KR102029819B1

KR102029819B1 - 글루코스 유입이 증진된 메티오닌 생산용 미생물

Info

Publication number: KR102029819B1
Application number: KR1020147002040A
Authority: KR
Inventors: 완다 디쉐흐; 라이네르 피게
Original assignee: 에보니크 데구사 게엠베하
Priority date: 2011-06-29
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2019-10-08
Also published as: KR20140043804A; MX347843B; US9506092B2; MX2013015202A; EP2726626A1; ES2654589T3; BR112013033675A2; WO2013001055A1; EP2726626B1; JP2014522642A; CN103781913B; MY166543A; AR086790A1; PL2726626T3; BR112013033675B1; CN103781913A; US20140134680A1

Abstract

본 발명은 발효에 의해 주요 탄소 공급원으로서의 글루코스로부터 메티오닌을 생산하기 위한 변형, 및 ptsG, sgrT, sgrS 및 dgsA로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 변형시킴으로써 글루코스 유입이 개선되는 것인, 글루코스 유입을 개선시키기 위한 변형을 포함하는, 메티오닌 생산의 개선을 위한 재조합 미생물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 글루코스를 함유하는 발효가능한 탄소 공급원 및 황 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 중에서 상기 기술된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배양 배지로부터 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 발효 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

글루코스 유입이 증진된 메티오닌 생산용 미생물 {A MICROORGANISM FOR METHIONINE PRODUCTION WITH ENHANCED GLUCOSE IMPORT}

본 발명은 개선된 메티오닌 생산용 미생물 및 메티오닌 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 ptsG, sgrS, sgrT 또는 dgsA로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 변형된 발현을 포함하는, 글루코스 유입이 개선된 메티오닌 생산용 미생물에 관한 것이다.

황-함유 화합물, 예컨대 시스테인, 호모시스테인, 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌은 세포 대사에 중요하며, 식품 및 사료 첨가제 및 제약으로서 사용하기 위해 산업적으로 생산된다. 특히, 동물에 의해 합성될 수 없는 필수 아미노산인 메티오닌은 많은 신체 기능에서 중요한 역할을 한다. 단백질 생합성에서의 그의 역할 이외에도, 메티오닌은 메틸 교환 반응 및 셀레늄과 아연의 생체이용성에 관여한다. 메티오닌은 또한 알레르기 및 류마티스성 열과 같은 장애를 치료하는 데에도 직접적으로 사용된다. 그럼에도 불구하고, 생산되는 메티오닌들은 대부분 동물용 사료에 첨가된다.

BSE 및 조류 독감의 결과로 인해 동물 유래의 단백질 사용이 감소함에 따라, 순수한 메티오닌에 대한 요구는 증가하고 있다. 보편적으로, D,L-메티오닌은 아크롤레인, 메틸 메르캅탄 및 시안화수소로부터 화학적으로 제조된다. 그러나, 순수한 L-메티오닌 뿐만 아니라, 라세미 혼합물도 기능 수행을 잘하지 못한다 (문헌 [Saunderson, C.L., 1985]). 추가로, 비록 순수한 L-메티오닌은 예를 들어, N-아세틸-D,L-메티오닌의 아실라제 처리를 통해 라세미 메티오닌으로부터 제조될 수 있지만, 이는 제조 비용을 현저하기 증가시킨다. 따라서, 환경적 관심과 연계하여 순수한 L-메티오닌에 대한 요구가 증가함에 따라 미생물에 의한 메티오닌 생산은 매력적인 유망한 대상이 되었다.

미생물로부터의 화학 물질 제조를 최적화시키는 것은 전형적으로 생합성 경로에 관여하는 단백질을 과다발현시키는 것, 생합성 경로 억제에 관여하는 단백질을 감쇠시키거나 바람직하지 못한 부산물 생산에 관여하는 단백질을 감쇠시키는 것을 포함한다. 미생물에서 L-메티오닌 생산을 최적화시키기 위한 이러한 접근법들은 모두 앞서 기술된 바 있지만 (예를 들어, 미국 특허 번호 제7,790,424호, 미국 특허 번호 제7,611,873호, 특허 출원 WO 2002/10209, WO 2006/008097 및 WO 2005/059093); 미생물로부터 L-메티오닌을 산업적으로 제조하는 것은 추가 개선이 요구된다.

전형적으로, L-메티오닌은 발효 공정에서 주요 탄소 공급원으로서 사용되는 글루코스 상에서 성장하는 미생물에서 의해 제조되어 왔다. 박테리아에서는 외부 글루코스가 세포 내로 수송되고, 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)에 의해 인산화된다 (문헌 [Meadow et al. 1990]; [Rohwer et al.1996]; [Tchieu et al. 2001]). PTS는 2개의 일반 세포질 단백질, 효소 I 및 HPr, 및 당-특이 효소 II 복합체 (EII) 시리즈로 구성된다. 이. 콜라이(E. coli)에서 ptsG에 의해 코딩되는 PTS 효소 IICB^Glc는 글루코스를 수송함과 동시에, 글루코스를 글루코스-6-포스페이트 (G6P)로 인산화시킨다. G6P는 글루코스 대상에서 필수적인 중간체이지만, 그의 세포내 축적은 "인산당 스트레스"로도 불리는 당-포스페이트 독성 현상을 유발하기도 한다. 실제로, 글루코스 축적은 박테리아에게는 매우 큰 독성을 띠며, 이는 당화 반응, DNA 돌연변이 유발 및 성장 억제를 일으키는 것으로 보고된 바 있다 (문헌 [Lee and Cerami, 1987]; [Kadner et al. 1992]).

이. 콜라이에서 IICB^Glc를 코딩하는 ptsG 유전자는 생리학적 조건에 따라 전사 및 전사 후 수준 둘 모두에서 매우 흥미로운 방식으로 고도로 조절된다는 것이 최근 연구를 통해 입증되었다 (문헌 [Plumbridge, 1998]; [Kimata et al. 1998]; [Plumbridge et al. 2002]; [Morita and Aieba, 2007]; [Goerke and Vogel, 2008]). 구체적으로, 수준을 조절하는 여러 가지의 것이 확인되었다:

- 많은 다른 조절 인자 (ArcA, Fis, Crp)에 의한 ptsG 유전자의 발현 조절, 및 특히, 최초로 Mlc (Making larger colonies: 보다 큰 콜로니 형성)로 불리는 전사 조절 인자인 DgsA에 의한 억제;

- 안티센스 기전에 의한 소형 RNA sgrS (Sugar transport-related sRNA: 당 수송-관련 sRNA)에 의한 ptsG mRNA의 탈안정화;

- 아직까지는 알려지지 않은 기전에 의한 소형 폴리펩티드 SgrT에 의한 PtsG 활성 제어; 및

- 전사 조절 인자 SgrR에 의한 sgrS / sgrT의 발현 조절.

G6P의 독성, 및 조절이 고도로 잘되고 복잡한 시스템의 성질에 기인하여, 미생물에서 글루코스 수송 시스템을 조작하는 것은 매우 어렵다. 현재까지 ptsG 또는 dgsA 유전자를 조작함으로써 글루코스 유입을 증가시켜 아미노산 생산, 및 특히 트레오닌 생산을 개선시키고자 하는 시도가 여러 차례 있었다 (WO03004675 및 WO03004670 (데구사(Degussa)); US2004229320 (아지노모토(Ajinomoto)) 및 WO0281721 (데구사)). 그럼에도 불구하고, 박테리아의 글루코스 유입을 증가시켜 메티오닌 생산을 개선시킨 예는 없었다.

본 발명의 발명자들은 글루코스 유입을 증가시킴으로써 미생물에 의한 L-메티오닌 생산을 개선시키기 위한 상기 논의된 어려움을 극복하였다. 따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 a) 발효에 의해 주요 탄소 공급원으로서의 글루코스로부터 메티오닌을 생산하기 위한 변형, 및 b) ptsG, sgrT, sgrS 또는 dgsA (mlc)로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 변형시킴으로써 글루코스 유입이 개선되는 것인, 글루코스 유입을 개선시키기 위한 변형을 포함하는, 메티오닌 생산의 개선을 위한 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명자들은 글루코스 유입에 관여하는 유전자의 발현을 변형시킴으로써 미생물 내로의 글루코스 유입을 개선시킬 수 있고, 미생물에 의한 메티오닌의 생산을 증가시킬 수 있다는 것을 밝혀냈다. 추가로, 본 발명자들은 글루코스 유입에 관여하는 유전자의 발현을 변형시키면, 부산물인 케토메틸발레레이트 (KMV) 및 호모란티오닌 (HLA) 생산이 감소되고, 이로써 생성물 메티오닌의 순도는 개선된다는 것을 발견하게 되었다. 한 실시양태에서, IICB^Glc를 코딩하는 유전자 ptsG의 발현은 증진된다. 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 ptsG의 발현이 증진될 수는 있지만, 한 실시양태에서, 유전자 ptsG는 유도성 또는 구성적 프로모터의 제어하에 과다발현된다. 또다른 실시양태에서, 유전자 ptsG는 소형 RNA sgrS에 대한 결합 부위의 서열을 함유하지 않는다.

다른 실시양태에서, 유전자 sgrS, sgrT 또는 dgsA의 발현은 감쇠된다. 유전자의 발현을 감쇠시키는 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 한 실시양태에서, 유전자 sgrS는 결실된다. 또다른 실시양태에서, 유전자 sgrT는 결실된다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 유전자 dgsA는 결실된다.

추가로, 글루코스 유입은 상기 논의된 변형의 조합을 통해 개선될 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 ptsG의 발현은 증진되고, 유전자 sgrS의 발현은 감쇠된다. 또다른 실시양태에서, 유전자 ptsG의 발현은 증진되고, 유전자 sgrT의 발현은 감쇠된다. 추가의 실시양태에서, 유전자 ptsG의 발현은 증진되고, 유전자 sgrS 및 sgrT의 발현은 감쇠된다. 또다른 실시양태에서, 유전자 ptsG의 발현은 증진되고, 유전자 dgsA의 발현은 감쇠된다.

본 발명의 미생물은 메티오닌을 생산하도록 변형된다. 미생물은 미생물에서의 메티오닌 생산을 촉진시키기 위해서 당업계에 공지된 임의의 변형을 포함할 수 있다고 이해함과 동시에, 한 실시양태에서, 하기 유전자: pyc , pntAB , cysP , cysU , cysW , cysA, cysM , cysJ , cysI , cysH , gcvT , gcvH , gcvP , lpd , serA , serB , serC , cysE , metF , metH , thrA , S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 효소를 코딩하는 metA 대립유전자 (MetA ^*), 또는 트레오닌에 대한 피드백 억제가 감소된 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자 (thrA ^* ) 중 하나 이상의 유전자의 발현이 증진된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 유전자는 유도성 프로모터의 제어하에 있다. 또다른 실시양태에서, 하기 유전자: metJ , pykA , pykF , purU , yncA , 또는 udhA 중 하나 이상의 유전자의 발현이 감쇠된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 유전자 metJ의 발현은 감쇠된다. 또다른 실시양태에서, 유전자 metJ의 발현은 감쇠되고, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 효소를 코딩하는 metA 대립유전자 (MetA ^*)의 발현은 증진된다. 추가의 실시양태에서, 유전자 metJ의 발현은 감쇠되고; S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 효소를 코딩하는 metA 대립유전자 (MetA ^*)의 발현은 증진되고; 트레오닌에 대한 피드백 억제가 감소된 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자 (thrA ^* )의 발현은 증진된다. 추가의 또다른 실시양태에서, 유전자 metJ의 발현은 감쇠되고; S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 효소를 코딩하는 metA 대립유전자 (MetA ^*)의 발현은 증진되고; 트레오닌에 대한 피드백 억제가 감소된 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자 (thrA ^* )의 발현은 증진되고; 유전자 cysE의 발현은 증진된다. 추가의 또다른 실시양태에서, 유전자 metJ의 발현은 감쇠되고; S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 효소를 코딩하는 metA 대립유전자 (MetA ^*)의 발현은 증진되고; 트레오닌에 대한 피드백 억제가 감소된 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자 (thrA ^* )의 발현은 증진되고; 유전자 cysE의 발현은 증진되고; 유전자 metF 및/또는 metH의 발현은 증진된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 a) 유전자 pstG가 과다발현되고/거나 sRNA sgrS 결합 부위를 함유하지 않고/거나, 유전자 sgrS가 결실되어 있고/거나, 유전자 sgrT가 결실되어 있고/거나, 유전자 dgsA가 결실되어 있고; b) 유전자 metA ^* , metH , cysPUWAM , cysJIH , gcvTHP , metF , serA , serB , serC , cysE, thrA ^* 및 pyc의 발현이 증진되어 있고; c) 유전자 metJ, pykA , pykF, purU 및 yncA의 발현이 감쇠되어 있는, 미생물을 포함한다.

본 발명의 미생물은 케토메틸발레레이트 (KMV) 및 호모란티오닌 (HLA)을 덜 생산하고, 따라서, 순도가 개선된 메티오닌을 생산하게 된다. 한 실시양태에서, 생산된 메티오닌의 순도는 증가된다. 한 실시양태에서, a) 글루코스를 함유하는 발효가능한 탄소 공급원 및 황 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 중에서 상기 기술된 재조합 미생물을 배양하는 단계, 및 b) 배양 배지로부터 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 순도가 증가된 메티오닌의 발효 생산 방법을 제공한다.

제2 측면에서, 본 발명은 a) 글루코스를 함유하는 발효가능한 탄소 공급원 및 황 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 중에서, i) 발효에 의해 주요 탄소 공급원으로서의 글루코스로부터 메티오닌을 생산하기 위한 변형, 및 ii) ptsG , sgrT , sgrS 또는 dgsA로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 변형시킴으로써 글루코스 유입이 개선되는 것인, 글루코스 유입을 개선시키기 위한 변형을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계, 및 b) 배양 배지로부터 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 순도가 증가된 메티오닌의 발효 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 제조하는 방법에 관한 것임을 이해할 것이다. 한 실시양태에서, a) 글루코스를 함유하는 발효가능한 탄소 공급원 및 황 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 중에서 상기 기술된 재조합 미생물을 배양하는 단계, 및 b) 배양 배지로부터 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 메티오닌 또는 메티오닌 유도체의 발효 생산 방법을 제공한다.

