RU2625008C2 - ШТАММ Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TrxTEVrs-TMS, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ С ОБРАЗОВАНИЕМ АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА ТУМАСТИНА, ПРОИЗВОДНОГО ФРАГМЕНТА [L69K-95] ТУМСТАТИНА ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА - Google Patents

ШТАММ Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TrxTEVrs-TMS, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ С ОБРАЗОВАНИЕМ АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА ТУМАСТИНА, ПРОИЗВОДНОГО ФРАГМЕНТА [L69K-95] ТУМСТАТИНА ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА Download PDF

Info

Publication number
RU2625008C2
RU2625008C2 RU2015147716A RU2015147716A RU2625008C2 RU 2625008 C2 RU2625008 C2 RU 2625008C2 RU 2015147716 A RU2015147716 A RU 2015147716A RU 2015147716 A RU2015147716 A RU 2015147716A RU 2625008 C2 RU2625008 C2 RU 2625008C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
tms
gly
peptide
coli
ptev
Prior art date
Application number
RU2015147716A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2015147716A (ru
Inventor
Роман Станиславович Есипов
Мария Андреевна Костромина
Ксения Андреевна Бейрахова
Дмитрий Александрович Макаров
Анатолий Иванович Мирошников
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority to RU2015147716A priority Critical patent/RU2625008C2/ru
Publication of RU2015147716A publication Critical patent/RU2015147716A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2625008C2 publication Critical patent/RU2625008C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к рекомбинантному получению антиангиогенных пептидов, и может быть использовано в медицине. Способ получения рекомбинантного антиангиогенного пептида Тумастина - производного модифицированного фрагмента [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, предусматривает культивирование штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS, разрушение клеточной биомассы в присутствии ингибитора протеаз, центрифугирование клеточного лизата и отделение клеточного супернатанта, содержащего гибридный белок, хроматографическую очистку гибридного белка на колонне с анионообменным сорбентом, протеолитическое расщепление с помощью TEV-протеиназы, хроматографическую очистку антиангиогенного пептида Тумастина. Изобретение позволяет получить с высоким выходом антиангиогенный пептид Тумастин. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии, и представляет собой способ получения рекомбинантного антиангиогенного пептида Тумастина, представляющего собой модифицированный фрагмент [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N-концу последовательностью Ser-Gly-Ala-Met-Gly и к С-концу последовательностью Pro-Gly-Pro. Проявляемые им антиангиогенные свойства определяют возможность его использования в качестве препарата для терапии заболеваний, ассоциированных с офтальмоангиопатиями.
Ангиогенез - процесс образования новых кровеносных сосудов в органе или ткани (Battegay E.J. J. Mol. Med. 1995. V. 73. №7. 333-346). Различают 2 вида ангиогенеза: физиологический и патологический. Физиологический ангиогенез является неотъемлемой частью физиологических и репаративных процессов. Патологический ангиогенез развивается как при избытке его стимуляторов и/или дефиците ингибиторов, так и при дефиците стимуляторов и/или избытке ингибиторов (Gao G., Ma J. Drug Discov. Today. 2002. V. 7. №3. 171-172). Неоангиогенез (неоваскуляризация) имеет место при ряде заболеваний глаз, таких как: диабетическая ретинопатия, возрастная макулярная дегенерация (ВМД), тромбоз центральной вены сетчатки, неоваскулярная глаукома, опухоли хориоидеи и сетчатки.
Сложный механизм ангиогенеза предоставляет много возможностей для терапевтического вмешательства. Основной мишенью антиангиогенной терапии является проангиогенный сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Однако развитие неоангиогенеза зависит от множества других проангиогенных белков и их функций.
