KR20000053547A - 크실리톨 또는 ｄ-크실룰로스의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속 또는 프라테우리아(Frateuria) 속에 속하고 크실리톨 또는 D-크실룰로스 생산능을 갖는 미생물을 적합한 배지에서 배양하여 배지내에 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 축적시키고, 상기 배지로부터 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 수집함으로써 글루코스로부터 직접 배양을 통해 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 제조한다.

Description

크실리톨 또는 Ｄ-크실룰로스의 제조 방법{Method for producing xylitol or D-xylulose}
본 발명은 크실리톨 또는 D-크실룰로스 생산능을 갖는 신규한 미생물, 및 크실리톨 또는 D-크실룰로스 생산능을 갖는 미생물을 사용함으로써 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 제조하는 방법에 관한 것이다. D-크실룰로스는 크실리톨 제조용 원료로서 유용하고, 크실리톨은 식품 산업 분야 등에서 감미제로서 유용하다.
천연에 존재하는 당 알콜인 크실리톨의 수요가 차후 증가할 것으로 예상된다. 크실리톨은 수크로스와 비교하여 칼로리가 낮으며 이에 필적하는 감미도를 나타내기 때문에 이는 유망한 저칼로리 감미제이다. 또한, 이의 항충치 특성으로 인해, 이는 충치 예방 감미제로서 사용된다. 게다가, 크실리톨은 혈당치를 상승시키지 않기 때문에, 이는 당뇨병 치료에서 수액(fluid) 요법에 이용된다. 이러한 이유로, 크실리톨의 수요가 차후 증가할 것으로 예상된다.
크실리톨의 현행 산업적 제조는 주로 미국 특허 제4,008,825호에 기술되어 있는 바와 같은 D-크실로스의 수소첨가에 의존하고 있다. 원료로서 사용된 D-크실로스는 수목, 밀짚, 옥수수속, 귀리 껍질 및 이외의 크실란이 풍부한 재료와 같은 식물 재료의 가수분해에 의해 수득한다.
그러나, 식물 재료의 가수분해에 의해 제조된 이러한 D-크실로스는 상당히 고가라는 단점이 있고, 이는 생산 비용이 높다는데서 기인한다. 예를 들어, 식물 재료의 가수분해 처리의 저수율은 생성된 D-크실로스의 저순도를 유발한다. 따라서, 가수분해에 사용된 산, 및 염료는 가수분해 처리 후 이온 교환 처리에 의해 제거하여야 하고, 생성된 D-크실로스는 추가로 결정화시켜 이외의 헤미셀룰로스 다당류를 제거하여야 한다. 식료품에 적합한 D-크실로스를 수득하기 위해서는, 추가의 정제가 필요하다. 상기 이온 교환 처리 및 결정화 처리는 생산 비용의 증가를 초래한다.
따라서, 용이하게 입수가능한 원료를 사용하고 적은 폐기물을 발생시키는, 크실리톨을 제조하는 수가지 방법이 개발되어 있다. 예를 들어, 출발 원료로서 다른 펜티톨을 사용하는, 크실리톨의 제조 방법이 개발되어 있다. 이러한 용이하게 입수가능한 펜티톨 중 하나는 D-아라비톨이고, D-아라비톨은 효모를 사용하여 제조할 수 있다[참조: Can. J. Microbiol., 31, 1985, 467-471; J. Gen. Microbiol., 139, 1993, 1047-54]. D-아라비톨을 원료로서 사용함으로써 크실리톨을 제조하는 방법으로서는, 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii) ATCC20121을 사용하여 발효에 의해 글루코스로부터 D-아라비톨을 제조한 다음, 아세토박터 서브옥시단스(Acetobacter suboxydans)를 사용하여 D-아라비톨을 D-크실룰로스로 전환시키고, 칸디다 구일리에르몬디이 변종 소야(Candida guilliermondii var. soya)의 작용에 의해 D-크실룰로스를 크실리톨로 전환시킴을 포함하는, 문헌[참조: Applied Microbiology., 18, 1969, 1031-1035]에 보고된 방법을 언급할 수 있다.
