CN1269421A - 生产木糖醇或d－木酮糖的方法 - Google Patents

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Abstract

通过在合适的培养基中培养属于葡糖杆菌,醋杆菌或弗拉特氏菌属的并且具有生产木糖醇或D－木酮糖能力的微生物,在培养基中积累木酮糖或D－木糖醇,并且从培养基中收集木酮糖或D－木糖醇的直接发酵方法,从葡萄糖生产木酮糖或D－木糖醇。

Description

生产木糖醇或D-木酮糖的方法
本发明涉及具有产生木糖醇或D-木酮糖的能力的新的微生物，和通过利用具有产生木糖醇或D-木酮糖的能力的微生物生产木糖醇或D-木酮糖的方法。D-木酮糖可用作生产木糖醇的材料，木糖醇可用作食品工业等领域的甜味剂。
预期对作为天然存在的糖醇的木糖醇的需求在将来会增加。木糖醇是有前途的低能量的甜味剂，因为它具有低的热量并且显示具有与蔗糖相当的甜度。另外，由于其具有抗踽齿特性，将它用作为防踽齿的甜味剂。此外，由于木糖醇不提高血液葡萄糖水平，可将它用作为糖尿病治疗中的流体治疗方法(fluidtherapy)。为了这些原因，预期对木糖醇的需求在将来将会提高。
目前木糖醇的工业化生产主要依赖于D-木糖的氢化，如在美国专利4,008,825中公开的。通过植物材料如树，稻草，玉米棒子，燕麦和其它富含木糖的材料的水解可以获得用作为原料的D-木糖。
然而，通过植物材料水解生产的D-木糖具有缺点：相当昂贵，并具有高生产成本。例如，植物材料的水解处理的低产量引起所产生的D-木糖的低纯度。因此必需通过在水解之后进行离子交换处理除去用于水解的酸和染料。进一步将获得的D-木糖结晶以去除其它半纤维素的多糖。为了获得适用于食用的D-木糖，需要进一步的纯化。这样的离子交换处理和结晶处理导致生产成本的增加。
因此，已经研制了可用于生产木糖醇的几种方法，该方法利用了易于获得的原料并且产生的废料很少。例如已经研制了利用其它戊糖醇作为起始物质生产木糖醇的方法。这样的易于获得的戊糖醇之一是D-阿拉伯糖醇，并且通过利用酵母可以生产D-阿拉伯糖醇(加拿大微生物学杂志，31，1985，457-471；微生物遗传杂志，139，1993，1047-54)。如通过利用D-阿拉伯糖醇作为粗原料生产木糖醇的方法，可以提到的有在应用微生物学，18，1969，1031-1035中报道的方法，该方法包括通过利用汉逊氏德巴利氏酵母ATCC20121发酵从葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇，然后利用弱氧化醋杆菌将D-阿拉伯糖醇转变为D-木酮糖，和通过季也蒙氏假丝酵母大豆变种的作用将D-木酮糖转变为木糖醇。
BP403392和EP421682公开了通过利用对渗透压有抗性的酵母进行发酵生产D-阿拉伯醇，然后利用属于醋杆菌属，葡糖杆菌属或克雷伯氏菌的细菌将D-阿拉伯醇转变为D-木酮糖，通过葡萄糖(木糖)异构酶的作用从D-木酮糖形成木糖和D-木酮糖的混合物，通过氢化作用将获得的木糖和D-木酮糖的混合物转变为木糖醇。生产木糖醇的方法也公开了，包括初步浓缩木糖和D-木酮糖混合物中的木糖并且通过氢化将木糖转变为木糖醇。
但是，上面介绍的生产木糖醇的方法利用了通过发酵生产的D-阿拉伯醇作为起始物质，并且通过多个步骤将它转变。因此，与基于提取的方法相比经济实用考虑该过程是复杂的，不能令人满意的过程。
因此，需要一种能够通过从葡萄糖起始发酵的单个步骤生产木糖醇或D-木酮糖的微生物，如用于其它糖和糖醇中生产。但是，至今还没有具有生产木糖醇或D-木酮糖的能力的细菌的报道。
