KR20150101752A - 증대된 환원활성을 나타내는 변이 메탄올 탈수소화 효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 메타놀리쿠스로부터 유래되고, 환원활성이 증대된 변이 메탄올 탈수소화 효소(MDH), 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 상기 변이 메탄올 탈수소화 효소를 제조하는 방법 및 상기 변이 메탄올 탈수소화 효소를 이용하여 포름알데히드로부터 메탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 변이 MDH를 사용하면, 종래의 MDH 보다도 환원활성이 향상되어 메탄올의 생산수율을 증대시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 메탄올의 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

증대된 환원활성을 나타내는 변이 메탄올 탈수소화 효소{Mutated methanol dehydrogenase having improved reduction activity}

본 발명은 증대된 환원활성을 나타내는 변이 메탄올 탈수소화 효소에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 바실러스 메타놀리쿠스로부터 유래되고, 환원활성이 증대된 변이 메탄올 탈수소화 효소(methanol dehydrogenase, MDH), 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 상기 변이 메탄올 탈수소화 효소를 제조하는 방법 및 상기 변이 메탄올 탈수소화 효소를 이용하여 포름알데히드로부터 메탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

포름알데히드는 유기 화합물로서 산업적, 생체의학적 용도로 다양하게 쓰이는 물질이다. 전체 생산양의 50%는 축합생성물인 수지 제조에 사용되어 열경화성수지와 열가소성 수지인 폴리아세탈 등을 제조하는데 사용되며, 40%는 합성 중간체로 섬유, 피혁, 페인트 용매 등으로 사용된다. 나머지 생산량의 약 1.5%는 35%의 수용액(포르말린)으로 제작되어 소독제, 시료보존액, 방부제로 사용된다. 미국과 캐나다 GDP의 1.2%를 차지 할 정도로 큰 시장을 이루고 있으며, 2010년 포름알데히드의 연간 총 생산량은 2900만 톤에 달한다. 하지만 이와 같이 널리 사용되는 물질임에도 불구하고 포름알데히드가 인간에게 미치는 독성에 때문에 사용에 많은 제약이 따른다. 상온에서 무색의 기체로서 주로 흡입과 피부 접촉을 통해 흡수 되는데 매우 짧은 시간에 대사가 되므로 노출직후에 점막이나 혈중에서 이를 검출하기가 어렵다. 눈과 호흡기의 자극제로서 일차적 자극성 및 알러지성 피부염을 유발하고 10~20ppm의 농도에서도 호흡이 곤란해지고, 기도손상, 폐부종 및 폐렴, 사망에 이를 수 있다. 2005년 국제암연구소(International Agency for Research on Cancer, IARC)에서 포름알데히드를 사람에게 발암확정물질인 ‘Group1'으로 지정하였다.

반면, 메탄올은 석유 자원의 차세대 대체 연료로 인식되며 점차 가치가 높아지고 있다. 성능이나 환경오염 측면에서 기존 가솔린이나 디젤유에 비해 우월하지만 경제성 때문에 보급화 되지 않고 있는 실정이지만, 유가가 상승하고 교토의정서에 따라 온실가스 배출 규제가 강화 되면서 상황이 변하고 있다. 중국은 2006년 메탄올을 자동차용 대체연료로 선정하였으며, MTO(Methanol to Olefin), MTP(Methanol to Propylene) 설비의 상업화가 진행 중이다. 또한 미국은 2007년부터 향후 10년간 가솔린 소비를 20% 감축하고 대체 연료 공급을 늘리겠다고 발표함으로서 메탄올을 이용한 대체 에너지 연구가 활발히 진행되고 있다. 그리고 환경오염이 적은 에너지원으로 주목 받는 수소에너지를 사용하기 위해서는 연료전지에 수소를 공급하는 매질이 필요한데, 메탄올은 높은 수소전환 효율, 안전성, 저온 운전특성 등의 장점을 지님으로서 수소 공급용 연료로도 사용이 확대 되고 있다.

한편, 메탄올 탈수소화 효소(methanol dehydrogenase, MDH)는 메탄올을 산화시켜 포름알데히드로 전환시키거나 다시 포름알데히드를 환원시켜 메탄올로 전환 시키는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소이다. 그 중에서 그람 양성 박테리아에 속하는 바실러스 메타놀리쿠스(Bacillus methanolicus)의 메탄올 탈수소화 효소는 NAD(P)⁺ 의존성 그룹에 속하며, 주로 주변세포질(periplasm)이 아닌 세포질(cytoplasm) 내에 존재하는 것으로 알려져 있다. 또한, 단일 서브유닛(subunit)으로 활성을 나타낸다고 알려져 있다. 상기 MDH는 메탄올의 산업적인 생산에 이용되고 있는데, 메탄올의 생산수율을 보다 증대시키기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

예를 들어, WO 85/01063호에는 NADH 의존성 MDH와 결합체를 형성하여 메탄올 환원활성을 증대시킬 수 있는 NDA 의존성 MDH가 개시되어 있고, 미국특허 제6280972호에는 MDH의 환원활성을 증대시킬 수 있는 활성화제가 개시되어 있다. 또한, MDH 자체의 환원활성을 증대시킨 변이 MDH에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 환원활성의 증대수준이 미약하다는 단점이 있었다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 종래의 MDH가 나타내는 환원활성을 증대시켜서 메탄올 생산성을 증대시킬 수 있는 변이 MDH를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 바실러스 메타놀리쿠스로부터 유래된 MDH를 대상으로 랜덤 돌연변이를 유발시켜 수득한 변이 MDH가 종래의 MDH 보다 최대 2배의 환원활성을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 증대된 환원활성을 갖도록 변이 메탄올 탈수소화 효소(MDH)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 MDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 변이 MDH를 회수하는 단계를 포함하는 변이 MDH의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이 MDH를 이용하여 포름알데히드로부터 메탄올을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 MDH 자체의 환원활성을 증대시킨 변이 MDH를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 바실러스 메탄올리쿠스로부터 유래된 MDH를 대상으로 랜덤 돌연변이를 유발시켜서 수득한 변이 MDH가 증대된 환원활성을 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, 바실러스 메탄올리쿠스의 MDH로부터 유래된 3종의 변이 MDH를 수득하였는데, 하나는 3개의 아미노산이 치환된 것이고, 다른 하나는 6개의 아미노산이 치환된 것이며, 마지막 하나는 18개의 아미노산이 치환된 것이다. 상기 3종의 변이 MDH를 발현시키는 변이균주를 포름알데히드가 포함된 배지에서 배양한 결과, 아미노산의 치환수가 적은 것일 수록 포름알데히드에 의한 독성에 대하여 향상된 내성을 나타냄을 확인하고, 상기 내성은 MDH의 환원활성에 기인한 것으로 분석하였다. 이에, 가장 환원활성이 우수하다고 판단된 변이 MDH의 3가지 아미노산 치환을 각각 조합하여 6종의 변이 MDH를 제작하고, 이들의 환원활성을 비교한 결과, 두개의 아미노산이 치환된(F213V, F289L) MDH가 가장 우수한 환원활성을 나타냄을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 제공하는 변이 MDH를 메탄올의 생산성을 증대시키는데 활용될 수 있을 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 야생형 메탄올 탈수소화 효소(MDH)에 변이가 도입되어, 상기 MDH 보다 환원활성이 증대된, 변이 메탄올 탈수소화 효소를 제공한다.

