JP7073312B2 - Crm197および関連タンパク質の発現および精製 - Google Patents
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Description
本願は、参照によりその全てが具体的に組み入れられる、2014年1月31日に出願された、同じ発明の名称の、米国仮出願第61/934,377号の優先権を主張する。
本発明は、細菌宿主における組み換えタンパク質産生の分野に関する。特に、本発明は、大腸菌(E. coli)から高レベルの可溶性の組み換えCRM197タンパク質を得るための産生プロセスに関する。本発明はまた、CRM197のための精製および特徴づけ方法、ならびに該方法により産生されたCRM197の使用にも関する。
ジフテリア毒素(DT)は、コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)の病原性株により合成および分泌されるタンパク性外毒素である。これらの病原性株は、毒素遺伝子を有する、バクテリオファージによる溶原菌を含む。ジフテリア毒素は、535残基の酵素前駆体として分泌されて、トリプシン様プロテアーゼにより2つのフラグメント(AおよびB)の放出を伴ってプロセシングされる、ADP-リボシル化酵素である。フラグメントAは、基質としてNADを使用し、ニコチンアミド環とN-リボースの間のN-グリコシド結合の切断を触媒し、伸長因子EF-2の修飾されたヒスチジン715(ジフタマイド)へのADP-リボースの共有結合転移(covalent transfer) (ADPRT活性)を媒介する。この翻訳後ジフタマイド修飾は、EF-2を不活性化し、タンパク質合成を停止させて、細胞死をもたらす。DTのAフラグメント(Cドメインとも呼ばれる)は触媒活性部位を有しており、かつこれは、中毒の最終段階で必要とされる、毒素の唯一のフラグメントである。Bフラグメント上にあるRドメインは、宿主細胞表面上の受容体への結合を媒介し、および同じくBフラグメント上にあるTドメインは、細胞質へのフラグメントAのpH依存性転移を促進する。アルギニンリッチジスルフィド連結ループはフラグメントAをフラグメントBに(つまり、ドメインCをドメインTRに)結合させる。この鎖間ジスルフィド結合は、鎖の186位でのタンパク分解切断後の、2つのフラグメントの間の唯一の共有連結である。さまざまな非毒性および部分的毒性の免疫学的公差反応型のジフテリア毒素(CRMまたは公差反応性物質)の単離により、CRM197の発見がもたらされた(Uchida et al., Journal of Biological Chemistry 248, 3845-3850, 1973(非特許文献1); またGiannini et al. Nucleic Acids Res. 1984 May 25; 12(10): 4063-9(非特許文献2)も参照されたい)。好ましくは、CRMは、任意の大きさのものであり得、かつDTの全てまたは一部を含有する組成物であり得る。
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法:
少なくとも一つのシストロンがCRMタンパク質をコードするポリシストロン性遺伝子配列に機能的に連結した誘導プロモーターを含む発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階、
CRMタンパク質を産生するために該発現ベクターを誘導する段階、および
発現された該CRMタンパク質を単離する段階。
[本発明1002]
組み換え細胞の、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性が低下している、本発明1001の方法。
[本発明1003]
各シストロンがリボソーム結合部位および開始コドンを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
ポリシストロン性遺伝子配列が、一つまたは複数のリボソーム結合部位と一つまたは複数の開始コドンとの間に少なくとも一つのスペーサーを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記細胞により発現されたCRMタンパク質が可溶性である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
発現されたCRMタンパク質が、細胞内にある、ペリプラズムにある、または分泌されたものである、本発明1001の方法。
[本発明1007]
組み換え細胞が、約15℃~約32℃の温度で増殖する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
CRMタンパク質が、クロマトグラフィによって前記細胞から単離される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
クロマトグラフィが、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
本発明1008の方法により単離されたCRMタンパク質。
[本発明1011]
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法:
発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階であって、該組み換え細胞が、未改変の組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態を、より酸化の状態にシフトさせるように改変されており、かつ該発現ベクターが、CRMコード配列に機能的に連結された誘導プロモーター、リボソーム結合部位と開始コドンなどのスタートコドンとの間のスペーサー配列、該CRMコード配列の上流の発現エンハンサー領域を含む、前記段階、
CRMタンパク質を産生するために該発現ベクターを誘導する段階、および
発現された該CRMタンパク質を単離する段階。
[本発明1012]
組み換え細胞が、大腸菌(E. coli)細胞、または大腸菌の派生体もしくは株である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
