KR20000076625A

KR20000076625A - 크실리톨의 생산방법

Info

Publication number: KR20000076625A
Application number: KR1020000005838A
Authority: KR
Inventors: 다케나카야스히로; 도노우치나오토; 요코제키겐조
Original assignee: 에가시라 구니오; 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1999-02-09
Filing date: 2000-02-08
Publication date: 2000-12-26
Also published as: CN1271017A; EP1029925A1; US20030148482A1; PE20010017A1; BR0000338A; JP2000295994A

Abstract

크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물을 D-크실룰로오스에 작용시켜 크실리톨을 생산하고, 생산된 크실리톨을 수집함으로써 D-크실룰로오스를 크실리톨로 효율적으로 전환시킨다.

Description

크실리톨의 생산방법{Method for producing xylitol}

본 발명은 크실리톨의 생산방법에 관한 것이다. 크실리톨은 식품 공업, 의약 등의 분야에서 유용하다.

천연 당알콜인 크실리톨의 요구량은 앞으로 증가될 것으로 예측된다. 크실리톨은 열량이 낮고 슈크로오스와 비교하여 필적할 정도의 당도를 나타내기 때문에 유망한 저칼로리 감미료이다. 또한, 이의 충치 억제 특성 때문에, 충치 방지용 감미료로서 이용된다. 또한, 크실리톨은 혈당치를 상승시키지 않기 때문에, 당뇨병의 치료에 있어서 유체 요법(fluid therapy)에 이용되고 있다.

현재 크실리톨의 공업적 생산은 주로 미국 특허 제4,008,825호에 기재된 바와 같이 D-크실로오스의 수소화반응에 따른다. 원료로서 사용되는 D-크실로오스는 수목, 짚, 옥수수 속대, 오트 외피 및 기타 크실란-풍부 재료와 같은 식물 재료의 가수분해에 의해 수득한다.

그러나, 식물 재료의 가수분해에 의해 생산된 바와 같은 D-크실로오스는 값이 비싸다는 단점이 있으며, 따라서 생산 단가를 상승시킨다. 예를 들면, 식물 재료의 가수분해 처리 수율이 낮기 때문에 생산된 D-크실로오스의 순도가 낮게 된다. 그러므로, 가수분해용으로 사용되는 산 및 염료를 가수분해 처리후 이온 교환 처리에 의해 제거하여야 하며, 생성된 D-크실로오스는 기타 헤미셀룰로오스성 사카라이드를 제거하기 위하여 추가로 결정화하여야 한다. 식품용으로 적합한 D-크실로오스를 수득하기 위해서는, 추가 정제가 필요하다. 상기와 같은 이온 교환 처리 및 결정화 처리는 생산 단가를 증가시킨다.

그러므로, 용이하게 구입할 수 있는 원료를 이용하며 폐기물을 거의 발생시키지 않는 몇가지 크실리톨 생산 방법이 개발되었다. 예를들어, 출발 물질로서 다른 펜티톨을 이용하는 크실리톨 생산 방법이 개발되었다. 상기와 같은 용이하게 구입 가능한 펜티톨중 하나가 D-아라비톨이며, D-아라비톨은 효모를 이용하여 생산할 수 있다 [참조: Can. J. Microbiol., 31, 1985, 467-471; J. Gen. Microbiol., 139, 1993, 1047-54].

이후, 원료로서 D-아라비톨을 이용하여 크실리톨을 생산하는 여러가지 방법이 개발되었다. 문헌[참조: Applied Microbiology, 18, 1031-1035 (1969)]에는 데바리오마이세스 한세니 (Debaryomyces hansenii) ATCC20121을 사용한 발효에 의해 글루코오스로부터 D-아라비톨을 생산하는 방법, 아세토박터 수복시단스(Acetobacter suboxydans)를 이용하여 D-아라비톨을 D-크실룰로오스로 전환시키는 방법, 및 또한 칸디다 길리에르몬디 변종 소야(Candida guilliermondii var. soya)의 작용에 의해 D-크실룰오로스를 크실리톨로 전환시키는 방법이 보고되어 있다.

그러나, 이 방법은 아라비톨 5.3%를 사용하여 39% 수율로 크실리톨을 수득하는데 112시간이 소요되며, 따라서 수율 및 생산성을 향상시킬 필요성이 있다.

제EP 403 392A호 [페레 로퀘트(Roquette Freres)] 및 제EP421 882A호 (페레 로퀘트)에는 내삼투압성 효모를 사용하여 발효시켜 D-아라비톨을 생산한 다음, 아세토박터속, 글루코노박터속 또는 클렙시엘라속에 속하는 세균을 사용하여 D-아라비톨을 D-크실룰로오스로 전환시키고, 글루코오스 (크실로오스) 이소머라제의 작용에 의해 D-크실룰로오스로부터 크실로오스와 D-크실룰로오스의 혼합물을 형성시키고, 수득한 크실로오스와 D-크실룰로오스의 혼합물을 수소화반응에 의해 크실리톨로 전환시킴을 특징으로 하는 방법이 기재되어 있다. 또한 크실로오스와 D-크실룰로오스의 혼합물중 크실로오스를 예비 농축시키고 상기 크실로오스를 수소화반응에 의해 크실리톨로 전환시킴을 특징으로 하는 크실리톨의 생산방법이 기재되어 있다.

그러나, 상기 언급한 크실리톨의 생산방법들은 출발 물질로서 발효에 의해 생산된 D-아라비톨을 이용하고, 이를 다단계 공정 단계에 의해 전환시킨다. 그러므로, 상기 공정들은 복잡하고, 공정상 경제적인 관점에서 덜 만족스럽다.

상기 언급한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 이미 D-아라비톨을 크실리톨로 직접 전환시키는 능력을 갖는 미생물을 발견하여, 이들 미생물을 D-아라비톨에 작용시켜, 생산된 크실리톨을 수집함을 특징으로 하여 크실리톨을 생산하는 방법을 개발하였다 (일본 특허원 제10-258962호). 또한 본 발명자들은 이들 미생물을 분석하여, D-아라비톨 데하이드로게나제 활성 및 D-크실룰로오스 리덕타제 (크실리톨 데하이드로게나제) 활성이 상기 전환 반응에 관련되어 있다는 결론을 내렸다. 또한, 본 발명자들은 탄소원 또는 NADH (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 환원형)를 첨가하여 상기 반응을 수행하여 환원력을 제공함으로써 고수율로 안정하게 크실리톨 생산할 수 있다는 것을 발견하였다 (일본 특허원 제10-258961호).

본 발명의 목적은 상기 언급한 발견을 이용하여 D-크실룰로오스를 크실리톨로 전환시키는 것을 효율적으로 수행하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

상기 언급한 목적을 성취하기 위하여 기울인 본 발명자들의 연구 결과, 증강된 크실리톨 데하이드로게나제 활성과 환원력 제공 능력을 갖는 미생물을 이용함으로써 D-크실룰로오스로부터 크실리톨을 효율적으로 생산할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물을 D-크실룰로오스와 반응시켜 크실리톨을 생산하는 단계 및 생산된 크실리톨을 수집하는 단계를 포함하여 크실리톨을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 언급한 방법의 바람직한 양태에 따르면, 환원력 제공 능력을 갖는 미생물은 에스케리치아속에 속하는 세균이다. 에스케리치아속에 속하는 상기와 같은 세균으로서, 에스케리치아 콜라이를 언급할 수 있다.

본 발명의 상기 언급한 다른 바람직한 양태에 따르면, 상기 방법은 D-아라비톨을 D-크실룰로오스로 전환시키는 능력을 갖는 미생물을 D-아라비톨과 반응시켜 D-크실룰로오스를 생산하는 단계 및 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물을 생산된 D-크실룰로오스와 반응시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 언급한 또 다른 바람직한 양태에 따르면, 상기 방법은 적합한 배지중에서 글루코오스로부터 D-크실룰로오스를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양시켜 D-크실룰로오스를 생산하는 단계 및 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물을 상기 배지중에서 생산된 D-크실룰로오스와 반응시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물과 D-아라비톨을 D-크실룰로오스로 전환시키는 능력을 갖는 미생물을 D-아라비톨을 함유하는 배지중에서 배양시켜 크실리톨을 생산하는 단계 및 생산된 크실리톨을 수집하는 단계를 포함하여 크실리톨을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물과 글루코오스로부터 D-크실룰로오스를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 적합한 배지중에서 배양시켜 크실리톨을 생산하는 단계 및 생산된 크실리톨을 수집하는 단계를 포함하여 크실리톨을 생산하는 방법을 제공한다.

이후, 본 발명이 상세하게 설명된다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물이다. 상기와 같은 능력을 갖는 미생물을 "본 발명의 미생물"로 언급한다.

