RU2700452C1 - Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34) - Google Patents

Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34) Download PDF

Info

Publication number
RU2700452C1
RU2700452C1 RU2019100018A RU2019100018A RU2700452C1 RU 2700452 C1 RU2700452 C1 RU 2700452C1 RU 2019100018 A RU2019100018 A RU 2019100018A RU 2019100018 A RU2019100018 A RU 2019100018A RU 2700452 C1 RU2700452 C1 RU 2700452C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
pth
tevrs
ptrx
recombinant
hybrid protein
Prior art date
Application number
RU2019100018A
Other languages
English (en)
Inventor
Игорь Валентинович Мягких
Василий Николаевич Степаненко
Илья Александрович Пучков
Николай Михайлович Новожилов
Дмитрий Александрович Макаров
Ирина Владимировна Соколова
Татьяна Владимировна Воробьева
Кристина Георгиевна Левандовская
Даниил Михайлович Павленко
Алексей Алексеевич Зинченко
Анатолий Иванович Мирошников
Мария Андреевна Костромина
Роман Станиславович Есипов
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority to RU2019100018A priority Critical patent/RU2700452C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2700452C1 publication Critical patent/RU2700452C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков и может быть использовано для получения активного фрагмента (1-34) эндогенного человеческого паратиреоидного гормона. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pTrx-TEVrs-РТН, которая обеспечивает синтез гибридного белка, содержащего последовательность тиоредоксина и терипаратида в клетках Escherichia coli. Путём трансформации штамма E.coli BL 21(DE3) плазмидой pTrx-TEVrs-РТН получают штамм- продуцент гибридного белка Trx-TEVrs-РТН. Разработан способ получения рекомбинантного терипаратида, предусматривающий получение и культивирование продуцента гибридного белка, содержащего терипаратид, с последующим выделением и расщеплением указанного гибридного белка. Изобретение позволяет получить рекомбинантный терипаратид с высоким выходом и по упрощённой технологии. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно может быть использовано для получения рекомбинантного фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона PTH (1-34).
Активный фрагмент эндогенного человеческого паратиреоидного гормона PTH (1-34), так же известный как терипаратид, способен индуцировать образование костной ткани, что делает его эффективным при лечении остеопороза.
Фрагмент эндогенного человеческого паратиреоидного гормона РТН (1-34) представляет собой 34-членный пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1.
Известен метод выделения РТН (1-34) из природного источника (Keutmann, H. T., Aurbach, G. D., Dawson, B. F., Niall, H. D., Deftos, L. J., and Potts, J. T., Jr. (1972) Biochemistry 10, 2779-2787). Недостаток данного метода заключается в небольших выходах продукта и невозможности масштабировать технологический процесс.
Известен химический способ получения PTH (1-34) посредством твердофазного пептидного синтеза /патент US4086196, C07К l4/635, опубл. 25.04.1978/. Недостатком такого метода является наличие продуктов близкородственных примесей, которые возникают в ходе твердофазного синтеза, что значительно усложняет процесс очистки РТН (1-34). Ко всему прочему, химический синтез требует использования сложновоспроизводимых и трудоёмких методов.
Наиболее перспективным, с точки зрения производства PTH(1-34), является применение методов рекомбинантных ДНК. Так, в источнике /патент CN1424325, C07H21/00, опубл.18.06.2003/ описан биотехнологический метод получения РТН(1-34), посредством его слияния с глутатион-S-трансферазой. Протеолитическое расщепление образовавшегося гибридного белка осуществляли тромбином, затем проводили очистку на аффинной колонке с химотрипсином и дальнейшее протеолитическое расщепление с помощью пролинэндопептидазы и дополнительную хроматографическую очистку. Использование аффинной хроматографии и двух протеиназ делает технологию нерентабельной, а также увеличивает трудозатраты.
Известен способ получения РТН (1-34) /патент РФ 2441019, C07K 1/36, опубл. 27.01.2012г./ в составе гибридного белка, который состоит из His-tag, фрагмента белка β-галактозидазы, сайта расщепления энтерокиназы и РТН (1-34). Недостатком данного метода является необходимость использования мочевины, поскольку гибридный белок продуцируется в виде тел включения. Также для очистки гибридного белка была использована аффинная хроматография, что делает процесс очистки нерентабельным.