組み換え細胞の改変が、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下を含む、本発明1011の方法。
[本発明1014]
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素が、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン還元酵素、タンパク質還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数を含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下が、組み換え細胞の細胞質の酸化還元状態を、非組み換え細胞と比較して酸化の状態にシフトさせる、本発明1011の方法。
[本発明1016]
CRMコード配列が、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはそれらの組み合わせをコードする、本発明1011の方法。
[本発明1017]
CRMコード配列がCRM197をコードする、本発明1011の方法。
[本発明1018]
スペーサーが9個を上回るまたは9個未満のヌクレオチドを含む、本発明1011の方法。
[本発明1019]
スペーサーが、5から20ヌクレオチドを含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
発現エンハンサーが、CRMコード配列の上流のリボソーム結合部位とATGコドンとを含む、本発明1011の方法。
[本発明1021]
前記細胞により発現されたCRMタンパク質が可溶性である、本発明1011の方法。
[本発明1022]
発現されたCRMタンパク質が、細胞内にある、ペリプラズムにある、または分泌されたものである、本発明1011の方法。
[本発明1023]
組み換え細胞が、約15℃~約32℃の温度で増殖する、本発明1011の方法。
[本発明1024]
CRMタンパク質が、クロマトグラフィによって前記細胞から単離される、本発明1011の方法。
[本発明1025]
クロマトグラフィが、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
本発明1024の方法により単離されたCRMタンパク質。
[本発明1027]
単離されたCRMタンパク質を結合する段階をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1028]
結合されたCRMタンパク質がワクチンである、本発明1027の方法。
[本発明1029]
本発明1028の方法により作製されたCRMタンパク質ワクチン。
[本発明1030]
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法:
CRMコード配列に機能的に連結したプロモーターを含む発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階、
該CRMコード配列からCRMタンパク質を発現する段階、および
発現された該CRMタンパク質を単離する段階。
[本発明1031]
組み換え細胞が、原核または真核細胞である、本発明1030の方法。
[本発明1032]
原核細胞が、大腸菌細胞、または大腸菌の派生体もしくは株である、本発明1031の方法。
[本発明1033]
プロモーターが構成的または誘導性である、本発明1030の方法。
[本発明1034]
CRMコード配列が、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはそれらの組み合わせをコードする、本発明1030の方法。
[本発明1035]
CRMコード配列が、CRM197をコードする、本発明1030の方法。
[本発明1036]
組み換え細胞が、未改変の組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態を、より酸化の状態にシフトさせるように改変されている、本発明1030の方法。
[本発明1037]
改変された組み換え細胞の、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性が低下している、本発明1036の方法。
[本発明1038]
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素が、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、タンパク質還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数を含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
発現ベクターが、リボソーム結合部位と開始コドンの間にスペーサー配列を含む、本発明1030の方法。
[本発明1040]
スペーサーが、9個を上回るまたは9個未満のヌクレオチドを含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
スペーサーが、5から20ヌクレオチドを含む、本発明1039の方法。
[本発明1042]
発現ベクターが、発現エンハンサーを含む、本発明1030の方法。
[本発明1043]
発現エンハンサーが、CRMコード配列の上流のリボソーム結合部位と開始コドンとを含む、本発明1030の方法。
[本発明1044]
単離する段階が以下を含む、本発明1030の方法:
ローディングバッファーと共に樹脂を含有するクロマトグラフィカラムに、CRMタンパク質を負荷する段階、
一種または複数種の洗浄バッファーで該樹脂を洗浄する段階、
溶出バッファーで樹脂からCRMタンパク質を溶出させる段階。
[本発明1045]
ローディングバッファーおよび洗浄バッファーが同じであってもよい、本発明1044の方法。
[本発明1046]
ローディングバッファーおよび一種または複数種の洗浄バッファーが、約10 mS/cm以下の伝導率を有する低伝導率バッファーである、本発明1044の方法。
