CN102304534A - 一种木糖醇脱氢酶编码基因及其重组蛋白和含有该基因的大肠杆菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种新的木糖醇脱氢酶的编码基因及其重组蛋白和含有该基因的大肠杆菌及其用途。其中，木糖醇脱氢酶的编码基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。由该基因所编码的重组蛋白为木糖醇脱氢酶，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明的大肠杆菌是在大肠杆菌BL21（DE3）中含有所述木糖醇脱氢酶的编码基因（798bp）。本发明的大肠杆菌经过诱导后能将D-木酮糖转化为D-木糖醇。本发明从含有该编码基因的大肠杆菌中获得重组蛋白，该重组蛋白能将催化D-木酮糖转化为D-木糖醇。
Description
技术领域
本发明涉及用于将D-木酮糖转化成D-木糖醇的木糖醇脱氢酶。
背景技术
D-木糖醇为天然的五碳糖醇，白色晶体，其甜度与蔗糖相当，热量为蔗糖的60％，是甜味剂的首选。D-木糖醇能有效抑制口腔细菌生长和酸的产生，具有防龋齿和巩固牙齿的功能，其次，D-木糖醇在人体内的代谢为胰岛素非依赖型且代谢到葡萄糖的速度较慢，是糖尿病患者可食用的甜味剂。此外，有研究表明，D-木糖醇可起到护肝保肝和治疗肺部感染的作用。
目前，木糖化学催化氢化法是工业生产D-木糖醇的主要方法。其中木糖来源于玉米芯、甘蔗渣、稻草等植物纤维原料中的木聚糖的水解产物。水解液中的木糖需经过中和、脱色、离子交换、浓缩、结晶等复杂的净化过程方可用于后续的催化加氢生成D-木糖醇(Suzuki et al.Biosci.Biotechnol Biochem，66(12)：2614-2620，2002)。
1969年，Onishi和Suzuki报道了以葡萄糖为底物(Onishi andSuzuki，APPLIED MICROBIOLOGY，18(6)：1031-1035，1969)，通过三步法转化生产D-木糖醇，即葡萄糖在耐高渗酵母的作用下转化为D-阿拉伯醇，然后在Acetobacter.Suboxydans的氧化作用下，生成D-木酮糖，最后在Candida.guilliermondii作用下，转化为D-木糖醇。该工艺不需要中间产物的分离与纯化等复杂工艺，证明了以淀粉或葡萄糖为原料生产D-木糖醇的绿色路线的可能性；但由于过程长、收率低，此方法并未用于D-木糖醇的工业生产。近来，能高效转化葡萄糖为D-阿拉伯醇(D-木糖醇的同分异构体)的酵母菌相继报道，且Suzuki等报道了选育到将D-阿拉伯糖醇通过生物发酵法转化为D-木糖醇的细菌(Suzuki et al.Biosci.Biotechnol Biochem，66(12)：2614-2620，2002)，通过两步法以葡萄糖为原料生产D-木糖醇显现出可能性，即葡萄糖在耐高渗酵母的作用下转化为D-阿拉伯醇，然后D-阿拉伯醇在氧化葡糖杆菌的作用下转化为D-木糖醇。其中，氧化葡糖杆菌将D-阿拉伯醇转化成D-木糖醇的路径如下：
ArDH：D-阿拉伯醇脱氢酶
XDH：木糖醇脱氢酶
研究表明D-木酮糖转化为D-木糖醇是提高D-木糖醇产率的瓶颈。Suzuki和Sugiyama从氧化葡糖杆菌纯化得到木糖醇脱氢酶(Suzuki et al.Biosci.Biotechnol Biochem，67(3)：584-591，2003)，并在氧化葡糖杆菌中过表达木糖醇脱氢酶，但由于此木糖醇脱氢酶活力相对较低，改造后的氧化葡糖杆菌将D-木酮糖转化成D-木糖醇的能力仍然有限。在本发明的前期研究中，氧化葡糖杆菌在将D-阿拉伯醇转化成D-木糖醇时，D-阿拉伯醇可以较快较彻底的转化成D-木酮糖，而D-木酮糖到D-木糖醇的还原反应是整个转化过程的限速步骤，因此亟待找到更高活性的木糖醇脱氢酶以提高木酮糖到D-木糖醇的转化能力，从而提高木糖醇的产率。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的木糖醇脱氢酶的编码基因及其重组蛋白和含有该基因的大肠杆菌及其用途，该木糖醇脱氢酶及含有木糖醇脱氢酶的编码基因的大肠杆菌可以催化D-木酮糖还原成D-木糖醇。
为实现上述目的，本发明通过聚合酶链式反应(英文全称：Polymerase ChainReaction简称PCR)，从氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans CGMCC 1.637)中克隆到一个木糖醇脱氢酶的编码基因；利用基因工程的方法构建重组质粒后转入大肠杆菌表达系统中得到基因工程菌。
本发明实现其目的所采取的技术方案是：本发明的木糖醇脱氢酶的编码基因具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。
本发明的大肠杆菌含有木糖醇脱氢酶的编码基因，所述木糖醇脱氢酶的编码基因具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。