Аналог, наиболее близкий к заявленному способу получения РТН (1-34), описан в работе (Fu, Xiang-Yang et al, Biotechnology Progress (2005), 21(5), 1429-1435), в котором РТН (1-34) получают в составе гибридного белка, состоящим из тиоредоксина и РТН (1-34). В процессе ферментации используют Тритон-Х 100 и термическую денатурацию, которая приводит к осаждению балластных белков. Нагревание проводят при 80°С в течение 15 минут. В данном способе белок инкубируют при высокой температуре, которая является нежелательной для белков и может привести к окислению метионинов, входящих в состав РТН (1-34).
Таким образом, техническая проблема, существующая при получении PTH (1-34) заключается в трудоемкости и сложности известных способов. Изобретение решает техническую проблему получения высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный РТН (1-34) с высоким выходом.
Техническим результатом заявленного изобретения является обеспечение выхода рекомбинантного РТН (1-34) до 5% относительно суммарного белка клетки при чистоте препарата не ниже 98%.
Для решения поставленной технической проблемы и заявленного технического результата предлагается гибридный белок Trx-TEVrs-РТН, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2, содержащий тиоредоксин, специфический сайт узнавания TEV-протеиназы, рекомбинантного РТН (1-34), имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1.
Предлагается также рекомбинантная плазмидная ДНК pTrx-TEVrs-РТН для экспрессии гибридного белка Trx-TEVrs-РТН (SEQ ID NO 2), состоящая из HindIII/MscI-фрагмента ДНК плазмиды pET32a, содержащего:
- последовательность промотора T7 и оператора lacO;
- последовательность, кодирующую гибридный белок SEQ ID NO 2;
- ген β-лактамазы в качестве генетического маркера;
- последовательность, кодирующую точку начала репликации;
- ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.
Предлагается Штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/pTrx-TEVrs-РТН, продуцирующий гибридный белок Trx-TEVrs-РТН (SEQ ID NO 2), содержащий рекомбинантую плазмиду ДНК pTrx-TEVrs-РТН. Указанный Штамм Escherichia coli получен путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН по п.2.
Способ получения рекомбинантного PTH(1-34) (SEQ ID NO 1), включает в себя стадии:
- культивирования полученного штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН с получением биомассы клеток штамма-продуцента;
- выделения РТН(1-34) SEQ ID NO 1 из биомассы клеток штамма-продуцента.
На стадии выделения РТН(1-34) SEQ ID NO 1 осуществляют отделение гибридного белка в виде супернатанта, хроматографическую очистку гибридного белка, расщепление TEV-протеиназой, центрифугиование, отделение супернатанта и хроматографическую очистку РТН(1-34).
1. Конструируют экспрессионную плазмиду pTrx-TEVrs-РТН, содержащую гибридный ген, состоящий из слитых в рамке нуклеотидных последовательностей тиоредоксина, специфического сайта узнавания TEV-протеиназы (SEQ ID NO 3) и N-концевого фрагмента РТН (1-34).
2. Путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН, получают штамм-продуцент гибридного белка Trx-TEVrs-PTH(1-34), состоящего из разделенных специфическим сайтом узнавания протеиназы вируса гравировки табака (TEV-протеиназой) тиоредоксина и РТН(1-34), накапливающегося в растворимой форме во время культивирования.
3. Клеточную биомассу разрушают в буферном растворе 50мМ Трис pH 8.5 в присутствии ингибиторов клеточных протеаз и отделяют осветленный клеточный лизат, содержащий гибридный белок Trx-TEVrs-PTH SEQ ID NO 2. Полученный осветлённый клеточный лизат наносят на анионообменную смолу и элюируют белок в градиенте соли.
Протеолитическое расщепление рекомбинантной TEV-протеиназой проводят в течение не менее 18 часов при комнатной температуре при рН 8.0-8.5 в присутствии дитиотреитола при соотношении фермент : белок 1:100.
Дальнейшую очистку целевого продукта проводят с помощью обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте этанола. Для удаления остаточного спирта проводят упаривание, объединённые фракции лиофилизуют. Идентичность полученного РТН (1-34) подтверждают с помощью масс-спектрометрии.