[本発明1047]
溶出バッファーが、約10 mS/cm以上の伝導率を有する高伝導率バッファーである、本発明1044の方法。
[本発明1048]
樹脂が、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂からなる群より選択される、本発明1044の方法。
[本発明1049]
以下を含む、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質の折りたたみを特徴づける方法:
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質をHB-EGFに接触させる段階、
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質のHB-EGFへの結合の量を測定する段階、および
測定された結合の量によって、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質の折りたたみを判定する段階であって、該結合が正しい折りたたみを示す、前記段階。
[本発明1050]
ジフテリア毒素またはCRMが受容体結合ドメインを含有する、本発明1049の方法。
[本発明1051]
CRMタンパク質がCRM197を含む、本発明1049のCRMタンパク質の折りたたみを特徴づける方法。
[本発明1052]
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質およびHB-EGFのうちの少なくとも一つが、固相支持体に結合されている、本発明1049の方法。
[本発明1053]
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質のHB-EGFへの結合の量が、ELISAにより決定される、本発明1049の方法。
[本発明1054]
HB-EGFに結合するCRMタンパク質がPBSにおいて可溶性であり、かつ約pH7.5のバッファー中5 mg/ml以上に濃縮される、本発明1049の方法。
[本発明1055]
プロモーターと、それぞれがタンパク質をコードする2つ以上のシストロンとを含む発現ベクターであって、少なくとも一つのシストロンがCRMタンパク質をコードし、各シストロンがリボソーム結合部位および開始コドンを有している、前記発現ベクター。
[本発明1056]
リボソーム結合部位と開始コドンの間にスペーサーをさらに含む、本発明1055の発現ベクター。
[本発明1057]
スペーサーが、5~20ヌクレオチドを含む、本発明1056の発現ベクター。
[本発明1058]
スペーサーが9ヌクレオチドを含まない、本発明1056の発現ベクター。
本発明の別の態様および利点は、一部は以下の説明に記述されており、および一部はこの説明から自明であるか、または本発明の実施から認識されるであろう。
可溶性で無傷の組み換えCRMは、最初はプロテアーゼ欠損大腸菌で産生された(Bishai et.al 1987)。しかしながら、タンパク質産生の量は極めて少なかった。次に、CRM197が、封入体として(Stefan A, et al. J Biotechnol. Dec 20;156(4):245-52, 2010;国際公開公報第2011/126811号, 中国特許出願第200610042194号)、またはシグナルペプチドによりペリプラズムに移動する可溶性タンパク質として(国際公開公報第2011/042516号)、大腸菌細胞内で産生された。大腸菌のペリプラズムは、ジスルフィド結合の形成を可能にする酸化環境である。CRM197は、正しい折りたたみおよび機能のために、ならびにタンパク質可溶性のためにおそらく重要である2つのジスルフィド結合を有する。
また好ましくは、細胞は、T7プロモーター駆動型タンパク質発現に適しており、かつ遺伝子型が
であるものである。SHUFFLE(商標)株は、ジスルフィド結合イソメラーゼDsbCの染色体コピーを構成的に発現する。DsbCは、誤って酸化したタンパク質のその正しい形への修正を促進する。細胞質のDsbCはまた、ジスルフィド結合を必要としないタンパク質の折りたたみに役立ち得るシャペロンでもある。
を含む。したがって、本発明の別の態様は、規定のスペーサー配列の有無にかかわらず、および宿主細胞の有無にかかわらず、CRM、ヌクレオチド、およびアミノ酸配列の発現構築物を含む。
成熟CRM197をコードしたDNAが、DNA調節フラグメントおよびコードフラグメントの次の配列をもたらすポリシストロン形式で発現ベクターにクローン化された:tacプロモーター-リボソーム結合部位-ATGコドン-T7 tag-リボソーム結合部位-ATGコドン-CRMコード配列-ストップコドン。ORIGAMI 2、C41を含む異なる大腸菌株が、発現株として試験された(図1)。
CRM197は、37℃で不溶性に発現された。発現温度が、37℃を下回ったとき、ORIGAMI(商標)2細胞およびSHUFFLE(商標)細胞において発現されたタンパク質の溶解度は増大するが、他の試験された大腸菌株では増大しない。CRM197は、ORIGAMI(商標)2細胞において18℃で発現されるとき、最も溶解する。
EESはCRM含有ベクター中のCRM配列の転写を促進し、2つのタンパク質;短いEESペプチドおよびCRMペプチドに翻訳されるポリシストロン性mRNAをもたらす。天然のCRM遺伝子のコード配列が可能性のある3D構造形成について分析されて、翻訳を阻害し得る潜在的な複数のヘアピンを含有することが判明した。ヘアピン構造を持たないmRNAをもたらすが同じCRMアミノ酸配列を翻訳する可能性があるCRM配列が作られた。この遺伝子配列は、最適化されたCRM配列を意味し、SEQ ID NO 8を含む。
CRM197を発現するSHUFFLE(商標)細胞を、マイクロフルダイザーを用いて破壊(open)し、1Mの塩化ナトリウムを細胞溶解物に加えた。同じ1Mまで十分な硫酸アンモニウムをこれに加え、次に30分間、20,000x gで遠心分離し、誤って折りたたまれたCRM197と細菌のタンパク質の大半を取り除いた。遠心分離の後に、硫酸アンモニウム濃度を2.2Mにさらに増加させた。主にCRM197である沈殿物が回収されて、そして低伝導率バッファー中で再度可溶化された。