본 발명의 용어 "메탄올 탈수소화 효소(methanol dehydrogenase, MDH)"란, 메탄올 탈수소효소라고도 하고, 메탄올을 산화시켜서 두개의 전자를 방출시킴으로서 포름알데히드를 생성하는 산화활성 및 포름알데히드를 환훤시켜서 두개의 전자를 결합시킴으로서 메탄올을 생성하는 환원활성을 가역적으로 나타낼 수 있는 효소를 의미한다. 이때, 사용되는 전자 공여체 또는 수용체로는 NADH가 사용될 수 있다. 상기 메탄올 탈수소화 효소의 구체적인 아미노산 서열 또는 그를 코딩하는 유전자의 염기서열 정보는 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스(GenBank Accession No. AAA25380.1, AAA88366.1, WP_003599114.1 등)에서 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 MDH는 바실러스 메탄올리쿠스로부터 유래된 MDH로 해석될 수 있는데, 상기 MDH는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 MDH 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 아미노산 서열을 갖는 야생형 MDH가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "변이 메탄올 탈수소화 효소(methanol dehydrogenase, MDH)"란, 바실러스 메탄올리쿠스로부터 유래된 MDH로부터 변이되고, 증대된 환원활성을 나타내는 MDH를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 변이 MDH는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 MDH에서 하나 또는 다수의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 구성되는 MDH가 될 수 있는데, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 L40P, S42G, I53T, D72E, D80G, V81A, F82L, K83E, K83I, L107S, V132A, K165E, I198T, T207K, T210A, F213V, F213S, E233G, L259S, H261R, V281A, F289L, S313G, K344R, A352T, F356S, Q371R 등의 치환된 아미노산을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 아미노산 서열로 구성되는 MDH가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 12 내지 19의 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 아미노산 서열 또는 서열번호 2 내지 9의 아미노산 서열로 구성되는 MDH가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 아미노산 서열로 구성되는 MDH가 될 수 있다.

아울러, 상기 변이 MDH는 상술한 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 효소의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

끝으로, 상기 변이 MDH는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 도메인을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 바실러스 메타놀리쿠스(Bacillus methanolicus) 유래의 야생형 MDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)를 대상으로 랜덤 돌연변이를 유발시켜서, 각각의 변이된 폴리뉴클레오티드를 수득하고, 이를 대장균에 도입하여 각각의 형질전환체를 수득한 다음, 상기 수득한 형질전환체를 포름알데히드가 포함된 배지에 접종하고 배양하여, 포름알데히드에 대하여 내성을 갖는 형질전환체를 수득하였다(실시예 2). 상기 수득한 형질전환체에 포함된 각 MDH의 아미노산 서열을 분석한 결과, 야생형 MDH 에서 3개의 아미노산이 치환된 형태(F213V, F289L, F356S)의 변이 MDH(서열번호 2), 야생형 MDH 에서 6개의 아미노산이 치환된 형태(S42G, K83I, L107S, L259S, S313G, A352T)의 변이 MDH(서열번호 3) 및 야생형 MDH 에서 18개의 아미노산이 치환된 형태(L40P, I53T, D72E, D80G, V81A, F82L, K83E, V132A, K165E, I198T, T207K, T210A, F213S, E233G, H261R, V281A, K344R, Q371R)의 변이 MDH(서열번호 4)를 발굴하였다(실시예 3). 상기 각각의 변이 MDH를 포함하는 변이균주를 2% 포름알데히드가 포함된 배지에 접종하고 배양한 결과, 서열번호 8의 변이 MDH가 가장 우수한 포름알데히드에 대한 내성을 나타냄을 확인하였는데, 이러한 내성은 변이 MDH가 나타내는 포름알데히드를 메탄올로 환원시키는 활성에 기인할 것으로 분석되었는 바, 상기 서열번호 2의 변이 MDH가 상대적으로 가장 우수한 환원활성을 나타낸다고 판단하였다(도 2). 이에, 상기 서열번호 2의 변이 MDH에 포함된 3종의 치환된 아미노산(F213V, F289L, F356S)을 조합하여 6종의 변이 MDH인 서열번호 5(F213V+F289L), 6(F289L+F356S), 7(F213V+F356S), 8(F213V), 9(F289L) 및 10(F356S)의 아미노산 서열로 구성된 변이 MDH를 제조하고, 이들의 환원활성을 야생형 MDH 및 서열번호 2의 변이 MDH의 것과 비교한 결과, 서열번호 10(F356S)의 변이 MDH을 제외한 나머지 5종의 변이 MDH가 야생형 MDH 및 서열번호 2의 변이 MDH의 것보다 우수한 환원활성을 나타냄을 확인하였고, 그 중에서도 서열번호 5의 두개의 아미노산이 치환된 형태의 MDH(F213V+F289L)가 야생형 MDH는 물론 다른 모든 변이 MDH 보다도 우수한 환원활성을 나타냄을 확인하였다(도 4).

따라서, 본 발명에서 제공하는 변이 MDH는 야생형 MDH 보다도 우수한 환원활성을 나타내는 신규한 단백질임을 확인할 수 있었고, 상기 변이 MDH를 사용할 경우 메탄올의 생산성을 증대시킬 수 있음을 알 수 있었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 변이 MDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변이 MDH 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 상기 변이 MDH를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드는 상기 본 발명에서 제공하는 변이 MDH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열번호 5, 6, 7 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 이로부터 발현되는 변이 MDH가 야생형 MDH 보다도 우수한 환원활성을 나타낼 수 있는 한, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터는 융합단백질의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명에서 제공하는 변이 MDH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 본 발명의 변이 MDH를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등) 이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 변이 MDH를 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 변이 MDH를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주역시 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 대장균 BL21 (DE3) 균주를 숙주로서 사용하였다.

상기 형질전환체는 본 발명에서 제공하는 변이 MDH를 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 변이 MDH의 제조방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 변이 MDH를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 변이 MDH를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 D형 젖산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다. 대체로 D형 젖산은 배양 배지 중으로 배출되지만, 경우에 따라서는 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

아울러, 배양물로부터 상기 변이 MDH를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 변이 MDH를 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 변이 MDH를 이용하여 포름알데히드를 환원시켜서 메탄올을 생산하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 메탄올 생산방법은 (a) 상기 변이 메탄올 탈수소화 효소를, 포름알데히드 및 전자공여체를 포함하는 혼합물에 가하여 반응시켜서 반응산물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 반응산물로부터 메탄올을 회수하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 전자공여체는 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 NADH를 사용할 수 있고, 상기 혼합물에 반응완충액을 추가로 포함할 수 있는데, 상기 반응완충액은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 중성의 인산염 완충액을 사용할 수 있다.