본 발명의 미생물은 환원력 제공 능력을 갖는 미생물을 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환시켜 수득할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "환원력 제공 능력"은 크실리톨 데하이드로게나제 (D-크실룰로오스 리덕타제)를 촉매로 사용하는, D-크실룰로오스를 크실리톨로 전환시키기 위한 환원 반응을 진행시키기에 충분한 양으로 NADH (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 환원형)를 제공할 수 있는 능력을 의미한다. 상기 언급한 바와 같이, D-아라비톨을 크실리톨로 직접 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 미생물을 사용하여 크실리톨을 생산하는 경우 관찰되는 미반응 D-크실룰로오스의 잔류 이유는 상기 반응에 요구되는 NADH의 공급이 불충분하기 때문인 것으로 제시되어 있다. 또한 본 발명자들은 탄소원 또는 NADH가 D-아라비톨로부터 크실리톨로의 전환 반응에 첨가될 경우 상기 반응이 효율적으로 진행되었음을 발견하였다. 대조적으로, 탄소원 또는 NADH를 반응 시스템에 첨가하지 않고 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 상기 미생물을 형질전환시킬 경우, D-크실룰로오스의 환원 반응을 충분하게 진행시키는 미생물은 본 발명에서 언급되는 환원력 제공 능력을 갖는 미생물이다. 더욱 상세하게, 적합한 반응 조건하에서 5%의 농도의 D-크실룰로오스에 작용시킬 경우 85%의 수율로 크실리톨을 생산하는 미생물은 본 발명의 환원력 제공 능력을 갖는 미생물이다. 상기와 같은 미생물의 예를들면, 에스케리치아에 속하는 세균이 있다. 상기와 같이 에스케리치아에 속하는 미생물로서, 에스케리치아 콜라이를 언급할 수 있다.

상세하게, 환원력 제공 능력을 갖는 미생물을 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환시키기 위해서는, 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자 단편을 미생물에서 작용하는 벡터, 바람직하게는 다중 복제형 벡터에 결합시킴으로써 재조합 DNA를 제조하고, 미생물에 도입시켜 형질전환시킬 수 있다.

크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자 공급원으로서, 크실리톨 데하이드로게나제를 갖는 것이라면 어느 미생물이라도 사용될 수 있다. 상기와 같은 미생물의 예로는, 글루코노박터 세리누스(Gluconobacter cerinus), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 아세토박터 리퀘파시엔스(Acetobacter liquefaciens), 아세토박터 파스튜리아누스(Acetobacter pasteurianus), 프라튜리아 아우란티아(Frateuria aurantia), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 프로테우스 레트게리(Proteus rettgeri), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes), 플라보박테리움 아우란티넘(Flavobacterium aurantinum), 플라보박테리움 레나넘(Flavobacterium rhenanum), 슈도모나스 바디오파시엔스(Pseudomonas badiofaciens), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 이너스(Pseudomonas iners), 로도코쿠스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous), 아크로모박터 비스코수스(Achromobacter viscosus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agromobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 아르트로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 아르트로박터 하이드로카보글루타미쿠스(Arthrobacter hydrocarboglutamicus), 아조토박터 인디쿠스(Azotobacter indicus), 브레비박테리움 케토글루타미쿰(Brevibacterium ketoglutamicum), 코리네박테리움 파시엔스(Corynebacterium faciens), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 플라보박테리움 페레그리눔(Flavobacterium peregrinum), 플라보박테리움 푸카툼(Flavobacterium fucatum), 마이크로코쿠스종 (Micrococcus sp.) CCM825, 노카르디아 오파카(Nocardia opaca), 플라노코쿠스 유시나투스(Planococcus eucinatus), 슈도모나스 싱크산타(Pseudomonas synxantha), 로도코쿠스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 악티노마두라 마두래(Actinomadura madurae), 악티노마이세스 비올라세오크로모게네스(Actinomyces violaceochromogenes), 스트렙토마이세스 코엘리콜로(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 플라벨루스(Streptomyces flavelus), 스트렙토마이세스 그리세올루스(Streptomyces griseolus), 스테렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 올리바세우스(Streptomyces olivaceus), 스트렙토마이세스 타나쉬엔시스(Streptomyces tanashiensis), 스트렙토마이세스 비르기니애(Streptomyces virginiae), 스트렙토마이세스 안티비오티쿠스(Streptomyces antibioticus), 스트렙토마이세스 카카오이(Streptomyces cacaoi), 스트렙토마이세스 라벤둘래(Streptomyces lavendulae), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) 등이 있다.

상기 언급한 미생물중에서, 예를들어, 피키아 스티피티스 (FEBS Lett., 324, 9 (1993)) 및 모르가넬라 모르가니 (DDBJ/GenBank/EMBL Accession No. L34345)로부터 유래된 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열이 보고되어 있으며, 따라서 상기 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자는 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 이들 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기본으로 프라이머를 합성하고, 주형으로서 모르가넬라 모르가니 ATCC25829와 같은 미생물의 염색체 DNA를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)[참조: White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)]을 수행함으로써 수득할 수 있다. 상기 프라이머의 특정예로는 서열목록에 서열 번호 1 및 2로 제시되어있는 염기 서열을 갖는 모르가넬라 모르가니의 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위한, 올리고뉴클레오티드가 있다.

크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 숙주 미생물에 도입시키는데 사용되는 벡터는 숙주 미생물중에서 복제할 수 있는 벡터라면 어느것이라도 사용할 수 있다. 이들의 특정예로는 pBR322, pTWV228, pMW119, pUC19 및 pUC18과 같은 플라스미드 벡터가 있다.

에스케리치아 세균에서 작용하는 벡터에 결합시킴으로써 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 제조하기 위하여, 벡터를 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자의 말단 서열에 매치시키는 제한 효소로 절단할 수 있으며, 상기 서열은 둘다 결합시킬 수 있다. 결합은 통상적으로 T4 DNA 리가제와 같은 리가제를 사용하여 수행한다.

상기한 바와 같이 제조된 재조합 플라스미드를 D.A. Morrison의 방법 (Mothods in Enzymology, 68, 326 (1979)) 또는 수용체 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA에 대한 투과성을 증가시키는 방법 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))과 같은 에스케리치아 콜라이에 대해 보고된 방법으로 숙주 미생물중으로 도입시킬 수 있다. 또한, 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 또한 형질도입, 트랜스포손(transposon) (Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)), Mu 파아지 (일본 공개특허공보 제2-109985호) 또는 상동성 재조합법(homologous recombination) (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972))을 이용하는 방법으로 숙주의 염색체중으로 혼입시킬 수 있다.

크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자의 발현용 프로모터로서, 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자에 대해 특이적인 프로모터가 숙주 세포에서 작용할 때, 상기 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 외래 프로모터를 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA에 결합시켜 상기 프로모터의 조정하에서 발현시킬 수 있다. 상기와 같은 프로모터로서, 에스케리치아 세균이 숙주로서 사용될 경우, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, P_R프로모터 및 람다 파아지의 P_L프로모터, tet 프로모터, amyE 프로모터, spac 프로모터 등이 사용될 수 있다. 또한, pUC19와 같은 프로모터를 함유하는 발현 벡터를 사용할 수 있으며, 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA 단편을 벡터로 삽입하여 상기 단편이 프로모터의 조정하에서 발현될 수 있도록 한다.

미생물이 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 함유할 때, 발현 조절 서열을 유전자 자체의 프로모터와 같은 더 강력한 것으로 대체시킴으로써 크실리톨 데하이드로게나제 활성을 증강시킬 수 있다 (참조: 일본 공개특허공보 제1-215280호). 예를들면, 에스케리치아 세균에서 작용하는 상기 언급한 프로모터는 모두 강력한 프로모터로서 공지되어 있다.

염색체 DNA의 제조방법 , PCR, 플라스미드 DNA의 제조, DNA의 분해 및 결합, 형질전환, 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드의 디자인 및 합성 등은 당해 분야의 숙련가들에게 익히 공지된 통상의 방법일 수 있다. 상기와 같은 방법은 예를들어 하기 문헌에 기재되어 있다: Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 등.

크실리톨은 상기한 바와 같이 수득한 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물을 D-크실룰로오스에 작용하도록하고 생산된 크실리톨을 수집함으로써 생산된다.

크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환시킨 미생물의 배양에 사용되는 배지는 탄소원, 질소원, 미생물에 적합한 무기 이온 뿐만 아니라 경우에 따라, 다른 성분을 함유하는 통상의 배지일 수 있다.

탄소원으로서, 글루코오스, 락토오스, 갈락토오스, 프럭토오스 또는 전분 가수분해물과 같은 슈가; 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 알콜; 또는 푸마르산, 시트르산 또는 석신산과 같은 유기산을 사용할 수 있다.

질소원으로서, 황산암모늄, 염화암모늄 또는 인산암모늄과 같은 무기 암모늄염; 대두 가수분해물과 같은 유기질소; 암모니아 가스; 또는 암모니아수를 사용할 수 있다.

유기 미량 영양소로서 비타민 또는 효모 추출물과 같은 필수 성분을 적합한 양으로 함유시키는 것이 바람직하다. 상기 이외에, 인산칼륨, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온 등을 경우에 따라 소량 가한다.

