RU2700452C1 - Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34) - Google Patents
Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2700452C1 RU2700452C1 RU2019100018A RU2019100018A RU2700452C1 RU 2700452 C1 RU2700452 C1 RU 2700452C1 RU 2019100018 A RU2019100018 A RU 2019100018A RU 2019100018 A RU2019100018 A RU 2019100018A RU 2700452 C1 RU2700452 C1 RU 2700452C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pth
- tevrs
- ptrx
- recombinant
- hybrid protein
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N teriparatide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N 0.000 title claims abstract description 42
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 title claims description 41
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 title claims description 35
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 title claims description 34
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 title claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 108010049264 Teriparatide Proteins 0.000 title abstract description 8
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 title 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 16
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 15
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 6
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims 1
- 229960005460 teriparatide Drugs 0.000 abstract description 7
- 101001135770 Homo sapiens Parathyroid hormone Proteins 0.000 abstract description 6
- 101001135995 Homo sapiens Probable peptidyl-tRNA hydrolase Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000058004 human PTH Human genes 0.000 abstract description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 102100036893 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 101150031139 pth gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 1
- 101000852559 Homo sapiens Thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 101710090149 Lactose operon repressor Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108700015930 Prolyl Oligopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000056251 Prolyl Oligopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 102000056461 human TXN Human genes 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002742 methionines Chemical class 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- -1 β-cyanethyl-diisopropylamino Chemical group 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков и может быть использовано для получения активного фрагмента (1-34) эндогенного человеческого паратиреоидного гормона. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pTrx-TEVrs-РТН, которая обеспечивает синтез гибридного белка, содержащего последовательность тиоредоксина и терипаратида в клетках Escherichia coli. Путём трансформации штамма E.coli BL 21(DE3) плазмидой pTrx-TEVrs-РТН получают штамм- продуцент гибридного белка Trx-TEVrs-РТН. Разработан способ получения рекомбинантного терипаратида, предусматривающий получение и культивирование продуцента гибридного белка, содержащего терипаратид, с последующим выделением и расщеплением указанного гибридного белка. Изобретение позволяет получить рекомбинантный терипаратид с высоким выходом и по упрощённой технологии. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно может быть использовано для получения рекомбинантного фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона PTH (1-34).
Активный фрагмент эндогенного человеческого паратиреоидного гормона PTH (1-34), так же известный как терипаратид, способен индуцировать образование костной ткани, что делает его эффективным при лечении остеопороза.
Фрагмент эндогенного человеческого паратиреоидного гормона РТН (1-34) представляет собой 34-членный пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1.
Известен метод выделения РТН (1-34) из природного источника (Keutmann, H. T., Aurbach, G. D., Dawson, B. F., Niall, H. D., Deftos, L. J., and Potts, J. T., Jr. (1972) Biochemistry 10, 2779-2787). Недостаток данного метода заключается в небольших выходах продукта и невозможности масштабировать технологический процесс.
Известен химический способ получения PTH (1-34) посредством твердофазного пептидного синтеза /патент US4086196, C07К l4/635, опубл. 25.04.1978/. Недостатком такого метода является наличие продуктов близкородственных примесей, которые возникают в ходе твердофазного синтеза, что значительно усложняет процесс очистки РТН (1-34). Ко всему прочему, химический синтез требует использования сложновоспроизводимых и трудоёмких методов.
Наиболее перспективным, с точки зрения производства PTH(1-34), является применение методов рекомбинантных ДНК. Так, в источнике /патент CN1424325, C07H21/00, опубл.18.06.2003/ описан биотехнологический метод получения РТН(1-34), посредством его слияния с глутатион-S-трансферазой. Протеолитическое расщепление образовавшегося гибридного белка осуществляли тромбином, затем проводили очистку на аффинной колонке с химотрипсином и дальнейшее протеолитическое расщепление с помощью пролинэндопептидазы и дополнительную хроматографическую очистку. Использование аффинной хроматографии и двух протеиназ делает технологию нерентабельной, а также увеличивает трудозатраты.
