KR20220154221A - 용해성 재조합 단백질의 생산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미생물에서 펩타이드 및 단백질과 같은 산물을 발현 및 정제하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 프리-산물을 재조합에 의해 발현시키고, 미생물의 세포질에서 발현된 프리-산물을 변형하여 활성/최종 또는 요망되는 형태로 생산물을 제조한다. 바람직한 재조합 산물의 발현과 관련한 변형은, 모두 동일한 세포에서 이루어지는, 적절한 단백질 접힘을 허용하기 위한 세포질의 레독스 상태의 시트프, 단백질을 활성화하기 위한 프리-단백질의 부위-특이적인 절단, 단백질의 N-말단으로부터 원치않는 메티오닌의 부위-특이적인 절단 및/또는 바람직한 단백질 입체형태를 형성하기 위한 하나 이상의 라이게이션을 포함한다.

Description

용해성 재조합 단백질의 생산
발명에 대한 권리
본 발명은 국립보건원에서 부여한 지원 번호 1R43AI148018-01A1 FAIN: R43AI148018로 미국 정부의 지원 하에 이루어졌으며, 미국 정부가 본 발명에 대해 일부 권리를 가진다.
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2021년 2월 24일자 미국 가출원 번호 63/152,954, 2020년 3월 16일자 미국 가출원 번호 62/990,083 및 2020년 3월 16일자 미국 출원 번호 16/819,775에 대해 우선권을 주장하며, 현재 계류 중인 이들 문헌은 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 구체적으로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 미생물에서 펩타이드 및 단백질과 같은 생산물을 발현 및 정제하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상세하게는, 프리-생산물이 재조합 방식으로 발현되고, 미생물의 세포질은 발현된 프리-생산물을 변형하여 최종 또는 유용한 형태로 만든다. 이러한 변형은 세포질의 레독스 상태의 시프트 및 부위-특이적인 절단 및/또는 라이게이션을 포함한다.
E. coli는 연구 및 치료학적 목적으로 재조합 단백질을 생산하기 위해 널리 이용되는 숙주이다. 재조합 단백질은 E. coli 세포질 또는 원형질막공간에서 발현될 수 있다. E. coli에서 세포질 재조합 단백질을 발현하는데 있어 한가지 문제는, E. coli에서 재조합 단백질의 발현을 개시하기 위해 단백질 코딩 서열이 ATG 코돈으로 시작해야 한다는 점으로, ATG는 포르밀-메티오닌으로 번역된 다음 포르밀메티오닌 데포르밀라제에 의해 처리되어 N-말단 메티노닌이 된다. 그래서, E. coli에서 재조합 단백질을 생산하기 위해, 천연 또는 성숙 단백질 서열에 ATG 코돈을 추가한다. 세포내 재조합 단백질의 발현 중에, N-말단 메티오닌은 통상적으로 내인성 E. coli 메티오닌 아미노펩티다제 (MAP)에 의해 절단된다. 이 과정은, 아마도 재조합 단백질의 과다 발현 및 존재하는 MAP의 양적 제한으로 인해, 인접 잔기가 절단하기에 최적임에도 불구하고, 재조합 단백질에 대해 반드시 효과적으로 이루어지는 것은 아니다. 그래서, 재조합 단백질의 상당량이 메티오닌이 첫번째 아미노산일 수 있다. 이는, N-말단 메티오닌은 성숙 단백질 서열의 일부가 아니므로, 대부분의 단백질에 적합하지 않다. N-말단 메티오닌의 존재는 또한 기능에 영향을 미치는 구조 변화를 단백질에서 유발할 수 있다. N 말단-메티오닌의 효율적인 절단을 보장하기 위한 기존 방법은 재조합 MAP를 이용한 시험관내 처리를 포함한다. 다른 방법은 발현 벡터에 MAP 코딩 서열을 추가하는 것으로, 즉 MAP를 재조합 단백질과 더불어 공동-발현시킨다. 후자의 경우, MAP의 공동-발현은 원하는 재조합 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다. 이러한 2가지 방법 모두 구현하는데 시간 및 비용이 많이 소모된다. 따라서, 재조합 단백질의 발현을 유의하게 저해하지 않으면서 MAP를 고도로 발현하는, E. coli 발현 균주를 확보하는 것이 요망될 것이다. 이는 세포질에서 이의 본래의 서열을 가진 표적 단백질을 증가된 양으로 생산할 수 있게 해준다.
E. coli의 세포질에서 발현된 재조합 단백질은 불용성 봉입체를 형성할 수 있다. 봉입체 내 단백질은 시험관내에서 다시 접히는 과정을 수행하여, 용해성 단백질을 제조할 수 있다. 그러나 이러한 단백질은 N-말단 메티오닌을 함유할 것이며, 부적절하다.
E. coli 세포질은 환원성 환경을 가지고 있어, 이황화 결합을 함유한 재조합 단백질은 통상적으로 세포내 발현시 불용성이다. 이와는 대조적으로, E. coli의 원형질막공간은 산화성 환경이다. 그래서, 이황화 결합을 가진 다수의 재조합 단백질들은 적절한 접힘 및 용해성을 확보하기 위해, 원형질막공간으로 분비시킨다. 재조합 단백질을 원형질막공간으로 향하게 하는 신호 펩타이드는 분비 과정 중에 절단되어, 본래의 아미노산 서열을 가진 단백질이 생산된다. 그러나, 단백질을 원형질막공간으로 향하게 하는 전좌 기전은 제한적인 능력으로 인해, 재조합 단백질의 원형질막공간 발현 수준은 통상적으로 낮다. 한편, E. coli 세포질에서 발현 수준은 세포 배양물 L 당 재조합 단백질 수 g일 수 있다. 따라서, 세포질에서 적절하게 접힌, 용해성의 이황화-결합된 단백질을 발현시킬 수 있는 방법이 요망될 것이다. 아울러, 이들 단백질을 N-말단 메티오닌 없이 생산할 수 있는 방법이 요망될 것이다.
gor-/trx- 돌연변이를 가진 Origami® (EMDMillipore), Shuffle® (New England Bio)과 같은 상업적으로 이용가능한 E. coli 균주는 이황화 결합을 가진 세포내 용해성 단백질을 생산할 수 있지만, 이들 세포 균주는 원활하게 기능하지 못하여 고 밀도로 증식시킬 수 없다. 따라서, 이들 균주는 연구용 물질을 제조하는데에는 적합하지만, 이의 낮은 증식 수준으로 인해 상업적으로 이용하긴 어렵다. 이에, N-말단 메티오닌이 없는, 적절하게 접힌 세포내 이황화-결합을 가진 단백질을 고 수준으로 발현하는 균주가 요구되고 있다.
본 발명은 현행 전략 및 설계와 관련한 문제 및 단점을 해결하며, 재조합 펩타이드 및 단백질을 생산하기 위한 새로운 조성물과 방법을 제시한다.
본 발명의 일 구현예는, 프로모터를 비롯하여 단백질 서열을 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 박테리아, 및 숙주의 게놈에 삽입된, 프로모터의 통제 하에 유전자를 포함하는 박테리아에서, 단백질을 발현시키는 단계; 및 단백질을 단리하는 단계를 포함하며, 유전자에 의해 발현된 폴리펩타이드가 세포질에서 재조합 단백질의 발현, 접힘 또는 용해성을 용이하게 하는, 박테리아에서 재조합 펩타이드 및 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는, 유도성 프로모터를 비롯하여 단백질 서열을 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 박테리아, 및 숙주 세포의 게놈에 삽입된 펩티다제 유전자를 또한 발현하는 박테리아에서, 단백질을 발현시키는 단계; 및 단백질을 단리하는 단계를 포함하며, 펩티다제 발현이 프로모터의 통제 하에 이루어지고, 펩티다제는 발현된 단백질에 작용해 단백질의 N-말단 영역으로부터 포르밀-메티오닌 기를 제거하는, 박테리아에서 재조합 펩타이드 및 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. N-말단 메티오닌을 제거하는 펩티다제는 메티오닌 아미노 펩티다제 (MAP)로 지칭할 수도 있다. 바람직하게는, 삽입되는 유전자는 리보솜 결합부, 개시 코돈 및 발현 인핸서 및/또는 억제자 영역을 포함한다. 바람직하게는, 재조합 세포는 단 한가지 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 또는 단 2가지 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소된 것이다. 바람직하게는, 재조합 세포는 E. coli 세포 또는 E. coli로부터 유래한 세포 (derivative) 또는 균주 (strain)이며, 바람직하게는, 발현되는 재조합 단백질은 파상풍 독소, 파상풍 독소 중쇄 단백질, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 엑소단백질 A, 슈도모나스 에어루지노사 톡소이드, 보르데텔라 퍼투시스 톡소이드, 클로스트리듐 퍼프린젠스 톡소이드, 에세리키아 콜라이 이열성 독소 B 서브유닛, 네이세리아 메닌기티디스 외막 복합체, 헤모필러스 인플루엔자 단백질 D, 플라젤린 Fli C, 사이토카인, 단쇄 항체, 낙타과 (camelids), 나노바디 및 이들의 단편, 유도체 및 변이체를 포함한다. 또한, 바람직하게는, 재조합 단백질은 프리-단백질은 프리-단백질 프로렐락신, 인슐린 및 인슐린-유사 계열의 구성원일 수 있다. 바람직하게는, 삽입된 유전자 및/또는 발현 벡터는 펩티다제에 대한 유도성 프로모터를 포함한다. 발현은 유도성 프로모터를 제1 유도 물질로 유도하는 것을 포함하며, 제2 유도 물질로 유도가능할 수 있는 재조합 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 제1 및 제2 유도 물질은 서로 다른 것일 수도 있지만, 동일하다. 바람직하게는, 제1 삽입 유전자 또는 발현 벡터는 유도성 제2 프로모터를 포함하며, 펩티다제 발현은 제1 유도 물질을 이용해 제2 유도성 프로모터를 유도하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 단리는 크로마토그래피를 포함하며, 크로마토그래피는 설페이트 수지, 겔 수지, 활성 황산화 수지, 포스페이트 수지, 헤파린 수지 또는 헤파린-유사 수지를 포함한다. 바람직하게는, 단리된 발현 단백질은 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 폴리에틸렌 글리콜의 유도체와, 또는 예를 들어, 다당류, 펩타이드, 항체 또는 항체의 일부분, 지질, 지방산, 소분자, 합텐 또는 이들의 조합과 같은 폴리머와 접합된다.