本发明的重组蛋白的宿主细胞为含有木糖醇脱氢酶的编码基因的大肠杆菌，所述木糖醇脱氢酶的编码基因具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列，所述的重组蛋白具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明作为宿主细胞的大肠杆菌的用途是在将D-木酮糖还原为D-木糖醇的反应中作为宿主细胞。该大肠杆菌经诱导后可将D-木酮糖还原为D-木糖醇。
本发明的重组蛋白的用途是在将D-木酮糖还原为D-木糖醇的反应中作为催化剂。
本发明的有益效果是：本发明所提供的新的木糖醇脱氢酶具有将D-木酮糖还原为D-木糖醇的催化活性。本发明通过基因工程的手段从氧化葡糖杆菌中获得一个新的木糖醇脱氢酶的编码基因，并成功构建工程菌，诱导表达后获得重组蛋白。该木糖醇脱氢酶的编码基因与已报道的木糖醇脱氢酶基因的相似性最高为77％，该木糖醇脱氢酶的氨基酸序列与已报道的木糖醇脱氢酶的氨基酸序列相似性最高为85％。本发明的新的木糖醇脱氢酶编码基因的发现，为生物转化法生产木糖醇提供了催化剂，对找到具有更高活性的木糖醇脱氢酶具有重要的意义。
附图说明
图1是氧化葡糖杆菌木糖醇脱氢酶的编码基因的PCR产物的电泳结果，其中，M：DNA Mark；1：对照；2：目的条带。
图2是氧化葡糖杆菌中的木糖醇脱氢酶的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳结果，其中，M：蛋白质Mark；1：大肠杆菌BL21(DE3)细胞裂解液；2：含表达载体pET-22b(+)的大肠杆菌BL21(DE3)细胞裂解液；3：含表达载体pET-22b(+)且经过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside简称IPTG)诱导的大肠杆菌BL21(DE3)细胞裂解液；4：含木糖醇脱氢酶编码基因的pET-22b(+)重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)的细胞裂解液；5：含木糖醇脱氢酶编码基因的pET-22b(+)重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，且该工程菌经IPTG诱导后的细胞裂解液。
具体实施方式
以下以具体实施例详细说明本发明。
实施例1：氧化葡糖杆菌的木糖醇脱氢酶的编码基因的克隆和测序
(1)氧化葡糖杆菌的木糖醇脱氢酶的编码基因片段的克隆
采用王端好等优化的氧化葡糖杆菌培养基，在30℃摇床以250rpm的转速培养氧化葡糖杆菌，24h后收集细胞，按照AxyPrep Bacterial Genomic DANMiniPrep Kit(AXYGEN)中所述的方法抽提氧化葡糖杆菌的基因组。根据DDBJ登录号AB091690的序列设计正向引物1和反向引物1(其中，正向引物1的序列如SEQ ID NO.6，反向引物1的序列如SEQ ID NO.7所示)，并以上述基因组为模板，进行PCR反应。PCR反应体系为50ul，其反应物组成如表1所示。
表1
| 成分 | 体积(ul) |
| H2O | 37 |
| 5*T4DNA聚合酶缓冲液 | 2 |
| MgCl2(25mmol/l) | 3 |
| 正向引物(10umol/ul) | 2 |
| 反向引物(10umol/ul) | 2 |
| dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各25mmol/l) | 1 |
| T4DNA聚合酶(5U/ul) | 1 |
| 模板 | 1 |
PCR反应条件如下：
取上述PCR产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳。回收PCR产物并与聚合酶链反应产物的克隆载体(聚合酶链反应产物的克隆载体，简称T载体)连接，转化进入大肠杆菌DH5α，挑取菌落进行测序验证。测序结果显示，该PCR产物的核苷酸序列与DDBJ登录号AB091690中的xylitol dehydrogenase的编码基因片段的相似性最高，为81％。该PCR产物为木糖醇脱氢酶的编码基因的片段，该木糖醇脱氢酶的编码基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
(2)氧化葡糖杆菌的木糖醇脱氢酶的编码基因的上游DNA片段的克隆
根据DDBJ登录号AB091690的序列和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列分别设计正向引物2和反向引物2(其中，正向引物2的序列如SEQ ID NO.8，反向引物2的序列如SEQ ID NO.9所示)，并以氧化葡糖杆菌的基因组为模板，进行PCR反应。其反应物组成如表1所示。
PCR反应条件如下：