Тумстатин (28 кДа) - NC1 домен цепи α3 коллагена IV типа, встречающейся в гломерулярных и альвеолярных базальных мембранах, а также в базальных мембранах передней капсулы хрусталика, внутреннего уха и некоторых других органов (Hudson B.G., Reeders S.T., Tryggvason К.J. Biol. Chem. 1993. V. 268. №35. P. 26033-26036). Тумстатин высвобождается из базальной мембраны в результате гидролиза коллагена IV под воздействием металлопротеиназы ММР-9. Исследования на мышах с инактивированным геном цепи α3ColIV показали, что отсутствие тумстатина в крови не влияет на эмбриональное развитие, физиологический ангиогенез и репаративные процессы, однако приводит к ускоренному росту опухолей в результате усиленной патологической неоваскуляризации (Hamano Y., Zeisberg M., Sugimoto H., Lively J.C., Maeshima Y., Yang C., Hynes R.O., Werb Z., Sudhakar A., Kalluri R. Cancer Cell. 2003. V. 3. №6. P. 589-601).
Тумстатин ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток, стимулированных bFGF (основной фактор роста фибробластов) и VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста), задерживая их деление на стадии G1 (Maeshima Y., Colorado P.С., Torre A., Holthaus K.A., Grunkemeyer J.A., Ericksen M.B., Hopfer H., Xiao Y., Stillman I.E., Kalluri R. J. Biol. Chem. 2000. V. 275. №28. P. 21340-21348; Maeshima Y., Manfredi M., Reimer C., Holthaus K.A., Hopfer H., Chandamuri B.R., Kharbanda S., Kalluri R. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. №18. P. 15240-15248). Тумстатин индуцирует апоптоз пролиферирующих эндотелиальных клеток, активируя каспазу-3 (Maeshima Y., Yerramalla U.L., Dhanabal М., Holthaus K.А., Barbashov S., Kharbanda S., Reimer C., Manfredi M., Dickerson W.M., Kalluri R. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. №34. 31959-31968). Действие тумстатина опосредовано через связывание с интегрином αVβ3 на поверхности эндотелиальных клеток, что приводит к ингибированию белкового синтеза (Maeshima Y., Colorado Р.С., Kalluri R. J. Biol. Chem. 2000. V. 275. №31. P. 23745-23750).
Недавно была исследована антиангиогенная активность рекомбинантного тумстатина, полученного в бакуловирусной экспрессионной системе, на модели неоваскуляризации роговицы мыши. Был выявлен значимый антиангиогенный эффект тумстатина и отмечено снижение экспрессии VEGF у экспериментальных животных (Gunda V., Wang S., Sheibani N., Sudhakar, A. J. Clinic. Experiment. Ophthalmol. 2011. V. 2. P. 132). Однако высокий молекулярный вес, потенциальная иммуногенность и низкая растворимость являются существенными ограничивающими его клинические исследования факторами.
Было показано, что антиангиогенная активность тумстатина локализована во фрагменте Tum5 (а.о. 54-132) (Maeshima Y., et al. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. №18. P. 15240-15248). Этот фрагмент, взаимодействуя с интегрином αVβ3 активирует FAK-PI3-PKB/Akt-mTOR сигнальный каскад и предотвращает диссоциацию фактора инициации трансляции 4Е от 4Е-связывающего белка, в результате чего происходит подавление Сар-зависимой трансляции в эндотелиальных клетках (Maeshima Y., Sudhakar A., Lively J.С., Ueki K., Kharbanda S., Kahn C.R., Sonenberg N., Hynes R.O., Kalluri R. Science. 2002. V. 295. №5552. P. 140-143). Путем сравнения гомологичных последовательностей тумстатина и NCl домена цепи α5 ColIV, не обладающего антиангиогенными свойствами, позволило выявить аминокислоты, ответственные за антиангиогенную активность тумстатина: Leu78, Val82 и Asp84 (Petitclerc Е., Boutaud A., Prestayko A., Xu J., Sado Y., Ninomiya Y., Sarras M.P. Jr, Hudson B.G., Brooks P.C. J. Biol. Chem. 2000. V. 275. №11. P. 8051-8061). Была исследована способность различных фрагментов пептида Tum-5 к ингибированию пролиферации эндотелиальных клеток и выявлен короткий биологически активный участок Tum-7 [74-98] (Maeshima Y., et al. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. №34. 31959-31968). В связи с его высокой гидрофобностью и, как следствие, низкой растворимостью была исследована активность фрагмента [69-95] с N-концевой заменой Leu на Lys с большей растворимостью. Данный пептид обладал сопоставимым с фрагментом Tum-7 антиангиогенным эффектом на эндотелиальные клетки.