본 발명의 다른 구현예는 펩타이드를 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포로부터 펩타이드의 N-말단에 포르밀-메티오닌 기를 가진 펩타이드를 발현시키는 단계, 발현된 펩타이드에 작용하여 펩타이드의 N-말단으로부터 포르밀-메티오닌 기를 제거하는 펩티다제를 재조합 세포의 삽입 유전자로부터 발현시키는 단계, 및 펩타이드를 단리하는 단계를 포함하는, 용해성 또는 불용성 펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는 펩타이드를 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포에서 펩타이드의 N-말단에 포르밀-메티오닌 기를 가진 펩타이드를 발현시키되, 재조합 세포는 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소된 것이고, 발현 벡터는 펩타이드의 코딩 영역에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하며, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 감소로 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소되지 않은 재조합 세포와 비교해 세포질의 레독스 상태가 더 산화성인 상태로 시프트되는 단계; 발현된 펩타이드에 작용하여 펩타이드의 N-말단으로부터 포르밀-메티오닌 기를 제거하는 펩티다제를 재조합 세포의 삽입된 유전자로부터 발현하는 단계; 및 펩타이드를 단리하는 단계를 포함하는, 펩타이드 생산 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 리보솜 결합부, 개시 코돈 및 발현 인핸서/억제자 영역을 포함한다. 바람직하게는, 재조합 세포는 다이설파이드 리덕타제 효소 단 1종 또는 다이설파이드 리덕타제 효소 단 2종의 활성이 감소된 것이다. 바람직하게는, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소는 옥시도리덕타제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 티오레독신 리덕타제 또는 글루타티온 리덕타제 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는, 재조합 세포는 E. coli 세포 또는 E. coli로부터 유래한 세포 또는 균주이며, 펩타이드 또는 단백질은 파상풍 독소, 파상풍 독소 중쇄 단백질, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 엑소단백질 A, 슈도모나스 에어루지노사 톡소이드, 보르데텔라 퍼투시스 톡소이드, 클로스트리듐 퍼프린젠스 톡소이드, 보툴리눔증 독소, 에세리키아 콜라이 이열성 독소 B 서브유닛, 네이세리아 메닌기티디스 외막 복합체, 헤모필러스 인플루엔자 단백질 D, 플라젤린 Fli C, 사이토카인, 단쇄 항체 , 낙타과, 나노바디, 및 이들의 단편, 유도체 및 변이체를 포함한다. 바람직하게는, 프로모터는 유도성 프로모터이고, 발현은 유도 물질을 이용하여 유도성 프로모터를 유도하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 단리는 크로마토그래피를 포함하며, 크로마토그래피는 설페이트 수지, 겔 수지, 활성 황산화 수지, 포스페이트 수지, 헤파린 수지 또는 헤파린-유사 수지를 포함한다. 바람직하게는, 단리된 펩타이드는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및/또는 PEG의 유도체와, 또는 예를 들어, 다당류, 펩타이드, 항체 또는 항체의 일부분, 지질, 지방산, 소분자, 합텐 또는 이들의 조합과 같은 폴리머와 접합된다.
본 발명의 다른 구현예는 gor 돌연변이를 가진 E. coli 세포주에 관한 것이다. 바람직하게는, 세포주는 ATCC 기탁번호 PTA-126975로부터 입수하거나 또는 유래한 세포를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는 재조합 조작된 프로테아제 유전자를 포함하는 재조합 세포에서 프리-단백질을 발현시키는 것을 포함하는 단백질 생산 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 프로테아제 유전자 및/또는 프리-단백질 유전자는 프로모터 및/또는 번역 유도 서열을 포함한다. 프로모터들은 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 번역 유도 서열은 존재할 경우 유전자들에서 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 바람직하게는, 프리-단백질이 발현된 후, 프로테아제 유전자의 발현은 프리-단백질이 단백질로부터 절단되도록 유도하며; 단백질을 회수한다. 바람직하게는, 프리-단백질은 프로-인슐린, 프로-인슐린-유사 단백질, 프로렐락신, 프로오피오멜라노코르틴 (proopiomelanocortin), 프로효소 (proenzyme), 프로호르몬, 프로안지오텐시노겐, 프로트립시노겐, 프로키모트립시노겐, 프로펩시노겐, 응고 시스템의 프로단백질, 프로트롬빈, 프로플라스미노겐, 컴플리먼트 시스템의 프로단백질, 프로카스파제, 프로팍시파스틴 (propacifastin), 프로엘라스타제, 프로리파제, 프로카르복시 폴리펩티다제, 절단가능한 리더 서열을 가진 단백질, 절단가능한 태그 서열, 절단가능한 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산 (예를 들어, Met)을 가진 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 프로테아제 유전자는 재조합 세포의 게놈에 삽입된다. 또한, 바람직하게는, 메티오닌 아미노펩티다제 유전자는 재조합 세포의 게놈에 삽입되며, 메티오닌 아미노펩티다제 유전자의 발현시 프리-단백질 또는 단백질로부터 N-말단 메티오닌이 제거된다. 메티오닌 아미노펩티다제 유전자의 발현은 바람직하게는 유도인자 서열 (inducer sequence)의 통제 하에 이루어지며, 메티오닌 아미노펩티다제의 유도인자 서열 및 프리-단백질의 번역 유도 서열은 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 또한, 바람직하게는, 재조합 세포는 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 저하된 것이며, 이는 gor 돌연변이를 가진 E. coli일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 둘다 삽입된, 메티오닌 아미노펩티다제 유전자 및 프로테아제 유전자를 포함하는 재조합 세포주에 관한 것이다. 바람직하게는, 세포는 gor 돌연변이로부터 기인할 수 있는 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 감소를 추가로 포함한다.
본 발명에 대한 다른 구현예 및 이점들이 아래 설명에서 일부 설명되며, 부분적으로는 이러한 설명으로부터 명확해질 수 있거나 또는 본 발명의 실시를 통해 학습할 수 있다.
E. coli에서는 번역을 개시하기 위해 단백질에 대응되는 ATG 코돈을 필요로 하므로, 전형적으로 N-말단에 메티오닌을 가진 상태로 발현된다. 따라서, 세포내 발현된 단백질은 (본래의 서열이 메티오닌으로 시작되지 않은 한) 본래의 아미노산 서열의 일부가 아닌 N-말단 메티오닌을 포함하고 있다. MAP에 의해 N-말단 메티오닌을 제거하는 것이 단백질의 기능과 안정성 측면에서 중요할 수 있다. 내인성 메티오닌 아미노펩티다제 (MAP)는 신생 합성된 단백질의 N-말단 메티오닌을 전형적으로 최대 60-70%로 절단할 수 있다. 그러나, 고도로 발현된 재조합 단백질의 경우, 내인성 MAP의 활성 수준이 N-말단 메티오닌의 요망되는 양을 제거할 정도로 충분하지 않을 수 있다. N-말단 메티오닌의 제거가 E. coli에서 세포내 재조합 단백질을 생산하는데 중요한 문제일 수 있다. 따라서, 원치않는 N-말단 Met을 효율적으로 제거할 수 있는 E. coli 균주가 매우 요망될 것이다.
세포내 발현된 재조합 단백질의 용해성과 적절한 접힘이 세포내 재조합 단백질 발현 시스템에서 주된 관심 사항이다. E. coli 세포질은 이황화 결합 형성에 유리하지 않은 환원성 환경이다. 그래서, 이황화 결합을 가진 재조합 단백질은 통상적으로 세포내 발현시 불용성이다. 이러한 불용성 단백질은 정제하기 어렵고, 비용이 많이 들며 시간이 걸린다. 재조합 단백질을 생산하기 위해서는, 특히 상업적인 용도에서는 세포 고 밀도가 바람직하다.
N-말단 포르밀-메티오닌이 또한 효과적으로 제거된 적절하게 구성된 재조합 단백질을 다량 발현하기 위해 유전자 조작된 미생물들이 놀랍게도 개발되었다. 이들 미생물은 이황화 결합을 가진 용해성 재조합 단백질을 세포질에서 발현하여 N-말단 메티오닌을 제거하도록, 유전자 조작된 것이다. 이들 미생물은 단백질의 N-말단에 메티오닌이 없는, 이황화 결합을 가진 적절하게 접힌 세포내 재조합 단백질을 다량으로 생산한다.
바람직하게는, 미생물은 박테리아의 게놈에 삽입된 하나 이상의 메티오닌 아미노펩티다제 (MAP) 유전자를 가진다. N-말단 메티오닌을 제거하는 펩티다제는 비-제한적으로 E. coli MAP, 효모 MAP 및 인간 MAP 및 이들의 돌연변이를 포함하며, 이들 모두 이용할 수 있다. MAP의 코딩 서열은 유도성 프로모터의 통제 하에 박테리아 게놈에, 바람직하게는 게놈의 파괴를 방지하는 방식으로, 삽입된다. 유도성 프로모터로 인해 선택된 시점에, 바람직하게는 과다 발현된 재조합 단백질로부터 포르밀-메티오닌을 효과적으로 제거하기 위해 더 많은 MAP가 필요할 경우에만, 부가적인 MAP의 발현을 개시할 수 있다. MAP 유전자에 대한 프로모터는 재조합 단백질에 대한 프로모터와 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 일 예에서, MAP와 재조합 단백질의 발현이 동일 시점에 유도될 수 있도록 MAP 유전자와 재조합 단백질 둘다에 대해 tac-프로모터를 락토스/IPTG 유도성 프로모터로서 이용하였다. MAP 발현 및 재조합 단백질의 발현에 대해 서로 다른 유도성 프로모터의 조합을 이용함으로써, 각각의 발현 시기를 제어할 수 있다.
구축된 안정적인 박테리아 발현 균주가 생체내에서 원치않는 f-Met가 절단된 재조합 단백질을 세포에서 생산하기 위해 이용될 수 있으므로, 게놈에 부가적인 MAP를 삽입하는 것이 특히 바람직하다. 기존에는, 원치않는 N 말단 메티오닌을 제거하는데 정제된 MAP를 이용하거나 또는 동일한 벡터에서 재조합 단백질로서 또는 추가적인 벡터를 이용하여 MAP를 발현시킴으로써 번역 후 시험관내 절단으로 수행하였다. 이러한 과정은 길고 복잡하다. 필요시에 f-met를 절단할 수 있는 세포를 이용함으로써, 이들 미생물은 단백질의 발현 및 정제 과정을 크게 단순화한다.
MAP는 인접 아미노산에 대한 특별한 요건을 충족하는 N-말단 메티오닌을 절단한다. 하나 이상의 부가적인 MAP를 이용해, N-말단 메티오닌이 없는 단백질을 세포에서 보다 효율적으로 생산할 수 있다. MAP를 1종 보다 더 많은 수를 삽입할 경우, 이들 MAP 유전자는 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 이들 MAP 유전자의 전사체는 동일한 또는 서로 다른 유도성 프로모터 하에 배치될 수 있다. 이들 프로모터는 재조합 단백질을 발현시키기 위해 사용되는 프로모터와 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 유도성 프로모터들의 조합을 이용함으로써, N-말단 메티오닌이 없는 세포에서 발현되는 재조합 단백질의 생산 시기와 양을 제어할 수 있다.