取上述PCR产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳。回收PCR产物并与T载体连接，转化进大肠杆菌DH5α，挑取菌落进行测序验证。测序结果显示：用正向引物2和反向引物2克隆的PCR产物的核苷酸序列的第561位到第14位核苷酸片段与登录号AB091690报道的xylitol dehydrogenase编码基因的第13位核苷酸到第560位核苷酸的序列片段的相似性最高，为74.5％；此外，该PCR产物的第582-580位核苷酸有一个TAC，所得PCR产物的第593-591位核苷酸有一个TAC，所得PCR产物的第633-631位核苷酸有一个TAC(ATG的反向互补序列)。测序及分析结果显示，该PCR产物是含有木糖醇脱氢酶的编码基因的上游DNA片段，含木糖醇脱氢酶的编码基因的上游DNA片段的PCR产物的序列如SEQ IDNo.4所示。
(3)氧化葡糖杆菌的木糖醇脱氢酶编码基因的3’DNA片段的克隆
根据SEQ ID No.3所示的核苷酸序列和DDBJ登录号AB091690的序列分别设计正向引物3和正向引物3(其中，正向引物3的序列如SEQ ID NO.10，反向引物3的序列如SEQ ID NO.11所示)，并以氧化葡糖杆菌的基因组为模板，进行PCR反应。其反应物组成如表1所示。
PCR反应条件如下：
取上述PCR产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳。回收PCR产物并与T载体连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5α，挑取菌落进行测序验证。测序结果显示：用正向引物3和反向引物3克隆的PCR产物，其核苷酸序列的第1位核苷酸到第146位核苷酸与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的第4位核苷酸到第149位核苷酸片段完全匹配；并且所获克隆的PCR产物的核苷酸序列从第47位到第177位的核苷酸序列片段与登录号AB091690中报道的xylitol dehydrogenase编码基因的第659位核苷酸到第789位核苷酸的片段相似性为80.9％，其中xylitoldehydrogenase编码基因的第787位核苷酸到第789位核苷酸为其编码基因的终止密码子(TAG)，对应于正向引物3和反向引物3克隆所得的PCR产物的第175位到第177位核苷酸(TAG)。测序及分析结果显示，该PCR产物含有木糖醇脱氢酶的编码基因的3’端的核苷酸序列，含木糖醇脱氢酶编码基因的3’DNA片段的PCR产物序列如SEQ ID No.5所示。
(4)氧化葡糖杆菌木糖醇脱氢酶的编码基因的全基因序列的克隆
将上述所获的如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的序列进行拼接，若以SEQ ID No.5所示的核苷酸序列的第582-580位核苷酸TAC(ATG的反向互补序列)作为起始密码子，则可得到一个798个核苷酸的开放性阅读框，根据拼接所得序列设计正向引物4和反向引物4(其中，正向引物4的序列如SEQ ID NO.12所示，反向引物4的序列如SEQ ID NO.13所示)，以氧化葡糖杆菌的基因组为模板，进行PCR反应。PCR反应体系为50ul，其中反应物组成如表1所示，PCR反应条件如下所示：
取上述PCR产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳。电泳图如图1所示，其中，泳道2在750bp到1000bp之间有一条清晰的条带，而作为对照的泳道1无对应条带。回收该条带的PCR产物并与T载体连接，转化进入大肠杆菌DH5α，挑取菌落进行测序验证。测序结果如SEQ ID NO.1所示，其长度为798个核苷酸，与拼接所得核苷酸序列相符，即为本发明所述的木糖醇脱氢酶的编码基因的核苷酸序列，其中ATG为起始密码子，TGA为终止密码子。利用BioXM软件将SEQID NO.1所示的核苷酸序列转换成氨基酸序列得到如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列(即得到本发明的重组蛋白的序列)。将本发明的木糖醇脱氢酶的编码基因和氨基酸序列分别与在线数据库中已报道的序列进行比对，发现本发明的木糖醇脱氢酶的编码基因的核苷酸序列与已报道的木糖醇脱氢酶的基因序列的最高相似性为77％，而本发明的重组蛋白(即木糖醇脱氢酶)的氨基酸序列与现已报道的木糖醇脱氢酶的氨基酸序列的相似性最高只有85％，由此说明，本发明所获得的木糖醇脱氢酶的编码基因是一个新的基因。
实施例2.：构建含木糖醇脱氢酶基因的pET-22b(+)重组载体及含有该重组载体的工程菌