Первым описанным способом получения фрагментов тумстатина человека с антиангиогенной активностью является твердофазный синтез (Maeshima Y., et al. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. №34. 31959-31968). Патент CN 101519658 описывает получение рекомбинантных фрагментов Tum-7 [74-98] тумстатина человека и его модифицированной формы T7-NGR с N-концевой аффинной меткой (CN 101519658, А Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 02.09.2009).
Изобретение решает задачу получения высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать с высоким выходом рекомбинантный антиангиогенный пептид Тумастин (TMS), представляющий собой модифицированный фрагмент [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно.
Поставленная задача решается за счет того, что:
1. Путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной ДНК pTEV-TMS, содержащей гибридный ген, состоящий из слитых в рамке нуклеотидных последовательностей тиоредоксина, специфического сайта для расщепления TEV-протеиназой (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln, ENLYFQ) и антиангиогенного пептида Тумастина, представляющего собой модифицированный фрагмент [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, получают штамм-продуцент гибридного белка TrxTEVrs-TMS, состоящего из разделенных сайтом для расщепления протеиназой вируса гравировки табака (TEV-протеиназой) тиоредоксина и антиангиогенного пептида TMS и накапливающегося в растворимой форме во время культивирования.
2. После разрушения клеточной биомассы в буферном растворе при рН 7.6-8.0 в присутствии ингибитора протеаз осветленный клеточный лизат, содержащий гибридный белок TrxTEVrs-TMS, отделяют от клеточного дебриса центрифугированием, разбавляют тем же буфером и наносят при рН 8.0 на колонну с анионообменным сорбентом. Проводят элюцию гибридного белка при рН 8.0 в линейном градиенте от 0 до 500 мМ NaCl.
Протеолитическое расщепление рекомбинантной TEV-протеиназой проводят в течение не менее 20 часов при комнатной температуре при рН 8.0-8.5 в присутствии дитиотреитола при соотношении фермент : белок от 1:50 до 1:100 (Esipov RS, Stepanenko VN, Beyrakhova KA, Muravjeva TI, Miroshnikov AI. Biotechnol Appl Biochem. 2010 V. 19. №5689) P. 17-25). Полученный белковый раствор наносят при рН 9.0 на колонну с анионообменным сорбентом. Элюат, полученный во время нанесения, титруют до рН 11 и наносят на колонну с тем же анионообменным сорбентом. Элюцию целевого пептида TMS проводят в изократическом градиенте 150 мМ NaCl при рН 10.0. Дальнейшую очистку целевого продукта проводят с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной и гель-фильтрационной хроматографий. Идентичность полученного пептида TMS подтверждают с помощью масс-спектрометрии.
Технический результат
Техническим результатом изобретения является получение в результате протеолитического расщепления гибридного белка антиангиогенного пептида Тумастина, представляющего собой модифицированный фрагмент [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно.
Антиангиогенный пептид TMS (SEQ ID NO 1, 2) получают на С-конце гибридного белка, содержащего N-концевой тиоредоксин и сайт для расщепления протеазой вируса гравировки табака (TEV протеазой, ЕС 3.4.22.4). С этой целью в штамм Е. coli BL21(DE3) (New England Biolabs, www.neb.com/products/c2527-bl21de3-competent-e-coli) трансформируют рекомбинантный плазмидный вектор pTEV-TMS, содержащий гибридный ген, состоящий из слитых в рамке нуклеотидных последовательностей тиоредоксина, специфического сайта для расщепления TEV-протеиназой (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln, ENLYFQ) и антиангиогенного пептида Тумастина. Полученный штамм Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS является продуцентом гибридного белка, состоящего из разделенных сайтом для расщепления TEV-протеиназой тиоредоксина и антиангиогенного пептида TMS. Выделение антиангиогенного пептида TMS, представляющего собой модифицированный фрагмент [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, включает выделение и протеолитическое расщепление гибридного белка и последующую хроматографическую очистку целевого продукта.