Известен способ получения РТН (1-34) /патент РФ 2441019, C07K 1/36, опубл. 27.01.2012г./ в составе гибридного белка, который состоит из His-tag, фрагмента белка β-галактозидазы, сайта расщепления энтерокиназы и РТН (1-34). Недостатком данного метода является необходимость использования мочевины, поскольку гибридный белок продуцируется в виде тел включения. Также для очистки гибридного белка была использована аффинная хроматография, что делает процесс очистки нерентабельным.
Аналог, наиболее близкий к заявленному способу получения РТН (1-34), описан в работе (Fu, Xiang-Yang et al, Biotechnology Progress (2005), 21(5), 1429-1435), в котором РТН (1-34) получают в составе гибридного белка, состоящим из тиоредоксина и РТН (1-34). В процессе ферментации используют Тритон-Х 100 и термическую денатурацию, которая приводит к осаждению балластных белков. Нагревание проводят при 80°С в течение 15 минут. В данном способе белок инкубируют при высокой температуре, которая является нежелательной для белков и может привести к окислению метионинов, входящих в состав РТН (1-34).
Таким образом, техническая проблема, существующая при получении PTH (1-34) заключается в трудоемкости и сложности известных способов. Изобретение решает техническую проблему получения высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный РТН (1-34) с высоким выходом.
Техническим результатом заявленного изобретения является обеспечение выхода рекомбинантного РТН (1-34) до 5% относительно суммарного белка клетки при чистоте препарата не ниже 98%.
Для решения поставленной технической проблемы и заявленного технического результата предлагается гибридный белок Trx-TEVrs-РТН, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2, содержащий тиоредоксин, специфический сайт узнавания TEV-протеиназы, рекомбинантного РТН (1-34), имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1.
Предлагается также рекомбинантная плазмидная ДНК pTrx-TEVrs-РТН для экспрессии гибридного белка Trx-TEVrs-РТН (SEQ ID NO 2), состоящая из HindIII/MscI-фрагмента ДНК плазмиды pET32a, содержащего:
- последовательность промотора T7 и оператора lacO;
- последовательность, кодирующую гибридный белок SEQ ID NO 2;
- ген β-лактамазы в качестве генетического маркера;
- последовательность, кодирующую точку начала репликации;
- ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.
Предлагается Штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/pTrx-TEVrs-РТН, продуцирующий гибридный белок Trx-TEVrs-РТН (SEQ ID NO 2), содержащий рекомбинантую плазмиду ДНК pTrx-TEVrs-РТН. Указанный Штамм Escherichia coli получен путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН по п.2.
Способ получения рекомбинантного PTH(1-34) (SEQ ID NO 1), включает в себя стадии:
- культивирования полученного штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН с получением биомассы клеток штамма-продуцента;
- выделения РТН(1-34) SEQ ID NO 1 из биомассы клеток штамма-продуцента.
На стадии выделения РТН(1-34) SEQ ID NO 1 осуществляют отделение гибридного белка в виде супернатанта, хроматографическую очистку гибридного белка, расщепление TEV-протеиназой, центрифугиование, отделение супернатанта и хроматографическую очистку РТН(1-34).
1. Конструируют экспрессионную плазмиду pTrx-TEVrs-РТН, содержащую гибридный ген, состоящий из слитых в рамке нуклеотидных последовательностей тиоредоксина, специфического сайта узнавания TEV-протеиназы (SEQ ID NO 3) и N-концевого фрагмента РТН (1-34).
2. Путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН, получают штамм-продуцент гибридного белка Trx-TEVrs-PTH(1-34), состоящего из разделенных специфическим сайтом узнавания протеиназы вируса гравировки табака (TEV-протеиназой) тиоредоксина и РТН(1-34), накапливающегося в растворимой форме во время культивирования.
3. Клеточную биомассу разрушают в буферном растворе 50мМ Трис pH 8.5 в присутствии ингибиторов клеточных протеаз и отделяют осветленный клеточный лизат, содержащий гибридный белок Trx-TEVrs-PTH SEQ ID NO 2. Полученный осветлённый клеточный лизат наносят на анионообменную смолу и элюируют белок в градиенте соли.
Протеолитическое расщепление рекомбинантной TEV-протеиназой проводят в течение не менее 18 часов при комнатной температуре при рН 8.0-8.5 в присутствии дитиотреитола при соотношении фермент : белок 1:100.