이황화 결합된, 적절하게 접힌 세포내 용해성 재조합 단백질을 발현할 수 있는 E. coli 세포가 언급된 바 있다 (미국 특허 번호 10,597,664 및 10,093,704). 이러한 균주의 일 예가 E. coli (BL21 Gor-)이다. BL21Gor-를 이용하여, 유전자 측면에서 무독화된 디프테리아 독소로서 백신 담체 단백질 CRM197 등의, 이황화 결합된 적절하게 접힌 세포내 용해성 재조합 단백질을 고 수준으로 발현한 바 있다. 이들 세포에서 발현된 CRM197은 대략 60%가 N-말단 메티오닌을 가지고 있었다. 이 균주에 부가적인 MAP 유전자를 프로모터의 통제 하에 균주에 삽입함으로써, 이황화 결합된, N-말단 메티오닌이 없는, 적절하게 접힌 세포내 용해성 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 이러한 균주에 대한 예는 E. coli (BL21 Gor/Met) 균주이다. 이 균주는 이황화 결합되지만 N-말단 메티오닌이 없는 용해성 단백질을 세포 배양물 1 L 당 수 g의 수준으로 세포에서 생산할 수 있다. BL21 Gor/Met에서 발현된 CRM197은 N-말단 메티오닌을 매우 낮은 수준으로 포함한다. 아울러, E. coli 게놈에 유도성 메티오닌 아미노펩티다제 유전자의 삽입은 CRM197 발현 수준에 유의한 영향을 미치지 않는다.
삽입을 용이하게 하기 위한 몇가지 다른 옵션들도 이용가능하지만, 상동적인 재조합에 의해 MAP 유전자를 게놈에 삽입하였다. Gor/Met 세포 균주를 구축하기 위해 이용된 방법이 유전자 삽입의 일 예이다. Gor/Met 세포의 경우, red 재조합효소 시스템 (recombinase system)을 이용해 MAP 유전자를 BL21 Gor- 세포의 Gor 유전자좌에 삽입하였다. MAP 유전자는 BL21 게놈으로부터 PCR을 이용해 추출하고, Tac 프로모터의 통제 하에, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 유전자의 하류에 삽입하였으며, 양쪽에는 플립파제 (flippase) 인지 표적 (FRT) 서열이 위치한다. MAP 및 CAT 유전자가 함께 전달 유전자 카세트를 구성한다. 오리지널 Gor 유전자좌의 상류 및 하류에 위치한 각각 염기 50개 서열을 PCR에 의해 각각 전달 카세트 상류 및 하류에 첨가하였다. 최종 PCR 산물을 이용해, 이미 Red 재조합효소로 형질전환된 BL21 Gor- 세포에 형질전환하였다. 세포에서 red 재조합효소의 발현은 Gor 유전자좌의 측면 서열과 전달 카세트 간의 상동적인 재조합을 촉매한다. 클로람페니콜 내성 박테리아 콜로니는 전달 카세트가 성공적으로 삽입되었음을 검증해준다. 그 후, 검증된 박테리아는, 발현시 CAT 유전자 측면에 위치한 FRT 서열을 인지하여 그 유전자를 잘라 삽입된 MAP를 남기게 되는, 플립파제 유전자로 형질전환하였다. 즉, Gor/Met 세포주는 게놈의 다른 부위는 파괴하지 않으면서 Gor 유전자좌에 MAP 유전자가 위치하게 된다.
E. coli 숙주 세포로부터 CRM197과 같은 단백질을 다량 생산하기 위해, 단백질의 N-말단에 존재하는 f-Met는 세포질에서 효소적으로 제거한다. 생산량은 전형적으로 박테리아 세포 배양물 L 당 mg으로 표시된다. 단백질은 25 mg/L 이상, 50 mg/L 이상, 200 mg/L 이상, 300 mg/L 이상, 400 mg/L 이상, 500 mg/L 이상, 600 mg/L 이상, 700 mg/L 이상, 800 mg/L 이상, 900 mg/L 이상, 1,000 mg/L 이상, 1,500 mg/L 이상 또는 2,000 mg/L 이상으로 생산된다. 요망되는 바와 같이 발현된 단백질은 전장 단백질 및/또는 말단 절단된 단백질뿐 아니라 단백질의 변형된 아미노산 서열을 모두 망라한다. 변형은 보존적인 아미노산 결손, 치환 및/또는 부가 중 하나 이상을 포함한다. 보존적인 변형은 분자의 기능적 활성 및/또는 면역원성을 유지하는 것이나, 활성 및/또는 면역원성이 증가되거나 또는 감소될 수도 있다. 보존적인 변형에 대한 예로는 비-제한적으로 아미노산 변형 (예를 들어, 하나, 2개 및 수개의 짧은 아미노산 부가, 결손 및/또는 치환), 활성 또는 기능성 서열 이외에서의 변형, 백신 형성시 접합에 접근가능한 잔기, 혈청형 변이로 인한 변형, 면역원성을 높이거나 또는 접합 효율을 높이는 변형, 헤파린에 대한 결합성을 실질적으로 바꾸지 않는 변형, 적절한 접힘 또는 3차원 구조를 유지하는 변형, 및/또는 단백질 또는 보호성 면역을 제공하는 단백질의 일부분의 면역원성을 현저하게 변경하지 않는 변형을 포함한다.
이용되는 재조합 세포는 바람직하게는 E. coli 박테리아이며, 바람직하게는, 예를 들어 옥시도리덕타제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 티오레독신 리덕타제, 글루타메이트 시스테인 리아제, 다이설파이드 리덕타제, 단백질 리덕타제, 및/또는 글루타티온 리덕타제 등의, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 유전자의 돌연변이에 의해서와 같이, 세포질의 레독스 상태가 더욱 산화성 상태로 바뀌도록, 유전자 조작된 E. coli이다. 바람직하게는, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 유전자가 돌연변이되어, 비-기능성으로 되거나 또는 매우 약하게 기능성으로 되며, 따라서 세포의 세포질 레독스 상태가 생존성이 손상되지 않은 야생형과 비교해 더욱 산화성인 상태로 바뀐다. 산화성 단백질 접힘은 이황화 결합의 형성 및 이성질화를 수반하며, CRM197 등의 다수의 단백질들의 안정성 및 용해성에 결정적인 역할을 담당한다. 이황화 결합의 형성 및 파괴는 일반적으로 티올-다이설파이드 옥시도리덕타제에 의해 촉매된다. 이 효소는 α-나선 3개로 둘러싸인 4-가닥 β-시트로 구성된 Trx 폴드 하나 이상을 특징으로 하며, CXXC 레독스 활성-부위 모티프를 가진다. 다양한 Trx 모듈들의 어셈블리로, 원핵생물 및 진핵생물 유기체에서 발견되는 여러가지 티올 옥시도리독타제가 형성된다. 박테리아 원형질막공간에서, 단백질들은 DsbB-DsbA 및 DsbD- DsbC/DsbE/DsbG 커플의 조합 작용에 의해 적절한 산화 상태 중에 유지된다. 단백질 발현 시스템은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능하다. 또한, 이황화 결합 이소머라제 DsbC의 염색체 카피를 구성적으로 발현하는 E. coli 발현 균주 역시 바람직하다. DsbC는 잘못-산화된 단백질을 올바른 형태로 보정하는 것을 촉진한다. 또한, 세포질 DsbC는 이황화 결합이 필요 없는 단백질의 접힘을 보조할 수 있는 샤페론이다.
발현가능한 단백질 서열을 포함하는 재조합 박테리아는, 신생 발현된 단백질의 N-말단에 위치한 f-Met가 효소적으로 제거된다. 바람직한 숙주 세포로는 비-제한적으로 유도성 MAP 유전자를 포함하며 이를 발현하는, 세포질의 레독스 상태를 더욱 산화성 상태로 바꾸도록, 유전자 조작된 세포를 포함한다. 바람직한 세포는 E. coli 발현 시스템, 바실러스 섭틸리스 발현 시스템 및 기타 박테리아 세포 발현 시스템과 같은 원핵생물이다. 바람직하게는, 세포는 외래 또는 비-천연적인 서열을 발현하기 위한 단백질 발현 시스템을 포함한다. 또한, 바람직하게는, 발현할 서열은 하나 이상의 유도성 프로모터 (예를 들어, 유도가능한, 바람직하게는, 특이적인 배지를 이용함), 개시 코돈 (예를 들어, ATG), 리보솜 결합부 및/또는 리보솜 결합부와 ATG 개시 코돈 사이 또는 개시 코돈과 발현할 서열 사이에 변형된 서열을 함유한 발현 벡터로 구성된다. 바람직한 변형된 서열 또는 스페이서 서열은, 예를 들어, 뉴클레오티드를 9개 이상 또는 이하 (예를 들어, 뉴클레오티드 7-12개)로 포함하며, 바람직하게는 뉴클레오티드 9개이다.
또한, 놀랍게도, 재조합 세포는 여러가지 프리-단백질 및/또는 프리-프로-단백질 하나 이상을 불활성 입체형태에서 활성 입체형태로 효과적으로 절단하는 부가적인 프로테아제를 함유하는 것으로 개발할 수 있음을 알게 되었다. 이들 단백질은 일반적으로 번역 후 수정을 요하는 자이모겐 (예를 들어, 프로효소)으로 지칭된다. 종종 활성 단백질이 유해하지만 발현시켜야 할 경우, 세포는 단백질 전구체를 이용한다. 재조합 세포에 이러한 단백질을 통합함으로써 발현을 안정적으로, 비용-효율적으로, 다량으로 달성할 수 있다. 모두 본원에 기술된 바와 같이, 비활성에서 활성으로 특이적인 절단을 수행하는 프로테아제를 발현하는 프로테아제 유전자는 대상 프로테아제 유전자를 함유한 벡터를 이용해 형질전환하거나 또는 세포 게놈에 삽입할 수 있다. 도입되는 프로테아제 유전자는 발현 및 수집할 재조합 유전자와 메티오닌을 자르는 프로테아제 유전자가 공통적인 프로모터의 통제 하에 배치될 수 있거나, 프로테아제 유전자는 다른 프로모터를 가질 수 있다. 마찬가지로, 유전자는 발현 및 수집할 재조합 유전자와 메티오닌을 절단하는 프로테아제 유전자를 별도로 또는 기본적으로 동시에 유도할 수 있다. 바람직하게는, 재조합 단백질의 발현이 충분히 이루어지면, 제2 프로테아제가 활성화될 것이며, 그래서 프로-단백질이 활성화 상태로 처리될 것이다. 시간 및 비용을 모두 절약하는데 효과적일 수 있는 프로단백질로는, 비-제한적으로, 프로-인슐린 -> 인슐린, 프로-인슐린-유사 단백질 -> 인슐린-유사 단백질, 프로렐락신 -> 렐락신, 프로오피오멜라노코르틴 -> 오피오멜라노코르틴, 프로-효소 -> 효소, 및 프로호르몬 -> 호르몬, 및 또한 단백질로부터 신호 펩타이드, 리더 서열, 태그 등의 제거를 포함한다. 일반적으로, 도입되는 프로테아제는 절단할 단백질에 특이적일 것이다. 효율적으로 생산할 수 있는 부가적인 단백질로는, 비-제한적으로, 안지오텐시노겐, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 펩시노겐, 응고 시스템의 단백질 (예를 들어, 프로트롬빈, 플라스미노겐), 컴플리먼트 시스템의 단백질, 프로카스파제, 팍시파스틴, 프로엘라스타제, 프로리파제, 프로카르복시폴리펩티다제를 포함한다. 아울러, 일부 유전자는, 단백질이 비활성 형태로 발현될 수 있게 하는 부분 (예를 들어, 리더 또는 태그 또는 내부 서열)을 가지도록 변형될 수 있으며, 이는 유전자가 세포에 도입되어 활성화된 프로테아제에 의해 절단되었을 때에만 활성 형태로 변환된다.