제3 측면에서, 본 발명은 a) 글루코스를 함유하는 발효가능한 탄소 공급원 및 황 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 중에서, i) 발효에 의해 주요 탄소 공급원으로서의 글루코스로부터 메티오닌을 생산하기 위한 변형, 및 ii) ptsG , sgrT , sgrS 또는 dgsA로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 변형시킴으로써 글루코스 유입이 개선되는 것인, 글루코스 유입을 개선시키기 위한 변형을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계, 및 b) 배양 배지로부터 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 메티오닌 또는 메티오닌 유도체의 발효 생산 방법을 제공한다.

본 발명을 상세하게 기술하기 앞서서, 본 발명은 특별히 예시되는 방법으로 한정되는 것이 아니며, 물론 이는 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 전문 용어들은 단지 본 발명의 특정 실시양태를 기술하기 위한 목적의 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니며, 본 발명은 오직 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한됨을 이해하여야 한다.

상기 또는 하기의 본원에서 인용된 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 그러나, 본원에서 언급된 공개 문헌은 공개 문헌에서 보고되고, 본원과 연계하여 사용될 수 있는 프로토콜, 시약 및 벡터를 기술 및 개시하기 위한 목적으로 인용된다. 본원에서 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 개시내용보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

추가로, 달리 명시되지 않는 한, 본 발명을 실시하는 것은 당업계의 기술 내에 포함되어 있는 종래 미생물학적 및 분자 생물학적 기법을 이용한다. 그러한 기법은 당업자에게 주지되어 있고, 문헌에 잘 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Prescott et al. (1999)]; 및 [Sambrook et al., (1989) (2001)]을 참조할 수 있다.

본원 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바, 단수 형태인 "하나의"("a", "an"), 및 "그"라는 것은 문맥상 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함한다는 것에 주의하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 미생물"이라고 언급하는 것은 복수 개의 상기 미생물을 포함하고, "하나의 효소"라고 언급하는 것은 하나 이상의 효소를 언급하는 것 등이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나, 등가인 임의의 물질 및 방법이 본 발명을 실시하거나, 시험하는 데 사용될 수는 있지만, 이제 바람직한 물질 및 방법을 기술한다.

본원에서 사용되는 바, 하기 용어는 특허청구범위 및 명세서를 해석하는 데 사용될 수 있다.

문맥상 언어 또는 필요한 암시 내용을 표현함으로써 다르게 요구되는 경우를 제외하면, 하기 특허청구범위에서, 및 상기 본 발명의 설명에서, "포함하다comprise)"라는 단어 또는 예컨대 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는"이라는 파생어는 포괄적 의미로, 즉, 본 발명의 다양한 실시양태에서, 추가의 특징이 존재하지 못하게 하거나, 부가되지 못하게 하는 것이 아니라, 언급된 특징이 존재함을 명시하는 데 사용된다.

본 발명의 설명에서, 유전자 및 단백질은 이. 콜라이 중의 상응하는 유전자의 명칭을 사용하여 확인된다. 그러나, 그리고 달리 언급되지 않는 한, 상기 명칭을 사용하는 것은 본 발명에 따라 더욱 일반적인 의미를 가지며, 다른 유기체, 더욱 특히 미생물에서 상응하는 유전자 및 단백질 모두에 적용된다.

PFAM (은닉 마르코프 모델(Hidden Markov model)을 이용한 단백질 패밀리들의 정렬을 모아놓은 데이터베이스; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)은 단백질 서열 정렬을 모아놓은 큰 콜렉션을 나타낸다. 각 PFAM을 통해 다중 정렬을 시각화시킬 수 있고, 단백질 도메인을 관찰할 수 있으며, 유기체들 간의 분포를 평가할 수 있고, 다른 데이터베이스에 접근할 수 있으며, 공지된 단백질의 구조를 시각화할 수 있다.

COG (Clusters of orthologous groups of proteins: 단백질의 오르토로거스 군으로 이루어진 클러스터; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는 38개의 주요 계통을 나타내는, 완전하게 서열 분석된 66개의 게놈으로부터 단백질 서열을 비교함으로써 수득한 것이다. 각 COG 3개 이상의 계통으로부터 정의되며, 이를 통해 이전의 보존된 도메인을 확인할 수 있다.

상동성 서열 및 그의 상동성(%)을 확인하는 수단은 당업자에게 주지되어 있고, 이는 특히 BLAST 프로그램을 포함하는 데, 상기 프로그램은 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/로부터 상기 웹사이트 상에 명시되어 있는 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있다. 이어서, 수득된 서열은, 예를 들어, 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)을, 상기 웹사이트 상에 명시되어 있는 디폴트 파라미터와 함께 사용함으로써 사용 (예를 들어, 정렬)할 수 있다.

공지된 유전자에 대한 진뱅크(GenBank) 상에 주어진 참조를 사용하여, 당업자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서 등가인 유전자를 확인할 수 있다. 이러한 통상의 작업은 이롭게는 다른 미생물로부터 유래된 유전자와의 서열 정렬을 수행하고, 축퇴성 프로브를 디자인하여 또다른 유기체에서 상응하는 유전자를 클로닝함으로써 확인될 수 있는 컨센서스 서열을 사용하여 수행된다. 이러한 통상의 분자 생물학적 방법은 당업자에게 주지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (1989)]에서 알려져 있다.

본 발명은 재조합 메티오닌 생산용 미생물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 글루코스 유입을 증가시킴으로써 미생물에서 메티오닌 생산을 개선시키는 것에 관한 것이다.

"메티오닌 생산의 개선"이라는 용어는 메티오닌의 생산성 증가 및/또는 메티오닌의 역가 증가 및/또는 메티오닌/탄소 공급원의 수율 증가 및/또는 메티오닌의 순도 증가를 의미한다. "메티오닌/탄소 공급원의 수율 증가"라는 용어는 발효 동안의 메티오닌 수득량을 글루코스 소모량으로 나눈 값으로 정의된다. 이는 % 메티오닌 (g)/글루코스 (g) 또는 메티오닌 (mol)/글루코스 (mol)로 표현될 수 있다. 이와 관련하여 "증가"라는 용어는 명시된 변형을 포함하지 않는 미생물과 비교하여 측정가능하게 증가된 것을 기술한다. 바람직한 실시양태에서, 증가는 약 7% 이상, 우선적으로 약 15% 이상, 우선적으로 약 25% 이상, 가장 우선적으로 약 30% 이상 증가된 것이다. 메티오닌/글루코스 총 수율은 우선적으로 약 7% g/g 이상, 우선적으로 약 15% g/g 이상, 우선적으로 약 20% g/g 이상, 가장 우선적으로 약 24% g/g 이상이다.

글루코스 소모량 및 메티오닌 생산량을 측정하는 방법은 당업자에게 주지되어 있고, 본원 다른 곳에서도 논의된다.

"메티오닌의 순도 증가" 또는 "순도가 증가된 메티오닌"라는 용어는 메티오닌 생산량과 비교하여, 발효 동안에 수득된 케토메틸발레레이트 (KMV) 및/또는 호모란티오닌 (HLA)의 수득량에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명의 미생물에서 메티오닌 양과 비교되는 KMV 및 HLA 양의 비는 개선된다. 상기 비는 KMV 및 HLA의 생산량을 감소시킴으로써, 또는 KMV 및 HLA의 농도는 그대로 유지시키면서 메티오닌의 생산량을 개선시킴으로써, 또는 그 둘 모두에 의해 개선될 수 있다. 이롭게는, 이는 메티오닌 생산량과 비교하여, 배양 종결시에 발효조에 남아있는 글루코스의 양을 의미하기도 한다. 본 발명에서, 본 발명의 미생물에서 메티오닌 생산량과 양과 비교되는 발효조에 남아있는 글루코스의 양의 비는 감소된다. 상기 비는 발효조에 남아있는 글루코스의 양을 감소시킴으로써, 또는 발효기에 주입되는 글루코스의 총량은 그대로 유지시키면서 메티오닌의 생산량을 개선시킴으로써, 또는 그 둘 모두에 의해 개선될 수 있다.

배지 중에 함유되어 있는 메티오닌, NAM, KMV, HLA 및 글루코스의 양을 측정하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, L-메티오닌의 양은 표준으로서 L-메티오닌 (플루카(Fluka), 참조 번호 64319)을 사용하여 OPA/Fmoc 유도체화를 수행한 후, HPLC에 의해 측정될 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 외부 글루코스가 박테리아 세포 내로 수송되고, 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)에 의해 인산화된다 (문헌 [Meadow et al. 1990]; [Rohwer et al.1996]; [Tchieu et al. 2001]). 인산화된 글루코스는 고농도일 경우, 세포에 대해 독성을 띠는 바, 이에 PTS 시스템은 고도로 조절된다. 이러한 이유에서 상기 시스템이 복잡하다는 사실과 연계하여 시스템을 조작하는 것은 매우 어렵다. 그러나, 하기 기술되는 바와 같이, 본 발명자들은 글루코스 유입이 개선된 재조합 미생물을 제조하였다.

본원에서 사용되는 바, "재조합 미생물"이라는 용어는 자연 상태에서는 발견되지 않으며, 자연 상태에서 발견되는 등가의 미생물과는 유전적으로 상이한 박테리아, 효모 또는 진균을 의미한다. 본 발명에 따라, "변형"이라는 용어는 미생물에 도입되거나, 그에서 유도된 임의의 유전적 변이를 나타낸다. 미생물은 새로운 유전 요소의 도입 또는 결실을 통해 변형될 수 있다. 추가로, 미생물은 특이적인 선택압하에 지정 돌연변이 유발 및 진화를 조합함으로써 새로운 대사 경로가 발생 및 진화할 수 있도록 가압함으로써 변형될 수 있다 (예를 들어, WO 2004/076659 참조). 우선적으로, 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토마이세타세아에(Streptomycetaceae), 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae) 및 사카로마이세테세아에(Saccharomyceteceae)를 포함하는 군으로부터 선택된다. 더욱 우선적으로 미생물은 엔테로박테리아세아에 또는 코리네박테리아세아에 종, 또는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)이다. 한 실시양태에서, 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) (이. 콜라이)이다.

특히, 실시예에서는 변형되는 이. 콜라이 균주를 제시하고 있지만, 이러한 변형은 같은 과의 다른 미생물에서도 쉽게 수행될 수 있다.

이. 콜라이는 그람 음성의 막대형 비-포자 형성이고, 전형적으로 길이가 1-5 ㎛인 구성원을 포함하는, 엔테로박테리아세아에 과에 속한다. 대부분의 구성원들은 주위를 돌아다니는 데 편모를 사용하지만, 일부 속은 비-운동성이다. 상기 과의 구성원들 다수는 인간 및 다른 동물의 창자 내에서 발견되는 장내 정상 세균총의 일부인 반면, 다른 것은 물 또는 토양에서 발견되거나, 또는 다양한 다른 동물 및 식물에서 기생하는 기생균이다. 이. 콜라이는 가장 중요한 모델 유기체 중 하나이지만, 엔테로박테리아세아에 과의 다른 중요한 구성원으로는 클레브시엘라(Klebsiella), 특히 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 및 살모넬라(Salmonella)를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "글루코스 유입을 개선시키다," "개선된 글루코스 유입"이라는 용어, 및 그의 문법상 등가 형태는 글루코스 흡수율 증가를 의미한다. "글루코스 흡수율 증가"라는 용어는 발효 동안의 글루코스 소모량을 바이오매스 농도로 나눈 값을 의미한다. 구체적으로, 글루코스 흡수율은 하기 기술된 것과 같이 정의될 수 있다:

(여기서, r_S는 글루코스 흡수율이고, X는 바이오매스 농도이다).

글루코스 흡수율은

(여기서, S는 t 시간째의 글루코스 소모량이다)로서 기술될 수 있다. 유가식 발효인 경우, 배양 동안의 글루코스 소모량은 배치식 배양에 존재하는 글루코스 + 접종물에 첨가된 글루코스 + 유가 단계 동안 주입된 글루코스 - 실험 종료시 잔류 글루코스 (감산)와 같다. 다른 기법이 사용될 수 있고, 이는 문헌에 기술되어 있다:

- 글루코스 흡수율 측정을 위해 형광성 글루코스 유사체 (2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)-2-데옥시글루코스 또는 2-NBDG) 사용 (문헌 [Natarajan A. and Srienc F. (1999) metabolic engineering, vol 1, issue 4, 320-333]),

- PtsG 활성 측정 (문헌 [Kornberg H. L. and Reeves R. E. Biochem. J (1972) 128, 1339-1344]; [Rungrassamee et al, Erch Microbiol (2008) 190:41-49]),

- 예컨대, ptsG mRNA와 같이 특이적이 표적을 정량화하고, 상응하는 유전자의 발현 증진을 확인하기 위해 사용되는 qRT-PCR (정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응) 프로파일링.

이와 관련하여 "증가된"이라는 용어는 명시된 변형을 포함하지 않는 미생물과 비교하여 측정가능한 증가를 기술한다.

본 발명에 따라, 글루코스 유입은 ptsG, sgrT, sgrS 또는 dgsA로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 변형시킴으로써 개선된다. 또한, 미생물에서 ptsG의 과다발현에 의한, 또는 PtsG의 활성 증가를 통한 글루코스 유입 개선은 당업자에게 공지되어 있는 상이한 기법에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "발현을 변형시키는"이라는 용어는 유전자의 발현이 유전 요소의 도입 또는 결실을 통해 증가 또는 감소되는 것을 의미한다. 전형적으로, 유전자의 발현이 변형되지 않은 등가의 미생물, 즉, 글루코스 수송 개선을 위한 유전 요소의 도입 또는 결실을 포함하지 않는 미생물과 비교하여 증가되거나 감소된다. 표준을 참조로 하여 유전자의 발현이 증가 또는 감소되었는지를 측정하는 방법은 당업계에 주지되어 있고, 이 또한 하기에서 논의된다.