EP 403 392A 및 EP 421 882A는 삼투-내성 효모를 사용하여 발효에 의해 D-아라비톨을 제조한 다음, 아세토박터 속, 글루코노박터 속 또는 클렙시엘라(Klebsiella) 속에 속하는 세균을 사용하여 D-아라비톨을 D-크실룰로스로 전환시키고, D-크실룰로스로부터 글루코스(크실로스) 이소머라제의 작용에 의해 크실로스 및 D-크실룰로스의 혼합물을 형성시키고, 수득된 크실로스 및 D-크실룰로스의 혼합물을 수소첨가에 의해 크실리톨로 전환시킴을 포함하는 방법을 기술하고 있다. 또한, 크실로스를 크실로스 및 D-크실룰로스의 혼합물내에서 예비 농축시킨 다음, 상기 크실로스를 수소첨가에 의해 크실리톨로 전환시킴을 포함하는, 크실리톨의 제조법이 기술되어 있다.
그러나, 상기 언급된 크실리톨의 제조 방법은 발효에 의해 제조된 D-아라비톨을 출발 원료로서 사용하고, 이를 다중 공정 단계에 의해 전환시킨다. 따라서, 상기 방법은 복잡하고, 추출을 기초로 한 방법과 비교하여 공정 경제성 관점에서 보다 덜 만족스럽다.
따라서, 이외의 다당류 및 당 알콜의 제조에 사용된 바와 같은, 글루코스로부터 출발하는 발효에 의해 단일 단계를 통해 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 요망되고 있다. 그러나, 이러한 크실리톨 또는 D-크실룰로스 생산능을 갖는 이러한 세균은 지금까지 보고된 바가 없다.
반면, 크실리톨 발효 세균의 육종은 유전자 조작 기술의 이용에 의해 시도되어 왔다. 국제 공개공보 WO94/10325에는 클렙스시엘라 속에 속하는 세균으로부터 유도된 아라비톨 데하이드로게나제 유전자 및 피치아(Pichia) 속에 속하는 세균으로부터 유도된 크실리톨 데하이드로게나제 유전자를 아라비톨 발효 미생물(칸디다 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속 또는 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 속에 속하는 효모)내로 삽입함으로써 수득된 재조합 미생물을 시용하여 발효에 의해 글루코스로부터 크실리톨을 제조하는 방법이 기술되어 있다. 그러나, 글루코스 400g/L로부터의 크실리톨 15g/L의 생산이 전술한 재조합 미생물에 대해 보고되어 있지만, 이는 실용적으로 유용한 축적 농도에 도달한 것은 아니다. 더욱이, 전술한 재조합 미생물에는 상이한 종으로부터 유도된 유전자가 삽입되어 있으므로, 이의 안전성에 대한 정보는 충분한 것으로 간주할 수 없다.
본 발명은 전술한 당해 분야의 상태를 고려하여 달성되었고, 본 발명의 목적은 크실리톨 또는 D-크실룰로스 생산능을 갖는 미생물을 사용하여 발효에 의해 글루코스로부터 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
전술한 목적을 성취하기 위해, 본 발명의 발명자들은 발효에 의해 글루코스로부터 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 조사하였다. 효모와 같은 미생물의 발효에 의한 당 알콜의 직접 제조에 대해서는, 또한 자이고사카로마이세스 아시디파시엔스(Zygosaccharomyces acidifaciens)를 사용하여 글리세롤을 제조하는 방법[참조: Arch. Biochem., 7, 257-271(1945)], 트리코스포로노이데스(Trychospronoides) 속에 속하는 효모를 사용하여 에리트리톨을 제조하는 방법[참조: Trychosporonoides sp., Biotechnology Letters, 15, 240-246(1964)] 등이 보고되어 있고, 또한 전술한 아라비톨 발효에 대해서도 보고되어 있다. 당 알콜 생산능을 갖는 상기 효모는 모두 고삼투압의 배양 배지에서 친삼투성, 즉 우수한 성장을 나타낸다. 따라서, 크실리톨 생산능을 갖는 미생물이 친삼투성 효모 가운데서 알려져 있지 않더라도, 본 발명의 발명자들은 크실리톨 생산능을 갖는 신규한 미생물이 친삼투성 미생물, 및 광범위하게 스크리닝된 친삼투성 미생물 가운데 존재하여야만 한다고 생각하였다. 결과로서, 본 발명자들은 글루코스로부터 크실리톨 및 D-크실룰로스를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 친삼투성 미생물 가운데서 이미 발견하였고, 이들 미생물은 공지된 아세트산 세균(일본 특허원 제10-193472호)과 유사하다.