用含有限制性内切酶Nde I识别位点的正向引物4和含有限制性内切酶xhol识别位点的反向引物4，以氧化葡糖杆菌的基因组为模板进行PCR，回收PCR产物并与T载体连接，转化进入大肠杆菌DH5α，挑取菌落进行测序验证。将测序结果与木糖醇脱氢酶的编码基因(如SEQ ID NO.1所示)进行比对，结果显示：含有限制性内切酶Nde I和xhol酶切位点的木糖醇脱氢酶的编码基因成功插入T载体。然后用限制性内切酶Nde I和xhol分别对含有木糖醇脱氢酶的编码基因的T载体和pET-22b(+)表达载体进行双酶切，用T4DNA连接酶将酶切下来的木糖醇脱氢酶的编码基因与经酶切后的pET-22b(+)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取菌落进行测序。将测序结果与木糖醇脱氢酶基因进行比对，结果表明：序列100％配对，说明成功构建了含有木糖醇脱氢酶的编码基因的pET-22b(+)重组载体和含有pET-22b(+)重组载体的工程菌。含有木糖醇脱氢酶的编码基因的pET-22b(+)重组载体的工程菌经过0.2mmol/lIPTG诱导、SDS-PAGE，电泳结果如图2所示。其中，SDS的全称为十二烷基硫酸钠，PAGE的全称为聚丙烯酰氨凝胶电泳(Polyacrylamide gelelectrophoresis)。在图2的第5泳道(工程菌经IPTG诱导后的细胞裂解液样品)的20-31KDa之间有一条清晰的条带，该条带显示蛋白大小与根据该木糖醇脱氢酶的氨基酸序列计算所得的大小相符，而其余泳道无对应蛋白条带，说明经IPTG诱导后，木糖醇脱氢酶的编码基因所编码的重组蛋白能高效表达。实施例3：含有木糖醇脱氢酶的编码基因的pET-22b(+)重组载体的大肠杆菌催化D-木酮糖形成D-木糖醇的鉴定
将含有木糖醇脱氢酶编码基因的大肠杆菌BL21(DE3)接入200ml含有浓度为50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基(LB培养基成分5g/l yeast extract，10g/lNaCl，10g/l tryptone，pH7.0)中，在37℃、转速为250rpm的条件下培养2-3小时直到OD600值达到0.5，加入0.2mmol/l的IPTG诱导，30℃、转速为250rpm的条件下继续培养6小时；后以转速为5000rpm的条件下离心15mins，用0.9％的氯化钠溶液洗涤沉淀两次，再以5000rpm的转速离心15mins，用10ml浓度为11.4g/l的D-木酮糖溶液(pH＝5.7)重新悬浮细胞后置于30℃、转速为200rpm的条件下转化15h。将所得到的转化溶液在转速为12000rpm的条件下离心20mins，取上清液，并用高效液相色谱-蒸发光散射检测连用法(英文全称为HighPerformance Liquid Chromatography-Evaporative Light ScatteringDetector，简称HPLC-ELSD)定量检测溶液成分。其中，HPLC-ELSD分析条件为：Shodex SC1011色谱柱(Showa Denko，Japan)，柱温80℃，流动相为纯水，流速1ml/min，ELSD漂移管温度为120℃，以氮气做载气，氮气的流速为3L/min。HPLC-ELSD的检测结果表明，溶液中含有4g/L D-木糖醇，转化率为40.48％；而原始大肠杆菌BL21(DE3)或未经IPTG诱导的工程菌在与上述相同的反应体系和反应条件下不能将D-木酮糖转化生成D-木糖醇；作为宿主细胞的大肠杆菌可以催化D-木酮糖形成D-木糖醇。
实施例4：重组蛋白(木糖醇脱氢酶)催化D-木酮糖形成D-木糖醇的鉴定
将含有木糖醇脱氢酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)接入200ml含有氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、转速为250rpm的条件下培养2-3h至OD值达到0.5-1.0后，加入0.02mmol/l的IPTG诱导6小时；在转速为5000rpm的条件下离心15mins，用50mmol/l Tris-HCl(pH8.0)缓冲液洗涤沉淀两次，再在5000rpm的条件下离心15mins，用20ml的浓度为50mmol/l的Tris-HCl(pH8.2)缓冲液重悬细胞，在冰浴条件下超声破碎细胞20mins(3s/5s)，破胞液在转速为12000rpm的条件下离心20mins，上清过Ni柱，流速约1ml/min；之后用约5-10个柱体积的洗杂缓冲液(该洗杂缓冲液含有20mmol/l咪唑、50mmol/lTris-HCl和0.3mol/l NaCl，且pH8.2)洗去杂蛋白，用洗脱缓冲液(该洗脱缓冲液含有200mmol/l咪唑、50mmol/l Tris-HCl和0.3mol/l NaCl，且pH8.2)洗脱目的蛋白(即木糖醇脱氢酶)，分管收集，用分光光度计波长为280nm条件下，测定各管的蛋白浓度，将蛋白浓淡高的液体合并到一起，用浓度为50mmol/l的Tris-HCl(pH8.3)在4℃条件下透析24h后，加入与透析后的酶溶液等体积的甘油，保存甘油酶液于-20℃，并用该甘油酶液进行转化实验。其中，转化体系为：浓度为50mmol/l的Tris-HCl(pH5.5)，浓度为30mmol/l的NADH(还原型辅酶I)，浓度为30mmol/l的D-xylulose，重组蛋白(即木糖醇脱氢酶)的浓度为0.4mg/l。于30℃条件下转化2h。用HPLC-ELSD定量转化液中的溶液成分，其中，HPLC-ELSD分析条件为：Shodex SC1011色谱柱(Showa Denko，Japan)，柱温80℃，流动相为纯水，流速1ml/min，ELSD漂移管温度为120℃，以氮气做载气，氮气的流速为3L/min。HPLC-ELSD检测到溶液中含有浓度为18.39mmol/l的D-木糖醇。由此进一步说明了本发明的木糖醇脱氢酶的编码基因所编码的重组蛋白，能够催化D-木酮糖形成D-木糖醇。