글루코스 유입은 본 발명에 따라 유전자 ptsG의 발현을 증진시킴으로써 개선된다. ptsG 유전자는 이. 콜라이에서 PTS 효소 IICB^Glc (동의어 - EC 2.7.1.69; 단백질-N(pi)-포스포히스티딘-당 포스포트랜스퍼라제; 포스포트랜스퍼라제 시스템의 효소 II; PEP-당 포스포트랜스퍼라제 효소 II; PTS 퍼미아제)를 코딩한다. ptsG 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 18에 제시되어 있다.

본원에서 사용되는 바, "증진된," "증진시키다"라는 용어, 및 문법상 그의 등가 형태는 변형되지 않은 등가의 미생물과 비교하여 유전자의 발현을 증가 또는 상향조절시키는 변형을 의미한다. "발현 증진," "발현 증가" 또는 "과다발현"이라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 유사한 의미를 가진다.

미생물에서 유전자의 발현을 증가시키는 수단으로는 다양한 것들이 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, 메신저 RNA의 안정성을 증가시키는 것, 유전자 카피수를 증가시키는 것, 보다 강력한 프로모터를 사용하는 것, 조절 요소를 제거하는 것 또는 활성이 증가된 대립유전자를 사용하는 것, 또는 가능하게는 이들 수단을 수단하는 것을 포함한다. 추가로, 유전자의 발현은 염색체 또는 염색체외 수단을 통해 증가될 수 있다. 예를 들어, 수개의 유전자 카피를 재조합 방법에 의해 미생물의 게놈 내로 도입시킬 수 있다. 별법으로, 유전자는 그의 복제 기점과 관련하여 상이하고, 이에 세포 내에서의 그의 카피수와 관련하여서도 상이한 다른 유형의 플라스미드에 의해 보유될 수 있다. 유전자는 엄격한 복제가 이루어지는 저카피수의 플라스미드 (pSC101, RK2), 저카피수의 플라스미드 (pACYC, pRSF1010) 또는 고카피수의 플라스미드 (pSK 블루스크립트 II)에 상응하는 1-5개의 카피, 약 20개 또는 최대 500개의 카피로 존재할 수 있다. 조절 요소는 유전자의 발현을 제어하는 데 있어서 중요하다. 예를 들어, 유전자는 추가로는 유도성일 수 있는 상이한 강도의 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 이러한 프로모터는 상동성이거나, 또는 이종성일 수 있다. 적절한 프로모터를 선택하는 것은 완전히 당업자의 능력 범위 내에 포함되어 있지만; 예를 들어, 프로모터 Ptrc , Ptac , Plac 또는 람다 프로모터 cI가 광범위하게 사용된다. 한 실시양태에서, 유전자 ptsG의 발현은 유전자를 유도성 또는 구성적 프로모터의 제어하에 배치시킴으로써 증진된다.

또다른 실시양태에서, 유전자 ptsG의 발현은 소형 RNA sgrS의 결합 부위를 코딩하는 서열을 제거함으로써 증진된다.

"소형 RNA sgrS의 결합 부위를 코딩하는 서열을 제거하는"이라는 용어는 유전자 ptsG 상의 소형 RNA sgrS 결합이 이루어지지 못하도록 하기 위해 소형 RNA sgrS의 결합 부위 (서열 번호 19)가 전체적으로 또는 부분적으로 결실된다는 것을 의미한다.

글루코스 유입은 또한 유전자 sgrS 및/또는 유전자 sgrT 및/또는 유전자 dgsA의 발현을 감쇠시킴으로써 개선된다. sgrS 유전자는 이. 콜라이에서 소형 RNA 당 수송-관련 sRNA를 코딩한다. sgrS 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 20에 제시되어 있다. sgrT 유전자는 이. 콜라이에서 소형 폴리펩티드 SgrT를 코딩한다. sgrT 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 21에 제시되어 있다. dgsA 유전자는 이. 콜라이로부터의 수개의 유전자, 특히, ptsG 유전자 및 ptsHIcrr 오페론에 대하여 전사 리프레서로서의 작용을 하는 통괄 조절 인자를 코딩한다. dgsA 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 22에 제시되어 있다.

본원에서 사용되는 바, "감쇠된"이라는 용어는 유전자의 발현의 부분적 또는 완전한 억제를 의미한다. 이러한 발현 억제는 유전자의 발현 억제, 유전자의 발현에 필요한 프로모터 영역 모두 또는 일부의 결실, 유전자의 코딩 영역의 결실, 및/또는 야생형 프로모터를 보다 약한 천연 또는 합성 프로모터로의 교환일 수 있다. 우선적으로, 유전자의 감쇠는 본질적으로 상기 유전자의 완전한 결실이며, 이는 본 발명에 따라 균주의 확인, 단리 및 정제를 촉진시킬 수 있는 선별 마커 유전자로 치환될 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현 억제는 상동성 재조합 기법에 의해 달성될 수 있다 (문헌 [Datsenko & Wanner, 2000]). 한 실시양태에서, 글루코스 유입은 유전자 sgrS의 결실에 의해 개선된다. 또다른 실시양태에서, 글루코스 유입은 유전자 sgrT의 결실에 의해 개선된다. 또다른 실시양태에서, 글루코스 유입은 유전자 dgsA의 결실에 의해 개선된다.

추가의 실시양태에서, 글루코스 유입은 상기 논의된 변형의 조합을 통해 개선된다. 예를 들어, 본 발명의 미생물에서 글루코스 유입은

· 유전자 ptsG의 발현을 증진시키고, 유전자 sgrS의 발현을 감쇠시킴으로써;

· 유전자 ptsG의 발현을 증진시키고, 유전자 sgrT의 발현을 감쇠시킴으로써;

· 유전자 ptsG의 발현을 증진시키고, 유전자 dgsA의 발현을 감쇠시킴으로써;

· 유전자 ptsG의 발현을 증진시키고, 유전자 sgrS 및 유전자 sgrT의 발현을 감쇠시킴으로써;

· 유전자 ptsG의 발현을 증진시키고, 유전자 dgsA 및 유전자 sgrS의 발현을 감쇠시킴으로써;

· 유전자 ptsG의 발현을 증진시키고, 유전자 dgsA 및 유전자 sgrT의 발현을 감쇠시킴으로써;

· 유전자 ptsG의 발현을 증진시키고, 유전자 dgsA 및 유전자 sgrT 및 sgrS의 발현을 감쇠시킴으로써;

· 유전자 dgsA의 발현을 감쇠시키고, 유전자 sgrS 및/또는 sgrT의 발현을 감쇠시킴으로써 개선될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 글루코스 유입은 유전자 ptsG의 발현을 증진시키고, 유전자 sgrS 및 유전자 sgrT의 발현을 감쇠시킴으로써 개선된다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 글루코스 유입은 유전자 ptsG의 발현을 증진시키고, 유전자 dgsA의 발현을 감쇠시킴으로써 개선된다.

더욱 바람직하게, 글루코스 유입은 유전자 ptsG의 발현을 증진시키고, 유전자 dgsA 및 유전자 sgrT 및 sgrS의 발현을 감쇠시킴으로써 개선된다.

메티오닌 생산을 개선시키기 위하여 글루코스 수송을 개선시키는 변형은 별개로 이루어지는 것이 아니라, 미생물에 의해 주요 탄소 공급원으로서의 글루코스로부터 메티오닌을 발효 생산하는 것을 촉진시키는 변형과의 조합으로 이루어진다. 미생물에서 메티오닌 생산을 촉진시키는 변형은 당업자에게 주지되어 있다. 한 실시양태에서, 하기 유전자: pyc , pntAB , cysP , cysU , cysW , cysA , cysM , cysJ , cysI , cysH , gcvT , gcvH, gcvP , lpd , serA , serB , serC , cysE , metF , metH , thrA , S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 효소를 코딩하는 metA 대립유전자 (MetA ^*), 또는 트레오닌에 대한 피드백 억제가 감소된 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자 (thrA ^* ) 중 하나 이상의 유전자의 발현이 증진된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 유전자들 중 하나 이상의 유전자는 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유전자 thrA ^* 는 유도성 프로모터의 제어하에서 발현된다.

또다른 실시양태에서, 하기 유전자: metJ , pykA , pykF , purU , yncA , 또는 udhA 중 하나 이상의 유전자의 발현이 감쇠된다. 미생물에서 유전자의 발현을 변형시키는 방법은 당업자에게 주지되어 있고, 이는 상기 및 하기에서 논의된다.

추가로, 미생물에 의해 주요 탄소 공급원으로서의 글루코스로부터 메티오닌을 발효 생산하는 것은 상기 논의된 변형의 조합을 통해, 예를 들어,

▷ 유전자 metJ의 발현을 감쇠시키고, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 효소를 코딩하는 metA 대립유전자 (MetA ^*)의 발현을 증진시킴으로써;

▷ 유전자 metJ의 발현을 감쇠시키고; S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 효소를 코딩하는 metA 대립유전자 (MetA ^*)의 발현을 증진시키고; 트레오닌에 대한 피드백 억제가 감소된 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자 (thrA ^* )의 발현을 증진시킴으로써;

▷ 유전자 metJ의 발현을 감쇠시키고; S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 효소를 코딩하는 metA 대립유전자 (MetA ^*)의 발현을 증진시키고; 트레오닌에 대한 피드백 억제가 감소된 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자 (thrA ^* )의 발현을 증진시키고; 유전자 cysE의 발현을 증진시킴으로써;

▷ 유전자 metJ의 발현을 감쇠시키고; S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 효소를 코딩하는 metA 대립유전자 (MetA ^*)의 발현을 증진시키고; 트레오닌에 대한 피드백 억제가 감소된 효소를 코딩하는 thrA 대립유전자 (thrA ^* )의 발현을 증진시킴으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시양태에서, 재조합 미생물은 하기 유전자 변형을 포함한다:

a) 유전자 pstG는 과다발현되고/거나 sRNA sgrS 결합 부위를 함유하지 않고/거나, 유전자 sgrS는 결실되어 있고/거나, 유전자 sgrT는 결실되어 있고/거나, 유전자 dgsA는 결실되어 있고;

b) 유전자 metA ^* , metH , cysPUWAM , cysJIH , gcvTHP , metF , serA , serB , serC, cysE , thrA ^* 및 pyc의 발현은 증진되어 있고;

c) 유전자 metJ, pykA , pykF, purU 및 yncA의 발현은 감쇠되어 있다.

본 발명은 또한 글루코스를 함유하는 발효가능한 탄소 공급원 및 황 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 중에서 상기 기술된 미생물을 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

당업자는 본 발명에 따른 미생물에 대한 배양 조건을 정의할 수 있다. 바람직하게, 미생물을 20℃ 내지 55℃, 우선적으로, 25℃ 내지 40℃, 및 더욱 구체적으로 이. 콜라이의 경우, 약 37℃ 온도에서 발효시킨다.

발효는 일반적으로 하나 이상의 단순 탄소 공급원, 및 필요할 경우, 대사 산물 생산에 필요한 공동 기질을 함유하는, 사용되는 미생물에 대해 적합화된 공지의 정의된 조성물로 이루어진 무기 배양 배지를 포함하는 발효기에서 수행된다. 특히, 이. 콜라이를 위한 무기 배양 배지는 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946]), M63 배지 (문헌 [Miller, 1992]) 또는 배지, 예컨대 문헌 [Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)]에 의해 정의된 것과 같은 배지와 동일하거나, 유사한 조성물로 이루어진 것일 수 있다.

"발효가능한 탄소 공급원"이라는 용어는 미생물에 의해 대사될 수 있는 임의의 탄소 공급원으로서, 여기서, 기질은 하나 이상의 탄소 원자를 함유하는 것인 것을 의미한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 탄소 공급원은 재생 가능한 공급 원료로부터 유도된 것이다. 재생 가능한 공급 원료는 짧은 지연 시간 이내에 그를 원하는 생성물로 전환시킬 수 있는 충분한 양으로 재생될 수 있는, 특정 산업 공정에 요구되는 원료로서 정의된다.

본 발명에 따라, 탄소 공급원은 글루코스를 함유한다.

발효 후, 메티오닌 또는 그의 메티오닌 유도체는 배양 배지로부터 회수될 수 있고, 필요할 경우, 정제될 수 있다. 화합물, 예컨대 메티오닌 및 메티오닌 유도체를 배양 배지로부터 회수하고 정제시키는 방법은 당업자에게 주지되어 있다.

메티오닌의 유도체는 메티오닌 전환 및/또는 분해 경로로부터 유래된 것이다. 특히, 이들 생성물은 S-아데노실-메티오닌 (SAM) 및 N-아세틸메티오닌 (NAM)이다. 특히, NAM은 단리될 수 있고, 탈아실화에 의해 메티오닌으로 전환될 수 있는, 쉽게 회수될 수 있는 메티오닌 유도체이다. 따라서, "배양 배지로부터 메티오닌 또는 메티오닌 유도체를 회수하는"이라는 어구는 메티오닌, SAM, NAM 및 유용할 수 있는 다른 모든 유도체를 회수하는 행동 조치를 의미한다.

도면

도 1은 균주 1 및 2의 배양 동안의 잔류 글루코스 농도 (g/L)이다.

(

): 참조 균주로 불리는 균주 1; (

): IPTG 농도가 20/20인 조건하의 균주 2; 및 (

): IPTG 농도가 20/80인 조건하의 균주 2.

실시예

프로토콜

수개의 프로토콜을 사용하여 하기 실시예에 기술된 메티오닌 생산 균주를 구축하였다.

프로토콜 1 : 재조합체의 상동성 재조합 및 선별에 의한 염색체 변형 (문헌 [Datsenko & Wanner, (2000)]).