В предлагаемом техническом решении используют штамм Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS, являющийся продуцентом гибридного белка TrxTEVrs-TMS, состоящего из разделенных сайтом для расщепления TEV-протеиназой тиоредоксина и антиангиогенного пептида TMS, представляющего собой модифицированный фрагмент [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно.
Штамм Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS, продуцирующий гибридный полипептид TrxTEVrs-TMS, состоящий из разделенных сайтом для расщепления TEV-протеиназой тиоредоксина и антиангиогенного пептида TMS, получают путем трансформации клеток штамма Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pTEV-TMS. Данная плазмида содержит гибридный ген TrxTEVrs-TMS, состоящий из слитых в рамке последовательностей тиоредоксина, сайта для расщепления TEV-протеиназой и антиангиогенного пептида TMS.
Предлагаемый штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки.
Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки.
Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или среде Лурье-Бертрана) образуют интенсивную ровную муть.
Физико-биологические признаки.
Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам.
Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).
Штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS отличается от штамма-реципиента Е. coli BL21(DE3) наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pTEV-TMS, которая и придает ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.
Генетические особенности штамма.
Генотип штамма - F-ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]).
Осуществление изобретения
Плазмидный вектор pTEV-TMS получают следующим образом.
Штамм-продуцент получают путем трансформации компетентных клеток Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pTEV-TMS. Созданный штамм Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS является суперпродуцентом гибридного белка TrxTEVrs-TMS, который накапливается в клетках в растворимой форме.
Культивирование штамма-продуцента проводят в богатой культуральной среде (среда Лурье-Бертрана) при 37°С. Индукцию белкового биосинтеза вызывают путем добавления в культуральную среду индуктора изопропилтио-β-D-галактозида (ИПТГ). Выращивание проводят до достижения наибольшего содержания гибридного белка относительного суммарного белка клетки (4 часа при 37°С после внесения ИПТГ).
Выделение антиангионного пептида TMS осуществляют в несколько этапов.
После разрушения клеточной биомассы в буферном растворе при рН 7.6-8.0 в присутствии ингибитора протеаз осветленный клеточный лизат, содержащий гибридный белок TrxTEVrs-TMS, отделяют от клеточного дебриса центрифугированием, разбавляют тем же буфером и наносят при рН 8.0 на колонну с анионообменным сорбентом. Проводят элюцию гибридного белка при рН 8.0 в линейном градиенте от 0 до 500 мМ NaCl.
Протеолитическое расщепление рекомбинантной TEV-протеиназой проводят в течение 20 часов при комнатной температуре при рН 8.0 в присутствии дитиотреитола при соотношении фермент : белок от 1:50 до 1:100.
Полученный белковый раствор наносят при рН 9.0 на колонну с анионообменным сорбентом. Элюат, полученный во время нанесения, титруют до рН 11 и наносят на колонну с тем же анионообменным сорбентом. Во время элюции при рН 10, изократическим градиентом 150 мМ NaCl собирают фракцию, содержащую пептид TMS. Дальнейшую очистку целевого продукта проводят с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной и гель-фильтрационной хроматографий. Идентичность полученного пептида TMS подтверждают с помощью масс-спектрометрии.
Перечень последовательностей, представленных в описании изобретения.
На SEQ ID NO 1 приведена аминокислотная последовательность рекомбинантного антиангиогенного пептида TMS.
На SEQ ID NO 2 приведена нуклеотидная последовательность гена, содержащего кодирующую антиангиогенный пептид TMS последовательность.
На SEQ ID NO 3 приведена нуклеотидная последовательность гибридного гена TrxTEVrs-TMS и аминокислотная последовательность кодируемого им гибридного белка TrxTEVrs-TMS.
На SEQ ID NO 4 приведена аминокислотная последовательность гибридного белка TrxTEVrs-TMS.
Краткое описание фигур
Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы.