<110> 杭州宝晶生物化工有限公司
<120> 一种木糖醇脱氢酶编码基因及其重组蛋白和含有该基因的大肠杆菌及其用途
<130> 1
<160> 13
<170> PatentIn version 3.1
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Gly Ala Gly Gly Asn Ile Gly Leu Ala Thr Ala Leu Arg Leu Ala Glu
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Met Gly Thr Asp Ile Ala Leu Leu Asp Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr
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Lys Ala Glu Ala Ala Val Arg Glu Lys Gly Val Lys Ala Glu Ser Tyr
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100 105 110
Pro Lys Val Leu Asn Ile Asn Val Thr Gly Ala Phe His Val Leu Lys
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cggcgctttc gcctttcaca tacatatcgg catacggtct gattgtctgc cccttctttg 660
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atatcgagca gaaaaaacaa ccaactcccc cctagacact tgacccctgc gttcaattcc 780
gcccaagccg tgccttcctg aatgctgcag cccatccgtc atggcgcctg cagccctttt 840
cacactcatc cctgcgagtc cctgagtgcg caatcacgcg attcctgttc actcgagtcg 900
tcacaaggag gcagtctact caaa 924
<210> 5
<211> 485
<212> DNA
<213> 氧化葡糖杆菌
<400> 5
aaggccaaca cgcagtattt ctcaaccaac ccggaagaag tctccaagca gatgatcggc 60
agtgttccga tgcgtcgtta tggagatatc aatgaaattc cgggcgtcgt agcctttctt 120
ctcggagacg attccagctt catgacaggt gtgaatctgg aaatctctgg aggctgaaga 180
gcccgttctt cgtcggacga tcaaaccgtc cggcgaagca cgtctgccat gccgtacaaa 240
cccggtggct gctgtgcgag ccaccgggct gccatgacgg cacctctggc aaagaccctg 300
cgatcgagtg cacgatgtga cagcgtgatc tgctcgtccg cagccatgaa catcagatcg 360
tgttctccca cgatctggcc gccccgcagg gaagcaaagc caatcgctcc atccggtcgg 420
gcgccattct gatcgagacg catgacgttc tcgagagcca cgtttcgtcc ttccgccaca 480
gcccg 485
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttcatgtggg agcgtcaggt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cccgtcatga agctggaatc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccagaacggt atcggaaatg 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttccgggttg gttgagaaat actg 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gccaaggcca acacgcagta t 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgggctgtgg cggaaggac 19