상술한 바와 같이, MDH는 메탄올을 산화시켜 포름알데히드로 전환시키거나 다시 포름알데히드를 환원시켜 메탄올로 전환 시키는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소이다. 본 발명에서 제공하는 변이 MDH는 야생형 MDH 보다도 포름알데히드를 메탄올로 환원시키는 환원활성이 우수하므로, 메탄올의 산업적인 생산시에 상기 변이 MDH를 사용하면, 메탄올의 생산수율을 증대시켜서, 보다 경제적인 메탄올의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

본 발명의 변이 MDH를 사용하면, 종래의 MDH 보다도 환원활성이 향상되어 메탄올의 생산수율을 증대시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 메탄올의 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 다양한 농도(0, 1, 2, 3, 4 또는 5mM)의 포름알데히드를 포함하는 배지에서 배양된 대장균 BL21 (DE3) 균주의 배양시간 경과에 따른 성장속도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 포름알데히드가 포함된 배지에서 배양된 야생형 또는 변이 MDH를 발현시키는 균주의 배양시간의 경과에 따른 증식수준의 변화를 나타내는 그래프로서, vector는 양성대조군을 나타내고, WT는 음성대조군을 나타내며, mt1은 변이체 1을 나타내고, mt2는 변이체 2를 나타내며, mt3은 변이체 3을 나타낸다.
도 3은 실시예 5-1에서 제작한 각 변이체로부터 발현된 변이 MDH의 발현변화를 나타내는 전기영동사진으로서, U는 IPTG를 첨가하지 않은 배양물을 나타내고, I는 IPTG를 첨가한 배양물의 고형분을 나타내며, S는 IPTG를 첨가한 배양물의 수용성분을 나타낸다.
도 4는 실시예 5-3에서 정제된 각 변이 MDH의 반응시간의 경과에 따른 환원활성의 변화를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 야생형 메탄올 탈수소화 효소 발현 벡터 클로닝 및 방향성 진화( direct evolution ) 방법을 이용한 변이 라이브러리 구축

바실러스 메타놀리쿠스(Bacillus methanolicus) 유래의 야생형 메탄올 탈수소화 효소(Methanol Dehydrogenase; MDH)(서열번호 1)를 대장균 내에서 발현하기 위하여, 상기 야생형 메탄올 탈수소화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 11)를 합성하였다(바이오니아, 대전). 상기 합성된 폴리뉴클레오티드를 pET21b 벡터에 클로닝하여 발현벡터를 수득하고, 상기 발현벡터를 변이 라이브러리를 구축하기 위한 방향성 진화 실험(direct evolution)의 주형으로 사용하였다. Diversity^® PCR Random Mutagenesis Kit(Clontech, USA)을 이용하여 MDH 유전자 내 변이를 유도하고, 하기 프라이머를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하여, 변이 라이브러리를 구축하였다. 이때, PCR 조건은 94℃에서 30초간 1회; 25회(94℃ 30초, 68℃ 1분); 68℃에서 1분간 1회의 반응조건으로 수행하였다.

forward primer: 5'-AAGAAGGAGATATACATATGACA-3'(서열번호 21)

reverse primer: 5'-ATACTCGAGCAGAGCGTTTTTG-3'(서열번호 22)

실시예 2: 야생형 보다 높은 포름알데히드 저항성을 갖는 MDH 변이주 선별

먼저, 야생형 MDH 유전자를 갖는 대장균 BL21 (DE3) 균주를 다양한 농도(0, 1, 2, 3, 4 또는 5mM)의 포름알데히드를 포함하는 배지에 접종하고, 배양하여 포름알데히드의 농도에 따른 성장속도의 차이를 비교하였다(도 1). 도 1은 다양한 농도(0, 1, 2, 3, 4 또는 5mM)의 포름알데히드를 포함하는 배지에서 배양된 대장균 BL21 (DE3) 균주의 배양시간 경과에 따른 성장속도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 2mM 이상의 포름알데히드가 배지에 존재 할 경우 대장균의 성장속도가 현저하게 감소함을 확인하였다.

다음으로, 상기 실시예 1에서 구축한 변이 라이브러리를 대장균 BL21 (DE3) 균주에 도입하여 각각의 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 3mM의 포름알데히드와 엠피실린(50㎍/㎖)이 포함 된 2YT 액체 배지(tryptone 16g, yeast extract 10g, NaCl 5g/ 1ℓ)에 접종한 다음, 37℃에서 진탕배양하였다. 배양액의 600nm 흡광도가 0.4가 되었을 때, MDH가 발현되도록 0.1mM의 IPTG를 첨가한 다음, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 배양액을 수득하고, 상기 수득한 배양액을 엠피실린이 포함된 고체 배지에 도말하고 배양하여, 포름알데히드에 저항성을 갖는 단일 콜로니를 선별하였다.

실시예 3: 변이 MDH의 서열분석

상기 실시예 2에서 수득한 단일 콜로니들을 각각 엠피실린을 포함한 2YT 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 12시간동안 진탕 배양하고, 상기 배양물로부터 플라스미드 DNA를 회수하여, 이에 포함된 MDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열 및 이로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과, 변이 MDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변이체 1, 변이체 2 및 변이체 3을 발굴하였는데, 이들 각 변이체는 서열번호 12 내지 14의 변이된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이로부터 발현되는 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 변이 MDH를 발현시킬 수 있음을 확인하였다. 상기 변이 MDH 중에서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 변이 MDH는 야생형 MDH에서 3개의 아미노산이 치환된 형태(F213V, F289L, F356S)이고, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 변이 MDH는 야생형 MDH에서 6개의 아미노산이 치환된 형태(S42G, K83I, L107S, L259S, S313G, A352T)이며, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 변이 MDH는 야생형 MDH 에서 18개의 아미노산이 치환된 형태(L40P, I53T, D72E, D80G, V81A, F82L, K83E, V132A, K165E, I198T, T207K, T210A, F213S, E233G, H261R, V281A, K344R, Q371R)임을 확인하였다.

실시예 4: 변이 MDH의 환원활성 분석

상기 서열번호 12 내지 14의 변이된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 대장균 BL21 (DE3)에 도입하여 각각의 형질전환체를 수득하고, 이들을 각각 엠피실린이 첨가된 2YT 배지에 접종하였으며, 37℃에서 진탕배양하였다. 배양물의 흡광도(O.D. 600)가 0.4에 도달하면, 상기 배양물에 0.1mM IPTG를 첨가하여 1시간 동안 추가로 배양하여, MDH를 발현시켰다. 그런 다음, 상기 각 배양물에 3mM의 포름알데히드를 첨가하고, 2-4시간 간격으로 배양물의 흡광도(O.D. 600)를 측정하였다(도 2). 이때, 양성대조군으로는 형질전환되지 않은 대장균 BL21 (DE3)을 사용하고, 음성대조군으로는 야생형 MDH를 발현시킬 수 있는 발현벡터가 도입된 대장균 BL21 (DE3)을 사용하였다.