예를 들어, 대상 유전자는 게놈에 다른 프로모터와 함께 삽입된다. 이황화 결합과, 또한 메티오닌을 제거하는 메티오닌 펩티다제를 가진, 유전자를 발현하도록, 세포에 도입된다. 절단된 단백질이 적정량으로 세포질에서 생산되면, 제2 프로모터가 유도되어 단백질이 최종 또는 활성 형태로 가공 처리된다. 증식 중에 트립신과 같은 활성 단백질의 발현은 세포질에서 필요한 단백질을 상당량 손상시키므로, 재조합 단백질의 발현을 방해할 것이다. 이러한 방식은 발현된 프로-단백질의 시험관내 가공의 필요성을 회피할 것이다.
본 발명의 다른 구현예는 유도성 프로모터 및/또는 리보솜 결합부와 ATG 개시 코돈 사이에 변형된 서열을 가진 발현 벡터를 이용하여, E. coli 또는 다른 숙주 세포에서 발현된 재조합 단백질에 관한 것으로, 세포에서 재조합 단백질의 N-말단에 존재하는 f-met는 효소적으로 제거된다. 바람직하게는, 발현 벡터는 락토스/IPTG 유도성 프로모터, 바람직하게는, tac 프로모터와, 리보솜 결합부와 ATG 개시 코돈 사이에 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는 조절 영역을 가진 또는 없는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 발현 구조체를 포함한다. 조절 영역은 발현 증가 (예, 개시 코돈, 효소 결합부, 번역 또는 전사 인자 결합부) 또는 발현 저해 (예를 들어, 오퍼레이터)를 위한 핵산 인지를 촉진하는 하나 이상의 서열을 부가함으로써 단백질 발현을 조절한다. 바람직하게는, 본 발명의 조절 인자는 리보솜 결합부를 재조합 단백질의 코딩 서열과는 다른 코딩 서열 및 이의 상류 개시 코돈과 더불어 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는 펩타이드 및 단백질뿐 아니라 본원에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있는 이들의 일부 및 도메인에 관한 것이다. 단백질 및 펩타이드는, 비-제한적으로, 예를 들어, 리더 또는 태그 서열 없이 본원에 개시 및 기술된 방법에 따라 상업적으로 유의한 수준으로 세포질에서 발현 가능한 단백질 및 펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 단백질 및 펩타이드는 본 발명의 재조합 세포에서 발현시 적절하게 접힌다. 본 발명의 재조합 세포는 바람직하게는 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 저하, 바람직하게는 5종 미만의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 저하, 바람직하게는 4종 미만의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 저하, 바람직하게는 3종 미만의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 저하를 나타낸다. 바람직하게는, 단백질 및 펩타이드의 발현은 본 발명의 재조합 세포에서 증가되지만, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 저하되지 않은 재조합 세포에서의 발현과 비교해 감소되지 않을 수 있거나 또는 현저하게 감소되지 않을 수 있다. 본원에 개시된 방법으로 발현가능한 단백질 및 펩타이드로는, 비-제한적으로, 예를 들어, 파상풍 독소, 파상풍 독소 중쇄 단백질, 디프테리아 톡소이드, CRM, 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 엑소단백질 A, 슈도모나스 에어루지노사 톡소이드, 보르데텔라 퍼투시스 톡소이드, 클로스트리듐 퍼프린젠스 톡소이드, 에세리키아 콜라이 이열성 독소 B 서브유닛, 네이세리아 메닌기티디스 외막 복합체, 헤모필러스 인플루엔자 단백질 D, 플라젤린 Fli C, 투구게 헤모시아닌, 및 이들의 단편, 유도체 및 변이체를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는 발현된, 유전자 측면에서 융합된 또는 화학적 변형 또는 다른 분자와의 접합 (예를 들어, 카르보디이미드, 1-시아노다이메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP))된, 단백질의 일부분 및 도메인에 관한 것이다. 바람직한 다른 분자는, 비-제한적으로, 반감기를 연장하거나 (예를 들어, PEG, Fc 단편과 같은 항체 단편), 자극하거나 및/또는 면역원성을 높이거나 또는 면역원성을 낮추거나 또는 없애는 분자를 비롯한, 다른 단백질, 펩타이드, 지질, 지방산, 사카라이드 및/또는 다당류와 같은 분자이다.
다수의 단백질들이 N-말단 세린 또는 트레오닌을 함유하거나, 또는 N-말단 세린 또는 트레오닌을 가진 상태로 유전자에 의해 발현될 수 있다. N-말단 세린 또는 트레오닌은 선택적으로 활성화하여 접합에 유용하게 만들 수 있다. N-말단 메티오닌의 존재는 선택적으로 이들 아미노산의 활성화 능력을 차단한다. 본 발명에 기술된 방법은 N-말단 메티오닌을 절단하여 원하는 N-말단 아미노산을 가진 상태로 생산될 수 있게 해준다. 전형적인 접합 파트너 분자로는, 비-제한적으로, 예를 들어 박테리아 다당류, 효모, 기생충 및/또는 기타 미생물로부터 유래한 다당류, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PEG 유도체 및 변형물, 덱스트란 및 유도체, 덱스트란의 변형된, 단편 및 유도체와 같은 폴리머를 포함한다. 접합 화합물에 대한 일 예는 PEGASYS® (페그인터페론 α-2a)이다. 덱스트란과 같은 기타 폴리머 역시 단백질의 반감기를 연장하고, 접합 파트너의 면역원성을 낮춘다. 폴리머는, 예를 들어, N-말단 세린 및/또는 트레오닌의 변형에 의해서와 같이, 부위 특이적인 접합을 통해 지시되거나 또는 무작위 연결될 수 있다. 또한, 부위 특이적인 접합을 위해 화학적 기를 선택적으로 산화하는 변형도 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 펩타이드를 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포로부터 펩타이드를 발현시키는 단계; 및 발현된 펩타이드를 단리하는 단계를 포함하되, 재조합 세포가 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소된 것이고; 발현 벡터가 펩타이드의 코딩 영역에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하고; 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소가 옥시도리덕타제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 티오레독신 리덕타제 또는 글루타티온 리덕타제 중 하나 이상을 포함하고; 발현되는 펩타이드가 용해성이고; 단백질 또는 펩타이드가 재조합 세포에서 또한 발현되는 펩티다제에 의해 제거되는 f-met를 N-말단에 함유하여 발현되는 것인, 도메인, 단편 및/또는 일부분을 함유한 펩타이드의 생산 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 리보솜 결합부, 개시 코돈, 및 선택적으로, 발현 인핸서/억제자 영역을 포함한다. 바람직하게는, 재조합 세포는 단 한가지 다이설파이드 리덕타제 효소, 단 2종의 다이설파이드 리덕타제 효소 또는 2종 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소된 것이다. 바람직하게는, 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 감소로, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소되지 않은 재조합 세포와 비교해, 세포질의 레독스 상태가 더 산화성인 상태로 바뀐다. 바람직하게는, 재조합 세포는 E. coli 세포 또는 E. coli로부터 유래한 세포 또는 균주이다. 바람직하게는, 발현된 용해성 펩타이드는 본래대로 접힌 단백질 또는 단백질의 도메인을 포함한다. 프로모터는 구성적인 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있으며, 따라서 발현은 유도성 프로모터를 유도 물질로 유도하는 것을 포함한다. 바람직한 유도 물질로는, 예를 들어, 락토스 (PLac), 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG), 기질 및 기질의 유도체를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 재조합 세포의 게놈은, 바람직하게는, 발현 벡터로부터 발현된 펩타이드 또는 단백질에 작용해 선택적으로 절단하는, 펩티다제에 대한 코딩 영역을 바람직하게는 포함하는, 부가적인 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 재조합 단백질 발현 벡터는 게놈에 삽입된 MAP 유전자와 동일한 또는 다른 유도성 프로모터를 포함한다. 발현 벡터 내 부가적인 유전자 및 유전자는 동일한 유도 물질 또는 다른 유도 물질로, 선택적으로 프로모터에 따라 다른 시점에 유도할 수 있다. 바람직하게는, 펩티다제는 펩티다제와 공동-발현된 펩타이드에 작용해 이를 절단한다. 바람직하게는, 발현된 펩타이드는 예를 들어 덱스트란, 박테리아 피막 다당류, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 이의 단편, 유도체 또는 변형체와 같은 폴리머와 접합된다. 바람직하게는, 발현된 펩타이드는 예를 들어 다당류, 펩타이드, 항체, 항체의 일부분, 지질, 지방산 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리머와 커플링된다.
본 발명의 다른 구현예는 본원에 개시 및 기술된 바와 같이 단편, 도메인 및 일부분을 비롯하여, 본 발명의 내용에 따라 발현 및 절단되는 단백질의 접합체를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는 본원에 개시 및 기술된 바와 같이 단편, 도메인 및 일부분을 비롯한 단백질의 융합 분자를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는 본원에 개시 및 기술된 바와 같이 단편, 도메인 및 일부분을 비롯한 단백질의 백신을 포함한다.
아래 실시예들은 본 발명의 구현예들을 예시하지만, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1. 박테리아 게놈의 댜양한 유전자좌에 MAP 유전자의 삽입.
과다 발현된 세포내 재조합 단백질에서 N-말단 메티오닌의 효과적인 제거는 MAP 유전자를 프로모터, 바람직하게는 유도성 프로모터와 함께 E. coli 게놈에 삽입함으로써 달성되었다. 이러한 방식으로, 유도인자의 통제 하에 MAP를 발현하는 영구적인 세포주가 구축되었다. 재조합 유전자를 또한 유도인자의 통제 하에 세포에 클로닝하였다. 따라서, 발현된 재조합 단백질로부터 N-말단 메티오닌을 효과적으로 절단하기 위한 필요한 시점에 MAP 유전자를 발현시킬 수 있다. E. coli MAP 이외에 다른 다수의 MAP 효소들이 공지되어 있거나, 고안되어 있다. 다른 종으로부터 유래한 MAP는 인접 아미노산에 대해 다른 선택성을 가질 수 있다. 일부 MAP는 N-말단 메티오닌에 인접한 부피가 크지 않는 아미노산에 대한 요건이 덜 엄격하도록 유전적으로 변형되었다. 이러한 MAP를 하나 이상의 유도성 프로모터와 함께 E. coli 게놈에 삽입하면, 효율적으로 처리가능한 N-말단 서열의 범위가 확장될 것이다.