另一方面，利用基因操作技术已经对发酵木糖醇的细菌的繁育进行了尝试。国际公开WO 94/10325公开了通过利用将来源于属于克雷伯氏菌属的细菌的阿拉伯糖醇脱氢酶的基因和来源于属于毕赤属的细菌的木糖醇脱氢酶基因导入到发酵阿拉伯糖醇的微生物(属于假丝酵母属，球拟酵母属，或属于接合糖酵母属的酵母)获得的重组微生物发酵从葡萄糖生产木糖醇的方法。但是已经有人报道了利用上面提到的重组微生物从400克/升葡萄糖生产15克/升的木糖醇，但是它没有达到实际上有用的积累水平。此外将来源于不同种的基因导入到上面提到的重组微生物，因此对其安全性的信息不是充分的。
根据上面提到的现有技术的状态完成了本发明。本发明的目的之一是通过利用具有通过发酵从葡萄糖生产木糖醇或D-木酮糖的能力的微生物提供生产木糖醇或D-木酮糖的方法。
为了达到上面提到的目的，本发明的发明人寻找了具有通过发酵从葡萄糖生产木糖醇或D-木酮糖的能力的微生物。对于通过发酵微生物(如酵母)直接生产糖醇，除了上面提到的阿拉伯糖醇发酵，也已经报道了通过利用产酸接合糖酵母生产甘油(Arch.Biochem.，7，257-271(1945))，通过利用属于Trychosporonoides属的酵母生产赤藓醇(Trychosporonoides sp.，生物技术通信，15，240-246(1964))等等。所有这些具有生产糖醇的能力的酵母显示嗜高渗性(osmophilicity)，即在高渗透性压力的培养基中良好生长。因此，尽管在嗜高渗性酵母中没有发现具有生产木糖醇能力的微生物，本发明的发明人仍考虑在嗜高渗性微生物中应该存在具有生产木糖醇能力的新的微生物，并且广泛筛选了高渗性微生物。结果，本发明人发现在嗜高渗性微生物中具有从葡萄糖产生木糖醇和D-木酮糖的能力的微生物，并且这些微生物与已知的醋酸细菌类似(日本专利申请10-193472)。
基于上述发现，本发明的发明人进一步在醋酸细菌和类似的细菌中寻找具有生产木糖醇或D-木酮糖能力的微生物。结果发现了属于葡糖杆菌，醋杆菌或弗拉特氏菌的并且具有从葡萄糖生产木糖醇或D-木酮糖能力的微生物。由此完成了本发明。
也就是说，本发明提供了生产木糖醇或D-木酮糖的方法，该方法包括在合适的培养基中培养属于葡糖杆菌，醋杆菌或弗拉特氏菌属并且具有从葡萄糖生产木糖醇或D-木酮糖能力的微生物，并且从培养基收集木糖醇或D-木酮糖。
根据本发明在上面提到的生产木糖醇或D-木酮糖的优选的实施方案中，属于葡糖杆菌的微生物选自于蜡状葡糖杆菌或氧化葡糖杆菌，属于醋杆菌属的微生物选自于醋化醋杆菌、液化醋杆菌或巴氏醋杆菌，属于弗拉特氏菌属的微生物是金黄弗拉特氏菌。
根据本发明，可以有效地从便宜的粗原料例如葡萄糖有效地生产木糖醇或D-木酮糖。
下文中，对本发明作进一步的详细的解释。
用于本发明的微生物是属于葡糖杆菌、醋杆菌或弗拉特氏菌属并且具有从葡萄糖产生木糖醇或D-木酮糖的能力的微生物。
对于上面提到的微生物，特别值得提到的有蜡状葡糖杆菌、氧化葡糖杆菌、醋化醋杆菌、液化醋杆菌、巴氏醋杆菌、金黄弗拉特氏菌等等。
对于用于本发明的特异性微生物菌株，可以列出下面的菌株：
蜡状葡糖杆菌IFO3262
氧化葡糖杆菌ATCC8147
氧化葡糖杆菌IFO3293
氧化葡糖杆菌LAM1839
氧化葡糖杆菌IFO3250
氧化葡糖杆菌IFO3292
氧化葡糖杆菌IFO3294
氧化葡糖杆菌氧化亚种IFO3189
氧化葡糖杆菌亚氧化亚种IFO3172
氧化葡糖杆菌亚氧化亚种IFO3130
木醋杆菌ATCC14851
液化醋杆菌TACC14835
巴氏醋杆菌IFO3222
巴氏醋杆菌IFO3223
金黄弗拉特氏菌IFO3245
氧化葡糖杆菌ATCC8147，木醋杆菌ATCC 14851和液化醋杆菌ATCC14835可以从美国典型培养物保藏中心(12301Parklawn Drive，Rockville，马里兰20852，美国)获得。