배양은 호기적 조건하에서 16 내지 120시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 배양 온도는 바람직하게는 25 내지 45 ℃로 조정하고 pH는 바람직하게는 배양중 5 내지 8로 조정한다. 무기 또는 유기, 산성 또는 알칼리성 물질 뿐만 아니라 암모니아 가스 등을 pH 조절용으로 사용할 수 있다.

상기한 바와 같이 배양된 세포를 함유하는 배양물, 배양물로부터 분리되어 수집된 세포, 아세톤 처리 또는 동결처리하여 가공된 세포, 상기와 같은 세포 또는 가공된 세포로부터 제조된 무세포 추출물(cell free extract), 상기와 같은 무세포 추출물로부터 분획화된 막 분획물과 같은 분획물, 또는 이들 세포, 가공된 세포, 무세포 추출물 및 분획물을 고정화시켜 생산된 고정화 물질을 D-크실룰로오스와 접촉시키고, 반응시켜 반응 혼합물중에 크실리톨이 생산될 수 있다. 상기 미생물은 상기 미생물중 1종으로 이루어질 수 있거나, 상기 미생물 2종 이상의 임의의 혼합물로서 사용될 수 있다.

본 발명의 미생물을 D-크실룰로오스를 함유하는 배지중에서 배양시킴으로써, 크실리톨이 또한 배지중에 생산될 수 있다. D-크실룰로오스는 어떠한 방법으로든 생산될 수 있지만, 예를들어 D-아라비톨을 D-크실룰로오스로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 미생물을 D-아라비톨에 작용하도록함으로써 생산된 D-크실룰로오스가 본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있다. 또한, 글루코오스로부터 D-크실룰로오스를 생산할 수 있는 능력을 갖는 미생물을 사용함으로써 생산된 D-크실룰로오스가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.

본 발명의 미생물 또는 이로부터 수득한 가공 물질을 D-크실룰로오스에 작용하도록할 때 사용되는 반응 혼합물 또는 배지에 글루코오스 또는 글리세롤을 가할 경우, D-크실룰로오스가 크실룰로오스로 전환되는 효율이 향상될 수 있다.

예를들면, 크실리톨은 또한 D-아라비톨을 D-크실룰로오스로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 미생물을 D-아라비톨을 함유하는 배지에서 배양시킨 다음, 동일한 배지를 사용하여 본 발명의 미생물을 배양시킴으로써 D-아라비톨로부터 생산할 수 있다. 또한, 크실리톨은 또한 글루코오스로부터 D-크실룰로오스를 생산할 수 있는 능력을 갖는 미생물을 적합한 배지중에서 배양시킨 다음, 본 발명의 미생물을 동일한 배지를 사용하여 배양시킴으로써 글루코오스로부터 생산할 수 있다. 또한, 크실리톨은 D-아라비톨을 D-크실룰로오스로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 미생물 또는 글루코오스로부터 D-크실룰로오스를 생산할 수 있는 능력을 갖는 미생물과 함께 적합한 배지중에서 본 발명의 미생물을 배양시킴으로써 생산할 수 있다.

D-아라비톨을 D-크실룰로오스로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 미생물의 예로는, 글루코노박터, 아크로모박터, 아그로박테리움, 알칼리게네스, 아르트로박터, 아조토박터, 브레비박테리움, 코리네박테리움, 엔테로박터, 에르위니아, 플라보박테리움, 마이크로코쿠스, 모르가넬라, 노카르디아, 플라노코쿠스, 프로테우스, 프로피오니박테리움, 슈도모나스, 로도코쿠스, 스포로사르시나, 스타필로코쿠스, 비브리오, 악티노마두라, 악티노마이세스, 키타사토스포리아, 스트렙토마이세스, 에어로모나스, 아우레오박테리움, 바실러스, 에스케리치아, 마이크로박테리움, 세라티아, 살모넬라 또는 크산토모나스속에 속하는 미생물이 있다.

더욱 상세하게, 상기 언급한 미생물의 예로는 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans), 글루코노박터 아사이 (Gluconobacter asaii), 아크로모박터 델마르배 (Achromobacter delmarvae), 아크로모박터 비스코수스 (Achromobacter viscosus), 아크로모박터 락티쿰 (Achromobacter lacticum), 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터 (Agrobacterium radiobacter), 알칼리게네스 패칼리스 (Alcaligenes faecalis), 아르트로박터 시트레우스 (Arthrobacter citreus), 아르트로박터 투메센스 (Arthrobacter tumescens), 아르트로박터 파라피네우스 (Arthrobacter paraffineus), 아르트로박터 하이드로카르보글루타미쿠스 (Arthrobacter hydrocarboglutamicus), 아르트로박터 옥시단스 (Arthrobacter oxydans), 아우레오박테리움 사페르대 (Aureobacterium saperdae), 아조토박터 인디쿠스 (Azotobacter indicus), 브레비박테리움 암모니아게네스 (Brevibacterium ammoniagenes), 디바리카툼 (divaricatum), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 글로보숨 (Brevibacterium globosum), 브레비박테리움 푸스쿰 (Brevibacterium fuscum), 브레비박테리움 케토글루타미쿰 (Brevibacterium ketoglutamicum), 브레비박테리움 헬콜룸 (Brevibacterium helcolum), 브레비박테리움 푸실룸 (Brevibacterium pusillum), 브레비박테리움 테스타세움 (Brevibacterium testaceum), 브레비박테리움 로세움 (Brevibacterium roseum), 브레비박테리움 이마리오필리움 (Brevibacterium immariophilium), 브레비박테리움 리넨스 (Brevibacterium lines), 브레비박테리움 프로토파르미애 (Brevibacterium protopharmiae), 코리네박테리움 아세토필룸 (Corynebacterium acetophilum), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 코리네박테리움 칼루내 (Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum), 엔테로박터 에어로게네스 (Enterobacter aerogenes), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 에르위니아 카로토보라 (Erwinia carotovora), 에르위니아 헤르비콜러 (Erwinia herbicola), 에르위니아 크리스안테미 (Erwinia chrysanthemi), 플라보박테리움 페레그리눔 (Flavobacterium peregrinum), 플라보박테리움 푸카툼 (Flavobacterium fucatum), 플라보박테리움 아우란티눔 (Flavobacterium aurantinum), 플라보박테리움 레나눔 (Flavobacterium rhenanum), 플라보박테리움 세와넨스 (Flavobacterium sewanense), 플라보박테리움 브레브 (Flavobacterium breve), 플라보박테리움 메닝고셉티쿰 (Flavobacterium meningosepticum), 마이크로코쿠스종 (Micrococcus sp.) CCM825, 모르가넬라 모르가니 (Morganella morganii), 노카르디아 오파카 (Nocardia opaca), 노카르디아 루고사 (Nocardia rugosa), 플라노코쿠스 유시나투스 (Planococcus eucinatus), 프로테우스 레트게리 (Proteus rettgeri), 프로피오니박테리움 쉐르마니 (Propionibacterium shermanii), 슈도모나스 싱크산타 (Pseudomonas synxantha), 슈도모나스 아조토포르만스 (Pseudomonas azotoformans), 슈도모나스 플루오레슨스 (Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 오발리스 (Pseudomonas ovalis), 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 아시도볼란스 (Pseudomonas acidovolans), 슈도모나스 무시돌렌스 (Pseudomonas mucidolens), 슈도모나스 세스토스테로니 (Pseudomonas testosteroni), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 로도코쿠스 에리트로폴리스 (Rhodococcus erythropolis), 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous), 로도코쿠스종 ATCC 15592, 로도코쿠스 종 ATCC 19070, 스포로사르시나 우레애 (Sporosarcina ureae), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 비브리오 메치니코비 (Vibrio metschnikovii), 비브리오 티로게네스 (Vibrio tyrogenes), 악티노마두라 마두래 (Actinomadura madurae), 악티노마이세스 비올라세오크로모게네스 (Actinomyces violaceochromogenes), 키타사토스로리아 파룰로사 (Kitasatosporia parulosa), 스트렙토마이세스 코엘리콜러 (Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 플라벨루스 (Streptomyces flavelus), 스트렙토마이세스 그리세올루스 (Streptomyces griseolus), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 올리바세우스 (Streptomyces olivaceus), 스트렙토마이세스 타나쉬엔시스 (Streptomyces tanashiensis), 스트렙토마이세스 비르기니애 (Streptomyces virginiae), 스트렙토마이세스 안티비오티쿠스 (Streptomyces antibioticus), 스트렙토마이세스 카카오이 (Streptomyces cacaoi), 스트렙토마이세스 라벤둘래 (Streptomyces lavendulae), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes), 에어로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmoniciea), 바실루스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실루스 시르쿨란스 (Bacillus circulans), 바실루스 티아미놀리티쿠스 (Bacillus thiaminolyticus), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 에스케리치아 프륜디 (Escherichia freundii), 마이크로박테리움 암모니아필룸 (Microbacterium ammoniaphilum), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 쇼트물레리 (Salmonella schottmulleri), 크산토모나스 시트리 (Xanthomonas citri) 등이 있다.

또한, 구체적인 세균 균주로 다음 균주가 언급된다.

