CN114410490A - 一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法 - Google Patents

一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114410490A
CN114410490A CN202210085418.1A CN202210085418A CN114410490A CN 114410490 A CN114410490 A CN 114410490A CN 202210085418 A CN202210085418 A CN 202210085418A CN 114410490 A CN114410490 A CN 114410490A
Authority
CN
China
Prior art keywords
yeast
selenium
culture
strain
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210085418.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李相前
李明振
丁浩
聂新玲
杨宇翔
李青飞
信姗姗
李婧
袁稚雯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huaiyin Institute of Technology
Original Assignee
Huaiyin Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huaiyin Institute of Technology filed Critical Huaiyin Institute of Technology
Priority to CN202210085418.1A priority Critical patent/CN114410490A/zh
Publication of CN114410490A publication Critical patent/CN114410490A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L31/00—Edible extracts or preparations of fungi; Preparation or treatment thereof
    • A23L31/10—Yeasts or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种含有高生物量富硒酵母及及其制备方法。属于微生物育种及发酵工程领域；具体步骤：取距离表层3‑5cm处土壤，进行富集培养、梯度稀释纯化得到较纯的酵母菌；通过等离子诱变育种技术，选育出具有高生物量、高富硒的富硒酵母菌种，优化出其最佳发酵培养基组成及发酵条件，通过一级种子培养、二级种子培养、补料发酵培养，在10h左右流加亚硒酸钠，收集发酵液，离心喷雾干燥，制成淡黄色干粉，最终制得含有高硒高生物量的酵母。本发明生产的富硒酵母含有高蛋白质，高核酸量，易于生物的吸收转化；本发明制备的含有高生物量富硒酵母具有成本低、安全无毒害、操作简单及生物量大等特点。

Description

一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法
技术领域
本发明属于微生物育种及发酵工程领域，涉及一种高生物量、高富硒的酵母菌株的筛选及条件工艺优化。
背景技术
硒(Se)是维持人或动物正常生理活动的重要微量元素之一，硒也是一种多功能的生命营养素，常常用于克山病、大骨节病、心血管病、糖尿病、肝病、前列腺病、心脏病、癌症等40多种疾病，广泛运用于癌症、手术、放化疗等；高等动物可利用硒参与自身的生长代谢与免疫调控，但其自身不能将无机硒转化为有机硒。
如何将不可利用的无机硒转化为人体可吸收的有机硒一般有以下几种方式：1：植物转化法，土壤中硒含量匮乏，需要人为干涉，目前包括以下几种方式提高植物富硒水平，将富硒植物的种子用硒盐浸泡；在叶面喷洒富硒肥料；在土壤中施硒肥提高植物种中硒含量；2：动物转化法，利用富硒饲料养殖动物，经动物体内代谢后转化成硒代氨基酸，形成有机硒的形式；3：微生物转化，利用微生物的生长代谢利用无机硒将氨基酸中的硫替代为硒转化成硒代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸等有机硒，以达到将不可利用的无机硒转化成可被利用的有机硒。
近年来，富硒酵母研究进展迅速，其具有繁殖快、物料利用率高等优点，目前对富硒酵母的文献报道也大多为酿酒酵母；较为常见的是将酿酒酵母在培养的过程中加入适量的亚硒酸钠，于一定的培养条件下培养富硒，进一步干燥包装成酵母产品；而对其他富硒酵母种类研究甚少，使得富硒酵母种类单一，酵母富硒水平不高，因此开发新品种的富硒酵母，提高酵母富硒的水平就成为现下技术人员需要的问题了。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供了一种高生物量、高富硒的酵母菌株的筛选及条件工艺优化。