В связи с отсутствием у РТН (1-34) жёсткой третичной структуры, он является доступной мишенью для клеточных протеаз. Чтобы избежать с этим связанных трудностей, фрагмент эндогенного человеческого паратиреоидного гормона РТН (1-34) (SEQ ID NO 1) получают в составе гибридного белка, содержащего N-концевой тиоредоксин и специфический сайт узнавания протеазы вируса гравировки табака (TEV протеазы, ЕС 3.4.22.4). С этой целью получают рекомбинантную векторную плазмиду pTrx-TEVrs-РТН, содержащую гибридный ген, состоящий из слитых в рамке нуклеотидных последовательностей тиоредоксина и терипаратида, разделенных специфическим сайтом узнавания TEV-протеинаы (SEQ ID NO 3), при этом целевой ген РТН (1-34) амплифицировали с помощью ПЦР, используя плазмиду с искусственным геном РТН (1-34) в качестве матрицы. Полученным экспрессионным вектором трансформируют штамм Е. coli BL21(DE3) (New England Biolabs), получая штамм-продуцент гибридного белка Е. coli BL21(DE3)/pTrx-TEVrs-РТН. Выход РТН (1-34) высокой степени чистоты (98%) после обращённо-фазовой хроматографии достигает 5% относительно суммарного белка клетки.
В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3), содержащий плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-PTH для суперпродукции гибридного белка Trx-TEVrs-PTH, содержащего последовательность тиоредоксина и РТН (1-34) человека.
Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-PTH:
- кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного
человеческого РТН (1-34);
- состоящую из SgrAI/XbaI-фрагмента ДНК плазмиды pET32a, содержащего последовательность промотора T7 и оператора lacO;
- содержащую последовательность, кодирующую гибридный белок SEQ ID NO 2, включающего в себя последовательность тиоредоксина, специфического сайта узнавания TEV-протеиназы и адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного человеческого терипаратида;
- содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pTrx-TEVrs-РТН клеток Е.coli к пенициллиновым антибиотикам; последовательность, кодирующую точку начала репликации; ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.
Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена гибридного белка Trx-TEVrs-РТН, содержащего на 5'-конце ген тиоредоксина, соединенного с геном сайта узнавания TEV-протеиназы и РТН (1-34). Для конструирования плазмиды используют химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.
Последовательность TEVrs-PTH получают химическим синтезом.
Концевые его участки, содержащие соответствующие вектору сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции вводят с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами А1 и В1 (SEQ ID NO 4), и затем последовательность клонируют в векторную плазмиду pET32a.
Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаризованной среде "Дифко" – колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие, серые, край ровный.
Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимальном значении рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН отличается от штамма-реципиента Е.coli BL21 (DE3) только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН, которая и придаёт ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.
Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3) соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.
Клетки Е.coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН являются суперпродуцентом. При индукции изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка Trx-TEVrs-РТН, который накапливается в клетках в растворимой форме в количестве не менее 35% от суммарного белка клетки.
Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-РТН, для чего нуклеотидную последовательность TEVrs-PTH (SEQ ID NO 5) амплифицируют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (SEQ ID NO 4), содержащими сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции MscI (N-конец гена, праймер А1) и HindIII (С - конец гена, праймер В1), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с обработанной по тем же сайтам векторной плазмидой pET32a. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е.coli BL21(DE3) и высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют с помощью секвенирования.
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) до достижения максимальной плотности культуры.
На (SEQ ID NO 1) изображена аминокислотная последовательность фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона РТН (1-34).
На (SEQ ID NO 2) изображена аминокислотная последовательность гибридного белка Trx-TEVrs-PTH.
На (SEQ ID NO 3) изображена аминокислотная последовательность специфического сайта узнавания TEV-протеиназы.
На (SEQ ID NO 4) изображена нуклеотидная последовательность праймеров, использованных для амплификации гена синтетического фрагмента TEVrs-PTH.
На (SEQ ID NO 5) изображенаи нуклеотидная последовательность синтетического фрагмента TEVrs-PTH
Изобретение иллюстрируется следующими рисунками.