문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기술되어 있는 바와 같이, 상동성 재조합에 의해 명시된 염색체 유전자좌에서의 대립유전자 치환 또는 유전자 파괴를 수행하였다. 각각 pKD3 또는 pKD4 플라스미드를 주형으로서 이용하여 PCR에 의해 Flp 인식 부위 측면에 위치하는 클로람페니콜 (Cm) 저항성 cat, 또는 카나마이신 (Km) 저항성 kan을 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 사용하여, λ Red (γ, β, 엑소) 리콤비나제를 발현하는 플라스미드 pKD46을 보유하는 수용체 이. 콜라이 균주를 형질전환시켰다. 이어서, 항생제-저항성 형질전환체를 선별하고, 하기 표 1에 열거된 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 분석을 수행함으로써 돌연변이화된 유전자좌의 염색체 구조를 확인하였다.

문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 의해 기술된 바와 같이, Flp 리콤비나제를 코딩하는 유전자를 보유하는 플라스미드 pCP20, 및 kan 유전자를 보유하는 플라스미드 pKD4를 사용함으로써 cat 저항성 유전자를 kan 저항성 유전자로 교체시킬 수 있었다. pCP20 및 pKD4 플라스미드를 적절화된 균주 내로 도입시키고, flp 유전자를 발현시키고자 하는 목적으로 형질전환체를 37℃에서 카나마이신으로 보충된 LB 상에 도말한 후, 하기 표 1에 열거되어 있는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR에 의해 성장 클론을 확인하였다.

문헌 [Datsenko. & Wanner (2000)]에 기술되어 있는 바와 같이, 플라스미드 pCP20을 사용하여 저항성 유전자를 제거하였다. 간략하면, pCP20 플라스미드를 보유하는 클론을 37℃에서 LB 상에서 배양한 후, 30℃에서 항생제 저항성 손실에 대하여 시험하였다. 이어서, 하기 표 1에 열거되어 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 항생제 감수성 클론을 확인하였다.

프로토콜 2 : 파지 P1의 형질도입

P1 형질도입에 의해 염색체 변형을 주어진 이. 콜라이 수용체 균주에게로 전달하였다. 프로토콜은 하기 2 단계로 구성되었다: (i) 저항성 관련 염색체 변형을 함유하는 기증자 균주 상에서 파지 용해물을 제조하는 단계, 및 (ii) 상기 파지 용해물에 의해 수용체 균주를 감염시키는 단계.

파지 용해물 제조

- 10 ml의 LB + Cm 30 ㎍/ml 또는 Km 50 ㎍/ml + 글루코스 0.2% + CaCl₂ 5 mM 중 관심의 대상이 되는 염색체 변형을 포함하는, 밤새도록 배양된 균주 MG1655 배양물 100 ㎕를 접종하였다.

- 37℃에서 30 min 동안, 진탕시키면서 인큐베이션시켰다.

- 기증자 균주 MG1655 상에서 제조된 P1 파지 용해물 100 ㎕ (대략 1 x 10⁹ 파지/ml)를 첨가하였다.

- 세포가 완전하게 용해될 때까지 3시간 동안 37℃에서 진탕시켰다.

- 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고, 볼텍싱시켰다.

- 4,500 g로 10 min 동안 원심분리하여 세포 파쇄물을 제거하였다.

- 상청액을 멸균 튜브로 옮겨 놓았다.

- 용해물을 4℃에서 보관하였다.

형질도입

- LB 배지에서 밤새도록 배양된 이. 콜라이 수용체 균주 배양물 5 ml를 1,500 g로 10 min 동안 원심분리하였다.

- 2.5 ml의 MgSO₄ 10 mM, CaCl₂ 5 mM 중에 세포 펠릿을 현탁시켰다.

- 염색체 상에 변형이 있는 균주 MG1655의 P1 파지 100 ㎕ (시험 튜브)로 100 ㎕ 세포를 감염시키고, 대조군 튜브로서 P1 파지를 함유하지 않는 100 ㎕ 세포 및 세포를 함유하지 않는 100 ㎕ P1 파지를 이용하였다.

- 진탕시키지 않고, 30℃에서 30 min 동안 인큐베이션시켰다.

- 각 튜브에 1 M 시트르산나트륨 100 ㎕씩을 첨가하고 볼텍싱시켰다.

- 1 ml의 LB를 첨가하였다.

- 37℃에서 1시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다.

- 7,000 rpm으로 3 min 동안 원심분리하였다.

- LB + Cm 30 ㎍/ml 또는 Km 50 ㎍/ml 상에 플레이팅하였다.

- 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다.

실시예 1: 균주 2 구축

1. 메티오닌을 생산하는 균주 1 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA - serC (pCL1920-PgapA-pycre-TT07)는 특허 출원 PCT/FR2010/052937 (이는 본 출원에서 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.

2. 균주 2 구축

세포 내로의 글루코스 유입을 증가시키기 위하여, 인공 유도성 trc 프로모터를 사용하고, 박테리아 인공 염색체로부터, 글루코스 포스포트랜스퍼라제 시스템의 글루코스-특이 PTS 퍼미아제인 PtsG (IIC^Glc)를 과다생산시켰다.

플라스미드 pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07을 (하기 기술하는) 플라스미드 pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07로부터, 및 이로써, 박테리아 인공 염색체 pCC1BAC (에피센터(Epicentre))로부터 유도하였다.

플라스미드 pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07을 구축하기 위해, 중복 PCR에 의해 PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07 단편을 수득하였다. 먼저, 하기 올리고뉴클레오티드, Ome2070-EcoRI-PlacIq-F 및 Ome2071-NheI-TT02-lacIq-R을 이용하여 PCR에 의해 플라스미드 pTRC99A (스트라타진(Stratagene))로부터 PlacIq-lacI-TT02 영역을 증폭시키고, 하기 올리고뉴클레오티드, Ome2072-GfpTurboOpt-RBS01*2-AvrII-OP01-Ptrc01-NheI-TT02-F 및 Ome2073-EcoRI-SfiI-PacI-TT07-R을 이용하여 PCR에 의해 (진아트(Geneart)에 의해 합성되고, 하기 기술되는) 플라스미드 pCR4BluntTOPO-TTadc-CI857*-P람다R*(-35)-RBS01-GfpTurboOpt-TT07로부터 Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07 영역을 증폭시켰다. 이어서, PlacIq-lacI-TT02, 및 매트릭스로서 중복 영역을 가지는 Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07 PCR 생성물, 및 올리고뉴클레오티드 Ome2070-EcoRI-PlacIq-F 및 Ome2073-EcoRI-SfiI-PacI-TT07-R을 이용하여 중복 PCR을 수행하였다. 최종 PCR 생성물 PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07을 EcoRI 및 SfiI 제한 효소에 의해 분해하고, pCC1BAC 벡터의 EcoRI/SfiI 내로 클로닝하였다. DNA 서열분석에 의해 재조합 플라스미드를 확인하고, pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07 플라스미드를 수득하였다.

Ome2070-EcoRI-PlacIq-F (서열 번호 1)

여기서,

- EcoRI 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 서열은 소문자로 표시,

- pTRC99A 벡터에 의해 보유되는, lacI 유전자의 PlacIq 변형된 버전의 프로모터에 상동성인 서열은 대문자로 표시 (2967-2991, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M22744.1 상의 참조 서열).

Ome2071-NheI-TT02-lacIq-R (서열 번호 2)

여기서,

- 인공 trc 프로모터, Ptrc01에 상동성인 서열은 굵은 대문자로 표시 (문헌 [Meynial-Salles et al. 2005]),

- NheI 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 서열은 소문자로 표시,

- TT02로 명명되는, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열인, 이. 콜라이 rrnB 유전자의 전사 종결 인자 T₁에 대한 서열은 대문자 이탤릭체로 표시 (문헌 [Orosz et al. 1991]),

- lacI 유전자에 상동성인 서열은 대문자로 표시 (4118-4137, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M22744.1 상의 참조 서열, 또는 365652-365671, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- 중복 PCR 단계에 필요한 중복 영역을 나타내는 서열은 밑줄체로 표시.

Ome2072-G TurboOpt-RBS01*2-AvrII-OP01-Ptrc01-NheI-TT02-F (서열 번호 3)

여기서,

- NheI 또는 AvrII 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 서열은 소문자로 표시,

- 인공 trc 프로모터, Ptrc01 및 오퍼레이터, OP01에 상동성인 서열은 굵은 대문자로 표시 (문헌 [Meynial-Salles et al. 2005]),

- RBS01*2로 명명되는, 리보솜 결합 부위 서열에 대한 서열은 굵은 소문자 이탤릭체로 표시,

- GfpTurboOpt로 명명되는 것으로서, 코돈 사용 빈도에 대해 최적화되었음을 의미하는 변형된 형태의 gfp 유전자에 대해 상동성인 서열은 대문자로 표시,

Ome2073-EcoRI-SfiI-PacI-TT07-R (서열 번호 4)

여기서,

- EcoRI, SfiI, PacI 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 서열은 소문자로 표시,

- TT07로 명명되는, 전사 종결 인자 서열 T7Te에 대한 서열은 대문자 이탤릭체로 표시 (문헌 [Harrington et al. 2001]).

진아트 컴퍼니(Geneart Company)에 의해 합성된, pCR4BluntTOPO-TTadc-CI857*-P람다R*(-35)-RBS01-GfpTurboOpt-TT07 플라스미드 내에 존재하는 GfpTurboOpt-TT07 영역 (서열 번호 17):

여기서,

- RBS01*2로 명명되는, 리보솜 결합 부위에 대한 서열은 굵은 소문자 이탤릭체로 표시,

- GfpTurboOpt로 명명되는 것으로서, 이. 콜라이에 대해 최적화된, GfpTurbo 유전자 (이브로진(Evrogene))에 대해 상동성인 서열은 소문자로 표시,

- BstZ17I 제한 부위에 대한 서열은 대문자로 표시,

- TT07로 명명되는, 전사 종결 인자 서열 T7Te에 대한 서열은 밑줄체로 표시 (문헌 [Harrington et al. 2001]).

pCC1BAC-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07 벡터 상에서 GfpTurboOpt 유전자를 ptsG 유전자로 교체하여 PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07을 수득하기 위해, 먼저 pCC1BAC-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07을 AvrII 및 BstZ17I 제한 효소로 분해하였다. 이어서, 하기 올리고뉴클레오티드, Ome2115-AvrII-RBS01*2-ptsG-F 및 Ome2116-BstZ17I-ptsG-R을 이용하여 PCR에 의해 이. 콜라이 MG1655 균주의 게놈 DNA로부터 ptsG 영역을 증폭시키고, 생성된 PCR 생성물을 AvrII 및 BstZ17I 제한 효소로 분해하고, pCC1BAC-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07 벡터의 AvrII/BstZ17I 부위로 클로닝하였다. DNA 서열분석에 의해 재조합 플라스미드를 확인하고, pCC1BAC-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07 플라스미드를 수득하였다.

Ome2115-AvrII-RBS01*2-ptsG-F (서열 번호 5)

여기서,

- NotI, AvrII 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 서열은 소문자로 표시,

- RBS01*2로 명명되는, 리보솜 결합 부위 서열에 대한 서열은 굵은 대문자로 표시,

- ptsG 유전자에 상동성인 서열은 대문자로 표시 (1157092-1157116, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

Ome2116-BstZ17I-ptsG-R (서열 번호 6)

여기서,

- BstZ17I 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 서열은 소문자로 표시,

- ptsG 유전자에 상동성인 서열은 대문자로 표시 (1158502-1158525, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

마지막으로, 생성된 플라스미드 pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07을 균주 1 내로 도입하여 MG1655 균주 2, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE Δ pgaABCD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA -metA*11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA - metA *11 ΔwcaM::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA - metA *11 ΔtreBC::TT02-serA-serC (pCL1920-PgapA - pycre-TT07) (pCC1BAC - P lacIq - lacI - TT02 -P trc 01/OP01/RBS01*2- ptsG -TT07)을 수득하였다.

상기 구축물 pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07에서 소형 RNA sgrS의 결합 부위 뿐만 아니라, 천연 프로모터도 강력한 인공 프로모터로 치환하였다. 그 결과, ptsG는 과다발현되었고, 그의 mRNA는 더 이상 조절되지 않았고, sgrS에 의해 분해되지 않았다.

유도성 조건하에서 (배양물 중 +IPTG) 성장시킨 균주 중에서의 ptsG 과다발현을 qPCR에 의해 체크하였다.

실시예 2: 균주 4 구축

1. 메티오닌을 생산하는 균주 3 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF ΔpykA Δ purU Δ yncA Δ malS::TTadc - CI857 -P 람다 R*(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - PgapA - metA *11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - PgapA - metA *11 Δ CP4 -6::TT02 -TTadc-P람다R*(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - PgapA - metA *11 Δ wcaM::TT02 - TTadc -P 람다 R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC::TT02 - serA - serC Ptrc30 -pntAB :: Cm Δ udhA (pCL1920 - PgapA - pycre - TT07)는 특허 출원 WO2012/055798 (이는 본 출원에서 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.

2. 균주 4 구축

그의 NADPH 생산 경로 (트랜스히드로게나제 UdhA 및 PntAB)가 변형된 메티오닌을 생산하는 균주에서 PtsG를 과다생산하기 위해, 본 발명자들은 (실시예 1에 기술된) 플라스미드 pCC1BAC-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07의 항생제 저항성 카세트를 변형시키는 것이 필요하였다. 본 발명자들 pCC1BAC-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07의 클로람페니콜 저항성 유전자를 겐타마이신 저항성 유전자로 교체하여 pCC1BACVB01-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07 플라스미드를 수득하였다.