Дальнейшую очистку целевого продукта проводят с помощью обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте этанола. Для удаления остаточного спирта проводят упаривание, объединённые фракции лиофилизуют. Идентичность полученного РТН (1-34) подтверждают с помощью масс-спектрометрии.
В связи с отсутствием у РТН (1-34) жёсткой третичной структуры, он является доступной мишенью для клеточных протеаз. Чтобы избежать с этим связанных трудностей, фрагмент эндогенного человеческого паратиреоидного гормона РТН (1-34) (SEQ ID NO 1) получают в составе гибридного белка, содержащего N-концевой тиоредоксин и специфический сайт узнавания протеазы вируса гравировки табака (TEV протеазы, ЕС 3.4.22.4). С этой целью получают рекомбинантную векторную плазмиду pTrx-TEVrs-РТН, содержащую гибридный ген, состоящий из слитых в рамке нуклеотидных последовательностей тиоредоксина и терипаратида, разделенных специфическим сайтом узнавания TEV-протеинаы (SEQ ID NO 3), при этом целевой ген РТН (1-34) амплифицировали с помощью ПЦР, используя плазмиду с искусственным геном РТН (1-34) в качестве матрицы. Полученным экспрессионным вектором трансформируют штамм Е. coli BL21(DE3) (New England Biolabs), получая штамм-продуцент гибридного белка Е. coli BL21(DE3)/pTrx-TEVrs-РТН. Выход РТН (1-34) высокой степени чистоты (98%) после обращённо-фазовой хроматографии достигает 5% относительно суммарного белка клетки.
В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3), содержащий плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-PTH для суперпродукции гибридного белка Trx-TEVrs-PTH, содержащего последовательность тиоредоксина и РТН (1-34) человека.
Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-PTH:
- кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного
человеческого РТН (1-34);
- состоящую из SgrAI/XbaI-фрагмента ДНК плазмиды pET32a, содержащего последовательность промотора T7 и оператора lacO;
- содержащую последовательность, кодирующую гибридный белок SEQ ID NO 2, включающего в себя последовательность тиоредоксина, специфического сайта узнавания TEV-протеиназы и адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного человеческого терипаратида;
- содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pTrx-TEVrs-РТН клеток Е.coli к пенициллиновым антибиотикам; последовательность, кодирующую точку начала репликации; ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.
Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена гибридного белка Trx-TEVrs-РТН, содержащего на 5'-конце ген тиоредоксина, соединенного с геном сайта узнавания TEV-протеиназы и РТН (1-34). Для конструирования плазмиды используют химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.
Последовательность TEVrs-PTH получают химическим синтезом.
Концевые его участки, содержащие соответствующие вектору сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции вводят с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами А1 и В1 (SEQ ID NO 4), и затем последовательность клонируют в векторную плазмиду pET32a.
Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаризованной среде "Дифко" – колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие, серые, край ровный.
Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимальном значении рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН отличается от штамма-реципиента Е.coli BL21 (DE3) только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН, которая и придаёт ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.
Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3) соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.
Клетки Е.coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН являются суперпродуцентом. При индукции изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка Trx-TEVrs-РТН, который накапливается в клетках в растворимой форме в количестве не менее 35% от суммарного белка клетки.
Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-РТН, для чего нуклеотидную последовательность TEVrs-PTH (SEQ ID NO 5) амплифицируют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (SEQ ID NO 4), содержащими сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции MscI (N-конец гена, праймер А1) и HindIII (С - конец гена, праймер В1), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с обработанной по тем же сайтам векторной плазмидой pET32a. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е.coli BL21(DE3) и высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют с помощью секвенирования.
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) до достижения максимальной плотности культуры.
На (SEQ ID NO 1) изображена аминокислотная последовательность фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона РТН (1-34).
На (SEQ ID NO 2) изображена аминокислотная последовательность гибридного белка Trx-TEVrs-PTH.
На (SEQ ID NO 3) изображена аминокислотная последовательность специфического сайта узнавания TEV-протеиназы.
На (SEQ ID NO 4) изображена нуклеотидная последовательность праймеров, использованных для амплификации гена синтетического фрагмента TEVrs-PTH.
На (SEQ ID NO 5) изображенаи нуклеотидная последовательность синтетического фрагмента TEVrs-PTH
Изобретение иллюстрируется следующими рисунками.