Фиг. 1.Физическая карта плазмиды pTrx-TEVrs-РТН.
Фиг. 2. Электрофореграмма лизата клеток штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3) / pTrx-TEVrs-РТН. М — стандарт молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610; С — лизат клеток.
Фиг. 3. Профиль аналитической ОФ ВЭЖХ полученного РТН (1-34). Образец — раствор РТН (1-34) в виде объединённых фракциях после конечной очистки, в объёме 20 мкл.
Фиг. 4. Масс-спектр полученного РТН (1-34). Образец — раствор РТН (1-34) в виде объединённых фракциях после конечной очистки, в объёме 20 мкл.
Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК.
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов – 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.
Для приготовления вектора ДНК плазмиды pET32a (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера 50 мМ ацетатат калия, 20 мМ Трис-ацетат, 10 мМ ацетат магния, 100 мкг/мл БСА рестриктазой MscI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 50 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой HindIII (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT , растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
Для приготовления гена TEVrs-PTH проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы искусственный ген TEVrs-PTH (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А1 (SEQ ID NO 4) и В1 (SEQ ID NO 4), по 60 пмоль каждого. ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация - 40 сек при 72°С, 30 циклов ПЦР. Ген после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE, затем обрабатывают теми же рестриктазами, которые используют при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.
Полученный синтетический фрагмент с геном рекомбинантного PTH (1-34) в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг, полученного из ДНК лазмиды pET32a, описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.
Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pTrx-TEVrs-РТН. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования. Физическая карта плазмиды pTrx-TEVrs-РТН представлена на фиг.1. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Ori – участок инициации репликации плазмиды. ApR – ген устойчисовсти к ампицилину. LacI – ген репрессора лактозного оперона. Trx-TEVrs-РТН – ген рекомбинантного белка, кодирующий тиоредоксин, сайт узнавания TEV-протеиназы и терипаратид.
Пример 2. Получение штамма-продуцента Е.coli BL21 (DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН и определение его продуктивности.
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН получают трансформацией компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3) плазмидой pTrx-TEVrs-РТН, получение которой как описано в примере 1.
Штамм продуцента Е.coli BL21 (DE3)/ p Trx-TEVrs-РТН культивируют при 37°С в 100 мл LB-бульона (рН 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч в орбитальном шейкере-инкубаторе в колбах Ерленмейера со скоростью вращения 190 об/мин до оптической плотности А550 0,7-0,8. Затем прибавляют изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозид до концентрации 0,2 мМ и инкубируют в течение 6 ч, или продолжают выращивание в отсутствие индуктора в течение 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А550 и количество культуры, соответствующее 1 мл с А550 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осаждённые клетки в 100 мкл лизирующего буферного раствора с красителем бромфеноловым синим обрабатывают ультразвуком в течение 20 сек, инкубируют 3 мин при 100°С, аликвоты по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Приводили оценку содержания гибридного белка Trx-TEVrs-РТН в клеточном лизате путём анализа насыщенности полос в программном обеспечении ImageJ. Определяют На фиг 2. представлена электрофореграмма лизата клеток штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН, содержание гибридного белка от общего клеточного не менее 30%.
Пример 3. Получение гибридного белка Trx-TEVrs-РТН, его расщепление и выделение рекомбинантного PTH (1-34).
После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С), разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе в буфере (50 мМ Tрис/HCl, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ ПМСФ, рН 8) и отделяют супернатант центрифугированием (15000 g, 45 мин). Осветленный клеточный лизат наносят на анионообменную смолу уравновешенную буфером для нанесения (50 мМ Трис/HCl, 10 рН 8,5). Гибридный белок элюируют градиентом концентрации соли в буфере для нанесения. В элюат добавляют TEV-протеиназу, тем самым инициируя расщепление гибридного белка, и инкубируют при 22°С в течении 18 ч. Из полученной смеси отбирают пробу в количестве 30 мкл и с красителем бромфеноловым синим инкубируют 3 мин при 100°С. Пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. После инкубирования при 22°С в течении 18 ч. доводят рН раствора соляной кислотой до 3.0 и центрифугируют. Дальнейшую очистку и анализ рекомбинантного РТН проводят посредством обращенно-фазовой хроматографии. На фиг. 3 представлен профиль аналитической ОФ ВЭЖХ РТН (1-34), которая свидетельствует о чистоте конечного препарата более 99%.