На Фиг. 1 показана физическая карта рекомбинантной плазмиды pTEV-TMS. Указаны уникальные сайты эндокуклеаз рестрикции. Ori - участок инициации репликации плазмидного вектора, М13 ori - участок инициации репликации фага М13, AmpR - ген устойчивости к ампициллину, lacI - ген репрессора лактозного оперона, Rop - ген РНК-организующего белка, TrxTEVrs-TMS - ген гибридного белка TrxTEVrs-TMS, состоящего из разделенных сайтом для расщепления TEV-протеиназой тиоредоксина и антиангиогенного пептида TMS.
На Фиг. 2 представлена электрофореграмма накопления гибридного белка TrxTEVrs-TMS в ходе выращивания клеточной культуры штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS. M - стандарт молекулярных масс; 1 - тотальный клеточный лизат после 2 часов выращивания после внесения ИПТГ; 2 - тотальный клеточный лизат после 3 часов выращивания после внесения ИПТГ; 3 - тотальный клеточный лизат после 4 часов выращивания после внесения ИПТГ; А - гибридный белок TrxTEVrs-TMS, содержащий антиангиогенный пептид TMS; Б - остаточный белок TrxTEVrs.
На Фиг. 3 представлена электрофореграмма выделения и протеолитического расщепления гибридного белка TrxTEVrs-TMS. М - стандарт молекулярных масс; 1 - тотальный клеточный лизат; 2 - осветленный клеточный супернатант; 3 - осадок клеточного дебриса; 4 - гибридный белок TrxTEVrs-TMS после анионообменной хроматографии; 5 - продукты расщепления гибридного белка TrxTEVrs-TMS с помощью TEV-протеиназы в соотношении 1:100 (фермент : белок) после инкубации в течение в течение 20 часов при комнатной температуре при рН 8.0.
На Фиг. 4 показан хроматографический профиль анализа продуктов протеолитического расщепления гибридного белка TrxTEVrs-TMS с помощью аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.
На Фиг. 5 показан результат масс-спектрометрического анализа рекомбинантного антиангиогенного пептида TMS.
Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1.
Получение штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS и определение его продуктивности
Штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS получают трансформацией компетентных клеток Е. coli BL21(DE3) с генотипом [F-ompT hsdSB (r-m-) gal dcm (DE3)] рекомбинантной плазмидой pTEV-TMS, содержащей гибридный ген TrxTEVrs-TMS, состоящий из слитых в рамке последовательностей тиоредоксина, сайта для расщепления TEV-протеиназой и антиангиогенного пептида TMS (SEQ ID NO 1, 2).
Клетки штамма Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS являются продуцентом гибридного белка TrxTEVrs-TMS (SEQ ID NO 3, 4), состоящего из разделенных сайтом для расщепления TEV-протеиназой тиоредоксина и антиангиогенного пептида TMS.
Трансформированные клетки высевают на агаризованную среду LB, содержащую ампициллин (100 мкг/мл), и выращивают в течении 14 часов при 37°С для получения отдельных колоний. После чего несколько колоний переносят в 100 мл среды LB, содержащую 2% глюкозу и ампициллином (100 мкг/мл), и выращивают 10 ч при 37°С на шейкере при перемешивании со скоростью 180 об/мин для получения культуры с ОД600=3.5. Полученной ночной культурой (процент засева составляет 2%) засевают требуемый объем среды LB, содержащей 0.2% глюкозу и ампициллин (100 мкг/мл), и выращивают при 37°С при перемешивании со скоростью 200 об/мин. При плотности клеточной культуры ОД600=0.8 вносят ИПТГ до концентрации 0.4 мМ и выращивают при 37°С в течение 4 часов. Каждый час после добавления ИПТГ отбирают аликвоты для последующего электрофоретического анализа.
На Фиг. 1 представлена физическая карта плазмиды pTEV-TMS. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Ori - участок инициации репликации плазмидного вектора, М13 ori - участок инициации репликации фага М13, AmpR - ген устойчивости к ампициллину, lacI - ген репрессора лактозного оперона, Rop - ген РНК-организующего белка, TrxTEVrs-TMS - ген гибридного белка TrxTEVrs-TMS, состоящий из тиоредоксина и антиангиогенного пептида TMS, разделенных сайтом для расщепления TEV-протеиназой.