도 2는 포름알데히드가 포함된 배지에서 배양된 야생형 또는 변이 MDH를 발현시키는 균주의 배양시간의 경과에 따른 증식수준의 변화를 나타내는 그래프로서, vector는 양성대조군을 나타내고, WT는 음성대조군을 나타내며, mt1은 변이체 1을 나타내고, mt2는 변이체 2를 나타내며, mt3은 변이체 3을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 모든 균주는 포름알데히드의 독성에 의해 일정 시간 정지기(stationary phage)를 갖다가 다시 재성장하는 양상을 나타내는데, 변이체 1이 17시간 만에 가장 빠르게 재성장이 수행되었고, 변이체 2는 21시간 만에 재성장이 수행되었으며, 변이체 3은 23시간 만에 재성장이 수행되었다. 그러나, 양성대조군 및 음성대조군은 재성장이 수행되지 못하였다.

상기 결과로부터, 변이 MDH가 야생형 MDH 보다도 포름알데히드를 메탄올로 환원시키는 활성이 우수하고, 그 중에서도 변이체 1에서 발현되는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 변이 MDH가 가장 우수한 환원활성을 나타내는 것으로 분석되었다.

실시예 5: 변이체 1에 포함된 변이 MDH 를 이용한 변이 MDH 의 제작 및 선별

상기 실시예 4에서 가장 우수한 환원활성을 나타내는 것으로 분석된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 변이 MDH는 3개의 페닐알라닌이 각각 발린, 루신 및 세린으로 치환된 형태(F213V, F289L, F356S)이다. 상기 페닐알라닌은 고리구조의 치환기를 포함하여 단백질 내에서 유동성을 약화시킨다고 알려져 있으므로, 상기 변이 MDH는 야생형 MDH 보다도 높은 수준의 유동성을 나타낼 것으로 예상하였다. 이에, 재조합 PCR 방법을 사용하여, 야생형 MDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 11)에 상기 3개의 치환부위를 조합함으로써, 각각의 변이 MDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하고, 이로부터 발현되는 변이 MDH의 활성을 비교하여, 환원활성이 가장 우수한 변이 MDH를 선별하고자 하였다.

실시예 5-1: 변이 MDH를 발현시키는 변이균주의 제작

상기 실시예 1에서 수득한 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 주형으로 하고, F213V 도입용 프라이머쌍(서열번호 23 및 24), F289L 도입용 프라이머쌍(서열번호 25 및 26) 또는 F356S 도입용 프라이머쌍(서열번호 27 및 28)을 사용한 재조합 PCR을 수행하여, 각각의 폴리뉴클레오티드를 제작하고, 상기 제작된 각각의 폴리뉴클레오티드가 도입된 발현벡터를 수득하였으며, 상기 각각의 발현벡터를 대장균 BL21 (DE3)에 도입하여 각각의 변이균주(변이체 4 내지 9)를 제작하였다(표 1).

F213V forward primer: 5'-TACTGATGCAGTTGCAATTCAAGCA-3'(서열번호 23)

F213V reverse primer: 5'-GAATTGCAACTGCATCAGTAACTGG-3'(서열번호 24)

F289L forward primer: 5'-CGTTTGCGCACTCAACCTAATTGCT-3'(서열번호 25)

F289L reverse primer: 5'-TTAGGTTGAGTGCGCAAACGTGTGG-3'(서열번호 26)

F356S forward primer: 5'-AAAAACGCATCCGAAGACGTATGTA-3'(서열번호 27)

F356S reverse primer: 5'-ACGTCTTCGGATGCGTTTTTCGCTA-3'(서열번호 28)

변이체 1에 포함된 변이 MDH를 이용하여 제작된 변이 MDH

변이체	F213V	F289L	F356S	서열번호	비고
음성대조군 양성대조군 4 5 6 7 8 9	× ○ ○ × ○ ○ × ×	× ○ ○ ○ × × ○ ×	× ○ × ○ ○ × × ○	1 2 5 6 7 8 9 10	야생형 MDH 변이체 1의 MDH

실시예 5-2: 변이 MDH의 생산

상기 실시예 5-1에서 제작한 대조군과 각 변이체(변이체 4 내지 9)를 5㎖의 최소 액체 배지(2YT, 50㎍/㎖ 엠피실린)에 접종하고, 37℃에서 배양하여 증식시켰으며, 이를 100㎖의 최소 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 흡광도(O.D. 600)가 0.4가 될 때 까지 배양하였다. 이어, 배양물에 0.1mM IPTG를 첨가하고 18℃에서 48시간 동안 진탕 배양하여, 각각의 변이 MDH를 발현시켰으며, 발현여부를 SDS-PAGE를 통해 확인하였다(도 3). 도 3은 실시예 5-1에서 제작한 각 변이체로부터 발현된 변이 MDH의 발현변화를 나타내는 전기영동사진으로서, U는 IPTG를 첨가하지 않은 배양물을 나타내고, I는 IPTG를 첨가한 배양물의 고형분을 나타내며, S는 IPTG를 첨가한 배양물의 수용성분을 나타낸다. 상기 도 3에서 보듯이, IPTG 첨가에 의하여 각 변이체에서 변이 MDH가 과발현됨을 확인하였다.

실시예 5-3: 변이 MDH의 정제

상기 실시예 5-2에서 배양된 각 변이체의 배양물을 원심분리(5000rpm, 15분, 4℃)하여 각 균체를 회수하고, 상기 회수된 각 균체를 완충액(20mM Tris, 0.5M NaCl, pH 7.5)에 현탁시켜서 현탁액을 수득하였으며, 상기 현탁액에 단백질 분해효소 억제제(proteinase inhibiter, complete mini, Roche, USA)를 가하였다. 상기 현탁액에 초음파를 처리하여(10mm 직경의 750W microtip, 20% amplitude, 4℃, 6분) 각 균체를 파쇄하여 파쇄물을 수득하고, 상기 파쇄물을 원심분리(10000rpm, 20분, 4℃)하여 각각의 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 각 상층액을 HisTrap FF 컬럼 크로마토그래피에 적용하여, 변이 MDH를 흡착시키고, 250 mM 이미다졸(imidazole; pH7.5) 완충 용액을 가하여 변이 MDH를 용출시켜서, 변이 MDH를 정제하였다.

실시예 5-4: 변이 MDH의 환원활성 분석

MDH가 포름알데히드를 메탄올로 환원 시킬 때 보조인자(cofactor)로 NADH를 소모시킨다. 이에, 환원반응시에 소모되는 NADH의 양을 측정하여, 상기 실시예 5-3에서 정제한 각 변이 MDH의 환원활성을 비교하였다.