技术方案：本发明所述的一种含有高生物量富硒酵母的生产方法，首先，通过对富硒土壤进行富集培养及分离纯化，筛选获得耐50-300ppm亚硒酸钠酵母菌；然后，采用等离子诱变育种技术选育出耐400-700ppm亚硒酸钠酵母菌；最后，在发酵培养基和工艺优化的发酵条件下，补料培养发酵生产出含有高生物量的富硒酵母；
其具体制备步骤如下：
(1)、富集酵母菌株：将富硒土壤进行富集培养，得到预培养基培养液；
其中，所述富集酵母菌株的方法是：将1-2g富硒土壤接种于富集培养基中进行培养24-30h；从而得到预培养基培养液；
其中，所述富集培养基包括：18-22g/L葡萄糖与1g/L氯霉素；其pH值为3.5-6.8，温度为28-32℃；
具体的，富集培养基：称取20g葡萄糖，加纯化水定容至1L在115℃灭菌20min，灭菌结束后冷凉至室温添加氯霉素工作浓度为0.1％；
分离纯化培养基：称取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母粉10g、琼脂20g定容至一升，在115℃灭菌20min，灭菌结束后冷却至50℃左右添加氯霉素工作浓度为0.1％；
种子培养基及发酵富硒培养基：为YPD培养基，称取葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母粉10g定容至一升，在115℃灭菌20min，在无菌操作台中吸取1000μg/mL亚硒酸钠溶液，配制成不同硒浓度的发酵富硒培养基(预培养基培养液)；
(2)、分离纯化酵母菌株：将得到的预培养基培养液进行稀释并涂布于纯化平板，得到酵母单菌落；
再将得到的酵母单菌落进行平板划线，从而得到纯酵母菌株单菌落；
所述分离纯化酵母菌株的方法具体是：将预培养基培养液采用无菌生理盐水按10倍梯度稀释法稀释至10-1-10-6的梯度，从而得到样品均液；
选择10-3～10-6稀释梯度的样品匀液，每个稀释梯度吸取100μL均匀涂布于经灭菌处理后的纯化平板上，再置于恒温培养箱中培养48～72h；
后挑选不同形态的酵母单菌落，通过在纯化平板进行划线，再置于恒温培养箱中培养48～72h，重复3～4次纯化操作，从而得到纯酵母菌株单菌落；
其中，所述纯化平板包括：葡萄糖15-25g/L、酵母粉5-15g/L、蛋白胨15-25g/L、琼脂15-25g/L及氯霉素1g/L，其温度为28-32℃；
具体的，取适量土壤置于富集培养基中，30℃、200rpm/min培养1-2d，在无菌条件下分别取上述富集过后的母液1mL，采用无菌生理盐水按10倍梯度稀释法稀释至10-1-10-6的梯度，从而得到样品均液；
选择10-3～10-6稀释梯度的样品匀液，每个稀释梯度吸取100μL均匀涂布于灭过菌分离纯化固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养48～72h，从而得到酵母单菌落，观察并记录菌落特征；
分别挑选不同形态的单菌落，通过划线稀释法在分离纯化固体培养基上进行划线，然后置于28℃恒温培养箱中培养48～72h，重复3～4次纯化操作，得到纯酵母菌株单菌落；
(3)、筛选、鉴定酵母菌株：
将纯酵母菌株单菌落进行液体种子培养得培养菌液体种子；将培养菌液体种子稀释涂布在筛选平板上得初筛酵母菌株；将初筛酵母菌株接种于含硒发酵培养基中得耐50-300ppm亚硒酸钠酵母菌；对其进行ITS序列鉴定；
具体的，所述筛选及鉴定酵母菌株的方法包括：
首先，将纯酵母菌株单菌落进行液体种子培养，从而得到培养菌液体种子；
其次，将培养菌液体种子稀释涂布在含有亚硒酸钠的筛选平板上，挑选60h之内长出的菌落，即为初筛酵母菌株；
接着，再将初筛酵母菌株以10-20％的接种量接种于含硒发酵培养基中，比较不同初筛酵母菌株的生物量及富硒能力，最终筛选获得耐50-300ppm亚硒酸钠酵母菌；
其中，所述筛选平板包括:葡萄糖15-25g/L、酵母粉5-15g/L、蛋白胨15-25g/L、琼脂15-25g/L及亚硒酸钠50-300ppm，其温度为28-32℃；
所述含硒发酵培养基包括：葡萄糖15-25g/L、酵母粉5-15g/L、蛋白胨15-25g/L及亚硒酸钠50-300ppm；其温度为28-32℃、pH值为3.5-6.8；
具体的，筛选酵母菌株：将分离得到的酵母菌液体24h培养获得酵母种子培养液，稀释涂布在含有50、200、400ppm亚硒酸钠的固体平板上，于30℃恒温培养箱中培养48～72h，挑选出长势较好且颜色微红或未变红的单菌落，保存于斜面培养基；将初筛得到的富硒酵母菌以10％的接种量分别接种于含有350ppm亚硒酸钠硒发酵培养基的三角瓶中，在30℃、200r/min的恒温摇床中培养48h，测其生物量及富硒量，然后计算其硒转化率，筛选获得硒转化率较高(50-300ppm)的亚硒酸钠酵母菌；
鉴定酵母菌株：将筛选得到的酵母通过ITS序列鉴定，正向引物TCCGTAGGTGAACCTCCGG，反向引物为TCCTCCGCTTATIGATATGC，菌液稀释10倍当作模板，以表1体系将酵母进行菌落PCR扩增，PCR扩增时，按照退火温度为引物设计的Tm值-5℃为参考温度，延伸时间按照1kb/min的时间原则，首先在94℃下预变性4min，然后进入循环(94℃变性30s，60℃退火温度30s，延伸温度72℃，延伸时间1kb/min)30个循环；最后充分72℃充分延伸10min；将PCR得到的序列通过软件比对，采用最大似然法与最大简约法构建系统发育树，并对基因序列采用Blast录入，观察该菌株所在分支，判断筛选菌株与已知菌株亲缘关系，确定酵母为杰丁毕赤酵母；