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
catatggcat acgtggtaag ttc 23
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtcgactcag cctccagaga tttcc 25
Claims (5)
1.一种木糖醇脱氢酶的编码基因，其特征在于：具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列。
2.一种大肠杆菌，其特征在于：该大肠杆菌含有木糖醇脱氢酶的编码基因，所述木糖醇脱氢酶的编码基因具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列。
3.一种重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的宿主细胞为含有木糖醇脱氢酶编码基因的大肠杆菌，所述木糖醇脱氢酶编码基因具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，所述重组蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
4.一种权利要求2的大肠杆菌的用途，其特征在于：它在将D-木酮糖还原为D-木糖醇的反应中作为宿主细胞。
5.一种权利要求3的重组蛋白的用途，其特征在于：它在将D-木酮糖还原为D-木糖醇的反应中作为催化剂。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN2011102501415A CN102304534B (zh) | 2011-08-29 | 2011-08-29 | 一种木糖醇脱氢酶编码基因及其重组蛋白和含有该基因的大肠杆菌及其用途 |
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|---|---|---|---|---|
| CN112603881A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-04-06 | 黄景添 | 一种高渗透性保湿精华液及其制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1263944A (zh) * | 1998-07-08 | 2000-08-23 | 味之素株式会社 | 用于产生木糖醇或d-木酮糖的新微生物和方法 |
| CN1269421A (zh) * | 1999-01-20 | 2000-10-11 | 味之素株式会社 | 生产木糖醇或d－木酮糖的方法 |
| CN1271017A (zh) * | 1999-02-09 | 2000-10-25 | 味之素株式会社 | 用于生产木糖醇的方法 |
| CN102046776A (zh) * | 2008-05-30 | 2011-05-04 | 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司 | 木糖还原酶的改造和木糖醇脱氢酶与木酮糖激酶的过表达促进耐热酵母菌多形汉逊酵母中的木糖乙醇发酵 |
-
2011
- 2011-08-29 CN CN2011102501415A patent/CN102304534B/zh active Active
Patent Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN1263944A (zh) * | 1998-07-08 | 2000-08-23 | 味之素株式会社 | 用于产生木糖醇或d-木酮糖的新微生物和方法 |
| CN1269421A (zh) * | 1999-01-20 | 2000-10-11 | 味之素株式会社 | 生产木糖醇或d－木酮糖的方法 |
| CN1271017A (zh) * | 1999-02-09 | 2000-10-25 | 味之素株式会社 | 用于生产木糖醇的方法 |
| CN102046776A (zh) * | 2008-05-30 | 2011-05-04 | 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司 | 木糖还原酶的改造和木糖醇脱氢酶与木酮糖激酶的过表达促进耐热酵母菌多形汉逊酵母中的木糖乙醇发酵 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112603881A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-04-06 | 黄景添 | 一种高渗透性保湿精华液及其制备方法 |
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