硫酸アンモニウムで沈殿されたCRM197を、20mM Tris-HCl pH 8.0中で再度可溶化して伝導率5 mS/cmを達成し、そしてヘパリンセファロースCL-6B樹脂(GE)を含有するカラムに負荷した。精製を次の条件下で実行した:流速が5ml/分、洗浄バッファーA: 20mM Tris-HCl pH8。溶出を、バッファーB 0~100%勾配で実施した。バッファーB: バッファーA + 20 CV中1M NaCl。溶出されたCRM197は、還元および非還元条件でSDS-PAGEにより分析した。溶出されたCRM197の純度は、95%より高かった。DDTで還元されたタンパク質は、無傷な形のCRM197が大腸菌において発現されることを裏づける一本のポリペプチドとして現れる。
CRM197を発現するSHUFFLE(商標)細胞を、1xPBS、pH 7.4、1%ピロリン酸ナトリウム中で、マイクロフルダイザーを用いて破壊した。溶解物は、深層濾過により不純物を除去した。不純物を除去した溶解物を、Q Sepharose XL (GE)を含有するカラムに負荷し、そして通過画分を回収した。量と伝導度を低減させるために、通過画分は、10Kカセット(Sartorius)を用いて、タンジェンタルフロー濾過に供した。Capto Devirs樹脂を、25mMリン酸ナトリウムバッファー、pH8.0で平衡化した。CRM197を、次の条件の下でカラムに結合させた:カオトロピック剤(例えば、この場合は尿素)を含有する結合バッファー中、伝導率は10mS/cm未満、洗浄バッファーは25mMリン酸ナトリウム、pH8.0だった。溶出はNaClを用いて行った。溶出されたCRM197は、還元および非還元条件下でSDS-PAGEにより分析した。溶出されたCRM197の純度は、95%より高かった。DDTで還元されたタンパク質は、CRM197が精製過程で無傷のままであったことを裏づける一本のポリペプチドとして現れる。
組み換え可溶性ジフテリア毒素受容体HB-EGF (DTR) (Sigma)をELISAプレートに結合させた。5%スキムミルクのブロック溶液を、高いバックグラウンドを予防するために使用した。1xPBS、pH7.4、0.1% Twin 20中に希釈された組み換えCRM197を、37℃で1時間プレート上でインキュベートした。HB-EGFに結合したCRM197を、ウサギポリクローナル抗CRM197抗体および大豆ペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体(Fina BioSolutions; Rockville, MD)により検出した。変性した組み換えCRM197は、受容体に結合しなかった。
ELISAプレートを可溶性HB-EGF(ヘパリン結合性EGF様成長因子)でコーティングし、そして5%スキムミルクでブロックした。CRM197は、受容体に結合し、そしてウサギ抗CRM197ポリクローナル抗体およびSBPと結合したヤギ抗ウサギポリクローナルで検出された。大腸菌内で発現されたCRM197は、HB-EGFに対し、コリネバクテリウムおよびシュードモナスで産生されたCRMと同じ親和性を示した。
CRM197を本発明の方法にしたがって発現させかつ精製し(実施例1)、そしてCDAPの化学的性質を用いて肺炎球菌莢膜多糖体血清型14および6Bに化学的に連結した(結合した)(Lees, A., Producing immunogenic constructs using soluble carbohydrates activated via organic cyanylating reagents。米国特許第5,651,971号; 第5,693,326号および第5,849,301号を参照されたい)。結合体を、結合していないタンパク質および多糖体から精製した。メスのBALB/cマウスを、表1にあるスケジュールにしたがって、結合体を用いて皮下的に免疫化した。マウスを、完全フロイントアジュバンドにおいて免疫化し、そして不完全フロイントアジュバンドにおいて2回ブーストし、そして57日目に採血した。
Claims (7)
- 完全長CRMタンパク質を産生する方法であって、
該CRMタンパク質をコードする発現ベクターを含む組み換え細胞から、該CRMタンパク質を発現させる段階であって、該組み換え細胞が、単一のジスルフィド還元酵素の活性の低下を有し、該発現ベクターが、該CRMタンパク質のコード領域に機能的に連結したプロモーターを含み、該組み換え細胞が、大腸菌(E. coli)細胞または大腸菌の株であり、該ジスルフィド還元酵素が、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つを含み、該ジスルフィド還元酵素の活性の低下が、該ジスルフィド還元酵素の活性の低下を有さない組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態をより酸化状態にシフトさせるものであり、該CRMタンパク質が、細胞質において発現され、該発現された該CRMタンパク質が、可溶性でありかつタグを含まないタンパク質である、段階;ならびに
該発現された該CRMタンパク質を単離する段階
を含む、前記方法。 - 前記発現ベクターが、リボソーム結合部位、開始コドン、および発現エンハンサー領域を含む、請求項1記載の方法。
- 前記発現された可溶性の完全長CRMタンパク質が、自然に折りたたまれたタンパク質を含む、請求項1記載の方法。
- 前記プロモーターが誘導プロモーターであり、かつ前記発現段階が、誘導プロモーターを第1の誘導剤を用いて誘導することを含む、請求項1記載の方法。
- 前記単離段階がクロマトグラフィを含む、請求項1記載の方法。
- 前記クロマトグラフィが、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む、請求項5記載の方法。
- 前記発現された完全長CRMタンパク質を多糖体またはペプチドと結合する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
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