表1PCR扩增反应体系(25uL)
Figure BDA0003487614550000031
Figure BDA0003487614550000041
(4)、诱变酵母菌株：
所述诱变酵母菌株的方法包括：
将得到的杰丁毕赤酵母采用等离子诱变育种技术，通过筛选平板获得耐400-700ppm亚硒酸钠酵母菌，即目标菌株；
其中，所述等离子诱变育种技术具体是：以高纯氮气为诱变仪的工作气体，气体流量为12slpm，诱变高度为5mm，工作功率为300W，选择等离子注入时间为20-30s；
所述筛选平板包括:葡萄糖15-25g/L、酵母粉5-15g/L、蛋白胨15-25g/L、琼脂15-25g/L及亚硒酸钠400-700ppm；其温度为28-32℃、pH值为3.5-6.8；
具体的，将杰丁毕赤酵母采用等离子诱变育种技术，将三角瓶中的菌液转入离心管中，10000r/min离心2min；离心后，倒去上清液，加入无菌生理盐水溶液将菌体沉淀打匀，重复一次，吸收成106CFU/ml的菌悬液；于无菌超净工作台中分别吸取制备好的菌悬液15-20uL放于加样器中，加入的菌悬液应均匀覆盖于皿槽底面，制成菌膜，表面湿润且无明显液滴为宜，放入已紫外灭菌的诱变仪中；以高纯氮气为诱变仪的工作气体，气体流量为12slpm，诱变高度为5mm，工作功率为300W，选择等离子注入时间为5、10、15、20、25、30、40、50s；诱变结束后，立即取出至超净台操作，取1ml无菌水至碟中，用枪头吹扫菌膜使菌体悬浮起来，将菌悬液稀释104～10-6倍，取100μl菌液均匀涂至YPD固体平板，在30℃培养箱过夜培养，制作致死率曲线如图所述，选择致死率在70～80％的时间为最佳诱变时间；以最佳诱变时间进行诱变，将菌悬液取100μl菌液均匀涂布在含有300、400、500、700ppm亚硒酸钠的筛选平板上，筛选耐硒酵母菌株，且其生物量在相同条件下比出发菌株提高，将其命名为Pichia jadinii cas7；
进一步的，摇瓶培养基、培养条件及富硒条件的优化：
通过单因素实验确定，葡萄糖、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙为最适培养基组成，其中葡萄糖、尿素、磷酸二氢钾为主要影响因素，通过响应面实验确定最优培养基组成；最终确定培养基组成为47g/L葡萄糖、尿素4.1g/L、磷酸二氢钾1.2g/L、氯化镁1-3g/L、氯化钙0.2-0.8g/L、谷氨酸0.5-2.5g/L、微量元素0.6ml(微量元素包括CuSO4·5H20 6.0g、NaI0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2Mo4·2H2O 0.2g、ZnCl2 20.0g、FeSO4·7H2O 65.0g,体积分数为98％的H2SO4 5.0mL，去离子水定容至1000mL。)；
发酵条件为26-32℃、pH4.2-6.8、溶氧40％-60％；
根据在不同时间添加添加不同浓度的亚硒酸钠确定加硒时间为10h，发酵液硒浓度小于280ppm；
(5)、补料发酵培养富硒：
将获得的目标菌株采用连续培养的方式进行逐级培养，从而最终获得含有高生物量的富硒酵母；
所述对目标菌株采用连续培养的方式进行逐级培养的生产工艺如下：斜面菌种、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养、收集菌体及喷雾干燥、包装；
其各生产工艺的具体步骤如下：
(5.1)、斜面菌种：斜面菌种：将目标菌株接种于YPD固体斜面，30℃培养24-36h，放于冰箱中4℃保存，得斜面菌种；
(5.2)、一级种子培养：将保存的斜面菌种，取接种环一环于装有50/250ml一级种子培养基中，在30℃摇床中培养20-24h，得一级种子培养菌液；菌重达到40g/L时为合格；
(5.3)、二级种子培养：将一级种子培养菌液接种于装有300/1000ml的二级培养基中，在30℃摇床中培养20-24h，得二级种子培养菌液；作为二级培养基使用；
(5.4)、发酵培养：将得到的二级种子培养菌液接入装有底料为1.2L的5L发酵培养基中，流加完全培养基和亚硒酸钠，从而得到酵母发酵液；达到高富硒高生物量的目的；
(5.5)、收集菌体及喷雾干燥：将得到的酵母发酵液经离心机8000rpm/min离心5min，后收集酵母菌体，喷雾干燥成粉；
(5.6)、包装：使用不透气的包装袋进行真空包装包装，即为含有高生物量的富硒酵母，其中，每克干富硒酵母细胞含有机硒达3500-4500微克；
进一步的，在步骤(5.2)中，所述一级种子培养基包括：葡萄糖20-50g/L，酵母粉5-10g/L及蛋白胨15-30g/L；其温度为28-32℃、pH值为3.5-4.5；
在步骤(5.3)-(5.4)中，所述二级种子培养基及发酵培养基具体包括：47g/L葡萄糖、尿素4.1g/L、磷酸二氢钾1.2g/L、氯化镁1-3g/L、氯化钙0.2-0.8g/L、谷氨酸0.5-2.5g/L、微量元素0.6ml；