상기 항생제 저항성 유전자 교체를 진행하기 위해, 본 발명자들은 pKD46 벡터 (진브릿지(Genebridges))가 보유하는 Red 시스템에 기초한 방법을 사용하였다. 본 목적을 위해 2개의 올리고뉴클레오티드가 사용되었다:

Ome2127-RHamont-pCC1BAC-Gt-F (서열 번호 7)

여기서,

- 클로람페니콜 저항성 유전자의 3' 중 pCC1BAC 벡터의 영역에 상동성인 서열은 대문자 밑줄체로 표시,

- p34S-Gm 벡터에 의해 보유되는 겐타마이신 저항성 유전자에 상동성인 서열은 대문자로 표시 (문헌 [Dennis & Zyltra, 1998]) (735-805, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF062079.1 상의 참조 서열), 및

Ome2128-RHaval-pCC1BAC-Gt-R (서열 번호 8)

여기서,

- 클로람페니콜 저항성 유전자의 5' 중 pCC1BAC 벡터의 영역에 상동성인 서열은 대문자 밑줄체로 표시,

- p34S-Gm 벡터에 의해 보유되는 겐타마이신 저항성 유전자에 상동성인 서열은 대문자로 표시 (문헌 [Dennis & Zyltra, 1998]) (272-344, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF062079.1 상의 참조 서열).

올리고뉴클레오티드 Ome2127-RHamont-pCC1BAC-Gt-F 및 Ome2128-RHaval-pCC1BAC-Gt-R을 사용하여 플라스미드 p34S-Gm으로부터 겐타마이신 저항성 카세트를 증폭시켰다 (문헌 [Dennis & Zyltra, 1998]). 이어서, 수득된 PCR 생성물을, Red 리콤비나제 효소를 통해 상동성 재조합이 가능한 균주 DH5알파 (pCC1BAC-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07) (pKD46) 내로 전기천공에 의해 도입시켰다. 이어서, 겐타마이신 저항성 및 클로람페니콜 감수성 형질전환체를 선별하고, 제한 프로파일 분석에 의해 저항성 카세트의 삽입을 확인하였다.

마지막으로, DNA 서열분석에 의해 재조합 플라스미드 pCC1BACVB01-PlacIq -lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07을 확인하고, 균주 3 내로 도입하여 MG1655 균주 4 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA ΔmalS::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA *1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA - metA*11 Δt re BC::TT02-serA - serC P trc 30 - pntAB :: Cm Δ udhA (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) (pCC1BACVB01-P lacIq - lacI -TT02-P trc 01/OP01/RBS01*2- ptsG -TT07)를 수득하였다.

상기 구축물 pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07에서 소형 RNA sgrS의 결합 부위 뿐만 아니라 천연 프로모터도 강력한 인공 프로모터로 치환하였다. 그 결과, ptsG는 과다발현되었고, 그의 mRNA는 더 이상 조절되지 않았고, sgrS에 의해 분해되지 않았다.

실시예 3: 균주 5 구축

ptsG 전사체 및 PtsG 단백질에 대한 임의의 조절을 막기 위해, 본 발명자들은 PtsG 활성을 조절하는 소량의 펩티드를 코딩하는 유전자 sgrT, 및 ptsG의 mRNA를 방해하는 sgrS 소형 RNA를 코딩하는 sgrS 유전자의 일부를 결실시켰다.

유전자 sgrS /T는 sgrS /T- setA 오페론의 첫번째 유전자이다. 하류 유전자 setA의 발현을 파기시키지 않으면서, sgrS /T 유전자를 결실시키기 위해, 본 발명자들은 sgrS/T를 결실시킴과 동시에, setA 유전자를 오페론의 프로모터 하류로 이동시켰다. 본 목적을 위해, 본 발명자들은 프로토콜 1에 기술되어 있는 상동성 재조합 전략법을 사용하였다. sgrS /T 유전자를 결실시키고, 오페론 프로모터 하류의 setA 유전자는 회복시키면서, 게이오(Keio) 돌연변이체 콜렉션 (문헌 [Baba et al., 2006])의 에스케리키아 콜라이 BW25113 Δ setA::Km (pKD46) 균주를 사용하여 클로람페니콜 저항성 카세트를 삽입하였다.

구체적으로, sgrS /T 유전자를 결실시키는 데 필요한, 단편 "sgrR-PsgrR-PsgrS-RBSsetA-setA-FRT-Cm-FRT-leuD" (단편 4)를 중복 PCR에 의해 증폭시켰다. 최종 중복 PCR을 위한 매트릭스로서의 역할을 하는 제1 단편 1, 2, 및 3을 증폭시켰다; 이들 단편은 각각 3' 말단부와 5' 말단부 사이에, 중복 PCR 단계를 허용하는, 48개의 뉴클레오티드 길이의 상동성 영역을 포함하였다. 단편 1인 "sgrR-PsgrR-PsgrS-RBSsetA-setA"는 올리고뉴클레오티드 Ome2371-DsgrS-F1 및 Ome2372-DsgrS-R1을 사용하여 에스케리키아 콜라이 MG1655 게놈 DNA로부터 증폭시켰고; 단편 2인 "PsgrR-PsgrS-RBSsetA-setA"는 올리고뉴클레오티드 Ome2373-DsgrS-F2 및 Ome2374-DsgrS-R2를 이용하여 에스케리키아 콜라이 MG1655 게놈 DNA로부터 증폭시켰고; 단편 3인 "FRT-Cm-FRT-leuD"는 올리고뉴클레오티드 Ome2375-DsgrS-F3 및 Ome2376-DsgrS-R3을 사용하여 플라스미드 pKD3으로부터 PCR 증폭시켰다. 마지막으로, 단편 4는 올리고뉴클레오티드 Ome2371-DsgrS-F1 및 Ome2376-DsgrS-R3을 사용함으로써, 매트릭스로서 사용되는 단편 1, 2, 및 3의 믹스로부터 PCR 증폭시켰다.

Ome2371-DsgrS-F1 (서열 번호 9)

sgrR 유전자에 상동성이다 (76743-76765, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

Ome2372-DsgrS-R1 (서열 번호 10)

여기서,

- sgrR 및 sgrS 프로모터 영역에 상동성인 서열은 대문자로 표시 (77379-77398, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- setA 영역에 상동성인 것은 굵은 대문자로 표시 (77637-77607, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열),

Ome2373-DsgrS-F2 (서열 번호 11)

여기서,

- sgrR 및 sgrS 프로모터 영역에 상동성인 서열은 대문자로 표시 (77370-77398, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- setA 영역에 상동성인 서열은 굵은 대문자로 표시 (77637-77607, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열),

Ome2374-DsgrS-R2 (서열 번호 12)

여기서,

- 클로람페니콜 저항성 카세트 증폭을 위한 서열은 대문자 이탤릭체로 표시 (문헌 [Datsenko & Wanner, 2000] 중의 참조 서열),

- setA 영역에 상동성인 서열은 굵은 대문자로 표시 (78799-78777, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열),

Ome2375-DsgrS-F3 (서열 번호 13)

여기서,

- setA 영역에 상동성인 서열은 굵은 대문자로 표시 (78764-78799, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열),

Ome2376-DsgrS-R3 (서열 번호 14)

여기서,

- setA - leuD 영역에 상동성인 서열은 대문자로 표시 (78919-78800, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열),

- 클로람페니콜 저항성 카세트 증폭을 위한 서열은 대문자 이탤릭체로 표시 (문헌 [Datsenko & Wanner, 2000] 중의 참조 서열).

이어서, 단편 4에 상응하는, 생성된 PCR 생성물을, Red 리콤비나제 효소를 통해 상동성 재조합이 가능한 균주 BW25113 Δ setA::Km (pKD46) 내로 전기천공에 의해 도입시켰다. 이어서, 클로람페니콜 저항성 형질전환체를 선별하고, 저항성 카세트의 삽입을 하기 정의되는 올리고뉴클레오티드 Ome2378-DsgrS-Fseq 및 Ome2377-DsgrS-Rseq를 이용하여 PCR 분석에 의해 확인하고, DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 선별된 균주를 BW25113 Δ sgrS::Cm으로 명명하였다.

sgrT 오픈 리딩 프레임은 소형 RNA를 코딩하는 sgrS 서열과 중복되는 바, sgrS 결실로 sgrT가 결실되었다. 따라서, sgrS /T 결실을 ΔsgrS로 명명하였다.

Ome2378-DsgrS-Fseq (서열 번호 15)

sgrR 유전자에 상동성이다 (76502-76521, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

Ome2377-DsgrS-Rseq (서열 번호 16)

leuD 유전자에 상동성이다 (79143-79120, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

P1 파지 형질도입에 의해 sgrS /T 결실을 BW25113 Δ sgrS::Cm 균주로부터 균주 1로 전달하였다. 이어서, 클로람페니콜 저항성 형질전환체를 선별하고, 올리고뉴클레오티드 Ome2378-DsgrS-Fseq 및 Ome2377-DsgrS-Rseq를 이용하여 PCR 분석에 의해 저항성 카세트의 삽입을 확인하였다. 생성된 균주를 균주 5, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA - serC ΔsgrS ::Cm (pCL1920-PgapA - pycre-TT07)으로 명명하였다.

실시예 4: 균주 6 구축

그의 NADPH 생산 경로 (트랜스히드로게나제 UdhA 및 PntAB)가 변형된 메티오닌 균주에서의 PtsG 조절을 극복하기 위해, 균주 3에서 sgrS /T 유전자를 결실시켰다.

본 목적을 위해, 먼저, Δ sgrS::Cm 결실의 클로람페니콜 저항성 카세트를 카나마이신 저항성 카세트로 교체하였다. 이를 위해, pCP20 및 pKD4 플라스미드를 BW25113 Δ sgrS::Cm 균주 내로 도입하고, 37℃에서 카나마이신으로 보충된 LB 상에 형질전환체를 도말한 후, 올리고뉴클레오티드 Ome2378-DsgrS-Fseq 및 Ome2377-DsgrS-Rseq를 이용하여 PCR에 의해 성장하는 클론을 확인하였다. 이어서, P1 파지 형질도입에 의해 Δ sgrS::Km 결실을 BW25113 Δ sgrS::Km 균주로부터 균주 3으로 전달하였다. 카나마이신 저항성 형질전환체를 선별하고, 올리고뉴클레오티드 Ome2378-DsgrS-Fseq 및 Ome2377-DsgrS-Rseq를 이용하여 PCR 분석에 의해 저항성 카세트의 삽입을 확인하였다. 생성된 균주를 균주 6, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE Δp gaAB CD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA - serC P trc 30 - pntAB ::Cm Δ udhA Δ sgrS :: Km (pCL1920-PgapA-pycre-TT07)으로 명명하였다.

실시예 5: 균주 7 구축

이미 pCC1BACVB01-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07로부터 ptsG를 과다발현하고 있는 것인 균주 2에서의 글루코스 유입을 급격하게 증가시키기 위해, 본 발명자들은 상기 균주에서 sgrS /T 유전자를 결실시켰다.

본 목적을 위해, P1 파지 형질도입에 의해 Δ sgrS 결실을 BW25113 ΔsgrS::Km 균주로부터 균주 2로 전달하였다. 이어서, 클로람페니콜 저항성 형질전환체를 선별하고, 올리고뉴클레오티드 Ome2378-DsgrS-Fseq 및 Ome2377-DsgrS-Rseq를 이용하여 PCR 분석에 의해 저항성 카세트의 삽입을 확인하였다. 생성된 균주를 균주 7, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA - serC Δ sgrS :: Cm (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) (pCC1BACVB01 - P lacIq - lacI - TT02 -P trc 01/OP01/RBS01*2- ptsG -TT07)으로 명명하였다.

실시예 6: 균주 15 구축

1. 균주 8

메티오닌을 생산하는 균주 8은 특허 출원 WO2012/055798 (이는 본 출원에서 참고로 포함된다)에 기술되어 있다. 균주 8의 유전자형은 하기 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA - serC이다.

2. 균주 9, 10, 11 및 12 구축

리조비움 에틀리(Rhizobium etli)의, pycre로 명명되는 피루베이트 카르복실라제 유전자를 과다발현시키기 위해, 상기 유전자의 카피를 염색체 상의 melB 및 purU 유전자좌에 2회에 걸쳐 통합시켰다. pycre 유전자의 번역 출발 부위의 상류에 통합되는 합성 Ptrc 프로모터 서열, mRNA-안정화 서열 및 최적화된 리보솜 결합 부위를 부가함으로써 melB 유전자좌에서 pycre 유전자를 발현시켰다. 상기 구축물에 ΔmelB::RN/Ptrc1/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07이라고 주석을 달았다. pycre 유전자의 번역 출발 부위의 상류에 통합되는 PL1*1 (파지 람다의 Pλ1 프로모터의 -10 박스 중 돌연변이), 및 최적화된 리보솜 결합 부위를 부가함으로써 purU 유전자좌에서 pycre 유전자를 발현시켰다. 상기 구축물에 Δ purU ::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07이라고 주석을 달았다.

하기 제시되는 염색체 상의 상이한 유전자좌에서의 유전자 통합에 관한 설명은 모두 동일한 방법에 따라 구축된 것이었다; 1) 관심의 대상이 되는 유전자좌의 상류 및 하류 상동성 서열, DNA 단편, 및 저항성 카세트를 함유하는 중복 벡터 구축, 2) 상동성 재조합에 의한 관심의 대상이 되는 변형의 최소 균주 (MG 1655 metA*11 pKD46)로의 통합, 및 3) 관심의 대상이 되는 변형의 복합 균주 (이미 수개의 변형을 함유하고 있는 것인 MG1655)로의 형질도입.