Фиг. 1.Физическая карта плазмиды pTrx-TEVrs-РТН.
Фиг. 2. Электрофореграмма лизата клеток штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3) / pTrx-TEVrs-РТН. М — стандарт молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610; С — лизат клеток.
Фиг. 3. Профиль аналитической ОФ ВЭЖХ полученного РТН (1-34). Образец — раствор РТН (1-34) в виде объединённых фракциях после конечной очистки, в объёме 20 мкл.
Фиг. 4. Масс-спектр полученного РТН (1-34). Образец — раствор РТН (1-34) в виде объединённых фракциях после конечной очистки, в объёме 20 мкл.
Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК.
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов – 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.
Для приготовления вектора ДНК плазмиды pET32a (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера 50 мМ ацетатат калия, 20 мМ Трис-ацетат, 10 мМ ацетат магния, 100 мкг/мл БСА рестриктазой MscI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 50 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой HindIII (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT , растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
Для приготовления гена TEVrs-PTH проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы искусственный ген TEVrs-PTH (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А1 (SEQ ID NO 4) и В1 (SEQ ID NO 4), по 60 пмоль каждого. ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация - 40 сек при 72°С, 30 циклов ПЦР. Ген после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE, затем обрабатывают теми же рестриктазами, которые используют при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.
Полученный синтетический фрагмент с геном рекомбинантного PTH (1-34) в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг, полученного из ДНК лазмиды pET32a, описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.
Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pTrx-TEVrs-РТН. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования. Физическая карта плазмиды pTrx-TEVrs-РТН представлена на фиг.1. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Ori – участок инициации репликации плазмиды. ApR – ген устойчисовсти к ампицилину. LacI – ген репрессора лактозного оперона. Trx-TEVrs-РТН – ген рекомбинантного белка, кодирующий тиоредоксин, сайт узнавания TEV-протеиназы и терипаратид.
Пример 2. Получение штамма-продуцента Е.coli BL21 (DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН и определение его продуктивности.
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН получают трансформацией компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3) плазмидой pTrx-TEVrs-РТН, получение которой как описано в примере 1.
Штамм продуцента Е.coli BL21 (DE3)/ p Trx-TEVrs-РТН культивируют при 37°С в 100 мл LB-бульона (рН 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч в орбитальном шейкере-инкубаторе в колбах Ерленмейера со скоростью вращения 190 об/мин до оптической плотности А550 0,7-0,8. Затем прибавляют изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозид до концентрации 0,2 мМ и инкубируют в течение 6 ч, или продолжают выращивание в отсутствие индуктора в течение 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А550 и количество культуры, соответствующее 1 мл с А550 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осаждённые клетки в 100 мкл лизирующего буферного раствора с красителем бромфеноловым синим обрабатывают ультразвуком в течение 20 сек, инкубируют 3 мин при 100°С, аликвоты по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Приводили оценку содержания гибридного белка Trx-TEVrs-РТН в клеточном лизате путём анализа насыщенности полос в программном обеспечении ImageJ. Определяют На фиг 2. представлена электрофореграмма лизата клеток штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН, содержание гибридного белка от общего клеточного не менее 30%.
Пример 3. Получение гибридного белка Trx-TEVrs-РТН, его расщепление и выделение рекомбинантного PTH (1-34).
После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С), разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе в буфере (50 мМ Tрис/HCl, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ ПМСФ, рН 8) и отделяют супернатант центрифугированием (15000 g, 45 мин). Осветленный клеточный лизат наносят на анионообменную смолу уравновешенную буфером для нанесения (50 мМ Трис/HCl, 10 рН 8,5). Гибридный белок элюируют градиентом концентрации соли в буфере для нанесения. В элюат добавляют TEV-протеиназу, тем самым инициируя расщепление гибридного белка, и инкубируют при 22°С в течении 18 ч. Из полученной смеси отбирают пробу в количестве 30 мкл и с красителем бромфеноловым синим инкубируют 3 мин при 100°С. Пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. После инкубирования при 22°С в течении 18 ч. доводят рН раствора соляной кислотой до 3.0 и центрифугируют. Дальнейшую очистку и анализ рекомбинантного РТН проводят посредством обращенно-фазовой хроматографии. На фиг. 3 представлен профиль аналитической ОФ ВЭЖХ РТН (1-34), которая свидетельствует о чистоте конечного препарата более 99%.