其中，所述微量元素包括CuSO4·5H20 6.0g、NaI 0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2Mo4·2H2O 0.2g、ZnCl2 20.0g、FeSO4·7H2O 65.0g,体积分数为98％的H2SO4 5.0mL，去离子水定容至1000mL。
进一步的，在步骤(5.4)中，所述发酵培养过程参数包括：温度26-32℃、pH4.2-6.8、溶氧45-70％；
所述发酵培养的方式是：采用流加浓缩完全培养和亚硒酸钠的方式实现酵母高生物量高富硒。
进一步的，所述得到的含有高生物量的富硒酵母的生物量是30-40g/L，得到的每Kg富硒酵母所含有机硒含量是3500-4500mg；
其中，无机硒所占总硒含量小于1％，硒的利用率可达到98％以上。
进一步的，一种含有高生物量的富硒酵母在食品、保健品或饲料添加剂中的应用。
有益效果：本发明与现有技术相比，本发明的特点是：本发明采用的富硒酵母杰丁毕赤酵母发酵得到的产品生物量高，且酵母细胞中有机硒含量高，每Kg干酵母粉中含有3500-4500mg，其中硒代蛋氨酸的含量达到62-70％；本发明采用流加高浓度的完全培养基使得酵母生物量达到30-40g/L，实现了大批量生产得目的，并通过流加亚硒酸钠的方式使硒的转化率大幅增加，减少了环境的污染，降低废水处理成本；另外，本发明所得到的富硒酵母中蛋白质的含量达到60-70％，核酸含量4.5-5.0％，较同类型酵母中营养更加丰富，在饲料、食品、保健品等领域有着更显著的优势。
附图说明
图1是本发明的操作流程图；
图2是本发明中实施例的示意图；其中，鉴定酵母根据ITS序列构建的系统进化树；
图3是本发明中实施例中发酵培养基优化响应曲面图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明：
实施例1
本实例的富硒酵母制备方法如下：
(1)、富硒酵母的筛选及鉴定：
富硒土壤取自淮安市流均镇某梨园距离表层3-5cm处土壤；取适量的富硒土壤置于富集培养基中，30℃、200rpm/min培养1-2d，得预培养基培养液；在无菌条件下分别取上述富集过后的母液1mL，采用无菌生理盐水按10倍梯度稀释法稀释至10-1-10-6梯度，得样品均液；选择10-3～10-6稀释梯度的样品匀液，每个稀释梯度吸取200μL均匀涂布于经灭菌处理的纯化平板上，再置于恒温培养箱中培养48～72h，观察并记录菌落特征；分别挑选不同形态的单菌落，通过划线稀释法在分离纯化固体培养基(纯化平板)上进行划线，然后置于28℃恒温培养箱中培养48～72h，重复3～4次纯化操作，得到纯酵母菌株单菌落；
将分离得到的纯酵母菌株单菌落进行24h液体种子培养，得培养菌液体种子，将其稀释涂布在含有50、100、200、300ppm亚硒酸钠的筛选平板上，于30℃恒温培养箱中培养48～72h，挑选出长势较好且颜色微红或未变红的单菌落，保存于斜面培养基，即为初筛酵母菌株；
将初筛得到的初筛酵母菌株以10％的接种量分别接种于含有350ppm含硒发酵培养基的三角瓶中，在30℃、200r/min的恒温摇床中培养48h，测其生物量及富硒量，然后计算其硒转化率，最终筛选获得耐200-300ppm亚硒酸钠酵母菌，经鉴定ITS序列鉴定确认为杰丁毕赤酵母；
将筛选得到的酵母通过ITS序列鉴定，正向引物为TCCGTAGGTGAACCTCCGG，反向引物为TCCTCCGCTTATIGATATGC，菌液稀释10倍当作模板，将酵母进行菌落PCR扩增，PCR扩增时，按照退火温度为引物设计的Tm值-5℃为参考温度，延伸时间按照1kb/min的时间原则，首先在94℃下预变性4min，然后进入循环(94℃变性30s，60℃退火温度30s，延伸温度72℃，延伸时间1kb/min)30个循环；最后充分72℃充分延伸10min；将PCR得到的序列通过软件比对，采用最大似然法与最大简约法构建系统发育树，并对基因序列采用Blast录入，观察该菌株所在分支，判断筛选菌株与已知菌株亲缘关系；确定酵母为杰丁毕赤酵母；
(2)、富硒酵母的诱变选育：
将筛选获得的杰丁毕赤酵母采用等离子诱变育种技术，将三角瓶中的菌液转入离心管中，10000r/min离心2min。离心后，倒去上清液，加入无菌生理盐水溶液将菌体沉淀打匀，重复一次，吸收成106CFU/ml的菌悬液；于无菌超净工作台中分别吸取制备好的菌悬液15-20uL放于加样器中，加入的菌悬液应均匀覆盖于皿槽底面，制成菌膜，表面湿润且无明显液滴为宜，放入已紫外灭菌的诱变仪中；以高纯氮气为诱变仪的工作气体，气体流量为12slpm，诱变高度为5mm，工作功率为300W，选择等离子注入时间为5、10、15、20、25、30、40、50s；诱变结束后，立即取出至超净台操作，取1ml无菌水至碟中，用枪头吹扫菌膜使菌体悬浮起来，将菌悬液稀释10-4～10-6倍，取100μl菌液均匀涂至YPD固体平板，在30℃培养箱过夜培养，选择致死率在70～80％的时间为最佳诱变时间；以最佳诱变时间进行诱变，将菌悬液取100μl菌液均匀涂布在含有400、500、600、700ppm亚硒酸钠的筛选平板上，通过筛选平板经多次诱变筛选获得耐400-700ppm亚硒酸钠酵母菌，即为目标菌株；且其生物量在相同条件下比出发菌株提高；