2.1. 균주 9 및 10 구축

melB 유전자를 결실시키고, 이를 Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 영역으로 치환시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기술되어 있는 상동성 재조합 전략법을 사용하였다. 상기 전략법을 통해, 관련 유전자들 대부분을 결실시키면서, 클로람페니콜 또는 카나마이신 저항성 카세트 뿐만 아니라, 추가의 DNA를 삽입시킬 수 있었다. 본 목적을 위해, 하기 플라스미드, pUC18-melB ::TT02- Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07::Km을 구축하였다. 상기 pUC18-melB ::TT02- Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07::Km 플라스미드는 pUC18 벡터로부터 유도된 것이고 (문헌 [Norrander et al., Gene 26 (1983), 101-106]), 이는 Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 단편에 연결된 카나마이신 저항성 카세트를 보유하는 것으로, 이 둘 모두는 melB의 상류 및 하류 영역 사이에서 클로닝되어 있는 것이다.

pUC18-Δ melB ::TT02-Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07::Km을 구축하기 위해, 먼저 pUC18-Δ melB ::TT02-SMC 플라스미드를 구축하였다. 상기 플라스미드는 전사 종결 인자 (TT02로 명명되는, 이. 콜라이 rrnB 유전자의 T₁)에 의해 이격되어 있는, melB의 상류 및 하류 영역, 및 (SMC로 명명되는, BstZ17I, HindIII, PacI, AvrII, ApaI, SmaI, BamHI 제한 부위로 구성된) 다중 클로닝 부위를 보유하였다. 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 게놈 DNA로부터 상기의 마지막 영역을 PCR 증폭시켰다:

melBup-F (서열 번호 23)

여기서,

- SfoI 및 KpnI 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 영역 (소문자로 표시),

- melB 영역의 서열 (4340489-4340513)에 상동성인 영역 (대문자로 표시) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열).

melBup-R (서열 번호 24)

여기서,

- BstZ17I 제한 부위 및 다중 클로닝 부위의 HindIII 제한 부위의 일부에 대한 영역 (소문자로 표시),

- 이. 콜라이의 rrnB 유전자의 전사 종결 인자 T₁에 대한 영역 (굵은 대문자로 표시) (문헌 [Orosz et al. 1991]),

- melB 영역의 서열 (4341377-4341406)에 상동성인 영역 (대문자로 표시) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열).

melBdown-F (서열 번호 25)

여기서,

- 이. 콜라이의 rrnB 유전자의 전사 종결 인자 T₁의 일부에 대한 영역 (굵은 대문자로 표시) (문헌 [Orosz et al. 1991]),

- 전체 다중 클로닝 부위에 대한 영역 (소문자로 표시),

- melB 영역의 서열 (4342793-4342818)에 상동성인 영역 (대문자로 표시) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열).

melBdown-R (서열 번호 26)

여기서,

- melB 영역의 서열 (4343694-4343719)에 상동성인 영역 (대문자로 표시) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열).

먼저, 각각 melBup-F/melBup-R 및 melBdown-F/melBdown-R 올리고뉴클레오티드를 사용하여 MG1655 게놈 DNA로부터 "upMelB" 및 "downMelB" 단편을 PCR 증폭시켰다. 이어서, melBup-F/melBdown-R 올리고뉴클레오티드를 사용하여 (이. 콜라이의 rrnB 유전자의 전사 종결 인자 T₁의 일부 및 다중 클로닝 부위의 일부로 구성된 중복 영역을 포함하는) "upMelB" 및 "downMelB" PCR 단편으로부터 "upMelB-downMelB" 단편을 증폭시켰다. "upMelB-downMelB" PCR 단편을 제한 효소 SfoI로 절단하고, pUC18 벡터의 평활화된 EcoRI/HindIII 부위로 클로닝하여 pUC18-ΔmelB::TT02-SMC 플라스미드를 수득하였다.

이어서, 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 pKD4 벡터로부터 카나마이신 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다:

Km-F (서열 번호 27)

여기서,

- 카나마이신 저항성 카세트의 증폭을 위한 영역 (소문자로 표시) (문헌 [Datsenko & Wanner (2000)] 중의 참조 서열),

- SmaI 및 BstZ17I 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 영역 (대문자로 표시).

Km-R (서열 번호 28)

여기서,

- HindIII 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 영역 (대문자로 표시).

PCR 단편을 제한 효소 BstZ17I 및 HindIII로 절단하고, pUC18-Δ melB ::TT02-SMC 플라스미드의 BstZ17I/HindIII 부위로 클로닝하여 pUC18-Δ melB ::TT02-SMC::Km 플라스미드를 수득하였다.

마지막으로, 프라이머 Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-F 및 pycre-TT07-R을 사용하여 특허 출원 WO2012/055798에 기술되어 있는 플라스미드 pCL1920-PgapA -pycre-TT07로부터 Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 단편을 PCR 증폭시켰다. PCR 단편을 제한 효소 AvrII 및 PacI로 절단하고, pUC18-Δ melB ::TT02-SMC::Km 플라스미드의 AvrII/PacI 부위로 클로닝하여 pUC18-Δ melB ::TT02-Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07::Km 플라스미드를 수득하였다.

재조합 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.

Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-F (서열 번호 29)

여기서,

- PacI 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 영역 (소문자로 표시),

- 인공 유도성 trc 프로모터에 상동성인 영역 (굵은 대문자로 표시),

- mRNA를 안정화시킨 서열에 상동성인 영역 (대문자 밑줄체로 표시) (문헌 [Meynial-Salles et al. 2005]),

- 최적화된 리보솜 결합 부위에 상동성인 영역 (대문자 이탤릭체로 표시),

- 리조비움 에틀리의 pyc 유전자의 출발부에 상동성인 영역 (대문자로 표시) (1-32).

pycre-TT07-R (서열 번호 30)

여기서,

- SmaI, AvrII 및 NotI 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 영역 (소문자로 표시),

- TT07로 명명되는, T7te 전사 종결 인자 서열에 대한 영역 (굵은 대문자로 표시) (문헌 [Harrington et al. 2001]),

- 리조비움 에틀리의 pyc 유전자의 말단부에 상동성인 영역 (대문자로 표시) (3441-3465).

두번째로, pUC18-Δ melB ::TT02-Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07::Km 플라스미드를 KpnI 제한 효소로 절단하여 Δ melB ::TT02-Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07::Km 단편을 수득한 후, 프로토콜 1에 따라 전기천공에 의해 MG1655 metA*11 pKD46 균주 내로 도입시켰다. 이어서, 카나마이신 저항성 형질전환체를 선별하고, 올리고뉴클레오티드 melB-pycre-F 및 melB-pycre-R을 이용하여 PCR 분석에 의해 Δ melB ::TT02-Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07::Km 단편의 삽입을 확인하였다. 확인되고 선별된 균주를 MG1655 metA *11 pKD46 Δ melB ::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07::Km으로 명명하였다.

melB-pycre-F (서열 번호 31)

melB 영역의 서열 (4340168-4340187) (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)에 상동성이다.

melB-pycre-R (서열 번호 32)

melB 영역의 서열 (4344044-4344065) (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)에 상동성이다.

세번째로, 프로토콜 2에 따라, 상기 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 ΔmelB::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07::Km으로부터의 P1 파지 용해물을 이용하여 Δ melB ::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07::Km 염색체 변형을 균주 8 내로 형질도입시켰다. 카나마이신 저항성 형질도입체를 선별하고, 프라이머 melB-pycre-F 및 melB-pycre-R을 이용하여 PCR에 의해 Δ melB ::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07::Km 염색체 변형의 존재를 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS ::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM ::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA - serC ΔmelB:: RN/P trc 01/ARN01/RBS01*2- pycre -TT07::Km을 균주 9로 명명하였다.

이어서, 카나마이신 저항성 카세트를 제거하였다. 카나마이신 저항성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 리콤비나제 FLP를 보유하는 pCP20 플라스미드를 균주 9내로 도입시켰다. 37℃에서의 일련의 배양 후, 앞서 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오티드, melB-pycre-F/melB-pycre-R을 이용하여 PCR 분석에 의해 카나마이신 저항성 카세트의 손실을 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δp u rU Δ yncA Δ malS ::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD ::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA - serC Δ melB :: RN / P trc 01 / ARN01 / RBS01 *2- pycre -TT07을 균주 10으로 명명하였다.

2.2. 균주 11 및 12 구축

purU 유전자를 결실시키고, 이를 PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 영역으로 치환시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기술되어 있는 상동성 재조합 전략법을 사용하였다. 본 목적을 위해, 하기 플라스미드, pUC18-ΔpurU::TT02-PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km을 구축하였다. 상기 pUC18-ΔpurU::TT02-PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km 플라스미드는 pUC18 벡터로부터 유도된 것이고 (문헌 [Norrander et al., Gene 26 (1983), 101-106]), 이는 PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 단편에 연결된 카나마이신 저항성 카세트를 보유하는 것으로, 이 둘 모두는 purU의 상류 및 하류 영역 사이에서 클로닝되어 있는 것이다.

pUC18-Δ purU ::TT02-PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km을 구축하기 위해, 먼저 pUC18-Δ purU ::TT02-SMC 플라스미드를 구축하였다. 상기 플라스미드는 전사 종결 인자 (TT02로 명명되는, 이. 콜라이 rrnB 유전자의 T₁)에 의해 이격되어 있는, purU의 상류 및 하류 영역, 및 (SMC로 명명되는, BstZ17I, HindIII, PacI, AvrII, ApaI, SmaI, BamHI 제한 부위로 구성된) 다중 클로닝 부위를 보유하였다. 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 게놈 DNA로부터 상기의 마지막 영역을 PCR 증폭시켰다:

purUup-F (서열 번호 33)

여기서,

- StuI 및 NsiI 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 영역 (소문자로 표시),

- purU 영역의 서열 (1288424-1288447)에 상동성인 영역 (대문자로 표시) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열).

purUup-R (서열 번호 34)

여기서,

- purU 영역의 서열 (1287849-1287877)에 상동성인 영역 (대문자로 표시) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열).

purUdown-F (서열 번호 35)

여기서,

- 전체 다중 클로닝 부위에 대한 영역 (소문자로 표시),

- purU 영역의 서열 (1287000-1287028)에 상동성인 영역 (대문자로 표시) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열).

purUdown-R (서열 번호 36)

여기서,

- purU 영역의 서열 (1286429-1286452)에 상동성인 영역 (대문자로 표시) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열).

먼저, 각각 purUup-F/purUup-R 및 purUdown-F/purUdown-R 올리고뉴클레오티드를 사용하여 MG1655 게놈 DNA로부터 "upPurU" 및 "downPurU" 단편을 PCR 증폭시켰다. 이어서, purUup-F/purUdown-R 올리고뉴클레오티드를 사용하여 (이. 콜라이의 rrnB 유전자의 전사 종결 인자 T₁의 일부 및 다중 클로닝 부위의 일부로 구성된 중복 영역을 포함하는) "upPurU" 및 "downPurU" PCR 단편으로부터 "upPurU-downPurU" 단편을 증폭시켰다. "upPurU-downPurU" PCR 단편을 제한 효소 StuI로 절단하고, pUC18 벡터의 평활화된 EcoRI/HindIII 부위로 클로닝하여 플라스미드 pUC18-Δ purU ::TT02-SMC를 수득하였다.

이어서, (상기 기술된) 올리고뉴클레오티드 Km-F 및 Km-R을 사용하여 pKD4 벡터로부터 카나마이신 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다. PCR 단편을 제한 효소 BstZ17I 및 HindIII로 절단하고, pUC18-Δ purU ::TT02-SMC 플라스미드의 BstZ17I/HindIII 부위로 클로닝하여 플라스미드 pUC18-Δ purU ::TT02-SMC::Km을 수득하였다.

마지막으로, 프라이머 PL1*1/RBS01*2-pycre-F 및 pycre-TT07-R2를 사용하여 특허 출원 WO2012/055798에 기술되어 있는 플라스미드 pCL1920-PgapA - pycre-TT07로부터 PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km 단편을 PCR 증폭시켰다. PCR 단편을 제한 효소 SpeI 및 SmaI로 절단하고, pUC18-Δ purU ::TT02-SMC::Km 플라스미드의 AvrII/SmaI 부위로 클로닝하여 pUC18-Δ purU ::TT02-PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km 플라스미드를 수득하였다. 재조합 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.

PL1*1/RBS01*2-pycre-F (서열 번호 37)

여기서,

- SpeI, SalI, HpaI 및 MluI 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 영역 (소문자로 표시),

- 단쇄 형태의 람다 박테리오파지 P_L 프로모터 (P_L1, 문헌 [Giladi et al. 1995])에 상동성이고, 문헌 [Kincade & deHaseth (1991)]에 기술된 -10 박스 중 돌연변이 (G12T, 굵은 밑줄체로 표시)를 보유하는 영역 (굵은 대문자로 표시). 상기 프로모터는 PL1*1로 명명하며,

- 리조비움 에틀리의 pyc 유전자의 5' 출발부에 상동성인 영역 (대문자로 표시) (1-32).

pycre-TT07-R2 (서열 번호 38)

여기서,

- SmaI, PacI, ScaI, SnaBI 제한 부위 및 잉여 염기에 대한 영역 (소문자로 표시),

- T7te 전사 종결 인자 서열에 대한 영역 (굵은 대문자로 표시) (문헌 [Harrington et al. 2001]),

- 리조비움 에틀리의 pyc 유전자의 5' 말단부에 상동성인 영역 (대문자로 표시) (3445-3465).

두번째로, pUC18-ΔpurU ::TT02-PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km 플라스미드를 NsiI 제한 효소로 절단하여 ΔpurU ::TT02-PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km 단편을 수득한 후, 프로토콜 1에 따라 전기천공에 의해 균주 MG1655 metA*11 pKD46 내로 도입시켰다. 이어서, 카나마이신 저항성 형질전환체를 선별하고, 올리고뉴클레오티드 purU-pycre-F 및 purU-pycre-R을 이용하여 PCR 분석에 의해 ΔpurU ::TT02-PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km의 삽입을 확인하였다. 확인되고 선별된 균주를 MG1655 metA *11 pKD46 Δ purU ::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km으로 명명하였다.

purU-pycre-F (서열 번호 39)

purU 영역의 서열 (1288589-1288608) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열)에 상동성이다.

purU-pycre-R (서열 번호 40)

purU 영역의 서열 (1285868-1285887) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열)에 상동성이다.