구체적으로, 500㎕의 100mM KH₂PO₄(pH 7.5) 완충용액에 0.6mM NADH와 50mM의 포름알데히드를 첨가한 후, 상기 실시예 5-3에서 정제한 각 변이 MDH 10㎍를 가하여 2시간 동안 반응시키면서, 340nm에서 흡광도를 측정하여 반응물에 포함된 NADH의 함량변화를 산출하였다(도 4). 도 4는 실시예 5-3에서 정제된 각 변이 MDH의 환원활성의 반응시간의 경과에 따른 변화를 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 변이체 4 내지 9에서 발현된 변이 MDH(서열번호 5 내지 10) 중에서 변이체 9에서 발현된 변이 MDH(서열번호 10)를 제외한 나머지 5종의 변이 MDH(서열번호 5 내지 9)는 모두 야생형 MDH(서열번호 1) 및 변이체 1에서 발현된 변이 MDH(서열번호 2) 보다도 우수한 환원활성을 나타냄을 확인하였다. 특히, 상기 5종의 변이 MDH(서열번호 5 내지 9) 중에서도 서열번호 5의 변이 MDH가 가장 우수한 환원활성을 나타낸 반면, 서열번호 10의 변이 MDH는 야생형 MDH 보다도 낮은 수준의 환원활성을 나타냄을 확인하였다.