(3)、摇瓶培养基优化：
通过单因素实验确定，葡萄糖、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钙为最适培养基组成，其中葡萄糖、尿素、磷酸二氢钾为主要影响因素，通过响应面实验确定最优培养基组成；最终确定培养基组成为葡萄糖47g/L、尿素4.1g/L、磷酸二氢钾1.2g/L、氯化镁1-3g/L、氯化钙0.2-0.8g/L、谷氨酸0.5-2.5g/L、微量元素0.6ml；微量元素包括CuSO4·5H206.0g、NaI 0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2Mo4·2H2O 0.2g、ZnCl2 20.0g、FeSO4·7H2O 65.0g,体积分数为98％的H2SO4 5.0mL，去离子水定容至1000mL；
发酵条件为26-32℃、pH4.2-6.8、溶氧40％-60％；
(4)、发酵过程控制：
根据得到的培养基组成及富硒条件，采用连续培养的方式，其生产工艺依次包括如下步骤：斜面菌种、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养、收集菌体及喷雾干燥、包装，其各生产工艺如下：
斜面菌种：将酵母菌接种于YPD固体斜面，30℃培养24-36h，放于4℃保存；
一级种子培养：将保存的斜面接一环于葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L、蛋白胨15g/L，装有50/250ml液体培养基中，30℃摇床培养20-24h；
二级种子培养：将一级种子全部倒入装有300/1000ml的发酵培养基中，30℃摇床培养20-24h，作为二级培养基使用；
发酵培养：将二级种子培养基全部接入装有底料为1.2L的5L发酵罐(发酵培养基)中，流加1.5L完全培养基：葡萄糖188g/L、尿素16.4g/L、磷酸二氢钾4.8g/L、氯化镁4g/L、氯化钙0.8g/L、谷氨酸2g/L、微量元素2.4ml；(微量元素：CuSO4·5H20 6.0g、NaI 0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2Mo4·2H2O 0.2g、、ZnCl2 20.0g、FeSO4·7H2O 65.0g，体积分数为98％的H2SO4 5.0mL，去离子水定容至1000mL)；在10h后匀速流加浓缩完全培养基，匀速流加1.0g亚硒酸钠溶于250ml纯化水中流加，从而得酵母发酵液；其达到高富硒高生物量的目的；
(5)、发酵产物收集及富硒能力检测：
收集经上述步骤制得的发酵液，离心洗涤，喷雾干燥，制成成品，产品水分小于7％。
发酵产品富硒酵母达到23g/L，每Kg富硒酵母含有3300mg有机硒，蛋白质含量达到64％，硒代蛋氨酸大于65％，硒转化率达到98.2％。
实施例2
本实施例的富硒酵母制备方法如下：
(1)、富硒酵母的筛选及鉴定
富硒酵母的筛选及鉴定和实施例1相同。
(2)、富硒酵母的诱变选育
富硒酵母的诱变选育和实施例1相同。
(3)、摇瓶培养基优化
摇瓶培养基优化和实施例1相同。
(4)、发酵过程控制：
根据得到的培养基组成及富硒条件，采用连续培养的方式，其生产工艺依次包括如下步骤：斜面菌种、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养、收集菌体及喷雾干燥、包装，其各生产工艺如下：
斜面菌种：将酵母菌接种于YPD固体斜面，30℃培养24-36h，放于4℃保存；
一级种子培养：将保存的斜面接一环于葡萄糖45g/L，酵母粉10g/L、蛋白胨15g/L，装有50/250ml液体培养基中，30℃摇床培养20-24h；
二级种子培养：将一级种子全部倒入装有300/1000ml的发酵培养基中，30℃摇床培养20-24h，作为二级种子使用；
发酵培养：将二级种子培养基全部接入装有底料为1.2L的5L发酵罐中，流加1.5L完全培养基：葡萄糖188g/L、尿素16.4g/L、磷酸二氢钾4.8g/L、氯化镁4g/L、氯化钙0.8g/L、谷氨酸8g/L、微量元素2.4ml；(微量元素：CuSO4·5H20 6.0g、NaI 0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2Mo4·2H2O 0.2g、ZnCl2 20.0g、FeSO4·7H2O 65.0g，体积分数为98％的H2SO4 5.0mL，去离子水定容至1000mL)；匀变速流加完全培养基，1.2g亚硒酸钠溶于250ml纯化水中匀变速流加，从而得酵母发酵液；其达到高富硒高生物量的目的；
(5)、发酵产物收集及富硒能力检测：
收集经上述步骤制得的发酵液，离心洗涤，喷雾干燥，制成成品，产品水分小于7％；
发酵产品富硒酵母达到30g/L，每Kg富硒酵母含有4058mg有机硒，蛋白质含量达到68％，硒代蛋氨酸大于65％，硒转化率达到99％。
实施例3
本实施例的富硒酵母制备方法如下:
(1)、富硒酵母的筛选及鉴定
富硒酵母的筛选及鉴定和实施例1相同。
(2)、富硒酵母的诱变选育
富硒酵母的诱变选育和实施例1相同。
(3)、摇瓶培养基优化
摇瓶培养基优化和实施例1相同。
(4)、发酵过程控制：