상기 발견을 기초로 하여, 본 발명의 발명자들은 아세트산 세균 및 유사 세균 가운데서 크실리톨 또는 D-크실룰로스 생산능을 갖는 미생물을 추가로 조사하였다. 결과로서, 본 발명자들은 글루코노박터 속, 아세토박터 속 또는 프라테우리아 속에 속하고 글루코스로부터 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 발견하였다. 이와 같이, 본 발명자들은 본 발명을 달성하였다.
즉, 본 발명은 글루코노박터 속, 아세토박터 속 또는 프라테우리아 속에 속하고 글루코스로부터 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 적합한 배지에서 배양하여 배지내에 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 축적시키고, 상기 배지로부터 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 수집함을 포함하는, 크실리톨 또는 D-크실룰로스의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 제조하는 전술한 방법의 바람직한 양태에서, 글루코노박터 속에 속하는 미생물은 글루코노박터 세리누스(Gluconobacter cerinus) 또는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans)로부터 선택되고, 아세토박터 속에 속하는 미생물은 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 아세토박터 리쿠에파시엔스(Acetobacter liquefaciens) 또는 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus)로부터 선택되고, 프라테우리아 속에 속하는 미생물은 프라테우리아 아우란티아(Frateuria aurantia)이다.
본 발명에 따라, 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 글루코스와 같은 값싼 원료로부터 효율적으로 제조할 수 있다.
이후, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 사용되는 미생물은 글루코노박터 속, 아세토박터 속 또는 프라테우리아 속에 속하고 글루코스로부터 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 생산하는 능력을 갖는 미생물이다.
전술한 미생물로서는, 글루코노박터 세리누스, 글루코노박터 옥시단스, 아세토박터 아세티, 아세토박터 리쿠에파시엔스, 아세토박터 파스테우리아누스, 프라테우리아 아우란티아 등을 구체적으로 언급할 수 있다.
본 발명에 사용되는 미생물의 특정 균주로서는, 하기 균주를 들 수 있다:
글루코노박터 세리누스 IFO3262
글루코노박터 옥시단스 ATCC8147
글루코노박터 옥시단스 IFO3293
글루코노박터 옥시단스 IAM1839
글루코노박터 옥시단스 IFO3250
글루코노박터 옥시단스 IFO3292
글루코노박터 옥시단스 IFO3294
글루코노박터 옥시단스 아종 옥시단스 IFO3189
글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3172
글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3130
아세토박터 아세티 아종 크실리눔(xylinum) ATCC14851
아세토박터 리쿠에파시엔스 ATCC14835
아세토박터 파스테우리아누스 IFO3222
아세토박터 파스테우리아누스 IFO3223
프라테우리아 아우란티아 IFO3245.
글루코노박터 옥시단스 ATCC8147, 아세토박터 아세티 아종 크실리눔 ATCC14851 및 아세토박터 리쿠에파시엔스 ATCC14835는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 미국 메릴랜드주 20852 록크빌 파크론 드라이브 12301 소재)으로부터 입수가능하다.
글루코노박터 세리누스 IFO3262, 글루코노박터 옥시단스 IFO3293, 글루코노박터 옥시단스 IFO3250, 글루코노박터 옥시단스 IFO3292, 글루코노박터 옥시단스 IFO3294, 글루코노박터 옥시단스 아종 옥시단스 IFO3189, 글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3172, 글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3130, 아세토박터 파스테우리아누스 IFO3222, 아세토박터 파스테우리아누스 IFO3223 및 프라테우리아 아우란티아 IFO3245는 인스티튜트 포 퍼멘테이션, 오사카(Institute for fermentation, Osaka; 일본 오사카후 532 요도가와쿠 주소혼마치 2초메 17-85 소재)로부터 입수가능하다.
글루코노박터 옥시단스 IAM1839는 일본 도쿄도 분쿄쿠 야요이 1초메 소재의 동경대의 인스티튜트 오브 몰레귤라 앤드 셀룰라 바이오사이언시즈(Institute of Molecular and Cellular Biosciences; 구 인스티튜트 오브 어플라이드 마이크로바이올러지(Institute of Applied Microbiology))로부터 입수가능하다.
크실리톨 및/또는 D-크실룰로스는 전술한 것과 같은, 글루코스로부터 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 적합한 배지에서 배양하여 크실리톨 또는 D-크실룰로스, 또는 이들 둘다를 배지내에 축적시키고, 상기 크실리톨 및/또는 D-크실룰로스를 배지로부터 수집함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 표적 생성물은 크실리톨 또는 D-크실룰로스일 수 있거나, 이들 둘 다일 수 있다.