또한, 반응액에 포함된 보조인자(NADH)가 반으로 감소되는데 소요되는 시간을 기준으로, 상기 서열번호 5의 변이 MDH는 야생형 MDH의 환원활성의 약 2배에 달하는 환원활성을 나타냄을 확인하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Mutated methanol dehydrogenase having improved reduction activity <130> KPA140093-KR <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 383 <212> PRT <213> Bacillus methanolicus <400> 1 Met Thr Asn Phe Phe Ile Pro Pro Ala Ser Val Ile Gly Arg Gly Ala 1 5 10 15 Val Lys Glu Val Gly Thr Arg Leu Lys Gln Ile Gly Ala Lys Lys Ala 20 25 30 Leu Ile Val Thr Asp Ala Phe Leu His Ser Thr Gly Leu Ser Glu Glu 35 40 45 Val Ala Lys Asn Ile Arg Glu Ala Gly Leu Asp Val Ala Ile Phe Pro 50 55 60 Lys Ala Gln Pro Asp Pro Ala Asp Thr Gln Val His Glu Gly Val Asp 65 70 75 80 Val Phe Lys Gln Glu Asn Cys Asp Ala Leu Val Ser Ile Gly Gly Gly 85 90 95 Ser Ser His Asp Thr Ala Lys Ala Ile Gly Leu Val Ala Ala Asn Gly 100 105 110 Gly Arg Ile Asn Asp Tyr Gln Gly Val Asn Ser Val Glu Lys Pro Val 115 120 125 Val Pro Val Val Ala Ile Thr Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ser Glu Thr 130 135 140 Thr Ser Leu Ala Val Ile Thr Asp Ser Ala Arg Lys Val Lys Met Pro 145 150 155 160 Val Ile Asp Glu Lys Ile Thr Pro Thr Val Ala Ile Val Asp Pro Glu 165 170 175 Leu Met Val Lys Lys Pro Ala Gly Leu Thr Ile Ala Thr Gly Met Asp 180 185 190 Ala Leu Ser His Ala Ile Glu Ala Tyr Val Ala Lys Gly Ala Thr Pro 195 200 205 Val Thr Asp Ala Phe Ala Ile Gln Ala Met Lys Leu Ile Asn Glu Tyr 210 215 220 Leu Pro Lys Ala Val Ala Asn Gly Glu Asp Ile Glu Ala Arg Glu Ala 225 230 235 240 Met Ala Tyr Ala Gln Tyr Met Ala Gly Val Ala Phe Asn Asn Gly Gly 245 250 255 Leu Gly Leu Val His Ser Ile Ser His Gln Val Gly Gly Val Tyr Lys 260 265 270 Leu Gln His Gly Ile Cys Asn Ser Val Asn Met Pro His Val Cys Ala 275 280 285 Phe Asn Leu Ile Ala Lys Thr Glu Arg Phe Ala His Ile Ala Glu Leu 290 295 300 Leu Gly Glu Asn Val Ser Gly Leu Ser Thr Ala Ala Ala Ala Glu Arg 305 310 315 320 Ala Ile Val Ala Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Asn Phe Gly Ile Pro Ser 325 330 335 Gly Tyr Ala Glu Met Gly Val Lys Glu Glu Asp Ile Glu Leu Leu Ala 340 345 350 Lys Asn Ala Phe Glu Asp Val Cys Thr Gln Ser Asn Pro Arg Val Ala 355 360 365 Thr Val Gln Asp Ile Ala Gln Ile Ile Lys Asn Ala Leu Leu Glu 370 375 380 <210> 2 <211> 383 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant 1 MDH <400> 2 Met Thr Asn Phe Phe Ile Pro Pro Ala Ser Val Ile Gly Arg Gly Ala 1 5 10 15 Val Lys Glu Val Gly Thr Arg Leu Lys Gln Ile Gly Ala Lys Lys Ala 20 25 30 Leu Ile Val Thr Asp Ala Phe Leu His Ser Thr Gly Leu Ser Glu Glu 35 40 45 Val Ala Lys Asn Ile Arg Glu Ala Gly Leu Asp Val Ala Ile Phe Pro 50 55 60 Lys Ala Gln Pro Asp Pro Ala Asp Thr Gln Val His Glu Gly Val Asp 65 70 75 80 Val Phe Lys Gln Glu Asn Cys Asp Ala Leu Val Ser Ile Gly Gly Gly 85 90 95 Ser Ser His Asp Thr Ala Lys Ala Ile Gly Leu Val Ala Ala Asn Gly 100 105 110 Gly Arg Ile Asn Asp Tyr Gln Gly Val Asn Ser Val Glu Lys Pro Val 115 120 125 Val Pro Val Val Ala Ile Thr Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ser Glu Thr 130 135 140 Thr Ser Leu Ala Val Ile Thr Asp Ser Ala Arg Lys Val Lys Met Pro 145 150 155 160 Val Ile Asp Glu Lys Ile Thr Pro Thr Val Ala Ile Val Asp Pro Glu 165 170 175 Leu Met Val Lys Lys Pro Ala Gly Leu Thr Ile Ala Thr Gly Met Asp 180 185 190 Ala Leu Ser His Ala Ile Glu Ala Tyr Val Ala Lys Gly Ala Thr Pro 195 200 205 Val Thr Asp Ala Val Ala Ile Gln Ala Met Lys Leu Ile Asn Glu Tyr 210 215 220 Leu Pro Lys Ala Val Ala Asn Gly Glu Asp Ile Glu Ala Arg Glu Ala 225 230 235 240 Met Ala Tyr Ala Gln Tyr Met Ala Gly Val Ala Phe Asn Asn Gly Gly 245 250 255 Leu Gly Leu Val His Ser Ile Ser His Gln Val Gly Gly Val Tyr Lys 260 265 270 Leu Gln His Gly Ile Cys Asn Ser Val Asn Met Pro His Val Cys Ala 275 280 285 Leu Asn Leu Ile Ala Lys Thr Glu Arg Phe Ala His Ile Ala Glu Leu 290 295 300 Leu Gly Glu Asn Val Ser Gly Leu Ser Thr Ala Ala Ala Ala Glu Arg 305 310 315 320 Ala Ile Val Ala Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Asn Phe Gly Ile Pro Ser 325 330 335 Gly Tyr Ala Glu Met Gly Val Lys Glu Glu Asp Ile Glu Leu Leu Ala 340 345 350 Lys Asn Ala Ser Glu Asp Val Cys Thr Gln Ser Asn Pro Arg Val Ala 355 360 365 Thr Val Gln Asp Ile Ala Gln Ile Ile Lys Asn Ala Leu Leu Glu 370 375 380 <210> 3 <211> 383 <212> PRT 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aatgaaactc 660 atcaatgaat acttaccaaa agcggtggca aacggagaag acatcgaagc acgtgaagca 720 atggcttatg cacaatacat ggcaggagtg gcatttaaca acggtggttt aggattagta 780 cactctattt ctcaccaagt aggtggagtt tacaaattac aacacggaat ctgtaactca 840 gttaatatgc cacacgtttg cgcattcaac ctaattgcta aaactgagcg cttcgcacac 900 attgctgagc ttttaggcga gaatgtttct ggcttaagca ctgcagcagc tgctgagaga 960 gcaattgtag cgcttgaacg ctataacaaa aacttcggta tcccatctgg ctatgcagaa 1020 atgggcgtga aagaagagga tatcgaatta ttagcgaaaa acgcattcga agacgtatgt 1080 actcaaagca acccacgtgt tgctacagtt caagacattg cacaaatcat caaaaacgct 1140 ctgtaa 1146 <210> 12 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant 1 MDH <400> 12 atgacaaact ttttcattcc accagccagc gtaattggac gaggtgcagt aaaggaagta 60 ggaacaagac ttaagcaaat tggagctaag aaagcgctta tcgttacaga tgcatttctt 120 catagcacag gtttatctga agaagttgct aaaaacattc gtgaagctgg ccttgatgtt 180 gcgattttcc caaaagctca accagatcca gcagatacac aagttcatga aggtgtagat 240 gtattcaaac aagaaaactg tgatgcactt 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cacaaatcat caaaaacgct 1140 ctgctcgagc accaccacca ccaccactga 1170 <210> 13 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant 2 MDH <400> 13 atgacaaact ttttcattcc accagccagc gtaattggac gaggtgcagt aaaggaagta 60 ggaacaagac ttaagcaaat tggagctaag aaagcgctta tcgttacaga tgcatttctt 120 catggcacag gtttatctga agaagttgct aaaaacattc gtgaagctgg ccttgatgtt 180 gcgattttcc caaaagctca accagatcca gcagatacac aagttcatga aggtgtagat 240 gtattcatac aagaaaactg tgatgcactt gtttcaatcg gtggaggtag ctctcacgat 300 acagctaaag caatcggttc agttgcagca aacggcggaa gaatcaatga ctatcaaggt 360 gtgaacagtg tagaaaaacc agtcgttcca gtagttgcaa tcactacaac agctggtact 420 ggtagtgaaa caacttctct tgcagttatt acagactctg cacgtaaagt aaaaatgcct 480 gttattgatg agaaaattac tccaactgta gcaattgttg acccagaatt aatggtgaaa 540 aaaccagctg gattaacaat cgcaactggt atggacgcat tatcacacgc aattgaagcg 600 tatgttgcaa aaggtgctac accagttact gatgcatttg caattcaagc aatgaaactc 660 atcaatgaat acttaccaaa agcggtggca aacggagaag acatcgaagc acgtgaagca 720 atggcttatg cacaatacat ggcaggagtg gcatttaaca acggtggttt aggatcagta 780 cactctattt ctcaccaagt aggtggagtt tacaaattac aacacggaat ctgtaactca 840 gttaatatgc cacacgtttg cgcattcaac ctaattgcta aaactgagcg cttcgcacac 900 attgctgagc ttttaggcga gaatgtttct ggcttaggca ctgcagcagc tgctgagaga 960 gcaattgtag cgcttgaacg ctataacaaa aacttcggta tcccatctgg ctatgcagaa 1020 atgggcgtga aagaagagga tatcgaatta ttaacgaaaa acgcattcga agacgtatgt 1080 actcaaagta acccacgtgt tgctacagtt caagacattg cacaaatcat caaaaacgct 1140 ctgctcgagc accaccacca ccaccactga 1170 <210> 14 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant 3 MDH <400> 14 atgacaaact ttttcattcc accagccagc gtaattggac gaggtgcagt aaaggaagta 60 ggaacaagac ttaagcaaat tggagctaag aaagcgctta tcgttacaga tgcatttcct 120 catagcacag gtttatctga agaagttgct aaaaacaccc gtgaagctgg ccttgatgtt 180 gcgattttcc caaaagcgca accagatcca gcagaaacac aagttcatga aggtgtaggt 240 gcactcgaac aagaaaactg tgatgcactt gtttctatcg gtggaggtag ctctcacgat 300 acagctaaag caatcggttt agttgcagca aacggcggaa gaatcaatga ctatcaaggt 360 gtaaacagtg tagaaaaacc ggtcgttcca gtagctgcaa tcactacaac agctggtact 420 ggtagtgaaa caacatctct cgcagttatt acagactctg cacgtaaagt aaaaatgccc 480 gttattgatg aggaaattac tccaactgta gcaattgttg acccagaatt aatggtgaaa 540 aaaccagctg gattaacaat cgcaactggt atggacgcat tatcacacgc aactgaagcg 600 tatgttgcaa aaggtgccaa accagttgct gatgcatctg caattcaagc aatgaaactc 660 atcaatgaat acttaccaaa agcggtggca aacggaggag acatcgaagc acgtgaagca 720 atggcttatg cacaatacat ggcaggagtg gcatttaaca acggtggttt aggattagta 780 cgctctattt cccaccaagt aggtggagtt tacaaattac aacacggaat ctgtaactca 840 gctaatatgc cacacgtttg cgcattcaac ctaattgcta aaactgagcg cttcgcacac 900 attgctgagc ttttaggcga gaatgtttct ggcttaagca ctgcagcggc tgctgagaga 960 gcaattgtag cgcttgaacg ctataacaaa aacttcggta tcccatctgg ctatgcagaa 1020 atgggcgtga gagaagagga tatcgaatta ttagcgaaaa acgcattcga agacgtatgt 1080 actcaaagca acccacgtgt tgctacagtt cgagacattg cacaaatcat caaaaacgct 1140 ctgctcgagc accaccacca ccaccactga 1170 <210> 15 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant 4 MDH <400> 15 atgacaaact ttttcattcc accagccagc gtaattggac gaggtgcagt aaaggaagta 60 ggaacaagac ttaagcaaat tggagctaag aaagcgctta tcgttacaga tgcatttctt 120 catagcacag gtttatctga agaagttgct aaaaacattc gtgaagctgg ccttgatgtt 180 gcgattttcc caaaagctca accagatcca gcagatacac aagttcatga aggtgtagat 240 gtattcaaac aagaaaactg tgatgcactt gtttctatcg gtggaggtag ctctcacgat 300 acagctaaag caatcggttt agttgcagca aacggcggaa gaatcaatga ctatcaaggt 360 gtaaacagtg tagaaaaacc agtcgttcca gtagttgcaa tcactacaac agctggtact 420 ggtagtgaaa caacatctct