根据得到的培养基组成及富硒条件，采用连续培养的方式，其生产工艺依次包括如下步骤：斜面菌种、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养、收集菌体及喷雾干燥、包装，其各生产工艺如下：
斜面菌种：将酵母菌接种于YPD固体斜面，30℃培养24-36h，放于4℃保存；
一级种子培养：将保存的斜面接一环于葡萄糖30g/L，酵母粉8g/L、蛋白胨12g/L，装有50/250ml液体培养基中，30℃摇床培养20-24h；
二级种子培养：将一级种子全部倒入装有300/1000ml的发酵培养基中，30℃摇床培养20-24h，作为二级种子使用；
发酵培养：将二级种子全部接入装有底料为1.2L的5L发酵罐中，流加1.5L完全培养基：葡萄糖188g/L、尿素16.4g/L、磷酸二氢钾4.8g/L、氯化镁4g/L、氯化钙0.8g/L、谷氨酸7g/L、微量元素2.4ml；(微量元素：CuSO4·5H20 6.0g、NaI 0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2Mo4·2H2O 0.2g、ZnCl2 20.0g、FeSO4·7H2O 65.0g,体积分数为98％的H2SO4 5.0mL，去离子水定容至1000mL)，采用分批流加浓缩完全培养基，流加1.3g亚硒酸钠溶于250ml纯化水中分批流加，从而得酵母发酵液；其达到高富硒高生物量的目的；
(5)、发酵产物收集及富硒能力检测：
收集经上述步骤制得的发酵液，离心洗涤，喷雾干燥，制成成品，产品水分小于7％。
发酵产品富硒酵母达到26g/L，每Kg富硒酵母含有3562mg有机硒，蛋白质含量达到67％，硒代蛋氨酸大于65％，硒转化率达到98.5％。
将实施例1～3制得的富硒酵母，应用于医药、食品、饲料中,能够易于消化吸收,提高了有机硒的消化利用率。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种含有高生物量富硒酵母的生产方法，其特征在于，首先，通过对富硒土壤进行富集培养及分离纯化，筛选获得耐50-300ppm亚硒酸钠酵母菌；然后，采用等离子诱变育种技术选育出耐400-700ppm亚硒酸钠酵母菌；最后，在发酵培养基和工艺优化的发酵条件下，连续培养发酵生产出含有高生物量的富硒酵母；
其具体制备步骤如下：
(1)、富集酵母菌株：将富硒土壤进行富集培养，得到预培养基培养液；
(2)、分离纯化酵母菌株：将得到的预培养基培养液进行稀释并涂布于纯化平板，得到酵母单菌落；
再将得到的酵母单菌落进行平板划线，从而得到纯酵母菌株单菌落；
(3)、筛选、鉴定酵母菌株：
将纯酵母菌株单菌落进行液体种子培养得培养菌液体种子；将培养菌液体种子稀释涂布在筛选平板上得初筛酵母菌株；将初筛酵母菌株接种于含硒发酵培养基中得耐50-300ppm亚硒酸钠酵母菌；对其进行ITS序列鉴定，确认为杰丁毕赤酵母；
(4)、诱变酵母菌株：
将得到的杰丁毕赤酵母采用等离子诱变育种技术，通过筛选平板获得耐400-700ppm亚硒酸钠酵母菌，即目标菌株；
(5)、补料发酵培养富硒：
将获得的目标菌株采用连续培养的方式进行逐级培养，从而最终获得含有高生物量的富硒酵母。
2.根据权利要求1所述的一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法，其特征在于，
在步骤(1)中，所述富集酵母菌株的方法是：将1-2g富硒土壤接种于富集培养基中进行培养24-30h；从而得到预培养基培养液；
其中，所述富集培养基包括：18-22g/L葡萄糖与1g/L氯霉素；其pH值为3.5-6.8，温度为28-32℃。
3.根据权利要求1所述的一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法，其特征在于，
在步骤(2)中，所述分离纯化酵母菌株的方法具体是：将预培养基培养液采用无菌生理盐水按10倍梯度稀释法稀释至10-1～10-6的梯度，从而得到样品均液；
选择10-3～10-6稀释梯度的样品匀液，每个稀释梯度吸取100μL均匀涂布于经灭菌处理后的纯化平板上，再置于恒温培养箱中培养48～72h；
后挑选不同形态的酵母单菌落，通过在纯化平板进行划线，再置于恒温培养箱中培养48～72h，重复3～4次纯化操作，从而得到纯酵母菌株单菌落；
其中，所述纯化平板包括：葡萄糖15-25g/L、酵母粉5-15g/L、蛋白胨15-25g/L、琼脂15-25g/L及氯霉素1g/L，其温度为28-32℃。
4.根据权利要求1所述的一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法，其特征在于，
在步骤(3)中，所述筛选及鉴定酵母菌株的方法包括：
首先，将纯酵母菌株单菌落进行液体种子培养，从而得到培养菌液体种子；
其次，将培养菌液体种子稀释涂布在含有亚硒酸钠的筛选平板上，挑选60h之内长出的菌落，即为初筛酵母菌株；
接着，再将初筛酵母菌株以10-20％的接种量接种于含硒发酵培养基中，比较不同初筛酵母菌株的生物量及富硒能力，最终筛选获得耐200-300ppm亚硒酸钠酵母菌；
其中，所述筛选平板包括:葡萄糖15-25g/L、酵母粉5-15g/L、蛋白胨15-25g/L、琼脂15-25g/L及亚硒酸钠50-300ppm，其温度为28-32℃；