게놈에 재조합 유전 삽입은 E. coli 게놈 구조를 파괴할 수 있으며, 잠재적으로 세포 증식을 해칠 수 있다. MAP 유전자를 E. coli 게놈에 삽입하는 안전한 방법은 유전자가 결손된 생존 균주를 이용하여, MAP 유전자로 결손된 유전자를 치환하는 것이다. 이런 방식으로, 유전자를 유전자로 치환함으로써, 게놈이 파괴될 가능성을 낮출 수 있다. E. coli 균주 2종, 즉 K12 균주 및 B 균주가 유전자를 조작하여 재조합 단백질을 발현시키기 위해 널리 사용되고 있다. K12 균주 및 B 균주 등의 E. coli 균주는 MAP 유전자를 삽입하기 위한 숙주 세포로서 이용할 수 있다.
필수 유전자의 오픈 리딩 프레임 또는 조절 인자를 파괴하는 부위에서의 삽입 결손 등의, 잘못된 부위로의 삽입은 박테리아에 치명적일 수 있다. 유도성 프로모터 및 종결인자와 함께 MAP 유전자를 삽입하는 예시적인 프로토콜 3가지는 다음과 같다:
(1) 이미 정의된 유전자의 상류 또는 하류에 MAP 유전자 삽입. 예를 들어, 재조합 MAP 유전자를 내인성 MAP 유전자의 하류에 삽입할 수 있다. E. coli MAP 유전자는 연구된 바 있으며, 유전자 구조가 정의되어 있다. 재조합 유전자의 하류 삽입은 다른 유전자의 발현을 파괴하지 않을 것이다.
(2) 이미 결손된 유전자 좌에 MAP 유전자 삽입. Gor/Met 세포주의 구축은 MAP 유전자를 결손된 유전자 부위에 삽입한 일 예이다. Gor- 세포는 BL21 세포에서 Gor 유전자를 결손시켜 구축된 것이다. Gor/Met 세포주는 MAP 유전자를 BL21 Gor- 세포의 Gor 유전자좌에 삽입하여 구축된다.
(3) 비-필수 유전자의 삽입/치환. 3번째 방법의 일예로서, MAP 유전자를 삽입하여 BL21(DE3) 세포에서 T7 RNA 중합효소를 치환한다. BL21 (DE3)은 T7 프로모터의 통제 하에 재조합 유전자를 전사할 수 있는 DE3 단편에서 활성이 매우 높은 T7 RNA 중합효소를 코딩한다. T7 중합효소 유전자는, 재조합 유전자가 T5 프로모터의 통제 하에 고유한 RNA 중합효소에 의해 전사되는 경우에, MAP 유전자에 의해 치환될 수 있다.
부위 특이적인 돌연변이 유발 기법은 전술한 삽입 부위에 대한 선택을 요한다. 박테리아 게놈을 조작하는 많은 방법들이 공지되어 있으며, 2가지 예가 본원에 기술되어 있다. 유전자를 삽입/결손하는 가장 일반적인 방법은 Red 재조합 조작이다. 이 기법은 박테리아 게놈뿐 아니라 진핵생물 게놈에서 돌연변이 유발에 널리 이용되고 있는데, 대상 유전자의 측면에 위치한 선택한 삽입 부위의 상류 및 하류에 상보적인 짧은 DNA 서열을 도입하기 위해 PCR을 이용해 개시된다. 그 후, PCR 산물을 이미 형질전환된 온도 민감성 벡터에서 red 재조합효소를 발현하는 E. coli에 전기천공으로 도입한다. red 재조합효소는 유전자를 선택 부위에 삽입하는 상동적인 재조합을 보조한다. red 재조합효소는, red 재조합효소 유전자가 온도 민감성 플라스미드 상에 존재하므로, 박테리아를 42℃에서 배양함으로써 제거할 수 있다.
양성 클로니 선별을 강화하기 위해, 마커 유전자를 도입할 수 있으며, 이후 양성 클론 검증 후 제거할 수 있다. 한가지 방법으로, 삽입된 유전자의 하류에 클로닝된 항생제 유전자와 같은 마커 유전자 옆에 플립파제 인지 신호를 도입한다. 유전자 삽입에 이용되는 PCR 산물에 따라서 마커 유전자를 함유시킨다. 재조합 현상이 이루어진 후 양성 클론 선별에 마커 유전자를 이용할 수 있다. 일단 양성 클론이 검증되면, 플립파제 인지 부위 2곳 사이에 위치한 마커 유전자를 제거하기 위해 박테리아에 플립파제 발현을 도입한다. 이러한 유형의 삽입은 삽입 부위에 플립파제 인지 서열을 포함하는 흔적을 남기게 된다. 이 방법은 Met 유전자를 결손된 Gor 유전자에 삽입함으로써 Gor/Met E. coli 균주를 구축하는데 이용하였으며, 아래 실시예 2에서 기술한다.
CRISPR 기법은 Red 재조합 조작과 조합하여 E. coli에서 이용할 수 있다. CRISPR-보조 red 재조합 조작에서는, 플라스미드 2종과 올리고 1종을 사용한다. 플라스미드 하나는 구성적으로 발현되는 Red 재조합효소와 Cas9 프로테아제를 코딩한다. 다른 플라스미드는 클로닝된 삽입 부위와 함께 CRISPR 가이드 RNA를 코딩한다. 이들 플라스미드 2종은 양립가능한 복제 오리진을 2개 가지고 있다. 올리고는 삽입 부위 서열이 양쪽에 위치한 대상 유전자를 함유하도록 제작된다. E. coli 세포에 이들 인자 3종을 형질전환하고, 생존 콜로니는 삽입된 유전자를 가진 것일 것이다: Cas9 프로테아제는 CRISPR 가이드 RNA와 결합하여 삽입 부위를 탐색할 것이다. 삽입 부위가 파악되면, Cas9는 이중 가닥 DNA를 절단할 것이며, red 재조합효소는 절단 부위와 대상 단백질을 함유한 올리고 간에 상동적인 재조합이 이루어지게 할 수 있다. 오리지널 서열을 가진 콜로니는 식별되어 제거된다. 대상 유전자를 가진 것만 생존할 것이다. CRISPR 보조 Red 재조합 조작은 성공율이 65%이며, 나머지 35%는 cas9가 삽입 부위의 위치를 식별하지 못한 결과이다. 따라서, 양성 클론에 대한 스크리닝이 빠르고 간단하다.
실시예 2. 재조합 단백질을 N-말단 메티오닌 없이 세포질에서 발현시키기 위한, 유전자 치환된 E coli 세포 균주의 구축
E. coli 세포 균주 BL21 Gor-의 구축은 미국 특허 10,093,704 및 10,597,664에 기술되어 있다. 언급된 균주들은 Gor 유전자 결손된 것으로, 세포질이 산화성 환경이며, 단백질은 세포질에서 다량으로, 이황화 결합되어 적절하게 접힌 형태로 발현된다. 이들 균주에, 추가의 E. coli MAP 유전자를 Gor 유전자 좌에 삽입하였으며, 새로운 균주를 Gor/Met E. coli로 칭하였다. Tac 프로모터 (+ Lac 오퍼레이터)를 MAP 유전자의 상류에 추가하여, MAP 유전자의 발현을 IPTG 첨가 시점에 의해 조절할 수 있다. 이는 다음과 같이 수행하였다: 부가적인 E. coli MAP 유전자를 상동적인 재조합에 의해 게놈에 삽입하였다. Gor/Met 세포의 경우에는, red 재조합효소 시스템을 이용해 BL21 Gor- 세포 내 Gor 유전자좌에 MAP 유전자가 삽입되는 것을 보조하였다. MAP 유전자는 BL21 Gor- 게놈으로부터 PCR 증폭시키고, Tac 프로모터의 통제 하에 배치하였다. 그 후, 유전자를 양쪽에 짧은 플립파제 인지 표적 (FRT) 서열들이 존재하는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 유전자의 하류에 클로닝하였다. MAP 및 CAP 유전자는 함께 전달 유전자 카세트를 구성한다. PCR을 통해 오리지널 Gor 유전자좌의 상류 및 하류 측면에 위치한 각각 염기 50개로 이루어진 서열을 전달 카세트의 상류 및 하류에 각각 도입하였다. 최종 PCR 산물을 이미 Red 재조합효소로 형질전환된 BL21 Gor- 세포에 형질전환하였다. 세포에서 Red 재조합효소의 발현은 전달 카세트와 Gor 유전자좌의 측면 서열 간의 상동적인 재조합을 촉진한다. 클로람페니콜에 내성인 박테리아 콜로니는 전달 카세트가 삽입된 것으로 검증한다. 검증된 박테리아에, 발현되면 CAT 유전자의 측면 FRT 서열을 인지하여 유전자를 절단함으로써 여전히 삽입된 MAP 서열을 남기는 플립파제 유전자를, 형질전환하였다. 따라서, Gor/Met 세포주는 게놈의 다른 부위는 파괴하지 않으면서 Gor 유전자좌에 삽입된 MAP 유전자를 가지게 된다. 이 세포주는 미국 기탁 기관 (American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-126975로 2021년 2월 9일에 기탁하였다. Gor 유전자좌의 측면에 대해 설계된 프라이머를 이용한 서열분석 결과, MAP 유전자가 성공적으로 삽입된 것으로 검증되었다.
균주의 기능성을 입증하기 위해, BL21 Gor/Met 세포에서 몇가지 유전자들을 발현시켰으며, N-말단 메티오닌을 효율적으로 절단하여 본래의 단백질을 생산하는 것으로 검증되었다.
실시예 3. Gor/Met E. coli 에서 CRM 197 발현
CRM197은 하나의 아미노산 치환 G52E가 존재하는, 효소적으로 비활성인, 디프테리아 독소의 무독성 형태이다. DT와 마찬가지로, CRM197은 이황화 결합을 2개 가지고 있다. 이황화 결합 하나는 Cys186와 Cys201 간에 이루어지며 단편 A와 단편 B를 연결한다. 2번째 이황화 결합은 단편 B에서 Cys461과 Cys471을 연결한다. CRM197은 탄수화물-, 펩타이드-, 및 합텐-단백질 접합체의 담체 단백질로 통상적으로 사용되고 있다. 담체 단백질로서, CRM197은 디프테리아 톡소이드뿐 아니라 다른 톡소이드 단백질들에 비해 많은 이점을 가지고 있다.