Идентификацию образующегося рекомбинантного РТН (1-34) проводят с помощью TOF-ESI-масс-спектрометрии на масс-спектрометре Agilent technologies 6224, результирующий масс-спектр представлен на Фиг. 4. Полученный сигнал рекомбинантного РТН соответствует расчётному значению массы 4117 Да. Элюат упаривают на роторном испарителе и лиофилизуют.
Figure 00000001

Claims (14)

1. Гибридный белок Trx-TEVrs-РТН, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2, содержащий тиоредоксин, специфический сайт узнавания TEV-протеиназы, рекомбинантный РТН (1-34), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1.
2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTrx-TEVrs-РТН для экспрессии гибридного белка Trx-TEVrs-РТН по п. 1, состоящая из HindHIII/MscI-фрагмента ДНК плазмиды pET32a, содержащая:
- последовательность промотора T7 и оператора lacO;
- последовательность, кодирующую гибридный белок по п. 1;
- ген β-лактамазы в качестве генетического маркера, детерминирующего устойчивость трансформированных плазмидой pTrx-TEVrs-РТН клеток Е.coli к пенициллиновым антибиотикам;
- последовательность, кодирующую точку начала репликации;
- ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.
3. Штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/pTrx-TEVrs-РТН, продуцирующий гибридный белок по п. 1, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-РТН по п. 2.
4. Штамм Escherichia coli по п. 3, отличающийся тем, что получен путём трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН по п. 2.
5. Способ получения рекомбинантного PTH(1-34), включающий в себя стадии:
(1) культивирование полученного штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН по п. 3 с получением биомассы клеток штамма-продуцента;
(2) выделение рекомбинантного РТН(1-34) SEQ ID NO 1 из биомассы клеток штамма-продуцента.
6. Способ получения рекомбинантного PTH(1-34) по п. 5, отличающийся тем, что выделение РТН(1-34) SEQ ID NO 1 осуществляют за счёт отделения гибридного белка в виде супернатанта, хроматографическую очистку гибридного белка, расщепление TEV-протеиназой, центрифугиование, отделение супернатанта и хроматографическую очистку рекомбинантного РТН(1-34).
7. Способ получения рекомбинантного PTH(1-34) по п. 5, отличающийся тем, что хроматографическую очистку гибридного белка осуществляют на анионообменном сорбенте.
RU2019100018A 2019-01-09 2019-01-09 Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34) RU2700452C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019100018A RU2700452C1 (ru) 2019-01-09 2019-01-09 Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019100018A RU2700452C1 (ru) 2019-01-09 2019-01-09 Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2700452C1 true RU2700452C1 (ru) 2019-09-17

Family

ID=67989619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019100018A RU2700452C1 (ru) 2019-01-09 2019-01-09 Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2700452C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110938151A (zh) * 2019-12-30 2020-03-31 重庆艾力彼生物科技有限公司 用于表达甲状旁腺素pth的融合蛋白及重组质粒、重组工程菌

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011151721A1 (en) * 2010-06-04 2011-12-08 Lupin Limited Process for production of fusion proteins using truncated e. coli thioredoxin
WO2014097323A1 (en) * 2012-12-21 2014-06-26 Enzene Biosciences Ltd. Novel fusion tags and expression vector system for the expression of human parathyroid hormone (rhpth)
RU2625008C2 (ru) * 2015-11-06 2017-07-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) ШТАММ Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TrxTEVrs-TMS, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ С ОБРАЗОВАНИЕМ АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА ТУМАСТИНА, ПРОИЗВОДНОГО ФРАГМЕНТА [L69K-95] ТУМСТАТИНА ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011151721A1 (en) * 2010-06-04 2011-12-08 Lupin Limited Process for production of fusion proteins using truncated e. coli thioredoxin
WO2014097323A1 (en) * 2012-12-21 2014-06-26 Enzene Biosciences Ltd. Novel fusion tags and expression vector system for the expression of human parathyroid hormone (rhpth)