蜡状葡糖杆菌IFO3262，氧化葡糖杆菌IFO3293，氧化葡糖杆菌IFO3250，氧化葡糖杆菌IFO3292，氧化葡糖杆菌IFO3294，氧化葡糖杆菌氧化亚种IFO3189，氧化葡糖杆菌亚氧化亚种IFO3172，氧化葡糖杆菌亚氧化亚种IFO3130，巴氏醋杆菌IFO3222，巴氏醋杆菌IFO3223和金黄弗拉特氏菌IFO3245可以从大阪发酵研究所(日本，大阪532，Yodogawa-ku，17-85，Juso-honmachi 2-chome)获得。
氧化葡糖杆菌IAM1839可以从东京大学分子和细胞生物学研究院(前身为应用微生物学研究院)(日本，东京，Bumkyo-ku，Yayoi 1-chome)获得。
通过在合适的培养基中培养具有从培养液产生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物(如上文提到的那些)以在培养基中积累木糖醇或D-木酮糖，或者两者，从培养基中收集木糖醇和/或D-木酮糖而生产木糖醇和/或D-木酮糖。
由本发明方法产生的目的产物可以是木糖醇或D-木酮糖，或者是两者。
可以适当地测试上面提到的任何微生物的生产D-木酮糖的能力。对于木糖醇的生产，虽然可以适当地使用上面提到的任何微生物，属于葡糖杆菌或醋杆菌属的微生物是优选的。特别地，对于生产木糖醇而言，蜡状葡糖杆菌、氧化葡糖杆菌、醋化醋杆菌、液化醋杆菌和巴氏醋杆菌是优选的。至于特定的菌株，下面的菌株对于生产木糖醇是优选的。
蜡状葡糖杆菌IFO3262
氧化葡糖杆菌ATCC8147
氧化葡糖杆菌IFO3292
氧化葡糖杆菌亚氧化亚种IFO3130
木醋杆菌ATCC14851
液化醋杆菌ATCC14835
巴氏醋杆菌IFO3222
巴氏醋杆菌IFO3223
对于本发明，可以使用具有从葡萄糖生产木糖醇或D-木酮糖的能力的属于葡糖杆菌、醋杆菌或弗拉特氏菌的微生物菌株获得的变异体或突变体。这样的突变体菌株包括通过UV照射，N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理，乙基甲烷硫酸盐(EMS)处理，硝酸处理，吖啶处理等而获得的那些，以及通过遗传工程技术例如细胞融合和遗传重组等等获得的遗传重组菌株。
用于培养上面提到的微生物的培养基可以是含有常规的碳源，氮源，无机离子，以及(如果需要的话)有机营养的常规培养基。
碳源可以使用碳水化合物(例如葡萄糖)，醇(例如甘油)，有机酸等等。考虑在已知的用于生产木糖醇的方法(例如用于从戊糖醇例如D-木糖和D-阿拉伯糖醇生产木糖醇的方法)中观察到的特性，主要的碳源优选地选自于己糖例如葡萄糖和果糖，二糖例如蔗糖和乳糖，或多糖例如淀粉。这些主要的碳源物质可以10-60％的量，优选的20-50％的量用于培养基。可将这些碳源一次或分批加入到培养基中。
氮源可以使用氨气，氨水，铵盐等等。对于无机离子，如果需要可以加入镁离子，磷酸离子，钾离子，铁离子，锰离子等等。对于有机营养，可以适当地使用维生素，氨基酸和含有它们的物质例如肝脏提取物，酵母提取物，麦芽提取物，胨，肉提取物，玉米提取液，酪蛋白分解产物等等。
对培养条件也没有特别的限定。但是通常可以将微生物在pH 5-8和25-40℃的温度范围内进行培养。通过搅拌或振荡使培养在有氧条件下完成。对于培养时间，将微生物适当地培养直到消耗掉主要的碳源，即通常3-8天。
以常规方法将如上所述的培养基中产生的木糖醇和/或D-木酮糖分离并且从培养物中收集。特别地，在通过离心、过滤等从培养物去除固体物质之后，将残留的溶液通过使用活性炭、离子交换树脂等脱色并脱盐，并且从该溶液中将木糖醇和/或D-木酮糖结晶。从培养物中分离和收集木糖醇和/或木酮糖的方法比从植物材料水解物中分离和收集的方法更容易，因为杂质含量较低。