tgcagttatt acagactctg cacgtaaagt aaaaatgcct 480 gttattgatg agaaaattac tccaactgta gcaattgttg acccagaatt aatggtgaaa 540 aaaccagctg gattaacaat cgcaactggt atggacgcat tatcacacgc aattgaagcg 600 tatgttgcaa aaggtgctac accagttact gatgcagttg caattcaagc aatgaaactc 660 atcaatgaat acttaccaaa agcggtggca aacggagaag acatcgaagc acgtgaagca 720 atggcttatg cacaatacat ggcaggagtg gcatttaaca acggtggttt aggattagta 780 cactctattt ctcaccaagt aggtggagtt tacaaattac aacacggaat ctgtaactca 840 gttaatatgc cacacgtttg cgcactcaac ctaattgcta aaactgagcg cttcgcacac 900 attgctgagc ttttaggcga gaatgtttct ggcttaagca ctgcagcagc tgctgagaga 960 gcaattgtag cgcttgaacg ctataacaaa aacttcggta tcccatctgg ctatgcagaa 1020 atgggcgtga aagaagagga tatcgaatta ttagcgaaaa acgcattcga agacgtatgt 1080 actcaaagca acccacgtgt tgctacagtt caagacattg cacaaatcat caaaaacgct 1140 ctgctcgagc accaccacca ccaccactga 1170 <210> 16 <211> 1143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant 5 MDH <400> 16 atgacaaact ttttcattcc accagccagc gtaattggac gaggtgcagt aaaggaagta 60 ggaacaagac ttaagcaaat tggagctaag aaagcgctta tcgttacaga tgcatttctt 120 catagcacag gtttatctga agaagttgct aaaaacattc gtgaagctgg ccttgatgtt 180 gcgattttcc caaaagctca accagatcca gcagatacac aagttcatga aggtgtagat 240 gtattcaaac aagaaaactg tgatgcactt gtttctatcg gtggaggtag ctctcacgat 300 acagctaaag caatcggttt agttgcagca aacggcggaa gaatcaatga ctatcaaggt 360 gtaaacagtg tagaaaaacc agtcgttcca gtagttgcaa tcactacaac agctggtact 420 ggtagtgaaa caacatctct tgcggttatt acagactccg cacgtaaagt aaaaatgcct 480 gttattgatg agaaaattac tccaactgta gcaattgttg acccagaatt aatggtgaaa 540 aaaccagctg gattaacaat cgcaactggt atggacgcat tatcacacgc aattgaagcg 600 tatgttgcaa aaggtgctac accagttact gatgcatttg caattcaagc aatgaaactc 660 atcaatgaat acttaccaaa agcggtggca aacggagaag acatcgaagc acgtgaagca 720 atggcttatg cacaatacat ggcaggagtg gcatttaaca acggtggttt aggattagta 780 cactctattt ctcaccaagt aggtggagtt tacaaattac aacacggaat ctgtaactca 840 gttaatatgc cacacgtttg cgcactcaac ctaattgcta aaaccgagcg cttcgcacac 900 attgctgagc ttttaggcga gaatgtttct ggcttaagca ctgcagcagc tgctgagaga 960 gcaattgtag cgcttgaacg ctataacaaa aacttcggta tcccatctgg ctatgcagaa 1020 atgggcgtga aagaagagga tatcgaatta ttagcgaaaa acgcatccga agacgtatgt 1080 actcaaagca acccacgtgt tgctacagtt caagacattg cacaaatcat caaaaacgct 1140 ctg 1143 <210> 17 <211> 1143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant 6 MDH <400> 17 atgacaaact ttttcattcc accagccagc gtaattggac gaggtgcagt aaaggaagta 60 ggaacaagac ttaagcaaat tggagctaag aaagcgctta tcgttacaga tgcatttctt 120 catagcacag gtttatctga agaagttgct aaaaacattc gtgaagctgg ccttgatgtt 180 gcgattttcc caaaagctca accagatcca gcagatacac aagttcatga aggtgtagat 240 gtattcaaac aagaaaactg tgatgcactt gtttctatcg gtggaggtag ctctcacgat 300 acagctaaag caatcggttt agttgcagca aacggcggaa gaatcaatga ctatcaaggt 360 gtaaacagtg tagaaaaacc agtcgttcca gtagttgcaa tcactacaac agctggtact 420 ggtagtgaaa caacatctct tgcggttatt acagactccg cacgtaaagt aaaaatgcct 480 gttattgatg agaaaattac tccaactgta gcaattgttg acccagaatt aatggtgaaa 540 aaaccagctg gattaacaat cgcaactggt atggacgcat tatcacacgc aattgaagcg 600 tatgttgcaa aaggtgctac accagttact gatgcagttg caattcaagc aatgaaactc 660 atcaatgaat acttaccaaa agcggtggca aacggagaag acatcgaagc acgtgaagca 720 atggcttatg cacaatacat ggcaggagtg gcatttaaca acggtggttt aggattagta 780 cactctattt ctcaccaagt aggtggagtt tacaaattac aacacggaat ctgtaactca 840 gttaatatgc cacacgtttg cgcattcaac ctaattgcta aaactgagcg cttcgcacac 900 attgctgagc ttttaggcga gaatgtttct ggcttaagca ctgcagcagc tgctgagaga 960 gcaattgtag cgcttgaacg ctataacaaa aacttcggta tcccatctgg ctatgcagaa 1020 atgggcgtga aagaagagga tatcgaatta ttagcgaaaa acgcatccga agacgtatgt 1080 actcaaagca acccacgtgt tgctacagtt caagacattg cacaaatcat caaaaacgct 1140 ctg 1143 <210> 18 <211> 1143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant 7 MDH <400> 18 atgacaaact ttttcattcc accagccagc gtaattggac gaggtgcagt aaaggaagta 60 ggaacaagac ttaagcaaat tggagctaag aaagcgctta tcgttacaga tgcatttctt 120 catagcacag gtttatctga agaagttgct aaaaacattc gtgaagctgg ccttgatgtt 180 gcgattttcc caaaagctca accagatcca gcagatacac aagttcatga aggtgtagat 240 gtattcaaac aagaaaactg tgatgcactt gtttctatcg gtggaggtag ctctcacgat 300 acagctaaag caatcggttt agttgcagca aacggcggaa gaatcaatga ctatcaaggt 360 gtaaacagtg tagaaaaacc agtcgttcca gtagttgcaa tcactacaac agctggtact 420 ggtagtgaaa caacatctct tgcggttatt acagactccg cacgtaaagt aaaaatgcct 480 gttattgatg agaaaattac tccaactgta gcaattgttg acccagaatt aatggtgaaa 540 aaaccagctg gattaacaat cgcaactggt atggacgcat tatcacacgc aattgaagcg 600 tatgttgcaa aaggtgctac accagttact gatgcagttg caattcaagc aatgaaactc 660 atcaatgaat acttaccaaa agcggtggca aacggagaag acatcgaagc acgtgaagca 720 atggcttatg cacaatacat ggcaggagtg gcatttaaca acggtggttt aggattagta 780 cactctattt ctcaccaagt aggtggagtt tacaaattac aacacggaat ctgtaactca 840 gttaatatgc cacacgtttg cgcattcaac ctaattgcta aaactgagcg cttcgcacac 900 attgctgagc ttttaggcga gaatgtttct ggcttaagca ctgcagcagc tgctgagaga 960 gcaattgtag cgcttgaacg ctataacaaa aacttcggta tcccatctgg ctatgcagaa 1020 atgggcgtga aagaagagga tatcgaatta ttagcgaaaa acgcattcga agacgtatgt 1080 actcaaagca acccacgtgt tgctacagtt caagacattg cacaaatcat caaaaacgct 1140 ctg 1143 <210> 19 <211> 1143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant 8 MDH <400> 19 atgacaaact ttttcattcc accagccagc gtaattggac gaggtgcagt aaaggaagta 60 ggaacaagac ttaagcaaat tggagctaag aaagcgctta tcgttacaga tgcatttctt 120 catagcacag gtttatctga agaagttgct aaaaacattc gtgaagctgg ccttgatgtt 180 gcgattttcc caaaagctca accagatcca gcagatacac aagttcatga aggtgtagat 240 gtattcaaac aagaaaactg tgatgcactt gtttctatcg gtggaggtag ctctcacgat 300 acagctaaag caatcggttt agttgcagca aacggcggaa gaatcaatga ctatcaaggt 360 gtaaacagtg tagaaaaacc agtcgttcca gtagttgcaa tcactacaac agctggtact 420 ggtagtgaaa caacatctct tgcggttatt acagactccg cacgtaaagt aaaaatgcct 480 gttattgatg agaaaattac tccaactgta gcaattgttg acccagaatt aatggtgaaa 540 aaaccagctg gattaacaat cgcaactggt atggacgcat tatcacacgc aattgaagcg 600 tatgttgcaa aaggtgctac accagttact gatgcatttg caattcaagc aatgaaactc 660 atcaatgaat acttaccaaa agcggtggca aacggagaag acatcgaagc acgtgaagca 720 atggcttatg cacaatacat ggcaggagtg gcatttaaca acggtggttt aggattagta 780 cactctattt ctcaccaagt aggtggagtt tacaaattac aacacggaat ctgtaactca 840 gttaatatgc cacacgtttg cgcactcaac ctaattgcta aaaccgagcg cttcgcacac 900 attgctgagc ttttaggcga gaatgtttct ggcttaagca ctgcagcagc tgctgagaga 960 gcaattgtag cgcttgaacg ctataacaaa aacttcggta tcccatctgg ctatgcagaa 1020 atgggcgtga aagaagagga tatcgaatta ttagcgaaaa acgcattcga agacgtatgt 1080 actcaaagca acccacgtgt tgctacagtt caagacattg cacaaatcat caaaaacgct 1140 ctg 1143 <210> 20 <211> 1143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant 9 MDH <400> 20 atgacaaact ttttcattcc accagccagc gtaattggac gaggtgcagt aaaggaagta 60 ggaacaagac ttaagcaaat tggagctaag aaagcgctta tcgttacaga tgcatttctt 120 catagcacag gtttatctga agaagttgct aaaaacattc gtgaagctgg ccttgatgtt 180 gcgattttcc caaaagctca accagatcca gcagatacac aagttcatga aggtgtagat 240 gtattcaaac aagaaaactg tgatgcactt gtttctatcg gtggaggtag ctctcacgat 300 acagctaaag caatcggttt agttgcagca aacggcggaa gaatcaatga ctatcaaggt 360 gtaaacagtg tagaaaaacc agtcgttcca gtagttgcaa tcactacaac agctggtact 420 ggtagtgaaa caacatctct tgcggttatt acagactccg cacgtaaagt aaaaatgcct 480 gttattgatg agaaaattac tccaactgta gcaattgttg acccagaatt aatggtgaaa 540 aaaccagctg gattaacaat cgcaactggt atggacgcat tatcacacgc aattgaagcg 600 tatgttgcaa aaggtgctac accagttact gatgcatttg caattcaagc aatgaaactc 660 atcaatgaat acttaccaaa agcggtggca aacggagaag acatcgaagc acgtgaagca 720 atggcttatg cacaatacat ggcaggagtg gcatttaaca acggtggttt aggattagta 780 cactctattt ctcaccaagt aggtggagtt tacaaattac aacacggaat ctgtaactca 840 gttaatatgc cacacgtttg cgcattcaac ctaattgcta aaactgagcg cttcgcacac 900 attgctgagc ttttaggcga gaatgtttct ggcttaagca ctgcagcagc tgctgagaga 960 gcaattgtag cgcttgaacg ctataacaaa aacttcggta tcccatctgg ctatgcagaa 1020 atgggcgtga aagaagagga tatcgaatta ttagcgaaaa acgcatccga agacgtatgt 1080 actcaaagca acccacgtgt tgctacagtt caagacattg cacaaatcat caaaaacgct 1140 ctg 1143 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 21 aagaaggaga tatacatatg aca 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 22 atactcgagc agagcgtttt tg 22 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F213V forward primer <400> 23 tactgatgca gttgcaattc aagca 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F213V reverse primer <400> 24 gaattgcaac tgcatcagta actgg 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F289L forward primer <400> 25 cgtttgcgca ctcaacctaa ttgct 25 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F289L reverse primer <400> 26 ttaggttgag tgcgcaaacg tgtgg 25 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F356S forward primer <400> 27 aaaaacgcat ccgaagacgt atgta 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F356S reverse primer <400> 28 acgtcttcgg atgcgttttt cgcta 25