세번째로, 프로토콜 2에 따라, 상기 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km으로부터의 P1 파지 용해물을 이용하여 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km 염색체 변형을 균주 10 내로 형질도입시켰다. 카나마이신 저항성 형질도입체를 선별하고, 프라이머 purU-pycre-F 및 purU-pycre-R을 이용하여 PCR에 의해 Δ purU ::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km 염색체 변형의 존재를 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Δ melB ::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU:: RN/PL1*1/RBS01*2- pycre -TT07::Km을 균주 11로 명명하였다.

이어서, 카나마이신 저항성 카세트를 제거하였다. 카나마이신 저항성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 리콤비나제 FLP를 보유하는 pCP20 플라스미드를 균주 11내로 도입시켰다. 37℃에서의 일련의 배양 후, 앞서 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오티드 purU-pycre-F/purU-pycre-R을 이용하여 PCR 분석에 의해 카나마이신 저항성 카세트의 손실을 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δp u rU Δ yncA Δ malS ::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD ::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM ::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA - serC Δ melB ::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 Δp u rU:: RN / PL1 *1/ RBS01 *2- pycre - TT07을 균주 12로 명명하였다.

3. 균주 13 및 14 구축

메틸렌-테트라히드로폴레이트 풀을 세포 내로 증가시키기 위하여, 염색체 상의 yjbI 유전자좌에 gcvTHP 오페론 1 카피를 첨가함으로써 gcvTHP 오페론에 의해 코딩되는 글리신 절단 복합체를 과다생산하였다. 인공 유도성 trc 프로모터 및 최적화된 리보솜 결합 부위를 사용하여 상기 추가의 gcvTHP 카피를 발현시킴으로써 특허 출원 PCT/FR2012/051361에 기술된 Δ yjbI ::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km 염색체 통합을 수득하였다.

프로토콜 2에 따라, 특허 출원 PCT / FR2012 /051361에 기술된, 균주 MG1655 metA*11 pKD46 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km으로부터의 P1 파지 용해물을 이용하여 Δ yjbI ::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km 염색체 변형을 균주 12 내로 형질도입시켰다. 카나마이신 저항성 형질도입체를 선별하고, 특허 출원 PCT/FR2012/051361에 기술된, 프라이머 yjbI-gcvTHP-F 및 yjbI-gcvTHP-R을 이용하여 PCR에 의해 Δ yjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km 염색체 변형의 존재를 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Δ melB ::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 Δ yjbI :: RN / P trc 01 / RBS01 - gcvTHP - TT07 :: Km을 균주 13으로 명명하였다.

이어서, 카나마이신 저항성 카세트를 제거하였다. 카나마이신 저항성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 리콤비나제 FLP를 보유하는 pCP20 플라스미드를 균주 13내로 도입시켰다. 37℃에서의 일련의 배양 후, 앞서 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오티드, yjbI-gcvTHP-F 및 yjbI-gcvTHP-R을 이용하여 PCR 분석에 의해 카나마이신 저항성 카세트의 손실을 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB Δ metJ ΔpykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS ::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM ::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA - serC ΔmelB::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU ::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 Δ yjbI:: RN/P trc 01/RBS01- gcvTHP -TT07을 균주 14로 명명하였다.

4. 균주 15 구축

세린 경로로의 유입을 증가시키기 위해, 특허 출원 PCT / FR2012 /051361에 기술된 플라스미드 pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca를 균주 14 내로 도입시켜 균주 15로 명명되는, 하기 균주 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS ::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM ::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA - serC ΔmelB::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU ::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 (pCC1BAC - TT02 - P trc 30 / RBS01 - serC - TT07 *2-P trc 30/RBS01- serA -TT adcca )을 수득하였다.

실시예 7: 균주 16 및 17 구축

1. 균주 16 구축

세포 내로의 글루코스 유입을 증가시키기 위해, 에스케리키아 콜라이 PEP-의존성 당 포스포트랜스퍼라제 (PTS) 시스템의 효소를 코딩하는 다수의 유전자 발현을 제어하는, 전사 이중 조절 인자를 코딩하는 유전자 dgsA (또는 mlc)를 결실시켰다.

dgsA 유전자를 결실시키기 위해, 본 발명자들은 게이오 돌연변이체 콜렉션 (문헌 [Baba et al., 2006])의 에스케리키아 콜라이 BW25113 Δ dgsA ::Km 균주를 사용하였다. (프로토콜 2에 따라) P1 파지 형질도입에 의해 ΔdgsA ::Km 결실을 BW25113 ΔdgsA ::Km 균주로부터 균주 14로 전달하였다. 카나마이신 저항성 형질도입체를 선별하고, 하기 정의되는 프라이머 dgsA-F 및 dgsA-R을 이용하여 PCR에 의해 ΔdgsA ::Km 염색체 결실의 존재를 확인하였다.

MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA ΔmalS::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD ::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM ::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δtre BC::TT02-serA - serC Δ melB ::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 Δ dgsA:: Km을 보유하는 균주는 균주 16이라고 명명하였다.

dgsA-F (서열 번호 41)

dgsA 영역의 서열 (1667067-1667086) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열)에 상동성이다.

dgsA-R (서열 번호 42)

dgsA 영역의 서열 (1664853-1664872) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 상의 참조 서열)에 상동성이다.

2. 균주 17 구축

세포 내로의 글루코스 유입을 증가시키는 또다른 방법은 글루코스 포스포트랜스퍼 시스템의 막통과 파트너인 PtsG (IIC^Glc)를 과다생산하는 데 있다. 균주 15 배경하에서 ptsG를 과다발현시키기 위해, 하기 플라스미드, pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca를 구축하였다.

플라스미드 pCC1BACVB01-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca는 (상기 실시예 1, 균주 2 구축에 기술되어 있는) 플라스미드 pCC1BACVB01-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT01로부터, 및 특허 출원 PCT / FR2012 /051361에 기술된 플라스미드 pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca로부터 유도된 것이다. Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca 단편을 플라스미드 pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca로 제한 효소 SnaBI 및 AvrII로 절단하고, pCC1BACVB01-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07 플라스미드의 평활화된 PacI 부위로 클로닝하여 플라스미드 pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca를 수득하였다.

이어서, 플라스미드 pCC1BACVB01-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca를 균주 16 내로 도입시켜, 균주 17로 명명되는, 하기 균주 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA ΔmalS::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD ::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM ::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC ::TT02-serA - serC Δ melB ::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 Δ dgsA:: Km (pCC1BACVB01 - P lacIq - lacI - TT02 - P trc 01 / OP01 / RBS01 *2- ptsG - TT07 -P trc 30/RBS01- serC -TT07*2-P trc 30/RBS01- serA -TT adcca )을 수득하였다.

상기 플라스미드 pCC1BACVB01-PlacIq - lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07에서 소형 RNA sgrS의 결합 부위 뿐만 아니라, ptsG 유전자의 천연 프로모터도 강력한 인공 프로모터로 치환하였다 (상기 실시예 1에 기술된 구축). 그 결과, ptsG는 과다발현되었고, 그의 mRNA는 더 이상 조절되지 않았고, sgrS에 의해 분해되지 않았다.

유도성 조건하에서 (배양물 중 +IPTG) 성장시킨 균주 17에서의 ptsG 유전자의 과다발현을 qPCR에 의해 체크하였다.

실시예 8: 균주 18 구축

균주 18은 (특허 출원 PCT / FR2012 /051361에 기술되어 있는) 플라스미드 pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca의 변형된 버전을 보유하였는데, 이는 본 발명자들이 pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca의 클로람페니콜 저항성 유전자를 겐타마이신 저항성 유전자로 교체하여 플라스미드 pCC1BACVB01-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca를 수득하였음을 의미한다.

pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca 플라스미드의 항생제 저항성 유전자를 교체하기 위해, 본 발명자들은 pCC1BACVB01-PlacIq -lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT01 플라스미드 구축에 대하여 상기 기술된 방법과 동일한 방법을 사용하였다.

이어서, 플라스미드 pCC1BACVB01--TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca를 균주 16 내로 도입하여 균주 18로 명명되는, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA ΔmalS::TTadc-CI857-P람다R*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD ::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM ::TT02-TTadc-P람다R*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔmelB::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU ::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 Δ dgsA :: Km (pCC1BACVB01-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca)을 수득하였다.

실시예 9: 진탕 플라스크에서의 발효에 의한 L-메티오닌 생산

소형 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 생산 균주를 평가하였다. 5.5 mL의 사전배양물을 혼합 배지 (2.5 g.L^-1 글루코스 및 90% 최소 배지 PC1을 포함하는 10% LB 배지 (시그마(Sigma) 25%) 중 30℃에서 21시간 동안 성장시켰다. 이를 사용하여 OD₆₀₀ = 0.2까지 PC1 배지 배양물 50 mL (하기 표 2)에 접종하였다. 필요할 경우, 스펙티노마이신의 경우, 50 mg.L^-1의 농도로, 클로람페니콜의 경우, 30 mg.L^-1의 농도로, 및 겐타마이신의 경우, 10 mg.L^-1의 농도로 항생제를 첨가하였다. IPTG는 각 실시예에서 지시되는 상이한 농도로 배양물을 첨가하였다. 배양물의 온도는 37℃였다. 배양물의 OD₆₀₀이 5 내지 7에 도달하였을 때, OPA/Fmoc 유도체화 후, HPLC에 의해 세포외 아미노산을 정량화하고, 굴절 계측 검출과 함께 HPLC (유기산 및 글루코스), 및 시릴화 후 GC-MS를 사용하여 다른 관련된 대사산물을 분석하였다. 각 균주에 대하여 수회에 걸쳐 반복하였다.

메티오닌 수율은 하기와 같이 표시하였다:

상이한 균주에서 ptsG 의 과다발현이 메티오닌 생산에 미치는 효과

표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 메티오닌 생산 수율은 ptsG의 과다발현시에 현저하게 증가하였다. IPTG가 20μM일 때, ptsG는 최상으로 유도되었고 (qPCR에 의해 체크하였을 때, 데이터는 나타내지 않음), 상기 조건하에서는 또한 메티오닌이 최상으로 생산되었다. 또한, ptsG 과다발현을 통해 배양물 중의 케토메틸발레레이트 축적은 감소되었다.

정보로서, 플라스크에서 배양된 대조군 균주 1에서의 메티오닌 생산 수율은 IPTG를 사용하지 않은 균주 2에서 수득된 수율과 동일하였다.

트랜스히드로게나제 발현이 변형되어 있는 (pntAB의 과다발현의 udhA의 결실) 균주 4에서의 ptsG의 과다발현을 통해 호모란티오닌 및 케토메틸발레레이트 생산이 감소되었다. 이러한 배경하에, ptsG의 과다발현은 메티오닌 생산 수율을 증진시키지는 못하였지만, 이를 통해 최종 생성물의 순도는 분명하게 개선되었다.

이는 메티오닌을 생산하는 균주에서 글루코스 유입 증가가 미치는 효과를 예측하는 것이 쉽지 않았음을 나타낸다.

sgrS 및 sgrT 가 메티오닌 생산에 미치는 효과

하기 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 메티오닌 수율은 유전자 sgrS 및 sgrT 결실시에 현저하게 증가하였다.

SgrS는 직접 및 간접적인 방식, 두 방식 모두로 ptsG mRNA의 번역을 억제시켰다. SgrS의 5' 말단은 PtsG의 활성을 조절하는, 43개의 아미노산 오픈 리딩 프레임 sgrT를 함유하였다.

균주 5에서는 두 유전자 sgrS 및 sgrT 모두가 결실되어 있는데, 이것이 메티오닌 생산에 대하여 미치는 효과는 긍정적이었고, ptsG의 과다발현시에 수득되는 효과와 유사하였다 (표 3 참조).

실시예 10: 균주 1 및 2를 이용한 생물반응기에서의 발효에 의한 L-메티오닌 생산

이어서, 생산 조건하에 플라스크에서 관심의 대상이 되는 대사 산물을 상당량 생산한 균주를 유가식 공정을 이용하여 2.5 L 발효기 (피에르 게랭(Pierre Guerin)) 중에서 시험하였다.

2.5 g.L^-1 글루코스를 포함하는 10 mL LB 배지 중에서 24시간 동안 성장시킨 배양물을 사용하여 최소 배지 (B1a) 중에서 24시간 동안 사전배양된 배양물에 접종하였다. 회전식 진탕기 (200 RPM)에서 50 mL의 최소 배지 (B1a)를 함유하는 500 mL 배플형 플라스크에서 상기 인큐베이션을 수행하였다. 제1 사전배양물을 30℃ 온도에서 배양하고, 제2 배양물은 34℃ 온도에서 배양하였다.

제3 사전배양 단계는 5 mL 진한 사전배양물과 함께, 1.2 g.L^-1 농도의 바이오매스에 접종된 200 mL의 최소 배지 (B1b)로 충전된 생물반응기 (식스포르스(Sixfors)) 중에서 수행하였다. 사전배양 온도는 34℃로 일정하게 유지시키고, pH는 10% NH₄OH 용액을 사용하여 pH 값이 6.8이 되도록 자동 조정하였다. 용존 산소 농도는 공기를 공급하고/거나 교반시켜 주면서, 30% 부분 공기압 포화값이 되도록 연속하여 조정하였다. 배치식 배지로부터의 글루코스 소진 후, 0.7 mL.h^-1을 초기 유속으로 하여 유가식 배양을 시작하고, 약 20 g.L^-1의 최종 세포 농도를 얻기 위해 0.13 h^-1의 성장 속도로 24시간 동안 지수적으로 성장시켰다.

이어서, 2.5 L 발효기 (피에르 게랭)를 600 mL의 최소 배지 (B2)로 충전시키고, 55 내지 70 mL 부피 범위의 사전배양물과 함께, 2.1 g.L^-1 농도의 바이오매스에 접종하였다.