글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans) ATCC621

글루코노박터 서브옥시단스 (Gluconobacter suboxydans) NRRL B-755

글루코노박터 옥시단스 아종 옥시단스 IFO14819

글루코노박터 옥시단스 IAM 1842

글루코노박터 아사이 (Gluconobacter asaii) IFO3276

아크로모박터 델마르배 (Achromobacter delmarvae) AJ1983

아크로모박터 비스코수스 (Achromobacter viscosus) ATCC12448

아크로모박터 락티쿰 (Achromobacter lacticum) AJ2394

아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) ATCC4720

알칼리게네스 패칼리스 (Alcaligenes faecalis) IAM1015

아르트로박터 시트레우스 (Arthrobacter citreus) ATCC11624

아르트로박터 투메센스 (Arthrobacter tumescens) ATCC6947

아르트로박터 파라피네우스 (Arthrobacter paraffineus) ATCC15590

아르트로박터 파라피네우스 (Arthrobacter paraffineus) ATCC15591

아르트로박터 파라피네우스 (Arthrobacter paraffineus) ATCC19064

아르트로박터 파라피네우스 (Arthrobacter paraffineus) ATCC19065

아르트로박터 히드로카보글루타미쿠스 (Arthrobacter hydrocarboglutamicus) ATCC15583

아르트로박터 옥시단스 (Arthrobacter oxydans) ATCC14358

아조토박터 인디쿠스 (Azotobacter indicus) ATCC9037

브레비박테리움 디바리카툼 (Brevibacterium divaricatum) ATCC14020

브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13655

브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869

브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC13826

브레비박테리움 플라붐 ATCC21406

브레비박테리움 글로보숨 (Brevibacterium globosum) AJ1563

브레비박테리움 푸스쿰 (Brevibacterium fuscum) AJ3124

브레비박테리움 케토글루타미쿰 (Brevibacterium ketoglutamicum) ATCC15587

브레비박테리움 케토글루타미쿰 ATCC15588

브레비박테리움 헬콜룸 (Brevibacterium helcolum) ATCC11822

브레비박테리움 푸실룸 (Brevibacterium pusillum) ATCC19096

브레비박테리움 테스타세움 (Brevibacterium testaceum) AJ1464

브레비박테리움 로세움 (Brevibacterium roseum) ATCC13825

브레비박테리움 이마리오필리움 (Brevibacterium immariophilium) ATCC14068

브레비박테리움 리넨스 (Brevibacterium linens) ATCC8377

브레비박테리움 프로토파르미애 (Brevibacterium protopharmiae) AJ3125

코리네박테리움 아세토필룸 (Corynebacterium acetophilum) NRRLB3421

코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13059

코리네박테리움 칼루내 (Corynebacterium callunae) ATCC 15991

코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870

코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC 21407

코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806

엔테로박터 아에로게네스 (Enterobacter aerogenes) ATCC13048

에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) IFO12687

에르위니아 카로토보라 (Erwinia carotovora) CCM969

에르위니아 카로토보라 AJ2992

에르위니아 허비콜러 (Erwinia herbicola) ATCC 23822

에르위니아 크리스안테미 (Erwinia chrysanthemi) ATCC 11662

플라보박테리움 페레그리눔 (Flavobacterium peregrinum) CCM1080-A

플라보박테리움 푸카툼 (Flavobacterium fucatum) AJ2478

플라보박테리움 아우란티눔 (Flavobacterium aurantinum) AJ2466

플라보박테리움 레나눔 (Flavobacterium rhenanum) AJ2468

플라보박테리움 세와넨세 (Flavobacterium sewanense) AJ2476

플라보박테리움 브레베 (Flavobacterium breve) ATCC 14234

플라보박테리움 메닌고셉티쿰 (Flavobacterium meningosepticum) ATCC 13253

마이크로코쿠스종 CCM825

노카르디아 오파카 (Nocardia opaca) NCIB9409

노카르디아 루고사 (Nocardia rugosa) NCIB 8926

플라노코쿠스 유시나투스 (Planococcus eucinatus) AJ1656

프로테우스 레트게리 (Proteus rettgeri) NRRL B-11344

프로테우스 레트게리 AJ2769

프로테우스 레트게리 AJ2770

모르가넬라 모르가니 (Morganella morganii) AJ2771

프로피오니박테리움 쉐르마니 (Propionibacterium shermanii) IAM1725

슈도모나스 싱크산타 (Pseudomonas synxantha) ATCC796

슈도모나스 아조토포르만스 (Pseudomonas azotoformans) IFO 12693

슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas flourescens) IFO 3757

슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas flourescens) ATCC 13525

슈도모나스 오발리스 (Pseudomonas ovalis) IAM 1201

슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) IAM 1504

슈도모나스 아시도볼란스 (Pseudomonas acidovolans) ATCC 9355

슈도모나스 뮤시돌렌스 (Pseudomonas mucidolens) ATCC4685

슈도모나스 테스토스테로니 (Pseudomonas testosteroni) ATCC17409

슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) ATCC15528

로도코쿠스 에리트로폴리스 (Rhodococcus erythropolis) ATCC11048

로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) ATCC 4273

로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) ATCC 21199

로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) ATCC 21198

로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) ATCC 19149

로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) ATCC 21197

로도코쿠스종 ATCC 15592

로도코쿠스종 ATCC 19070

스포로사르시나 우레애 (Sporosarcina ureae) AJ1232

스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) IFO3761

비브리오 메치니코비 (Vibrio metschnikovii) ATCC7708

비브리오 티로게네스 (Vibrio tyrogenes) AJ2807

악티노마두라 마두래 (Actinomadura madurae) ATCC19425

악티노마이세스 비올라세오크로모게네스 (Actinomyces violaceochromogenes) IFO13100

키타사토스포리아 파룰로사 (Kitasatosporia parulosa) AJ9458

스트렙토마이세스 코엘리콜러 (Streptomyces coelicolor) ATCC10147

스트렙토마이세스 플라벨루스 (Streptomyces flavelus) AJ9012

스트렙토마이세스 그리세올루스 (Streptomyces griseolus) NRRL B-1062

스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) IFO13385

스트렙토마이세스 올리바세우스 (Streptomyces olivaceus) ATCC21379

스트렙토마이세스 타나쉬엔시스 (Streptomyces tanashiensis) ATCC15238

스트렙토마이세스 비르기니애 (Streptomyces virginiae) AJ9053

스트렙토마이세스 안티비오티쿠스 (Streptomyces antibioticus) NRRL3238

스트렙토마이세스 카카오이 (Streptomyces cacaoi) ATCC19093

스트렙토마이이세스 라벤둘래 (Streptomyces lavendulae) ATCC8664

스트렙토마이세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes) IFO3113

에어로모나스 살로니시다 (Aeromonas salmonicida) ATCC 14174

아우레오박테리움 사페르대 (Aureobacterium saperdae) ATCC19272

바실루스 푸밀루스 (Bacillus pumilus) IAM 1244

바실루스 시르쿨란스 (Bacillus circulans) ATCC 9966

바실루스 티아미놀리티쿠스 (Bacillus thiaminolyticus) IAM 103

에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) IAM 1204

에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) IAM 1239

에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) IAM 1518

에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) IAM 1519

에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) IAM 1137

에스케리치아 프륜디 (Escherichia freundii) IFM S-36

마이크로박테리움 암모니아필룸 (Microbacterium ammoniaphilum) ATCC 15354

세라티아 마그세센스 (Serratia marcescens) CCM 958

살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) AJ2636

살모넬라 쇼트물레리 (Salmonella schottmulleri) ATCC 8759

크산토모나스 시트리 (Xanthomonas citri) IAM1648

아크로모박터 락티쿰 AJ2394는 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1984년 1월 20일자로 수탁번호 FERM P-7401로 기탁되었다. 이 균주는 2000년 1월 6일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6981이다.

브레비박테리움 테스타세움 AJ1464는 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1987년 7월 11일자로 수탁번호 FERM P-9469로 기탁되었다. 이 균주는 2000년 1월 6일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6984이다.

브레비박테리움 프로토파르미애 AJ3125는 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1995년 2월 23일자로 수탁번호 FERM P-14784로 기탁되었다. 이 균주는 2000년 1월 6일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6985이다.

에르위니아 카로토보라 AJ2992는 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1987년 1월 19일자로 수탁번호 FERM P-9135로 기탁되었다. 이 균주는 1987년 10월 27일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-1538이다.

플라보박테리움 아우란티눔 AJ2466은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1984년 1월 20일자로 수탁번호 FERM P-7402로 기탁되었다. 이 균주는 2000년 1월 6일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6982이다.

플라보박테리움 레나눔 AJ2468은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1985년 9월 30일자로 수탁번호 FERM P-8459로 기탁되었다. 이 균주는 1988년 4월 21일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-1862이다.

플라보박테리움 세와넨스 AJ2476은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1983년 4월 25일자로 수탁번호 FERM P-7052로 기탁되었다. 이 균주는 1984년 2월 2일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-476이다.