전술한 미생물 중 어느 것이나 D-크실룰로스의 제조에 적합하게 사용할 수 있다. 크실리톨의 제조의 경우, 전술한 미생물 중 어느 것이나 적합하게 사용할 수 있으나, 글루코노박터 속 또는 아세토박터 속에 속하는 미생물이 바람직하다. 구체적으로는, 글루코노박터 세리누스, 글루코노박터 옥시단스, 아세토박터 아세티, 아세토박터 리쿠에파시엔스 및 아세토박터 파스테우리아누스가 크실리톨의 제조에 바람직하다. 특정 균주로서는, 하기 균주가 크실리톨의 제조에 바람직하다:
글루코노박터 세리누스 IFO3262
글루코노박터 옥시단스 ATCC8147
글루코노박터 옥시단스 IFO3292
글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3130
아세토박터 아세티 아종 크실리눔 ATCC14851
아세토박터 리쿠에파시엔스 ATCC14835
아세토박터 파스테우리아누스 IFO3222
아세토박터 파스테우리아누스 IFO3223.
본 발명에 대해서는, 글루코노박터 속, 아세토박터 속 또는 프라테우리아 속에 속하고 글루코스로부터 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 생산하는 능력을 갖는 미생물 균주로부터 수득된 변이주 또는 돌연변이주를 사용할 수 있다. 이러한 돌연변이주는 UV 노출, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 처리, 에틸 메탄설포네이트(EMS) 처리, 아질산 처리, 아크리딘 처리 등에 의해 수득된 것, 유전자 공학 기술, 예를 들어, 세포 융합 및 유전자 재조합 등에 의해 수득된 유전자 재조합형 균주 등을 포함한다.
전술한 미생물을 배양하기 위한 배지는 통상의 탄소원, 질소원, 무기 이온, 및 필요로 하는 유기 영양원을 함유하는 통상의 배지일 수 있다.
탄소원으로서는, 탄수화물, 예를 들어, 글루코스, 알콜, 예를 들어, 글리세롤, 유기산 등을 적합하게 사용할 수 있다. 공지된 크실리톨의 제조 방법, 예를 들어, D-크실로스 및 D-아라비톨과 같은 펜티톨로부터 크실리톨을 제조하는 방법에서 관찰되는 우위성의 관점에서, 주요 탄소원은 바람직하게는 헥소스, 예를 들어, 글루코스 및 프럭토스, 이당류, 예를 들어, 수크로스 및 락토스, 또는 다당류, 예를 들어, 전분으로부터 선택한다. 이들 주요 탄소원 물질은 배지내에서 10 내지 60%, 바람직하게는 20 내지 50%의 양으로 사용한다. 이들 탄소원은 일괄적으로, 또는 분획으로 분배하여 가하고 배양 동안 분할하여 가할 수 있다.
질소원으로서는, 암모니아 기체, 수성 암모니아, 암모늄 염 등을 사용할 수 있다. 무기 이온으로서는, 마그네슘 이온, 인산염 이온, 칼륨 이온, 철 이온, 망간 이온 등을 필요한 경우 사용할 수 있다. 유기 영양원으로서는, 비타민, 아미노산 및 이들을 함유하는 물질, 예를 들어, 간 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 펩톤, 고기 추출물, 옥수수 침지액, 카제인 분해 생성물 등을 적합하게 사용할 수 있다.
또한, 배양 조건은 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 미생물은 통상적으로 5 내지 8의 pH 범위 및 25 내지 40℃의 온도내에서 선택된 제한된 pH 및 온도에서 배양할 수 있다. 배양은, 예를 들어, 교반 또는 진탕에 의해 달성된 호기성 조건하에 수행한다. 배양 시간에 대해서는, 미생물은 바람직하게는 주요 탄소원이 소비될 때까지, 즉, 통상적으로 3 내지 8일 동안 배양한다.
상기한 바와 같은 배지내에 생성된 크실리톨 및/또는 D-크실룰로스를 통상적인 방법으로 배지로부터 분리하여 수집한다. 구체적으로는, 고형물을 원심분리, 여과 등에 의해 배양물로부터 제거하고, 활성탄, 이온 교환 수지 등을 사용하여 잔류 용액을 탈색 및 탈염시키고, 크실리톨 및/또는 D-크실룰로스를 용액으로부터 결정화시킨다. 크실리톨 및/또는 D-크실룰로스의 배양물로부터의 분리 및 수집 과정은 보다 낮은 불순물 함량으로 인해 식물 재료 가수분해물로부터의 분리보다는 용이하다.