可用已知的方法通过氢化将产生的D-木酮糖转化为木糖醇。
参照下面的实施例更具体地解释本发明。但是本发明不限于这些实施例。在实施例中，在下面的条件下利用高效液相层析(HPLC)分析所产生木糖醇和D-木酮糖。
层析柱：Shodex SC1011(Showa Denko的产品)
流动相：20％乙腈/80％钙-EDTA的50ppm水溶液
流速：1.0毫升/分钟
温度：75℃
检测：RI检测器
将含有0.2％硫酸铵，0.1％的磷酸二氢钾，0.3％的磷酸氢二钾，0.5％硫酸镁和0.5％的酵母提取物(pH6.0)的培养基以每个管4毫升的量加入到测试管，并且加热到120℃，加热20分钟灭菌。将单独灭菌的D-葡萄糖以5％的浓度加入到该培养基。上面所述的浓度(％)以w/v％表示。
将表1提到的各个菌株接种到上面所述的培养基，并且在30℃振荡培养1天。获得的培养基用作为种子培养基。以每个培养瓶50毫升的量将具有相同于上面提到的组成的培养基(不同的是D-葡萄糖)加入到500毫升的Sakaquchi培养瓶，并且通过加热到120℃，加热20分钟灭菌。分别以浓度为5％和4％将单独灭菌的葡萄糖和碳酸钙加入到培养基。以2％的浓度将该种子培养基接种到该培养基，并且在30℃振荡培养4天。然后，在通过离心去除细菌细胞之后，通过HPLC定量分析培养基产生的木酮糖和D-木糖醇。结果显示于表1。
                          表1
    菌株 所产生的木酮糖(克/升) 所产生的D-木糖醇(克/升)
    蜡状葡糖杆菌IFO3262     0.3     1.11
    氧化葡糖杆菌ATCC8147     0.4     0.4
    氧化葡糖杆菌IFO3293     ND     1.0
    氧化葡糖杆菌IAM1839     ND     0.5
    氧化葡糖杆菌IFO3250     ND     0.5
    氧化葡糖杆菌IFO3292     0.3     1.0
    氧化葡糖杆菌IFO3294     ND     1.0
    氧化葡糖杆菌氧化亚种IFO3189     ND     1.0
    氧化葡糖杆菌亚氧化亚种IFO3172     ND     0.5
    氧化葡糖杆菌亚氧化亚种IFO3130     0.4     1.2
    木醋杆菌ATCC 14851     0.5     1.6
    液化醋杆菌ATCC14835     0.5     1.1
    巴氏醋杆菌IFO3222     0.4     1.0
    巴氏醋杆菌IFO3223     0.3     2.3
    金黄弗拉特氏菌IFO3245     ND     0.8
*：ND是指“没有测定”。

Claims (2)

1.用于生产木糖醇或D-木酮糖的方法，该方法包括在合适的培养基中培养属于葡糖杆菌、醋杆菌或弗拉特氏菌属的并且具有从葡萄糖生产木糖醇或D-木酮糖能力的微生物以在培养基中积累木糖醇或D-木酮糖，并且从培养基中收集木糖醇或D-木酮糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中属于葡糖杆菌属的微生物选自蜡状葡糖杆菌或氧化葡糖杆菌，属于醋杆菌属的微生物选自醋化醋杆菌、液化醋杆菌或巴氏醋杆菌，属于弗拉特氏菌属的微生物是金黄弗拉特氏菌。
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