살모넬라 티피무리움 AJ2636은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1987년 7월 11일자로 수탁번호 FERM P-9470으로 기탁되었다. 이 균주는 1998년 11월 2일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6566이다.

프로테우스 레트게리 NRRL B-11344는 Agricultural Research Service Culture Collection에 1978년 7월 13일자로 국제 기탁으로 기탁되어 수탁번호 NRRL B-11344를 부여받았다.

프로테우스 레트게리 AJ2770은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1985년 11월 28일자로 국제 기탁으로 기탁되었으며, 수탁번호는 FERM BP-941이다.

스포로사르시나 우레애 AJ1232는 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1983년 4월 25일자로 수탁번호 FERM P-7050으로 기탁되었다. 이 균주는 2000년 1월 6일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6979이다.

플라보박테리움 푸카툼 AJ2478은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1983년 4월 25일자로 수탁번호 FERM P-7053으로 기탁되었다. 이 균주는 1998년 9월 9일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6492이다.

플라노코쿠스 유시나투스 AJ1656은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1987년 1월 19일자로 수탁번호 FERM P-9133으로 기탁되었다. 이 균주는 1998년 9월 9일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6493이다.

프로테우스 레트게리 AJ2769는 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1983년 4월 25일자로 수탁번호 FERM P-7057로 기탁되었다. 이 균주는 2000년 1월 6일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6980이다.

비브리오 티로게네스 AJ2807은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1983년 4월 25일자로 수탁번호 FERM P-7060으로 기탁되었다. 이 균주는 1997년 3월 4일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-5848이다.

아크로모박터 델마르배 AJ1983은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1998년 1월 16일자로 수탁번호 FERM P-16593으로 기탁되었다. 이 균주는 2000년 1월 6일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6988이다.

브레비박테리움 글로보숨 AJ1563은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1998년 1월 16일자로 수탁번호 FERM P-16590으로 기탁되었다. 이 균주는 2000년 1월 6일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6987이다.

브레비박테리움 푸스쿰 AJ3124는 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1985년 4월 23일자로 수탁번호 FERM P-8194로 기탁되었다. 이 균주는 2000년 1월 6일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6983이다.

모르가넬라 모르가니 AJ2771는 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1998년 1월 16일자로 수탁번호 FERM P-16594로 기탁되었다. 이 균주는 1998년 9월 9일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6496이다.

키타사토스포리아 파룰로사 AJ9458은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1998년 1월 16일자로 수탁번호 FERM P-16588로 기탁되었다. 이 균주는 2000년 1월 6일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6986이다.

스트렙토마이세스 플라벨루스 AJ9012는 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1998년 1월 16일자로 수탁번호 FERM P-16585로 기탁되었다. 이 균주는 1998년 9월 9일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6494이다.

스트렙토마이세스 비르기니애 AJ9053은 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (현재는, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 1998년 1월 16일자로 수탁번호 FERM P-16587로 기탁되었다. 이 균주는 1998년 9월 9일자로 국제 기탁으로 이전되었으며, 수탁번호는 FERM BP-6495이다.

에르위나 카로토보라 CCM969, 플라보박테리움 페레그리눔 CCM1080-A, 마이크로코쿠스종 CCM825 및 세라티아 마그세센스 CCM958은 다음 기관으로부터 입수가능하다: Czechoslovak Collection of Microorganisms (주소: Tvrdeho 14, Brno CS-602 00, Czechoslovakia).

노카르디아 오파카 NCIB9409 및 노카르디아 루고사 NCIB 8926은 다음 기관으로부터 입수가능하다: National Collections of Industrial and Marine Bacteria (주소: NCIMB Lts., Torry Research Station 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom).

글루코노박터 옥시단스 아종 옥시단스 IFO14819, 글루코노박터 아사이 IFO3276, 스타필로코쿠스 아우레우스 IFO3761, 에스위니아 아밀로보라 IFO12687, 악티노마에세스 비올라세오크로모게네스 IFO13100, 스트렙토마이세스 리비단스 IFO13385 및 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스 IFO3113은 다음 기관으로부터 입수가능하다: Institute for Fermentation (Osaka 소재) (주소: 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan).

글루코노박터 옥시단스 IAM 1842, 프로피오니박테리움 쉐르마니 IAM1725, 알칼리게네스 패칼리스 IAM1015, IAM1725, 바실러스 푸밀러스 IAM 1244, 에스케리치아 콜라이 IAM 1204, 에스케리치아 콜라이 IAM 1239, 에스케리치아 콜라이 IAM 1518, 에스케리치아 콜라이 IAM 1519, 에스케리치아 콜라이 IAM 1137, 및 크산토모나스 시트리 IAM 648은 다음 기관으로부터 입수가능하다: Institute of Molecular and Cellular Bioscience (전에는, Institute of Applied Microbiology, 주소: The University of Tokyo, Yayoi 1-chome, Bunkyo-ky, Tokyo, Japan).

에스케리치아 프륜디 IFM S-36은 다음으로부터 입수가능하다: the Research Center for Pathogenic Fungi and Microbial Toxicoses, Chiba University (주소: 8-1, Inohara 1-chomme, Chuo-ku, Chiba-shi, Chiba, Japan).

다른 균주는 다음 기관으로부터 입수가능하다: the American Type Culture Collection (주소: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America).

이들 미생물 배양용으로 사용되는 배지는 특별하게 제한되지 않으며, 탄소원, 질소원 및 무기 이온 뿐만 아니라 경우에 따라, 유기 영양소를 함유하는 통상의 배지일 수 있다. 탄소원으로서, 글루코오스와 같은 탄수화물, 글리세롤과 같은 알콜 등이 적합하게 사용될 수 있다. 질소원으로서, 암모니아 가스, 암모니아수, 암모늄염 및 기타 물질이 사용될 수 있다. 무기 이온으로서, 마그네슘 이온, 인산 이온, 칼륨 이온, 철 이온, 망간 이온 등이 필요에 따라 적합하게 사용될 수 있다. 유기 영양소로서, 비타민, 아미노산, 이들을 함유하는 레버 추출물과 같은 물질, 효모 추출물, 맥아 추출물, 펩톤, 육류 추출물, 옥수수 침지액, 카제인 분해 생성물 등이 적합하게 사용될 수 있다.

또한, D-크실로오스, D-크실룰로오스, D-아라비톨 및 크실리톨과 같은 사카라이드 및 당 알콜을 효소 유도제로서 배지에 가함으로써, D-아라비톨의 D-크실룰로오스로의 전환 활성이 향상될 수 있다.

배양 조건 또한 특별하게 제한되지 않으며, 예를들어, pH 5 내지 8 및 25 내지 40 ℃의 온도 범위내에서 12 내지 72시간 동안 pH와 온도를 적합하게 조절하면서 호기성 조건하에서 배양을 수행할 수 있다.

D-크실룰로오스는 상기한 바와 같이 수득한 세포를 함유하는 배양물, 배양물로부터 분리되고 수집된 세포, 아세톤 처리 또는 동결건조시킨 가공된 세포, 상기와 같은 세포 또는 가공된 세포로부터 제조된 무세포 추출물, 상기와 같은 무세포 추출물으로부터 분획화시킨 막 분획과 같은 분획물, 또는 이들 세포, 가공된 세포, 무세포 추출물 및 분획물를 고정화시킴으로써 생산된 고정화 물질을 D-아라비톨과 접촉시키고 반응시킴으로써 반응 혼합물중에 생산될 수 있다. 사용될 미생물은 1종 이상의 미생물로 이루어질 수 있거나, 2종 이상의 미생물의 임의의 혼합물로 사용될 수 있다.

일반적으로, 20 내지 60 ℃, 바람직하게는 30 내지 40 ℃에서, pH 4.0 내지 9.0, 바람직하게는 6.5 내지 8.0에서 반응을 수행함으로써, 양호한 결과가 수득될 수 있다. 상기 반응은 정치 반응으로 또는 교반하여 수행할 수 있다. 반응 시간은 사용될 미생물의 활성 및 D-아라비톨의 농도와 같은 여러가지 조건에 따라 변화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 100시간이다. 또한, 글루코오스 및 에탄올과 같은 탄소원을 반응에 가함으로써, D-크실룰로오스의 생산량을 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 반응 혼합물에 피롤로퀴놀린 퀴논을 첨가함으로써, D-크실룰로오스의 생산량을 향상시킬 수 있다.

또한, 상기 언급한 미생물을 D-아라비톨을 함유하는 배지중에서 배양시킴으로써, D-아라비톨로부터 D-크실룰로오스를 생성시키는 반응을 배양과 동시에 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 크실리톨을 생산할 경우, 상기한 바와 같이 생산된 D-크실룰로오스를 반응 완결후 그대로 반응 혼합물로서 사용하거나, 혼합물로부터 수집 및 정제후 사용할 수 있다. 반응 완결후 반응 혼합물로부터 D-크실룰로오스를 수집 및 분리하기 위하여, 흡착성 합성 수지를 사용하는 방법, 침전제를 사용하는 방법 및 기타 통상의 수집 및 분리법을 사용할 수 있다.