所述含硒发酵培养基包括：葡萄糖15-25g/L、酵母粉5-15g/L、蛋白胨15-25g/L及亚硒酸钠50-300ppm；其温度为28-32℃、pH值为3.5-4.5。
5.根据权利要求1所述的一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法，其特征在于，
在步骤(4)中，所述诱变酵母菌株的方法包括：
将杰丁毕赤酵母采用等离子诱变育种技术，通过筛选平板获得耐400-700ppm亚硒酸钠酵母菌；
其中，所述等离子诱变育种技术具体是：以高纯氮气为诱变仪的工作气体，气体流量为12slpm，诱变高度为5mm，工作功率为300W，选择等离子注入时间为20-30s；
所述筛选平板包括：葡萄糖15-25g/L、酵母粉5-15g/L、蛋白胨15-25g/L、琼脂15-25g/L及亚硒酸钠400-700ppm；其温度为28-32℃、pH值为3.5-6.8。
6.根据权利要求1所述的一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法，其特征在于，
在步骤(5)中，所述对目标菌株采用补料培养的方式进行逐级培养的生产工艺如下：斜面菌种、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养、收集菌体及喷雾干燥、包装；
其各生产工艺的具体步骤如下：
(5.1)、斜面菌种：将目标菌株接种于YPD固体斜面，30℃培养24-36h，放于冰箱中4℃保存，得斜面菌种；
(5.2)、一级种子培养：将保存的斜面菌种，取接种环一环于装有50/250ml一级种子培养基中，在30℃摇床中培养20-24h，得一级种子培养菌液；
(5.3)、二级种子培养：将一级种子培养菌液接种于装有300/1000ml的二级培养基中，在30℃摇床中培养20-24h，得二级种子培养菌液；
(5.4)、发酵培养：将得到的二级种子培养菌液接入装有底料为1.2L的5L的发酵培养基中，再流加完全培养基和亚硒酸钠，从而得到酵母发酵液；
(5.5)、收集菌体及喷雾干燥：将得到的酵母发酵液经离心机8000rpm/min离心5min，后收集酵母菌体，喷雾干燥成粉；
(5.6)、包装：使用不透气的包装袋进行真空包装包装，最终得到含有高生物量的富硒酵母。
7.根据权利要求6所述的一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法，其特征在于，
在步骤(5.2)中，所述一级种子培养基包括：葡萄糖20-50g/L，酵母粉5-10g/L及蛋白胨15-30g/L；其温度为28-32℃、pH值为3.5-6.8；
在步骤(5.3)-(5.4)中，所述二级种子培养基及发酵培养基具体包括：47g/L葡萄糖、尿素4.1g/L、磷酸二氢钾1.2g/L、氯化镁1-3g/L、氯化钙0.2-0.8g/L、谷氨酸0.5-2.5g/L、微量元素0.6ml；
其中，所述微量元素包括CuSO4·5H20 6.0g、NaI 0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2Mo4·2H2O0.2g、ZnCl2 20.0g、FeSO4·7H2O 65.0g,体积分数为98％的H2SO4 5.0mL，去离子水定容至1000mL。
8.根据权利要求6所述的一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法，其特征在于，
在步骤(5.4)中，所述发酵培养过程参数包括：温度26-32℃、pH4.0-6.8、溶氧45-70％；
所述发酵培养的方式是：采用流加浓缩完全培养和亚硒酸钠的方式实现酵母高生物量高富硒。
9.根据权利要求6所述的一种富硒酵母的生产方法，其特征在于：
所述得到的含有高生物量的富硒酵母的生物量是30-40g/L，得到的每Kg富硒酵母所含有机硒含量是3500-4500mg；
其中，无机硒所占总硒含量小于1％。
10.如权利要求1-9制备的所述的一种含有高生物量的富硒酵母在食品、保健品或饲料添加剂中的应用。
CN202210085418.1A 2022-01-25 2022-01-25 一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法 Pending CN114410490A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210085418.1A CN114410490A (zh) 2022-01-25 2022-01-25 一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210085418.1A CN114410490A (zh) 2022-01-25 2022-01-25 一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114410490A true CN114410490A (zh) 2022-04-29

Family

ID=81277588