RU2625008C2 (ru) * 2015-11-06 2017-07-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) ШТАММ Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TrxTEVrs-TMS, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ С ОБРАЗОВАНИЕМ АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА ТУМАСТИНА, ПРОИЗВОДНОГО ФРАГМЕНТА [L69K-95] ТУМСТАТИНА ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FU X.Y. et al., Extracellular production of human parathyroid hormone as a thioredoxin fusion form in Escherichia coli by chemical permeabilization combined with heat treatment, Biotechnol. Prog., 2005, v.21, n.5, p.1429-1435. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110938151A (zh) * 2019-12-30 2020-03-31 重庆艾力彼生物科技有限公司 用于表达甲状旁腺素pth的融合蛋白及重组质粒、重组工程菌
CN110938151B (zh) * 2019-12-30 2023-03-17 重庆艾力彼生物科技有限公司 用于表达甲状旁腺素pth的融合蛋白及重组质粒、重组工程菌

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106906236B (zh) 唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法，唾液酸酶及其制备方法
KR20170085129A (ko) 펩티드 생산용 융합 파트너
JP2023517162A (ja) 枯草菌及びエンドヌクレアーゼを使用したヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の生成
JP2024040366A (ja) 操作されたホスホペントムターゼ改変体酵素
JP2024042079A (ja) 操作されたガラクトースオキシダーゼ改変体酵素
CN114072165A (zh) 工程化蔗糖磷酸化酶变体酶
RU2700452C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)
EP1411131A1 (en) Process for producing template dna and process for producing protein in cell-free protein synthesis system with the use of the same
JP2016518855A (ja) 融合プロテアーゼ
RU2593172C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-TA1 GyrA-AcSer, КОДИРУЮЩАЯ СЕРИНОВУЮ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, СПОСОБНУЮ in vivo АЦЕТИЛИРОВАТЬ N-КОНЦЕВОЙ СЕРИН ДЕЗАЦЕТИЛТИМОЗИНА α1 И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Eschrichia coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННЫХ БЕЛКОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА
JP7449000B2 (ja) 可溶性の組換えタンパク質の生成
CN111372941A (zh) 用于周质蛋白质表达的细菌前导序列
Esipov et al. Comparative analysis of the effectiveness of C-terminal cleavage intein-based constructs in producing a recombinant analog of anophelin, an anticoagulant from Anopheles albimanus
RU2619170C2 (ru) Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3
KR20160077750A (ko) 재조합 트랜스 글루타미나아제의 대량 생산 방법
RU2697375C2 (ru) ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pRh15A ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 DE3 - ПРОДУЦЕНТ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b
RU2302465C2 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-Gl, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ Escherichia coli ER-2566/pER-Gl - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА
RU2592860C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-TB4GyrA-AcSer, КОДИРУЮЩАЯ СЕРИНОВУЮ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, СПОСОБНУЮ in vivo АЦЕТИЛИРОВАТЬ N-КОНЦЕВОЙ СЕРИН ДЕЗАЦЕТИЛТИМОЗИНА β4 И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ТИМОЗИНА β4 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Eschrichia coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННЫХ БЕЛКОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ТИМОЗИНА β4 ЧЕЛОВЕКА
Jia et al. A new vector coupling ligation-independent cloning with sortase a fusion for efficient cloning and one-step purification of tag-free recombinant proteins
RU2441072C1 (ru) ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА ИЗ ЭТОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА
KR101219716B1 (ko) 제한효소의 생산방법
RU2435858C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-Hir, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ [Leu1, Thr2]-63-ДЕСУЛЬФАТОГИРУДИНА, ШТАММ Escherichia coli ER2566/pER-Hir-ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО [Leu1, Thr2]-63-ДЕСУЛЬФАТОГИРУДИНА
KR102075740B1 (ko) 고속 효소 스크리닝 시스템에 의해 동정된 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제
RU2188234C2 (ru) Способ получения рекомбинантной тимидин-фосфорилазы, рекомбинантная плазмидная днк pertpho1 и штамм escherichia coli bl21(de3)/pertpho1-продуцент тимидин-форфорилазы
JP2024500102A (ja) 操作されたウリジンホスホリラーゼ改変体酵素