글루코오스로부터 D-크실룰로오스를 생산할 수 있는 능력을 갖는 미생물의 예로는 글루코노박터, 아세토박터 또는 프라튜리아속에 속하는 미생물이 있다.

상기와 같은 미생물의 특정예는 다음과 같다:

글루코노박터 세리누스 (Gluconobacter cerinus), 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans), 글루코노박터 아사이 (Gluconobacter asaii),

아세토박터 아세티 (Acetobacter aceti), 아세토박터 리퀘파시엔스 (Acetobacter liquefaciens), 아세토박터 파스튜리아누스,

프라튜리아 아우란티아 (Frateuria aurantia) 등.

특정 세균 균주는 다음과 같다:

글루코노박터 세리누스 IFO3262

글루코노박터 옥시단스 ATCC8147

글루코노박터 옥시단스 IFO3293

글루코노박터 옥시단스 IAM1839

글루코노박터 옥시단스 IFO3250

글루코노박터 옥시단스 IFO3292

글루코노박터 옥시단스 IFO3294

글루코노박터 옥시단스 아종 옥시단스 IFO3189

글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3172

글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3130

아세토박터 아세티 아종 크실리눔 ATCC14851

아세토박터 리퀘파시엔스 ATCC14835

아세토박터 파스튜리아누스 IFO3222

아세토박터 파스튜리아누스 IFO3223

프라튜리아 아우란티아 IFO3245

글루코노박터 옥시단스 ATCC621 및 글루코노박터 옥시단스 ATCC8147, 아세토박터 아세티 아종 크실리눔 ATCC14851, 및 아세토박터 리퀘파시엔스 ATCC14835는 다음 기관으로부터 입수가능하다: American Type Culture Collection (주소: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America).

글루코노박터 세리누스 IFO3262, 글루코노박터 옥시단스 IFO3293, 글루코노박터 옥시단스 IFO3250, 글루코노박터 옥시단스 IFO3292, 글루코노박터 옥시단스 IFO3294, 글루코노박터 옥시단스 아종 옥시단스 IFO3189, 글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3172, 글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3130, 아세토박터 파스튜리아누스 IFO3222, 아세토박터 파스튜리아누스 IFO3223 및 프라튜리아 아우란티아 IFO3245는 다음 기관으로부터 입수가능하다: the Institute for Fermentation (Osaka소재) (주소: 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan).

글루코노박터 옥시단스 IAM1839는 다음으로부터 입수가능하다: the Institute of Molecular and Cellular Biosciences (전신, Institute of Applied Microbiology, The University of Tokyo, 주소: Yayoi 1-chome, Bunkyo-ky, Tokyo, Japan).

전술한 미생물 배양용 배양 배지는 통상의 탄소원, 질소원, 무기 이온 뿐만 아니라 필요에 따라 유기 영양소를 함유하는 통상의 배양 배지일 수 있다.

탄소원으로서, 글루코오스와 같은 탄수화물, 글리세롤과 같은 알콜, 유기산 등이 적합하게 사용될 수 있다. 크실리톨의 공지된 생산 방법, 예를들면, D-크실로오스 또는 D-아라비톨과 같은 펜티톨로부터 크실리톨을 생산하는 방법에서 관찰된 바람직한 측면에서는, 글루코오스 및 프럭토오스와 같은 헥소오스, 슈크로오스 및 락토오스와 같은 디사카라이드, 및 전분과 같은 폴리사카라이드가 바람직하다. 이들 물질은 배지중 주 탄소원으로서 10 내지 60%, 바람직하게는 20 내지 50%의 양으로 사용된다. 이들 탄소원은 배양 배지에 한번에, 또는 분획으로 나누어 배양 과정에 걸쳐 나누어서 가할 수 있다.

질소원으로서, 암모니아 가스, 암모니아수, 암모늄염 등이 사용된다. 무기 이온으로서, 마그네슘 이온, 인산 이온, 칼륨 이온, 철 이온, 망간 이온 등이 필요에 따라 적당하게 사용된다. 유기 영양소로서, 비타민, 아미노산, 이들을 함유하는 레버 추출물과 같은 물질, 효모 추출물, 맥아 추출물, 펩톤, 육류 추출물, 옥수수 침지액, 카제인 분해 생성물 등이 필요에 따라 사용된다.

배양 조건 또한 특별하게 제한되지 않는다. 그러나, 미생물은 일반적으로, 5 내지 8의 pH 범위내에서, 25 내지 40 ℃ 온도 범위에서 pH와 온도를 적합하게 조정하면서 배양시킬 수 있다. 배양은 예를들어, 통기를 위한 교반 또는 진탕에 의해 수득되는 호기성 조건하에서 수행한다. 배양 시간의 경우, 미생물을 주 탄소원이 소모될 때까지, 즉, 통상적으로 3 내지 8일간 배양시키는 것이 바람직하다.

크실리톨을 본 발명의 방법으로 생산할 경우, 상기한 바와 같이 배지중에 생산된 D-크실룰로오스를 배지 상태 그대로 사용할 수 있거나, 배지로부터 수집하여 정제한 후 사용할 수 있다. 배지로부터 D-크실룰로오스를 수집하고 분리하기 위하여, 흡착성 합성 수지를 사용하는 방법, 침전제를 사용하는 방법 및 기타 통상의 수집 및 분리 방법을 사용할 수 있다.

상기한 바와 같이 생산된 크실리톨은 통상의 방법으로 반응 혼합물로부터 분리하여 수집할 수 있다. 상술하면, 예를들어, 고형물을 원심분리, 여과 등에 의해 반응 혼합물로부터 제거한 후, 잔류 용액을 활성탄, 이온-교환 수지 등을 사용하여 탈색 및 탈염시키고, 크실리톨을 상기 용액으로부터 결정화시킬 수 있다.

본 발명에 따라서, 크실리톨을 글루코오스, D-아라비톨 또는 D-크실룰로오스로부터 효율적으로 생산할 수 있다.

본 발명은 다음 실시예를 참고로하여 더욱 상세하게 설명된다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다. 실시예에서는, 원료로서 D-아라비톨, 및 생산된 크실리톨 및 D-크실룰로오스를 고성능 액체 크로마토그라피 (HPLC)에 의해 다음 조건하에서 분석한다.

컬럼: Shodex SC1211 (Showa Denko, Japan)

이동상: 50% 아세토니트릴/50% Ca-EDTA의 50ppm 수용액

유속: 0.8 ㎖/분

온도: 60 ℃

검출: RI 검출기

실시예 1

크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환시킨 에스케리치아 콜라이의 생산

모르가넬라 모르가니 ATCC25829 균주 (DDBJ/GenBank/EMBL 수탁번호: L34345)의 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 공지된 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기본으로하여, 서열 목록에서 서열 번호 1 및 2로 표시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성한다.

이들 합성 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서, 상기 균주의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하여 통상의 조건으로 PCR을 수행한다. 결과로서, 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 함유하는 약 1.2 kb의 DNA 단편이 증폭된다. 상기 DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동법으로 분리하고 수집한다. 이후, 상기 단편의 양쪽 말단을 EcoRI 및 BamHI로 분해시키고, pUC18 (Takara Shuzo)의 EcoRI 및 BamHI 분해 생성물에 결합시킨다. 이를 에스케리치아 콜라이 JM109의 형질전환용으로 사용하고, 상기 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 함유하는 형질전환 균주를 선택한다. 클로닝된 단편이 상기 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 함유하는 경우, lac Z' 유전자를 갖는 융합 유전자로서 lac 프로모터의 조절하에서 발현된다.

형질전환 균주의 크실리톨 데하이드로게나제 활성은 다음과 같이 측정한다. L 배지 (트립톤 1%, 효모 추출물 0.5%, NaCl 0.5%)중에서 밤새 배양시킨 세포를 초음파 처리하고, 상등액을 조 효소 용액으로 사용한다. 100mM 글리신 완충액 (pH 9.5), 100mM 크실리톨, 2mM NAD 및 상기 조 효소 용액 100㎕를 함유하는 반응 혼합물 1 ㎖중에 30 ℃에서 1분간 반응을 수행한다. NADH 또는 NADPH의 생산을 340 ㎚에서의 흡광도 증가량을 기본으로하여 검출한다. 상기 언급한 반응 조건하에서 분당 크실리톨 1 μmol을 산화시켜 NADH 1 μmol을 생성시키는 효소 활성을 1unit로 정의한다.

그 결과, 형질전환 균주에서는 3.9 U/㎎의 크실리톨 데하이드로게나제 활성이 나타나는 반면, 대조군으로 사용되는 에스케리치아 콜라이 JM109 (숙주 균주)에서는 상기 효소 활성이 관찰되지 않는다.

따라서, 형질전환체 균주가 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 갖는다는 것이 확인된다.