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210085418.1A Pending CN114410490A (zh) 2022-01-25 2022-01-25 一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114410490A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114794303A (zh) * 2022-05-10 2022-07-29 吉林省农业科学院 一种富硒胶红酵母、富硒胶红酵母饲料添加剂及其制备方法和应用
CN115226875A (zh) * 2022-06-23 2022-10-25 重庆三不加食品有限公司 一种向调味品中添加有机硒的方法
CN115612647A (zh) * 2022-10-20 2023-01-17 淮阴工学院 一种富硒生物絮团的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107868778A (zh) * 2017-11-07 2018-04-03 常州禾吉纺织品有限公司 一种富硒酵母的制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107868778A (zh) * 2017-11-07 2018-04-03 常州禾吉纺织品有限公司 一种富硒酵母的制备方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114794303A (zh) * 2022-05-10 2022-07-29 吉林省农业科学院 一种富硒胶红酵母、富硒胶红酵母饲料添加剂及其制备方法和应用
CN114794303B (zh) * 2022-05-10 2023-07-14 吉林省农业科学院 一种富硒胶红酵母、富硒胶红酵母饲料添加剂及其制备方法和应用
CN115226875A (zh) * 2022-06-23 2022-10-25 重庆三不加食品有限公司 一种向调味品中添加有机硒的方法
CN115612647A (zh) * 2022-10-20 2023-01-17 淮阴工学院 一种富硒生物絮团的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114410490A (zh) 一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法
CN108220175B (zh) 酿酒酵母高密度培养方法及其pH调控方法
CN103910548B (zh) 一种生物复合肥水剂及其生产方法
CN102344326B (zh) 一种抑制烤烟连作障碍的生物有机肥
CN101575580B (zh) 一种富锌酵母及其生产方法
CN103130553A (zh) 一种抗菌生物活性富硒有机肥
CN114107073B (zh) 一种利用糖蜜生产菌丝蛋白的方法
WO2021027197A1 (zh) 一种基于氢氧化细菌的复合菌种及其培养方法
CN101619298B (zh) 5千亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉制备方法
CN110791462B (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用
CN113046253B (zh) 一种提高马克斯克鲁维酵母耐热性的培养方法
CN117187130B (zh) 一株产ddp-iv抑制剂的泛菌及其应用
CN112725397A (zh) 一种微生物发酵生产单细胞蛋白的方法
CN105779317B (zh) 一株高产甲醇蛋白的毕赤酵母菌株及应用
CN101575579B (zh) 一种富铁酵母及其生产方法
CN115895974A (zh) 一株富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用
CN109266578B (zh) 大肠埃希氏菌ACThr1032及其在发酵生产L-苏氨酸中的应用
CN104593306A (zh) 一种大肠埃希氏菌株hy-05c高密度培养方法
CN101709318A (zh) 一种产朊假丝酵母流加发酵制备谷胱甘肽的方法
CN114907982A (zh) 小球藻突变株及其高密度异养培养方法和应用
CN114276944A (zh) 一种富硒的酵母新菌株及酵母硒的生产方法
CN112851412A (zh) 一种新型有机硒肥料及其制备方法
CN102154129B (zh) 一株降解棉酚的红冬孢酵母及其应用
CN105695349A (zh) 一种磷饥饿培养提高酵母细胞胞内海藻糖的方法
Lee et al. Analysis of bioenergetic yield and maintenance parameters associated with mixotrophic and photoheterotrophic growth

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220429