Claims (11)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 야생형 메탄올 탈수소화 효소(MDH)에 변이가 도입되어, 상기 MDH 보다 환원활성이 증대된, 변이 메탄올 탈수소화 효소.
   
2. 제1항에 있어서,
   서열번호 2 내지 9로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 것인 변이 메탄올 탈수소화 효소.
   
3. 제1항 또는 제2항의 변이 메탄올 탈수소화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
   
4. 제3항에 있어서,
   서열번호 12 내지 19로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
   
5. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
   
6. 제5항의 발현벡터가 도입되어 형질전환된 형질전환체.
   
7. (a) 제6항의 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및,
   (b) 상기 배양물로부터 제1항의 변이 메탄올 탈수소화 효소를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항의 변이 메탄올 탈수소화 효소의 제조방법.
   
8. (a) 제1항 또는 제2항의 변이 메탄올 탈수소화 효소를, 포름알데히드 및 전자공여체를 포함하는 혼합물에 가하여 반응시켜서 반응산물을 수득하는 단계; 및
   (b) 상기 반응산물로부터 메탄올을 회수하는 단계를 포함하는, 메탄올의 생산방법.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 전자공여체는 NADH인 것인 방법.
   
10. 제8항에 있어서,
    상기 혼합물은 반응완충액을 추가로 포함하는 것인 방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 반응완충액은 중성의 인산염 완충액인 것인 방법.
    

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