사전배양 온도는 37℃로 일정하게 유지시키고, pH는 NH₄OH 용액을 자동 첨가함으로써 (9시간 동안 10% NH₄OH 및 배양 종결시까지 28%) 작업 값 (6.8)로 유지시켰다. 배치식 단계 동안에서 초기 교반 속도를 200 RPM으로 설정하고, 유가식 단계 동안 최대 1,000 RPM으로까지 증가시켰다. 배치식 단계 동안에서 초기 기류 속도를 40 NL.h^-1로 설정하고, 유가식 단계 시작 시점에 100 NL.h^-1로까지 증가시켰다. 용존 산소 농도를 20 내지 40% 값으로 유지시키고, 우선적으로는 교반을 증가시킴으로써 30% 포화로 유지시켰다.

세포량이 거의 5 g.L^-1 농도에 도달하게 되었을 때, 5 mL.h^-1의 초기 유속으로 유가식 배양을 시작하였다. 14시간 동안 공급액을 주입하고, 유속을 증가시켜 26시간 후에는 27 mL.h^-1에 도달한 S자형 프로파일을 얻었다. 정확한 공급 조건은 하기 등식으로 계산하였다:

여기서, Q(t)는 600 mL의 배치식 부피에 대한 공급 유속 (mL.h^-1)이다.

14시간인 경우, 파라미터는 p1 = 1.80, p2 = 22.40, p3 = 0.27, p4 = 6.50이고, 이어서, 14 h 내지 26시간인 경우, 파라미터는 p1 = 2.00, p2 = 25.00, p3 = 0.40, p4 = 9.00이었다.

26시간 동안의 유가식 배양 후, 공급액 펌프를 중단시키고, 글루코스 소진 후에는 배양을 중단하였다.

OPA/Fmoc 유도체화 후, HPLC에 의해 세포외 아미노산을 정량화하고, 굴절 계측 검출과 함께 HPLC (유기산 및 글루코스), 및 시릴화 후 GC-MS를 사용하여 다른 관련된 대사산물을 분석하였다.

표 10에서 알 수 있는 바와 같이, 균주 2 배양 동안 가해지는 IPTG 농도와는 상관없이, ptsG 과다발현이 메티오닌 생산을 현저하게 증가시켰다. 균주 2에서 ptsG 유전자의 구성적 과다발현 (유도 조건: 배치식 배지 중 20 μM IPTG-유가식 배지 중 20 μM IPTG)이 메티오닌 수율을 증진시키는 데 있어서 최상의 조건이었다.

ptsG의 발현 유도는 qPCR에 의해 체크하였다. ptsG mRNA 수준은 대조군 균주 1에서보다 IPTG를 이용한 균주 2 및 3에서 더욱더 높았다. 결과에 대해서는 도 1을 참조할 수 있다.

ptsG 과다발현시, 균주 2는 배양 동안에도, 배양 종결시에도 글루코스를 축적시키지 않았다. 대조적으로, 야생형 글루코스 유입을 가지는 균주 1은 25 h의 성장 이후 강한 글루코스 축적을 보였다. 잔류 글루코스 농도는 균주 1의 경우, 10 g/L 초과에, 및 균주 2의 경우, 3 g/L 미만에 도달하였다.

글루코스 유입 개선은 메티오닌 생산을 개선시킬 뿐만 아니라, 생성물의 순도도 개선시켰다.

pH를 조절하기 위해, 및 배양물을 공급하기 위해 첨가된 용액의 양을 초기 부피에 가산하고, 샘플링에 사용되고, 증발에 의해 손실된 부피를 감산함으로써 반응기 부피를 계산하였다.

이어서, 연속하여 공급 원료의 중량을 측정함으로써 유가식 부피로 이어졌다. 이어서, 주입된 중량, 용액 밀도 및 브릭스(Brix) ([글루코스]) 방법에 의해 측정된 글루코스 농도에 기초하여 글루코스 주입량을 계산하였다. 메티오닌 수율은 하기와 같이 표현되었다:

여기서, 각 균주에 대한 배양 동안 수득된 최대 수율을 나타내었다.

메티오닌₀ 및 메티오닌_t는 각각 초기 및 최종 메티오닌 농도이고, V₀ 및 V_t는 초기 및 t 시점 그 순간의 부피이다.

글루코스 소모량은 하기와 같이 계산하였다:

글루코스 주입량_t = 공급 부피_t*[글루코스]

글루코스 소모량_t = [글루코스]₀*V₀ + 글루코스 주입량 - [글루코스]_잔류량*V_t

[글루코스]₀, [글루코스], [글루코스]_잔류량은 각각 초기, 공급 및 잔류량 농도를 의미한다.

실시예 11: 균주 15, 17 및 18을 이용한 생물반응기에서의 발효에 의한 L-메티오닌 생산

사전배양 조건은 상기 기술되어 있다 (실시예 10).

이어서, 2.5 L 발효기 (피에르 게랭)를 600 mL의 최소 배지 (B2)로 충전시키고, 55 내지 70 mL 부피 범위의 사전배양물과 함께, 2.1 g.L^-1 농도의 바이오매스에 접종하였다. 배치식 배지 B2 중 최종 포스페이트 농도는 0 내지 20 mM을 포함하는 값으로 조정하였다.

배양 온도는 37℃로 일정하게 유지시키고, pH는 NH₄OH 용액을 자동 첨가함으로써 (9시간 동안 10% NH₄OH 및 배양 종결시까지 28%) 작업 값 (6.8)로 유지시켰다. 배치식 단계 동안에서 초기 교반 속도를 200 RPM으로 설정하고, 유가식 단계 동안 최대 1,000 RPM으로까지 증가시켰다. 배치식 단계 동안에서 초기 기류 속도를 40 NL.h^-1로 설정하고, 유가식 단계 시작 시점에 100 NL.h^-1로까지 증가시켰다. 용존 산소 농도를 20 내지 40% 값으로 유지시키고, 우선적으로는 교반을 증가시킴으로써 30% 포화로 유지시켰다. 필요할 경우, IPTG를 배치식 및 유가식 배지에 최종 농도 20 μM으로 첨가하였다. 필요할 경우, 카나마이신의 경우, 50 mg.L^-1의 농도로, 클로람페니콜의 경우, 30 mg.L^-1의 농도로, 및 겐타마이신의 경우, 10 mg.L^-1의 농도로 항생제를 첨가하였다.

세포량이 거의 5 g.L^-1 농도에 도달하게 되었을 때, 5 mL.h^-1의 초기 유속으로 유가식 배양을 시작하였다. F2 배지 중 최종 포스페이트 농도는 배양 동안 포스페이트 한계에 도달하도록 5 내지 30 mM을 포함하는 값으로 조정하였다. 공급액을 주입하고, 유속을 증가시켜 26시간 후에는 27 mL.h^-1에 도달한 S자형 프로파일을 얻었다. 정확한 공급 조건은 하기 등식으로 계산하였다:

여기서, Q(t)는 600 mL의 배치식 부피에 대한 공급 유속 (mL.h^-1)이며, p1 = 1.80, p2 = 22.4, p3 = 0.27, p4 = 6.50이다. 상기 유속을 전 배양 기간 동안에 걸쳐 10에서 50%로, 우선적으로 30%로 증가시켰다.

비 글루코스 소모율 (q_s)은 ptsG의 과다발현과 관련하여, 또는 그와 상관없이 dgsA 유전자 결실시에 증가하였다. 또한, 메티오닌 생산 수율 (최대 및 최종 수율 둘 모두)은 이러한 유전자 변형시에 증가하였다.

메티오닌의 수율에 관한 정의에 대해서는 상기 실시예 10을 참조할 수 있다.

비 글루코스 소모율 (q_s)은 하기와 같이 계산하였다:

여기서, [X]는 t 시점에서의 세포 농도였다.

참고문헌:

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Oligonucleotide <400> 23 cgtaggcgcc ggtaccgacc tcaatatcga cccagctacg c 41 <210> 24 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 24 gcttgtatac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg actgagcctt tcgttttatt 60 tgatgcattg aaatgctcat agggtatcgg gtcgc 95 <210> 25 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 25 agactgggcc tttcgtttta tctgttgtat acaagcttaa ttaacctagg gcccgggcgg 60 atccgtgagt gatgtgaaag cctgacgtgg 90 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 26 cgtaggcgcc ggtacccgaa ctgcactaag taacctcttc gg 42 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 27 tcccccgggg tataccatat gaatatcctc cttag 35 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 28 gcccaagctt tgtaggctgg agctgcttcg 30 <210> 29 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 29 cgtagttaac ttaattaaga gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga 60 aggtggagtt atctcgagtg agatattgtt gacgtaagga ggttataaat gcccatatcc 120 aagatactcg ttgccaatcg 140 <210> 30 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 30 cgacccgggc ctagggcaga aaggcccacc cgaaggtgag ccagtgtgag cggccgctca 60 tccgccgtaa accgccagca gg 82 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 31 gccgattttg tcgtggtggc 20 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 32 gccggttatc catcaggttc ac 22 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 33 ctgaggccta tgcatggaat gcaatcgtag ccacatcgc 39 <210> 34 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 34 gcttgtatac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg actgagcctt tcgttttatt 60 tgatggctgg aaaaaccttg ttgagagtgt ttgc 94 <210> 35 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 35 agactgggcc tttcgtttta tctgttgtat acaagcttaa ttaacctggg ccctcgcccg 60 ggcggatccg gtaatcgaac gattattctt taatcgcc 98 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 36 ctgaggccta tgcatgcgga ttcgttggga agttcaggg 39 <210> 37 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 37 ctctagaact agtttatctc tggcggtgtt gacataaata ccactggcgg ttatactgag 60 cacagtcgac gttaacacgc gttaaggagg ttataaatgc ccatatccaa gatactcgtt 120 gccaatcg 128 <210> 38 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 38 tcgagcccgg ggcagaaagg cccacccgaa ggtgagccag tacgtaagta ctttaattaa 60 tcatccgccg taaaccgcca g 81 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 39 gcccaccagc gaaccaattg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 40 gtaaacgtgg tgccatcggg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 41 cctggcaaat aacccgaatg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 42 cccattcaga gagtggacgc 20

Claims

a) 발효에 의해 주요 탄소 공급원으로서의 글루코스로부터 메티오닌을 생산하기 위한 하나 이상의 변형, 및
b) PTS 효소 IICB^Glc를 코딩하는 유전자 ptsG의 과다발현 및 전사 조절 인자를 코딩하는 유전자 dgsA의 결실에 의해, 명시된 변형이 없는 미생물과 비교하여 글루코스 유입을 증가시키는 것인, 글루코스 유입을 개선시키기 위한 하나 이상의 변형
을 포함하는, 메티오닌 생성의 개선을 위한 재조합 미생물로서,
하기 유전자: metJ, pykA, pykF, purU, yncA, 또는 udhA 중 하나 이상의 유전자의 발현이 감쇠되어 있고, 상기 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 유전자 ptsG가 유도성 프로모터, 구성적 프로모터 또는 둘 다의 제어하에 과다발현되는 것인 미생물.
제1항에 있어서, 유전자 ptsG가 소형 RNA sgrS에 대한 결합 부위의 서열인 서열 번호 19를 함유하지 않는 것인 미생물.
제1항에 있어서, 유전자 sgrS, sgrT 또는 둘 다의 발현이 감쇠되어 있는 것인 미생물.
제4항에 있어서, 유전자 sgrS, sgrT 또는 둘 다가 결실되어 있는 것인 미생물.
제1항에 있어서, 하기 유전자: pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metH, 또는 thrA 중 하나 이상의 유전자의 발현이 증진되어 있는 것인 미생물.
제6항에 있어서, 하나 이상의 유전자가 유도성 프로모터의 제어하에 있는 것인 미생물.
제1항에 있어서,
a) 하기 i) 내지 iii) 중 하나 이상을 만족하고:
i) 유전자 pstG가 sRNA sgrS 결합 부위를 함유하지 않음,
ii) 유전자 sgrS가 결실되어 있음, 및
iii) 유전자 sgrT가 결실되어 있음;
b) 유전자 metH, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE 및 pyc의 발현이 증진되어 있고;
c) 유전자 metJ, pykA, pykF, purU 및 yncA의 발현이 감쇠되어 있는 것
인 미생물.
a) 글루코스를 함유하는 발효가능한 탄소 공급원 및 황 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지 중에서 제1항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
b) 배양 배지로부터 메티오닌, 메티오닌 유도체 또는 둘 다를 회수하는 단계
를 포함하는, 메티오닌, 메티오닌 유도체 또는 둘 다를 발효 생산하는 방법.
제9항에 있어서, 유전자 ptsG가 소형 RNA sgrS에 대한 결합 부위의 서열인 서열 번호 19를 함유하지 않는 것인 방법.
제9항에 있어서, 유전자 sgrS, sgrT 또는 둘 다의 발현이 감쇠되어 있는 것인 방법.
제9항에 있어서, 유전자 sgrS, sgrT 또는 둘 다가 결실되어 있는 것인 방법.
제9항에 있어서, 하기 유전자: pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metH, 또는 thrA 중 하나 이상의 유전자의 발현이 증진되어 있는 것인 방법.
제13항에 있어서, 하나 이상의 유전자가 유도성 프로모터의 제어하에 있는 것인 방법.
제9항에 있어서, metJ, pykA, pykF, purU, yncA, 또는 udhA 중 하나 이상의 유전자의 발현이 감쇠되어 있는 것인 방법.
제9항에 있어서,
d) 하기 i) 내지 iii) 중 하나 이상을 만족하고:
i) 유전자 pstG가 sRNA sgrS 결합 부위인 서열 번호 19를 함유하지 않음,
ii) 유전자 sgrS가 결실되어 있음, 및
iii) 유전자 sgrT가 결실되어 있음;
e) 유전자 metH, cysPUWAM, cysJIH, gcvTHP, metF, serA, serB, serC, cysE 및 pyc의 발현이 증진되어 있고;
f) 유전자 metJ, pykA, pykF, purU 및 yncA의 발현이 감쇠되어 있는 것
인 방법.