Идентификацию образующегося рекомбинантного РТН (1-34) проводят с помощью TOF-ESI-масс-спектрометрии на масс-спектрометре Agilent technologies 6224, результирующий масс-спектр представлен на Фиг. 4. Полученный сигнал рекомбинантного РТН соответствует расчётному значению массы 4117 Да. Элюат упаривают на роторном испарителе и лиофилизуют.
Claims (14)
1. Гибридный белок Trx-TEVrs-РТН, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2, содержащий тиоредоксин, специфический сайт узнавания TEV-протеиназы, рекомбинантный РТН (1-34), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1.
2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTrx-TEVrs-РТН для экспрессии гибридного белка Trx-TEVrs-РТН по п. 1, состоящая из HindHIII/MscI-фрагмента ДНК плазмиды pET32a, содержащая:
- последовательность промотора T7 и оператора lacO;
- последовательность, кодирующую гибридный белок по п. 1;
- ген β-лактамазы в качестве генетического маркера, детерминирующего устойчивость трансформированных плазмидой pTrx-TEVrs-РТН клеток Е.coli к пенициллиновым антибиотикам;
- последовательность, кодирующую точку начала репликации;
- ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.
3. Штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/pTrx-TEVrs-РТН, продуцирующий гибридный белок по п. 1, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-РТН по п. 2.
4. Штамм Escherichia coli по п. 3, отличающийся тем, что получен путём трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН по п. 2.
5. Способ получения рекомбинантного PTH(1-34), включающий в себя стадии:
(1) культивирование полученного штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН по п. 3 с получением биомассы клеток штамма-продуцента;
(2) выделение рекомбинантного РТН(1-34) SEQ ID NO 1 из биомассы клеток штамма-продуцента.
6. Способ получения рекомбинантного PTH(1-34) по п. 5, отличающийся тем, что выделение РТН(1-34) SEQ ID NO 1 осуществляют за счёт отделения гибридного белка в виде супернатанта, хроматографическую очистку гибридного белка, расщепление TEV-протеиназой, центрифугиование, отделение супернатанта и хроматографическую очистку рекомбинантного РТН(1-34).
7. Способ получения рекомбинантного PTH(1-34) по п. 5, отличающийся тем, что хроматографическую очистку гибридного белка осуществляют на анионообменном сорбенте.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019100018A RU2700452C1 (ru) | 2019-01-09 | 2019-01-09 | Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019100018A RU2700452C1 (ru) | 2019-01-09 | 2019-01-09 | Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2700452C1 true RU2700452C1 (ru) | 2019-09-17 |
Family
ID=67989619
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019100018A RU2700452C1 (ru) | 2019-01-09 | 2019-01-09 | Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34) |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2700452C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110938151A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-03-31 | 重庆艾力彼生物科技有限公司 | 用于表达甲状旁腺素pth的融合蛋白及重组质粒、重组工程菌 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011151721A1 (en) * | 2010-06-04 | 2011-12-08 | Lupin Limited | Process for production of fusion proteins using truncated e. coli thioredoxin |
WO2014097323A1 (en) * | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Enzene Biosciences Ltd. | Novel fusion tags and expression vector system for the expression of human parathyroid hormone (rhpth) |
RU2625008C2 (ru) * | 2015-11-06 | 2017-07-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | ШТАММ Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TrxTEVrs-TMS, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ С ОБРАЗОВАНИЕМ АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА ТУМАСТИНА, ПРОИЗВОДНОГО ФРАГМЕНТА [L69K-95] ТУМСТАТИНА ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА |
-
2019
- 2019-01-09 RU RU2019100018A patent/RU2700452C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011151721A1 (en) * | 2010-06-04 | 2011-12-08 | Lupin Limited | Process for production of fusion proteins using truncated e. coli thioredoxin |