실시예 2

글루코노박터 옥시단스 및 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환시킨 에스케리치아 콜라이를 사용한 D-아라비톨로부터의 크실리톨의 생산

(1) D-아라비톨의 D-크실룰로오스로의 전환

글루코노박터 옥시단스 ATCC621 균주를 감자 덱스트로오스 2.4%, 효모 추출물 3%, 글리세롤 0.5%, 만니톨 3% 및 탄산칼슘 2%를 함유하는 배지 (pH 6.0) 3 ㎖를 포함하는 시험관에 접종시키고, 30 ℃에서 16시간 동안 배양한다. 이후, 상기 배지를 5%의 양으로 효모 추출물 0.5% (w/v), 펩톤 0.5%, 고기 추출물 0.5%, 황산암모늄 0.5%, 인산이수소칼륨 0.1%, 인산수소이칼륨 0.3%, 황산마그네슘 7수화물 0.05%, 황산철 7수화물 0.001%, 황산망간 n-수화물 0.001%, D-아라비톨 5% 및 탄산칼슘 2%를 함유하는 배지 (pH 6.0)를 포함하는 50㎖ 용적의 플라스크에 접종시켜, 30 ℃에서 진탕시키며 배양시킨다. 그 결과, 4.7%(수율: 94%)의 D-크실룰로오스가 17시간내에 수득된다.

(2) D-크실룰로오스로부터의 크실리톨의 생산

상기 세포를 상기 수득한 D-크실룰로오스를 함유하는 배지로부터 원심분리에 의해 제거하고, 실시예 1에서 생산된 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환시킨 에스케리치아 콜라이를 사용하여 D-크실룰로오스를 크실리톨로 전환시킨다.

먼저, 상기 언급한 형질전환체 균주를 효모 추출물 0.5%, 펩톤 0.5%, 고기 추출물 0.5%, 황산암모늄 0.5%, 인산이수소칼륨 0.1%, 인산수소이칼륨 0.3%, 황산마그네슘 7수화물 0.05%, 황산철 7수화물 0.001%, 황산망간 n-수화물 0.001%, 글리세롤 1%, D-아라비톨 5% 및 탄산칼슘 2%를 함유하는 배지 (pH 6.0) 4 ㎖를 포함하는 시험관에 접종시키고, 30 ℃에서 진탕시키며 16시간 동안 배양시킨다. 이후, 상기 배지 1 ㎖를 상기와 동일한 배지 50 ㎖를 함유하는 500-㎖ 용적 플라스크에 접종시켜 3일간 배양시킨다. IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 lac 프로모터의 발현 유도제로서 상기 배지에 1mM의 최종 농도로 가하고, 4시간 동안 배양을 계속한다. 상기한 바와 같이 수득한 배지를 (1)에서 수득된 D-크실룰로오스를 함유하는 글루코노박터 옥시단스의 배양 상등액에 5%의 최종 농도로 가하고, 30 ℃에서 진탕시키며 배양시킨다. 그 결과, 4.3% (수율: 91%)의 크실리톨이 40시간내에 수득된다.

상기 (1) 및 (2)의 공정을 합하여, 글루코노박터 옥시단스 및 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환시킨 에스케리치아 콜라이를 사용하여 총 57시간 동안 5% 농도의 D-아라비톨로부터 4.3% (수율: 86%)의 농도로 크실리톨을 효율적으로 생산할 수 있다.

실시예 3

글루코노박터 옥시단스 및 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환시킨 에스케리치아 콜라이를 동시에 사용하는 D-아라비톨로부터의 크실리톨의 생산

실시예 2에서와 동일한 방법으로, 글루코노박터 옥시단스 ATCC621 균주를 감자 덱스트로오스 2.4%, 효모 추출물 3%, 글리세롤 0.5%, 만니톨 3% 및 탄산칼슘 2%를 함유하는 배지 (pH 6.0) 3 ㎖를 포함하는 시험관에 접종시켜, 30 ℃에서 16시간 동안 배양시킨다.

한편, 이와 유사하게, 실시예 1에서 생산된, 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환시킨 에스케리치아 콜라이를 효모 추출물 0.5%, 펩톤 0.5%, 고기 추출물 0.5%, 황산암모늄 0.5%, 인산이수소칼륨 0.1%, 인산수소이칼륨 0.3%, 황산마그네슘 7수화물 0.05%, 황산철 7수화물 0.001%, 황산망간 n-수화물 0.001%, D-아라비톨 5% 및 탄산칼슘 2%룰 함유하는 배지 (pH 6.0) 4 ㎖를 포함하는 시험관에 접종시켜, 30 ℃에서 16시간 동안 진탕시키며 배양시킨다. 이후, 상기 배지 1 ㎖를 상기와 동일한 배지 50 ㎖를 함유하는 500-㎖ 용적 플라스크에 접종시켜, 3시간 동안 배양시킨다. IPTG를 발현 유도제로서 1mM의 최종 농도로 상기 배지에 가하고, 4시간 동안 계속 배양시킨다.

글로코노박터 옥시단스 및 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환시킨 에스케리치아 콜라이의 동시 배양 배지를 효모 추출물 0.5% (w/v), 펩톤 0.5%, 고기 추출물 0.5%, 황산암모늄 0.5%, 인산이수소칼륨 0.1%, 인산수소이칼륨 0.3%, 황산마그네슘 7수화물 0.05%, 황산철 7수화물 0.001%, 황산망간 n-수화물 0.001%, D-아라비톨 5% 및 탄산칼슘 2%를 함유하는 배지 (pH 6.0) 50 ㎖를 포함하는 500-㎖ 용적 플라스크에 접종시켜, 30 ℃에서 진탕시키며 배양한다.

그 결과, 5%의 D-아라비톨로부터 50시간에 4.4%의 농도 (수율: 88%)로 크실리톨이 수득된다.

참고 실시예 1

D-아라비톨로부터 D-크실룰로오스의 생산

1.8% (w/v) 영양액 (EIKEN CHEMICAL CO., LTD. 제조)을 함유하는 배지 (pH 7.0) 4 ㎖를 각 시험관에 도입시키고, 120 ℃에서 20분간 가열시켜 멸균시킨다. 별도로 멸균시킨 D-아라비톨, 크실리톨 및 D-크실로오스를 각 배지에 1%의 농도로 가한다. 표 1에 나타낸 각각의 균체를 상기 언급한 배지에 접종시켜 30 ℃에서 2일간 진탕시키며 배양시킨다. 균체를 원심분리에 의해 상기 배지로부터 수집하고, 생리 식염수로 1회 세척한다.

각 배양 균체를 0.1M 인산염 완충액 (pH 7.0)중에 습중량으로 약 5%의 농도로 현탁시킨다. 유리 비드 (Biospec Products 제조, 직경: 0.1 ㎜)를 상기 현탁액에 균체 현탁액의 약 절반의 용적으로 가하고, 균체를 Multi-Beads Shocker MB-200 (Yasui Kikai)을 사용하여 파괴시킨다. 3000 rpm에서 3분간 파괴시키고, 수득한 파괴된 균체 현탁액을 조 효소 제제로서 이후의 전환 반응에 사용한다.

D-아라비톨 및 NAD를 1M Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 각각 5% (w/v) 및 10 mM의 최종 농도로 용해시키고, 각 시험관에 대해 0.9 ㎖의 양으로 시험관에 도입한다. 상기 반응 혼합물에 각 조 효소 제제 0.1 ㎖를 가하여 pH 8.0에서 30 ℃에서 22시간 동안 반응시킨다. 반응후, 침전물을 원심분리에 의해 제거하고, 생산된 D-크실룰로오스를 HPLC로 측정한다. 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 각 균체를 사용하여 D-아라비톨로부터 D-크실룰로오스가 효율적으로 생산되어 축적된다.

균주	D-글루코오스 생산량(g/ℓ)	반응 수율(%)
아크로모박터 델마르배 AJ1983아크로모박터 비스코수스 ATCC12448아그로박테리움 투메파시엔스 ATCC4720아그로박테리움 라디오박터 ATCC4718알칼리게네스 패칼리스 IAM1015아르트로박터 시트레우스 ATCC11624아르트로박터 투메센스 ATCC6947아르트로박터 파라피네우스 ATCC15590아르트로박터 파라피네우스 ATCC15591아르트로박터 파라피네우스 ATCC19064아르트로박터 파라피네우스 ATCC19065아르트로박터 하이드로카르보글루타미쿠스 ATCC15583아조토박터 인디쿠스 ATCC9037브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC6871브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC6872브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13655브레비박테리움 플라붐 ATCC13826브레비박테리움 플라붐 ATCC21406브레비박테리움 글로보숨 AJ1563브레비박테리움 푸스쿰 FERM BP-6983브레비박테리움 케토글루타미쿰 ATCC15587브레비박테리움 케토글루타미쿰 ATCC15588코리네박테리움 아세토필룸 NRRLB3421엔테로박터 아에로게네스 ATCC13048에르위니아 아밀로보라 IFP12687에르위니아 카로토보라 CCM969플라보박테리움 페레그리눔 CCM1080-A플라보박테리움 푸카툼 FERM BP-6492마이크로코쿠스종 CCM825노르카디아 오파카 NCIB9409플라노코쿠스 유시나투스 FERM BP-6493프로테우스 레트게리 NRRL 11344프로테우스 레트게리 FERM BP-6980프로테우스 레트게리 FERM BP-941모르가넬라 모르가니 AJ2771프로피오니박테리움 쉐르마니 IAM1725슈도모나스 싱크산타 ATCC796로도코쿠스 에리트로폴리스 ATCC11048스포로사르시나 우레애 FERM BP-6979스타필로코쿠스 아우레우스 IFO3761비브리오 메치니코비 ATCC7708비브리오 티로게네스 FERM BP-5848	0.40.10.30.10.60.30.40.71.30.81.00.90.10.40.50.50.51.30.30.10.50.40.90.30.10.10.10.10.10.31.00.40.70.70.60.50.10.41.10.10.10.10.6	0.80.20.60.21.20.60.81.42.61.62.01.80.20.81.01.01.02.60.60.21.00.81.80.60.20.20.20.20.20.62.00.81.41.41.21.00.20.82.20.20.20.21.2