CRM197은 오리지널 숙주 코리네박테리움에서 만들어졌지만, 배가 시간이 수분이 아닌 수시간으로 느리게 증식해 수율이 낮으며, 전형적으로 < 50 mg/L이다. 코리네박테리움 균주가 CRM197을 높은 수준으로 생산하도록 조작되었다 (예를 들어, 미국 특허 5,614,382 참조). 또한, CRM197은 슈도모나스 플루오레센스 균주에서도 높은 수준으로 발현되었다. 그러나, BL1 안전성 수준이며 배양 및 증폭 비용이 저렴한 균주에서 CRM197을 생산하는 것이 유익할 것이다. BL21 Gor- 균주에서 용해성의, 적절하게 접힌 세포내 CRM197을 발현시키는데 성공하였으며, 발효조 세포 배양물 L 당 CRM197 >2 g이었다. 그러나, 생산된 CRM197 대부분이 N-말단 f-메티오닌을 가지고 있는 것으로 확인되었다. CRM197 유전자를 tac 프로모터와 함께 Gor/Met E coli 균주에 클로닝하였다 (예를 들어, gor- 균주에 대해서는 미국 특허 10,093,704 및 10,597,664 참조). 따라서, MAP 유전자 및 재조합 CRM197 유전자 둘다 동일한 tac 프로모터의 통제 하에 존재하며, IPTG 유도시 동시에 발현시킬 수 있다.
BL21 gor- 및 BL21 Gor/Met E. coli에서 CRM197의 발현을 비교하였다. 비슷한 수율, 즉 ~2 g/L이 양쪽 균주에서 확인되었는데, 이는 MAP 유전자의 공동-발현이 CRM197의 발현에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. BL21 gor- 및 BL21 Gor/Met 균주로부터 정제한 CRM197을 MALDI-TOF 질량 분광 측정에 의해 분석하였으며, 그 결과를 표 1에 요약 기술한다. Lot NO21p114는 Gor- 균주에서 발현한 것이고, Lot NO21p221은 Gor/Met 균주에서 발현한 것이다. BL21 Gor-에서 발현된 CRM197은 N-말단 Met가 없는 반면, Gor/Met E. coli에서 발현된 CRM197은 그렇지 않았는데, 이는 본 발명에 기술된 방법이 성공적임을 입증해준다.
Figure pct00001
실시예 4. Gor/Met 균주에서 엡스타인-바 바이러스로부터 사이토카인 IL10의 발현
엡스타인-바 바이러스로부터 유래한 IL10 유전자를 클로닝하여, Gor/Met E. coli에서 세포내 용해성 단백질로 발현시켰다. 정제를 용이하게 하기 위해 C-말단에 금속 친화성 태그를 포함시켰다. IMAC 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한 IL10에 대해 질량 분광 측정 분석을 수행하여, N-말단 펩타이드의 서열을 결정하였다. 샘플을 트립신으로 효소 분해한 후, LC-MS/MS에 의해 분석하였으며, 단백질에 N-말단 메티오닌이 없는 것으로 확인되었다.
공정은 하기 프로토콜에 따라 수행하였다: 샘플을 트립신으로 분해하고, LC-MS/MS에 의해 Proxeon 1200 nanoLC (Proxeon Biosystems)와 연결된 LTQ Orbitrap Velos (ThermoFisher Scientific, Bremen, Germany)에서 분석하였다. 크로마토그래피는 길이 15 cm x 75 ㎛ i.d. Self-Pack PicoFrit 용융 실리카 캐필러리 (New Objective, Woburn, MA)에서 수행하였다. 정지 상은 역상 C18 Jupiter 컬럼 (5 ㎛, 300 Å)(Phenomenex, Torrance, CA)이다. 질량 해상도는 MS 모드에서 모 분자 ( parent mass) 결정을 위해 30 000으로 설정하고, MS/MS 모드에서 단편화 스펙트럼 (fragmentation spectra) 획득을 위해 7 500으로 설정하였다. LC-MS/MS 조작시 수득한 MS/MS 스펙트럼을 예상 단백질 서열에 대해 Mascot 검색하였다. 카르브아미도메틸 (C)을 고정 변수 (Fixed modification)로 선택하고, 산화 (M)를 가변 변수 (Variable modification)로 선택하였다. 목적은 첫번째 트립시 절단에 대응돠는 펩타이드를 분해 용액으로부터 회수하고자 하는 것이었다. 이 펩타이드는 제출된 서열에서 13번 위치에 아르기닌을 함유할 것이다. 만일 메티오닌이 N-말단에 존재한다면, 그 결과는 아미노산 서열 1 - 13 (MTDQCDNFPQMLR; 서열번호: 1)일 것이며, 만일 메티오닌이 없다면 그 결과는 아미노산 서열 2 - 13 (TDQCDNFPQMLR; 서열번호: 2)일 것이다.
Figure pct00002
표 2에서 밑줄 친 진한색 아미노산은 MS/MS 서열분석 데이터로부터 Mascot 에 의해 동정한 서열을 나타낸다. 이는 2-13 서열 (N-말단에 메티오닌이 없음)을 검증하는 이온이 확인되었으며, 1-13 서열 (N-말단에 메티오닌 존재)에 대한 이온은 확인되지 않았음을 의미한다.
2-13 서열 (N-말단에 메티오닌이 없음)은 MS 트레이스에서 다음과 같은 이온의 존재 및 MS/MS 트레이스에서 이들의 대응되는 단편화 패턴에 의해 검증되었다: 762.8 m/z (+2), 508.9 m/z (+3), 770.8 m/z (+2). 동정된 이온 3종 모두 알킬화된 시스테인을 함유한 반면 770.8 m/z에서의 이온은 산화된 메티오닌을 (제출된 서열의 11번 위치) 함유하였다. 결론적으로, Gor/Met에서 발현된 IL10은 N-말단 메티오닌 없이 생산된다.
실시예 4. Gor/Met E. coli 에서 유전자 측면에서 무독화된 파상풍 독소 (8MTT)
파상풍 독소는 인간에서 가장 강력한 독소들 중 하나로 알려져 있으며, 연축성 독소 또는 TeNT로 지칭된다. 이 독소의 LD50은 대략 2.5-3 ng/kg으로 측정된다. 파상풍 독소는 토양에서 보통 발견되는 혐기성 바실러스인 클로스트리듐 테타니에 의해 번역된 후 트립신-유사 프로테아제에 의해 2개의 체인으로 절단되어 활성형 단백질을 형성하는 하나의 폴리펩타이드 체인으로서 만들어진다. 50 kDa 도메인의 경쇄 (LC)는 N-말단 엔도펩티다제를, 중쇄 (HC)는 50 kDa 수용체 결합 도메인을 C-말단 (HCC)에, 그리고 50 kDa LC 전좌 도메인을 N-말단 (HCN)에 포함한다. 체인 2개는 이황화 결합 하나에 의해 연결된다. 파상풍 독소는 중쇄 (HCC)의 C-말단 도메인을 통해 표면 상의 강글리오시드 및 시냅스 단백질에 결합함으로써 말초 운동신경세포에 들어간다. 이 독소는 체세포 (soma) 및 중추 신경계의 뉴런 간 시냅스로 이동하고, 통과세포외배출 후 시냅스 소낭 내 억제성 뉴런으로 들어간다. 억제성 뉴런에서, 중쇄의 전좌 도메인 (HCN)은 pH-매개 입체구조 변화를 겪으며, 시냅스 소낭의 막을 통해 LC를 세포질로 수송되어, 이곳에서 LC는 세포질로 방출된 다음 소낭-부속 막 단백질 2 (VAMP2), 소낭 용해성 NSF 부착 단백질 수용체 (SNARE)를 절단한다. 억제성 뉴런에서 VAMP2 전달은 신경전달물질의 세포외 배출을 차단하여, 신경근 시냅스 기능 저해제의 방출을 방지하고, 따라서 지속적인 신경근 활성화 및 경련 마비를 유발한다.
독소에 포름알데하이드를 처리함으로써 만들어지는 화학적으로 비활성화된 파상풍 톡소이드 (TTxd)는 파상풍에 대한 효과적인 백신으로 사용되고 있다. TTxd는 또한 다당류 항원에 대한 접합 백신 담체로도 이용되고 있다. TTxd를 담체 단백질로 이용한 접합 백신으로는 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 타입 b 및 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningiditis) 백신이 있다. 그러나, TTxd는 접합에 이용되는 아민을 여러개 가지고 있는데, 톡소이드화 공정에 의해 차단된다. 또한, TTxd는 이종적인 산물이며, 클로스트리듐 및 배지 오염물질과 더불어 응집물을 함유하고 있다. 그래서 TTxd 백신은 접합 백신에 사용하기 위해 추가로 정제하여야 한다. 보다 중요한 점은, 클로스트리듐으로부터 TT를 생산 및 정제하는데 시간 및 비용이 많이 든다. E. coli와 같은 저렴한 숙주에서 생산된, 유전자 측면에서 불활성화된 균질한 재조합 파상풍 독소가 바람직할 것이다.
비활성화된 재조합 TT 단백질을 백신 또는 담체 단백질로서 생산하기 위한 여러가지 전략들이 조사되었다. 한가지는 중쇄 단편 (TTHC)을 이용하는 것이다. 다른 방법은 유전자 측면에서 비활성화된 파상풍 독소 (미국 특허 출원 공개번호 2020/03841201)를 이용하는 것이다. TTHC는 촉매 도메인을 보유하지 않는 TT의 일부이다. TTHC 서브유닛 백신에 대한 중화 항체는 전체 톡소이드 백신 항체보다 성능이 우수한 것으로 주장되어 있다. TTHC는 BL21 Gor- 시스템에서 높은 수준 (>400 mg/L)으로 발현된다 (예를 들어, 미국 특허 10,597,664 및 10,093,704 참조).
8MTT는 아미노산 돌연변이가 8개인 유전자 측면에서 무독화된 파상풍 독소 (TT)이다. 파상풍 독소와 마찬가지로, 8MTT는 이황화 결합을 5개 가지고 있다. LD50은 본래의 TT보다 독성이 5천만배 낮다. 8MTT를 백신 접종하면 마우스에서 강력한 면역 반응 IgG 항체 반응이 유발되며, 이는 새로운 파상풍 백신에 대한 선두적인 후보물질이며, 널리 사용되는 CRM197과 마찬가지로 접합 백신 담체 단백질로 사용될 잠재성이 높다. 8MTT는 본래 pET28 발현 벡터에 클로닝하여, 정제를 용이하게 하기 위해 His 태그가 달린 형태로 BL21(DE3) 세포에서 발현되었다. 발현은 진탕 플라스크에서 약 10 mg/L이었다. N-말단 메티오닌이 존재하거나 또는 없는 단백질을 생산하기 위해, 8MTT 유전자를 tac 프로모터 (+ lac 오퍼레이터) 및 T7 종결인자를 가진 발현 벡터에 서브 클로닝한 다음 BL21 Gor/Met 세포에서 피드-배치 발효기에서 발현시켰다. 발현된 M8TT 단백질은 용해성인 것으로 확인되었으며, L 당 500 mg 이상으로 정제할 수 있었다. 음이온 교환 컬럼, HIC 컬럼 및 TFF 정용여과/농축의 조합을 이용해, M8TT를 99% 이상의 순도로 정제하였다. 정제한 M8TT를 MALDI-ISD (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - In Source Decay)에 의해 분석해, 말단 단편화 (terminal fragmentation)를 입수하였다. ISD는 N-말단 단편들의 래더를 식별할 수 있었으며, 서열이 N-말단 메티오닌을 함유하지 않은 것으로 검증되었으며, 서열의 첫번째 잔기는 예상된 프롤린이었다. 즉, Gor/Met E. coli 균주는 N-말단 메티오닌이 없는 용해성 M8TT를 다량으로 효율적으로 발현한다.
