada por ingeniería genética que dan como resultado una cepa de producción modificada por ingeniería genética, y en el que la cepa de producción modificada por ingeniería genética produce el 10% más de metionina en comparación con el microorganismo sin tales cambios.

30.: Método según la disposición 29, en el que la cepa de producción modificada por ingeniería genética incluye una modificación genética para disminuir el catabolismo de productos, aumentar la disponibilidad de reactantes, disminuir la inhibición de la ruta de biosíntesis de metionina o combinaciones de los mismos.

Claims

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