참고 실시예 2

D-아라비톨로부터의 D-크실룰로오스의 생산

500㎖ 용적 플라스크에, 효모 추출물 0.2% (w/v), 고기 추출물 0.2%, 펩톤 0.4%, NaCl 0.5% 및 황산마그네슘 7수화물 0.2%를 함유하는 배지 (pH 7.2)를 각 플라스크에 대해 50 ㎖ 도입시키고, 120 ℃에서 20분간 가열시켜 멸균시킨다. 별도로 멸균시킨 D-아라비톨, 크실리톨 및 D-크실로오스를 각 배지에 1%의 농도로 가한다. 표 2에 나타낸 각각의 균체를 상기 언급한 배지에 접종시켜 30 ℃에서 2일간 진탕시키며 배양시킨다. 균체를 원심분리에 의해 상기 배지로부터 수집하고, 생리 식염수로 1회 세척한다.

D-아라비톨 및 NAD를 1M Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)에 각각 5% (w/v) 및 10 mM의 최종 농도로 용해시키고, 각 시험관에 대해 0.9 ㎖의 양으로 시험관에 도입시킨다. 상기 반응 혼합물에 각 조 효소 제제 0.1 ㎖를 가하여 pH 8.0에서 30 ℃에서 22시간 동안 반응시킨다. 반응후, 침전물을 원심분리에 의해 제거하고, 생산된 D-크실룰로오스를 HPLC로 측정한다. 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 각 균체를 사용하여 D-아라비톨로부터 D-크실룰로오스가 효율적으로 생산되어 축적된다.

균주	D-글루코오스 생산량(g/ℓ)	반응 수율(%)
악티노마두라 마두래 ATCC19425악티노마이세스 비올라세오크로모게네스 IFO13100키다사토스포리아 파룰로사 AJ9458스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스 NRRL3238스트렙토마이세스 카카오이 ATCC19093스트렙토마이세스 코엘리콜러 ATCC10147스트렙토마이세스 플라벨루스 AJ9012스트렙토마이세스 그리세올루스 NRRL B-1062스트렙토마이세스 라벤둘래 ATCC8664스트렙토마이세스 리비단스 IFO13385스트렙토마이세스 올리바세우스 ATCC21379스트렙토마이세스 타나쉬엔시스 ATCC15238스트렙토마이세스 비르기니애 AJ9053스트렙토마이세스 비리도크로모게네스 IFO3113	0.10.70.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1	0.21.40.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2

참고 실시예 3

글루코오스로부터의 D-크실룰로오스의 생산

황산암모늄 0.2%, 인산이수소칼륨 0.1%, 인산수소이칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.05% 및 효모 추출물 0.5%를 함유하는 배지 (pH 6.0)를 각 시험관에 대해 4 ㎖ 도입시키고, 120 ℃에서 20분간 가열시켜 멸균시킨다. 별도로 멸균시킨 D-글루코오스를 각 배지에 5%의 농도로 가한다. 농도 (%)는 중량/용적 (w/v)%로 표시된다.

표 3에 나타낸 각각의 균체를 상기 언급한 배지에 접종시켜 30 ℃에서 1일간 진탕시키며 배양시킨다. 이를 씨드 배양으로 사용한다. 500㎖ 용적의 사카구치(Sakaguchi) 플라스크에, 상기 언급한 바와 동일한 조성을 갖는 배지 (D-글루코오스 제외) 50 ㎖를 각 플라스크에 도입시켜 120 ℃에서 20분간 가열시켜 멸균시킨다. 별도로 멸균시킨 D-글루코오스 및 탄산칼슘을 배지에 각각 5% 및 4%의 농도로 가한다. 상기 언급한 씨드 배양을 상기 배지에 2%의 농도로 접종시켜 30 ℃에서 4일간 진탕시키며 배양시킨다. 균체를 원심분리에 의해 상기 배지로부터 제거하고, 배지중에 생산된 크실리톨과 D-크실룰로오스를 HPLC로 측정한다. 결과를 표 3에 나타낸다.

균주

D-글루코오스 생산량(g/ℓ)

글루코노박터 세리누스 IFO3262글루코노박터 옥시단스 ATCC8147글루코노박터 옥시단스 IFO3293글루코노박터 옥시단스 IAM1839글루코노박터 옥시단스 IFO3250글루코노박터 옥시단스 IFO3292글루코노박터 옥시단스 IFO3294글루코노박터 옥시단스 아종 옥시단스 IFO3189글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3172글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3130아세토박터 아세티 아종 크실리눔 ATCC14851아세토박터 리퀘파시엔스 ATCC14835아세토박터 파스튜리아누스 IFO3222아세토박터 파스튜리아누스 IFO3223프라튜리아 아우란티아 IFO3245

1.110.41.00.50.51.01.01.00.51.21.61.11.02.30.8

본 발명에 의해 글루코오스, D-아라비톨 또는 D-크실룰로오스로부터 크실리톨을 효율적으로 생산할 수 있다.

〈110〉 AJINOMOTO CO., INC.

〈120〉 Method for producing xylitol

〈130〉 5-1998-096241-9

〈150〉 JP 99-031464

〈151〉 1999-02-09

〈150〉 JP 99-197621

〈151〉 1999-07-12

〈160〉 2

〈170〉 KOPATIN 1.5

〈210〉 1

〈211〉 26

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 primer

〈400〉 1

cgggaattcg atatcatttt aatgaa 26

〈210〉 2

〈211〉 29

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 primer

〈400〉 2

ggcggatccg cagtcaatac cggcataga 29

Claims

크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물을 D-크실룰로오스와 반응시켜 크실리톨을 생산하는 단계 및 생산된 크실리톨을 수집하는 단계를 포함하여 크실리톨을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 환원력 제공 능력을 갖는 미생물이 에스케리치아속에 속하는 세균인 방법.
제2항에 있어서, 에스케리치아속에 속하는 세균이 에스케리치아 콜라이인 방법.
제1항에 있어서, D-아라비톨을 D-크실룰로오스로 전환시키는 능력을 갖는 미생물을 D-아라비톨과 반응시켜 D-크실룰로오스를 생산하는 단계 및 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물을 생산된 D-크실룰로오스와 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
제4항에 있어서, D-아라비톨을 D-크실룰로오스로 전환시키는 능력을 갖는 미생물이 글루코노박터, 아크로모박터, 아그로박테리움, 알칼리게네스, 아르트로박터, 아조토박터, 브레비박테리움, 코리네박테리움, 엔테로박터, 에르위니아, 플라보박테리움, 마이크로코쿠스, 모르가넬라, 노카르디아, 플라노코쿠스, 프로테우스, 프로피오니박테리움, 슈도모나스, 로도코쿠스, 스포로사르시나, 스타필로코쿠스, 비브리오, 악티노마두라, 악티노마이세스, 키타사토스포리아, 스트렙토마이세스, 에어로모나스, 아우레오박테리움, 바실러스, 에스케리치아, 마이크로박테리움, 세라티아, 살모넬라 또는 크산토모나스속에 속하는 미생물인 방법.
제1항에 있어서, 적합한 배지중에서 글루코오스로부터 D-크실룰로오스를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양시켜 D-크실룰로오스를 생산하는 단계 및 크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물을 상기 배지중에서 생산된 D-크실룰로오스와 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 글루코오스로부터 D-크실룰로오스를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 글루코노박터, 아세토박터 또는 프라튜리아속에 속하는 미생물인 방법.
크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물과 D-아라비톨을 D-크실룰로오스로 전환시키는 능력을 갖는 미생물을 D-아라비톨을 함유하는 배지중에서 배양하여 크실리톨을 생산하는 단계 및 생산된 크실리톨을 수집하는 단계를 포함하여 크실리톨을 생산하는 방법.
크실리톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 환원력 제공 능력을 갖는 미생물 및 글루코오스로부터 D-크실룰로오스를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 적합한 배지중에서 배양하여 크실리톨을 생산하는 단계 및 생산된 크실리톨을 수집하는 단계를 포함하여 크실리톨을 생산하는 방법.