생성된 D-크실룰로스는 수소첨가에 의해 크실리톨로 전환시킬 수 있으며, 이는 공지된 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 보다 상세하게 설명된다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다. 실시예에서는, 생성된 크실리톨 및 D-크실룰로스를 하기 조건하에 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)시킨다.
칼럼: Shodex SC1011(쇼와 덴코(Showa Denko)사 제품)
이동상: 20% 아세토니트릴/80% 50ppm Ca-EDTA 수용액
유속: 1.0ml/분
온도: 75℃
검출: RI 검출기
황산암모늄 0.2%, 인산이수소칼륨 0.1%, 인산수소이칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.05% 및 효소 추출물 0.5%를 함유하는 배지(pH 6.0)를 각각의 시험관에 4ml의 양으로 유입하여, 120℃에서 20분 동안 가열 살균한다. 개별적으로 살균시킨 D-글루코스를 5%의 농도로 배지에 가한다. 전술한 농도(%)는 w/v %이다.
표 1에 언급한 각각의 균주를 전술한 배지에 접종하여, 30℃에서 1일 동안 진탕하에 배양한다. 수득된 배양물을 종균 배양물로서 사용한다. 전술한 바와 동일한 조성을 갖는 배지(D-글루코스 제거)를 500ml 사카구치(Sakaguchi) 플라스크에 각각의 플라스크에 대해 50ml의 양으로 유입하여, 120℃에서 20분 동안 가열 살균한다. 개별적으로 살균시킨 글루코스 및 탄산칼슘을 각각 5% 및 4%의 농도로 배지에 가한다. 종균을 2%의 농도로 상기 배지에 접종하여, 30℃에서 4일 동안 진탕하에 배양한다. 다음, 세균 세포를 원심분리에 의해 제거한 후, 배지내에 생성된 크실리톨 및 D-크실룰로스를 HPLC에 의해 정량화시킨다. 결과는 표 1에 제시한다.
균주 생성된 크실리톨(g/L) 생성된 D-크실룰로스(g/L)
글루코노박터 세리누스 IFO3262 0.3 1.11
글루코노박터 옥시단스 ATCC8147 0.4 0.4
글루코노박터 옥시단스 IFO3293 ND* 1.0
글루코노박터 옥시단스 IAM1839 ND 0.5
글루코노박터 옥시단스 IFO3250 ND 0.5
글루코노박터 옥시단스 IFO3292 0.3 1.0
글루코노박터 옥시단스 IFO3294 ND 1.0
글루코노박터 옥시단스 아종 옥시단스 IFO3189 ND 1.0
글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3172 ND 0.5
글루코노박터 옥시단스 아종 서브옥시단스 IFO3130 0.4 1.2
아세토박터 아세티 아종 크실리눔 ATCC14851 0.5 1.6
아세토박터 리쿠에파시엔스 ATCC14835 0.5 1.1
아세토박터 파스테우리아누스 IFO3222 0.4 1.0
아세토박터 파스테우리아누스 IFO3223 0.3 2.3
프라테우리아 아우란티아 IFO3245 ND 0.8
*: ND는 ″측정되지 않음″을 의미한다
본 발명에 따라 글루코노박터 속, 아세토박터 속 또는 프라테우리아 속에 속하고 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 사용하여 글루코스와 같은 값싼 원료로부터 직접 발효에 의해 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 효율적으로 제조할 수 있다.

Claims (2)

  1. 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속 또는 프라테우리아(Frateuria) 속에 속하고 크실리톨 또는 D-크실룰로스 생산능을 갖는 미생물을 적합한 배지에서 배양하여 배지내에 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 축적시키고, 상기 배지로부터 크실리톨 또는 D-크실룰로스를 수집하는 단계를 포함하는, 크실리톨 또는 D-크실룰로스의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 글루코노박터 속에 속하는 미생물이 글루코노박터 세리누스(Gluconobacter cerinus) 또는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans)로부터 선택되고, 아세토박터 속에 속하는 미생물이 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 아세토박터 리쿠에파시엔스(Acetobacter liquefaciens) 또는 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus)로부터 선택되고, 프라테우리아 속에 속하는 미생물이 프라테우리아 아우란티아(Frateuria aurantia)인 방법.
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