실시예 5. N-말단 세린을 가진 CRM 197 돌연변이
N-말단 세린 (CRM-Ser)을 가진 CRM197 유전자를 Gor/Met E. coli 균주에 클로닝하고, 생물반응조에서 발현시켰다. 발효 조건에 대한 어떠한 최적화도 하지 않은 경우, 용해성 CRM-Ser은 >1 g/L로 발현되어, 단백질 발현 수준이 우수한 것으로 확인되었다. 세포를 회수하고, CRM-Ser 정제하였다. CRM-Ser을 실시예 4에 기술된 바와 같이 MALDI-ISD에 의해 분석하였다. ISD는 N-말단 단편들의 래더를 식별할 수 있었으며, 그 서열에 N-말단 메티오닌이 없었으며 서열의 첫번째 잔기는 예상한 세린인 것으로 확인되었다. 즉, Gor/Met E. coli 균주는 N-말단 메티오닌이 없는 용해성 CRM-Ser을 다량으로 효율적으로 발현한다. 세린은 선택적으로 산화할 수 있으며, 접합에 이용할 수 있다.
실시예 6: 박테리아 게놈에 삽입 가능한 MAP 유전자.
MAP에 의한 N-말단 메티오닌의 제거는 단백질의 적절한 기능 및 안정성에 중요할 수 있다. E. coli에서 발현되는 대부분의 재조합 단백질은, 고유한 MAP가 활성임에도 불구하고, N 말단에 메티오닌 개시 코돈을 여전히 가지고 있다. 과다 발현되는 재조합 단백질의 생산시, MAP 또는 이의 보조인자가 불충분할 수 있다. 재조합 단백질에서 N 말단 메티오닌의 처리를 보장하기 위해, 추가적인 MAP 유전자를 강력한 유도성 프로모터 하에 삽입해, 필요시 메티오닌 절단 과정을 촉진하였다.
1. E. coli MAP 유전자
Gor/Met 세포는 발현 벡터에서의 재조합 유전자의 프로모터와 동일한 유도성 프로모터 하에 추가적인 E. coli MAP 유전자를 박테리아 게놈에 삽입하기 위한 일 예이다. MAP 유전자는 유도하지 않을 경우, 침묵 상태로 유지되고, 박테리아는 추가적인 유전자 발현 부담 없이 증식하게 된다. 재조합 단백질의 발현을 유도하면 추가적인 MAP 단백질도 유도되므로, MAP 단백질이 필요시에만 발현되도록 설계할 수 있다. 이 시스템의 잠재적인 단점은, N-말단 메티오닌을 가진 모든 단백질들이 E. coli MAP에 의해 효율적으로 절단될 수 있는 것은 아니라는 것이다. E. coli MAP는, 소형 아미노산 (G, A, S, C, P, T, V)(P1' 위치)이 N-말단 메티오닌에 인접한 경우에만 작동한다. 바람직하게는, 아미노산의 P2' 위치 (P1의 C 말단 아미노산)는 프롤린이 아니다. N-말단 메티오닌 다음에 큰 아미노산을 가진 단백질을 처리하기 위해서는, 대신 P1 및 P2 아미노산 요건이 다른 MAP 유전자를 삽입할 수 있다.
2. 여러가지 유도성 프로모터 하에 나란히 배치된 2종 이상의 MAP 유전자
효모 유전자는 2종의 MAP 유전자에 의해 처리된다. 효모 MAP1 및 MAP2는 동일한 기질에 대해 생체내에서 서로 다른 절단 효능을 나타낸다. 이들 MAP 둘다, 2번째 잔기가 V일 경우에는 효능이 매우 낮으며, 2번째 잔기가 G, C 또는 T일 경우에는 MAP2가 MAP1보다 효능이 약하다. 인간 역시 MAP 2종을 가지고 있다: MAP1 및 MAP2. 이들 유전자는 P1' 위치에 A, C, G, P 또 S를 가진 단백질을 처리할 수 있다. P1' 잔기가 T 또는 V일 경우, N-말단 Met 제거는 주로 MAP2에 의해 촉매되고, 절단 정도는 P2'-P5' 위치에서의 서열에 좌우된다. P2' 잔기가 A, G 또는 P가 아닐 경우, N-말단 처리는 완전할 것으로 예상된다. P2' 잔기가 A, G 또는 P일 경우, 메티오닌 제거는 불완전하거나 또는 제거되지 않는다. 서로 다른 MAP는 다른 기질 특이성을 가지므로, 서로 다른 또는 동일한 종으로부터 유래한 2종 이상의 MAP 유전자들이 더 많은 재조합 단백질로부터 메티오닌을 제거하는 과정을 커버할 수 있다. 유전자 전사를 통제하는 (예를 들어, 유도성) 프로모터는, MAP 유전자들 2종을 필요에 따라 서로 다른 시점에 또는 한번에 온/오프시킬 수 있다.
3. 다음번 위치의 아미노산에 대한 제한없이 모든 N-말단 메티오닌을 절단할 수 있도록 돌연변이된 MAT 유전자의 삽입.
현재 MAP는 일부 단백질의 N-말단 구조에 우호적이지 않으며, 그래서 이들의 N-말단 메티오닌의 제거를 촉매하지 않을 것이다. 첫번째 메티오닌이 MAP에 의해 처리될 지를 예측하는 보편적인 규칙은 P1' 위치에 놓인 아미노산의 크기에 따른다. 일반적으로, 아미노 잔기의 회전 반경이 1.29 Å 이하일 경우, 메티오닌이 절단된다. 인간 MAP들은 기질에 대해 보다 더 엄격한 요건을 가지고 있으며, P2' 및 P5' 위치에 더 산성인 잔기가 있어야 한다. 기존 MAP의 기질 특이성을 확장하기 위해, 발현 산물이 단백질 데이터베이스에 열거된 단백질들에서 N-말단 메티오닌의 85-90%를 절단할 수 있도록 E. coli MAP 유전자에 돌연변이를 유발하였다. 이 MAP는 이의 기질 결합 포켓에 돌연변이를 3개 가지고 있으며, 따라서 소형 아미노산뿐 아니라 큰 또는 산성 아미노산 (예를 들어, P2' 위치에 M, H, D, N, E, Q, L, I, Y 및 W)을 가진 단백질에서도 N-말단 메티오닌을 제거할 수 있다. 이들 효소는 또한, P2' 위치의 아미노산 잔기가 소형일 경우, P1' 위치에서 아미노산을 절단할 수 있다. 이 MAP 유전자의 삽입으로 더 광범위한 N-말단 구조를 가진 단백질을 처리할 수 있다. 재차, 유도성 프로모터의 추가는 이러한 강력한 돌연변이 유전자 발현의 활성을 통제하는데 유익할 것이다.
실시예 7: 이황화 결합 없이 Gor/Met 세포주에서 생산할 수 있는 단백질
Gor/Met 세포주가 N-말단 메티오닌 없이 이황화 결합된 단백질을 발현시키기 위해 개발되었지만, 이황화 결합이 없는 단백질도 Gor/Met 세포에서 N-말단 메티오닌 없이 발현시킬 수 있다. 이러한 단백질은 또한 Met를 함유한 상태로 E. coli에서 발현시킬 수 있지만, 반드시 gor-인 것은 아니다. 이러한 단백질에 대한 일 예는 항체 정제시 널리 사용되는 스타필로코커스 단백질 A (SPA)이다. SPA는 본래 박테리아 스타필로코커스 아우레우스의 세포벽에서 발견된 42　kDa 단백질이다. 이 단백질은 다수의 포유류 종으로부터 유래한 단백질, 특히 IgG에 결합할 수 있는 상동적인 Ig-결합 도메인 5개로 구성되어 있으며, 대부분의 면역글로불린의 Fc 부위의 그리고 인간 VH3 패밀리의 Fab 부위의 중쇄에 결합한다. SPA는 임의의 이황화 결합을 함유하지 않는다. 상업적으로, SPA는 2가지 기원으로부터 유래한다: SPA가 분비되는 세포 벽에 병변을 가진 스타필로코커스 아우레우스 돌연변이 균주 (Sigma), 세포내 또는 세포외에서 재조합 단백질로서 SPA를 발현하는 E. coli (Sigma-Aldrich, SinoBiological, ThermoFisher, DeNovo Biopharma 등). SPA 생산은 피키아 파스토리스에서 높은 수준일 수 있다. SPA 대부분이 E. coli에서 세포내 발현된다. 성숙한 SPA는 메티오닌이 아닌 알라닌으로 시작하므로, SPA를 세포내 생산하기 위해 유전자의 N-말단에 메티오닌을 추가하여야 하거나 또는 시험관내에서 절단하여 성숙한 단백질을 방출할 수 있는 융합 단백질의 C-말단에서 발현시켜야 한다. 전자는 진정한 성숙한 단백질 형태가 아니며, 후자는 비용 및 시간 측면에서 비-효율적이다.
SPA의 발현은 유도성 MAP 유전자가 삽입된 본원에 개시된 박테리아 균주들에서 효율적이다. SPA는 E. coli 균주에서 다량으로 발현되며, Gor/Met 세포주에서도 마찬가지로 기능하며, 또한 MAP 세포주에서도 발현시킬 수 있다. 다른 세포주에 비해 MAP 세포주를 이용하는 이점은 f-메티오닌을 자유자재로 절단할 수 있다는 것이다. MAP 유전자의 유도성 프로모터는, 설계에 따라 SPA가 발현될 때 동시에 또는 이후 임의 시점에, 발현시킬 수 있다. N-말단 메티오닌을 제거하기 위한 시험관내 조작은 필요 없다.
본 발명에 대한 다른 구현예 및 용도들이 본원에 개시된 본 발명의 설명 및 실시를 고려하여 당해 기술 분야의 당업자들에게 명백할 것이다. 모든 간행물, 미국 및 외국 특허 및 특허 출원을 비롯하여 본원에 인용된 모든 참조문헌들은 구체적으로 전체적으로 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 용어 "포함하는"은 사용된 경우에 용어 "구성되는" 및 "로 필수적으로 구성되는"이라는 용어를 포괄하는 것으로 의도된다. 아울러, 용어 "포함하는", "가지는" 및 "함유하는"은 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 명세서 및 실시예들은 단순 예로 간주되며, 본 발명의 진정한 사상 및 범위는 첨부된 청구항에 의해 정의되는 것으로, 의도된다.