WO2014097323A1 (en) * | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Enzene Biosciences Ltd. | Novel fusion tags and expression vector system for the expression of human parathyroid hormone (rhpth) |
RU2625008C2 (ru) * | 2015-11-06 | 2017-07-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | ШТАММ Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TrxTEVrs-TMS, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ С ОБРАЗОВАНИЕМ АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА ТУМАСТИНА, ПРОИЗВОДНОГО ФРАГМЕНТА [L69K-95] ТУМСТАТИНА ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
FU X.Y. et al., Extracellular production of human parathyroid hormone as a thioredoxin fusion form in Escherichia coli by chemical permeabilization combined with heat treatment, Biotechnol. Prog., 2005, v.21, n.5, p.1429-1435. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110938151A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-03-31 | 重庆艾力彼生物科技有限公司 | 用于表达甲状旁腺素pth的融合蛋白及重组质粒、重组工程菌 |
CN110938151B (zh) * | 2019-12-30 | 2023-03-17 | 重庆艾力彼生物科技有限公司 | 用于表达甲状旁腺素pth的融合蛋白及重组质粒、重组工程菌 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106906236B (zh) | 唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法,唾液酸酶及其制备方法 | |
KR20170085129A (ko) | 펩티드 생산용 융합 파트너 | |
JP7491587B2 (ja) | 操作されたガラクトースオキシダーゼ改変体酵素 | |
JP2023517162A (ja) | 枯草菌及びエンドヌクレアーゼを使用したヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の生成 | |
CN111032682A (zh) | 用于工业生物催化的工程化转氨酶多肽 | |
JP2024040366A (ja) | 操作されたホスホペントムターゼ改変体酵素 | |
CN114072165A (zh) | 工程化蔗糖磷酸化酶变体酶 | |
RU2700452C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34) | |
EP1411131A1 (en) | Process for producing template dna and process for producing protein in cell-free protein synthesis system with the use of the same | |
CN114381471A (zh) | 一种辅助蛋白在重组蛋白生产中的应用及融合表达系统 | |
JP2016518855A (ja) | 融合プロテアーゼ | |
RU2593172C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-TA1 GyrA-AcSer, КОДИРУЮЩАЯ СЕРИНОВУЮ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, СПОСОБНУЮ in vivo АЦЕТИЛИРОВАТЬ N-КОНЦЕВОЙ СЕРИН ДЕЗАЦЕТИЛТИМОЗИНА α1 И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Eschrichia coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННЫХ БЕЛКОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА | |
JP7449000B2 (ja) | 可溶性の組換えタンパク質の生成 | |
CN111372941A (zh) | 用于周质蛋白质表达的细菌前导序列 | |
RU2619170C2 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3 | |
Esipov et al. | Comparative analysis of the effectiveness of C-terminal cleavage intein-based constructs in producing a recombinant analog of anophelin, an anticoagulant from Anopheles albimanus | |
KR20160077750A (ko) | 재조합 트랜스 글루타미나아제의 대량 생산 방법 | |
RU2302465C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-Gl, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ Escherichia coli ER-2566/pER-Gl - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА | |
Jia et al. | A new vector coupling ligation-independent cloning with sortase a fusion for efficient cloning and one-step purification of tag-free recombinant proteins | |
RU2592860C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-TB4GyrA-AcSer, КОДИРУЮЩАЯ СЕРИНОВУЮ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, СПОСОБНУЮ in vivo АЦЕТИЛИРОВАТЬ N-КОНЦЕВОЙ СЕРИН ДЕЗАЦЕТИЛТИМОЗИНА β4 И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ТИМОЗИНА β4 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Eschrichia coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННЫХ БЕЛКОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ТИМОЗИНА β4 ЧЕЛОВЕКА | |
RU2441072C1 (ru) | ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА ИЗ ЭТОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА | |
KR101219716B1 (ko) | 제한효소의 생산방법 | |
RU2435858C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-Hir, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ [Leu1, Thr2]-63-ДЕСУЛЬФАТОГИРУДИНА, ШТАММ Escherichia coli ER2566/pER-Hir-ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО [Leu1, Thr2]-63-ДЕСУЛЬФАТОГИРУДИНА | |
KR102075740B1 (ko) | 고속 효소 스크리닝 시스템에 의해 동정된 신규 가용성 메탄 모노옥시게나아제 | |
RU2188234C2 (ru) | Способ получения рекомбинантной тимидин-фосфорилазы, рекомбинантная плазмидная днк pertpho1 и штамм escherichia coli bl21(de3)/pertpho1-продуцент тимидин-форфорилазы |