American Type Culture Collection PTA-126975 20210209
SEQUENCE LISTING <110> FINA BIOSOLUTIONS, LLC <120> PRODUCTION OF SOLUBLE RECOMBINANT PROTEIN <130> 8164.022.PCT <140> PCT/US2021/022126 <141> 2021-03-12 <150> 63/152,954 <151> 2021-02-24 <150> 62/990,083 <151> 2020-03-16 <150> 16/819,775 <151> 2020-03-16 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Met Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Met Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg 1 5 10 15 Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu 20 25 30 Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr 35 40 45 Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu 50 55 60 Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val 65 70 75 80 Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg 85 90 95 Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln 100 105 110 Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala 115 120 125 Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr 130 135 140 Ile Lys Ala Arg Gly His His His His His His 145 150 155

Claims (50)

  1. 하나 이상의 이황화 결합을 가진 단백질을 생산하는 방법으로서,
    상기 단백질 서열을 코딩하는 발현 벡터 및 게놈을 함유한 재조합 세포로부터 상기 단백질을 발현시키는 단계;
    상기 재조합 세포의 유전자로부터 펩티다제를 발현시키는 단계; 및
    상기 단백질을 단리하는 단계
    를 포함하고,
    상기 재조합 세포는 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 저하된 것이고, 상기 단백질의 N-말단은 메티오닌을 포함하며,
    상기 펩티다제는 상기 발현된 단백질의 N-말단에서 메티오닌을 제거하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발현되는 단백질이 파상풍 독소, 파상풍 독소 중쇄 단백질, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 엑소단백질 A, 슈도모나스 에어루지노사 톡소이드, 보르데텔라 퍼투시스 톡소이드, 클로스트리듐 퍼프린젠스 톡소이드, 에세리키아 콜라이 (E. coli) 이열성 독소 B 서브유닛, 네이세리아 메닌기티디스 외막 복합체, 헤모필러스 인플루엔자 단백질 D, 플라젤린 Fli C, 투구게 헤모시아닌, 또는 이들의 단편, 유도체 및 변이체를 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 단 1종의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소된, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    2종 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소된, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 E. coli 세포 또는 E. coli로부터 유래한 세포 (derivative) 또는 균주 (strain)인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 ATCC 기탁번호 PTA-126975로부터 입수되거나 또는 유래한, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 펩티다제가 메티오닌 아미노펩티다제를 포함하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 발현 벡터가 리보솜 결합부, 개시 코돈 및/또는 발현 인핸서 영역을 포함하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 발현 벡터가 제1 유도성 프로모터를 포함하고, 단백질 발현이 상기 제1 유도성 프로모터를 제1 유도 물질로 유도하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 유전자가 제2 유도성 프로모터를 포함하고, 펩티다제 발현이 상기 제2 유도성 프로모터를 제2 유도 물질로 유도하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 발현 벡터가 제1 유도성 프로모터를 포함하고 단백질 발현이 상기 제1 유도성 프로모터를 제1 유도 물질로 유도하는 것을 포함하고, 상기 유전자가 제2 유도성 프로모터를 포함하고 펩티다제 발현이 상기 제2 유도성 프로모터를 제2 유도 물질로 유도하는 것을 포함하며, 상기 제1 유도 물질과 제2 유도 물질이 동일한, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 펩티다제 유전자가 상기 재조합 세포의 게놈에 삽입된, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 단리가 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 크로마토그래피가 설페이트 수지, 겔 수지, 활성 황산화 수지, 포스페이트 수지, 헤파린 수지 또는 헤파린-유사 수지를 포함하는, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    단리된 단백질에 화학적 화합물을 접합하거나 또는 커플링하는 것을 더 포함하는, 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 화학적 화합물이 다당류, 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 펩타이드, 항체 또는 항체의 일부분, 지질, 지방산 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  17. 펩타이드 생산 방법으로서,
    펩티다제 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 세포에서 펩타이드를 발현시키는 단계;
    상기 펩타이드로부터 N-말단 메티오닌을 제거하는 펩티다제 효소를 발현시키는 단계; 및
    상기 펩타이드를 단리하는 단계
    를 포함하며,
    상기 펩티다제 효소를 코딩하는 유전자는 상기 재조합 세포의 게놈에 삽입되고,
    상기 재조합 세포는 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소된 것이고,
    상기 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성 감소로, 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소되지 않은 재조합 세포와 비교해, 세포질의 레독스 상태가 더 산화성 상태로 바뀌게 되고,
    상기 펩타이드는 N-말단 메티오닌을 포함하는, 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 펩타이드가 파상풍 독소, 파상풍 독소 중쇄 단백질, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 슈도모나스 엑소단백질 A, 슈도모나스 에어루지노사 톡소이드, 보르데텔라 퍼투시스 톡소이드, 클로스트리듐 퍼프린젠스 톡소이드, 에세리키아 콜라이 (E. coli) 이열성 독소 B 서브유닛, 네이세리아 메닌기티디스 외막 복합체, 헤모필러스 인플루엔자 단백질 D, 플라젤린 Fli C, 투구게 헤모시아닌, 또는 이들의 단편, 유도체 및 변이체를 포함하는, 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 단 1종의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소된, 방법.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 재조합 세포는 2종 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소된, 방법.
  21. 제16항에 있어서,
    상기 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소가 옥시도리덕타제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 티오레독신 리덕타제 또는 글루타티온 리덕타제 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  22. 제16항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 E. coli 세포 또는 E. coli로부터 유래한 세포 또는 균주인, 방법.
  23. 제16항에 있어서,
    상기 펩타이드를 코딩하는 유전자가 제1 유도성 프로모터를 포함하거나 및/또는 펩티다제 효소를 코딩하는 유전자가 제2 유도성 프로모터를 포함하는, 방법.
  24. 제16항에 있어서,
    상기 펩타이드를 코딩하는 유전자가 제1 유도성 프로모터를 포함하고, 펩티다제 효소를 코딩하는 유전자가 제2 유도성 프로모터를 포함하며, 제1 유도성 프로모터와 제2 유도성 프로모터가 동일한, 방법.
  25. 제16항에 있어서,
    상기 단리가 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 크로마토그래피가 설페이트 수지, 겔 수지, 활성 황산화 수지, 포스페이트 수지, 헤파린 수지 또는 헤파린-유사 수지를 포함하는, 방법.
  27. 제16항에 있어서,
    단리된 펩타이드에 화학적 화합물을 접합하거나 또는 커플링하는 것을 더 포함하는, 방법.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 화학적 화합물이 다당류, 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 펩타이드, 항체 또는 항체의 일부분, 지질, 지방산 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  29. 제16항에 있어서,
    상기 펩타이드는 산화제를 이용해 산화 처리되는, 방법.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 산화제가 하이드라지드, 하이드라진, 아미노옥시 기, N-말단 1-아미노, 2-알코올 아미노산 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  31. 이황화 결합을 포함하는 펩타이드를 생산하는 방법으로서,
    펩티다제 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 세포에서 펩타이드를 발현시키는 단계;
    상기 펩타이드로부터 N-말단 메티오닌을 제거하는 펩티다제 효소를 발현시키는 단계; 및
    상기 재조합 세포의 세포질에서 펩타이드를 단리하는 단계
    를 포함하며,
    상기 펩타이드는 발현 벡터에서 코딩되고,
    상기 펩티다제 효소를 코딩하는 유전자는 상기 재조합 세포의 게놈에 삽입되고,
    상기 재조합 세포는 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소된 것이고,
    상기 재조합 세포는 E. coli이고,
    상기 펩타이드는 N-말단 메티오닌을 포함하고,
    상기 단리된 펩타이드는 용해성인, 방법.
  32. ATCC 기탁번호 PTA-126975로부터 수득되거나 또는 유래하는 재조합 세포.
  33. 단백질을 생산하는 방법으로서,
    번역 유도 서열을 함유한 재조합 조작된 프로테아제 유전자를 포함하는 재조합 세포에서 프리-단백질을 발현시키는 단계;
    상기 프리-단백질이 절단되어 단백질을 생성하도록 프로테아제 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및
    상기 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하는, 방법
  34. 제33항에 있어서,
    상기 프리-단백질이 프로-인슐린, 프로-인슐린-유사 단백질, 프로렐락신, 프로오피오멜라노코르틴, 프로효소, 프로호르몬, 프로안지오텐시노겐, 프로트립시노겐, 프로키모트립시노겐, 프로펩시노겐, 응고 시스템의 프로단백질, 프로트롬빈, 프로플라스미노겐, 컴플리먼트 시스템의 프로단백질, 프로카스파제, 프로팍시파스틴, 프로엘라스타제, 프로리파제 및 프로카르복시폴리펩티다제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 프로테아제 유전자가 상기 재조합 세포의 게놈에 삽입된, 방법.
  36. 제33항에 있어서,
    상기 메티오닌 아미노펩티다제 유전자가 상기 재조합 세포의 게놈에 삽입된, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 메티오닌 아미노펩티다제 유전자의 발현으로 상기 프리-단백질 또는 단백질로부터 N-말단 메티오닌이 제거되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 메티오닌 아미노펩티다제 유전자의 발현이 유도인자 서열의 통제 하에 이루어지는, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 메티오닌 아미노펩티다제의 유도인자 서열과 상기 프리-단백질의 번역 유도 서열이 서로 다른, 방법.
  40. 제38항에 있어서,
    상기 메티오닌 아미노펩티다제의 유도인자 서열과 상기 프리-단백질의 번역 유도 서열이 서로 동일한, 방법.
  41. 제33항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소된, 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 gor 돌연변이를 가진 E. coli인, 방법.
  43. 메티오닌 아미노펩티다제 유전자 및 프로테아제 유전자가 둘다 삽입된, 재조합 세포주.
  44. 제43항에 있어서,
    하나 이상의 다이설파이드 리덕타제 효소의 활성이 감소된, 재조합 세포주.
  45. 제44항에 있어서,
    gor 돌연변이를 포함하는, 재조합 세포주.
  46. 하기 단계를 포함하는 펩타이드 생산 방법:
    재조합 세포에서 펩타이드를 발현시키는 단계로서, 발현되는 펩타이드가 N-말단 메티오닌을 포함하고, 상기 재조합 세포가 펩티다제를 코딩하는 유전자를 포함하는, 단계;
    펩티다제 유전자를 발현시켜, 발현된 펩타이드로부터 N-말단 메티오닌을 제거하는 단계;
    펩타이드를 단리하는 단계; 및
    단백질을 회수하는 단계.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 펩타이드가 상기 재조합 세포의 게놈에 삽입된 다른 유전자로부터 발현되는, 방법.
  48. 제46항에 있어서,
    상기 펩티다제 유전자가 상기 재조합 세포의 게놈에 삽입된, 방법.
  49. 제46항에 있어서,
    상기 펩티다제가 메티오닌 아미노 펩티다제인, 방법.
  50. 제46항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 E. coli 세포인, 방법.
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