На Фиг. 2 представлена электрофореграмма накопления гибридного белка TrxTEVrs-TMS в ходе выращивания клеточной культуры штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS. На электрофореграмме представлены: М - стандарт молекулярных масс, 1 - тотальный клеточный лизат после 2 часов выращивания после внесения ИПТГ, 2 - тотальный клеточный лизат после 3 часов выращивания после внесения ИПТГ, 3 - тотальный клеточный лизат после 4 часов выращивания после внесения ИПТГ; А - гибридный белок TrxTEVrs-TMS, содержащий антиангиогенный пептид TMS.
Пример 2.
Получение гибридного белка TrxTEVrs-TMS, его протеолитическое расщепление и выделение рекомбинантного антиангиогенного пептида TMS
По окончании культивирования, описанного в примере 1, клеточную биомассу штамма Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 10°С и 7500 об/мин. Разрушение клеточной биомассы проводят в буферном растворе при рН 7.6-8.0 в присутствии ингибитора протеаз с помощью УЗ-дезинтегратора при 10°С.
Клеточный дебрис отделяют центрифугированием в течение 40 мин при 10°С и 7500 об/мин.
Полученный клеточный супернатант разбавляют буферным раствором, использованным для разрушения клеточной биомассы, титруют до рН 8.0 и наносят на колонну с анионообменным сорбентом Q Sepharose XL (GE Healthcare). Элюцию гибридного белка TrxTEVrs-TMS проводят при 8.0 в линейном градиенте от 0 до 500 мМ NaCl. Полученный раствор титруют до рН 8.0, добавляют дитиотреитол до конечной концентрации 1 мМ и раствор рекомбинантной TEV-протеиназы в 50% глицерине с концентрацией 5 мг/мл в соотношении 1:100. Протеолитическое расщепление проводят при комнатной температуре в течение 20 часов. После окончания инкубации белковый раствор титруют до рН 9 и наносят на колонну с анионообменным сорбентом Q Sepharose XL. Элюат, собранный во время нанесения, титруют до рН 11 и наносят на колонну с анионообменным сорбентом Q Sepharose XL. Во время элюции изократическим градиентом 150 мМ NaCl при рН 10.0 собирают фракцию, содержащую пептид TMS. Последующую очистку TMS осуществляют с помощью ОФ ВЭЖХ на хроматографической колонне PerfectSil300 С18 (MZ-Analysentechnik GmbH) в линейном градиенте от 0 до 32% ацетонитрила (0.1% ТФУ). Окончательную очистку рекомбинантного TMS осуществляют с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонне, содержащей сорбент Bio-Gel Р-2 Gel (Bio-Rad) в буферном растворе 5 мМ уксусной кислоты. Полученный пептид TMS лиофильно высушивают.
Идентификацию образующегося рекомбинантного антиангиогенного пептида TMS проводят с помощью масс-спектрометрического анализа. Молекулярная масса продукта составляет 3870.68 Да, что соответствует теоретически рассчитанному значению 3870.70 Да.
На Фиг. 3 представлена электрофореграмма выделения и протеолитического расщепления гибридного белка TrxTEVrs-TMS. М - стандарт молекулярных масс; 1 - тотальный клеточный лизат; 2 - осветленный клеточный супернатант; 3 - осадок клеточного дебриса; 4 - гибридный белок TrxTEVrs-TMS после анионообменной хроматографии; 5 - продукты расщепления гибридного белка TrxTEVrs-TMS с помощью TEV-протеиназы в соотношении 1:100 (фермент : белок) после инкубации в течение в течение 20 часов при комнатной температуре при рН 8.0; А - гибридный белок TrxTEVrs-TMS, содержащий антиангиогенный пептид TMS; В - остаточный белок TrxTEVrs.
На Фиг. 4 показан хроматографический профиль анализа продуктов протеолитического расщепления гибридного белка TrxTEVrs-TMS с помощью аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии; 1 - антиангиогенный пептид TMS; 2 - остаточный белок TrxTEVrs.
На Фиг. 5 показан результат масс-спектрометрического анализа рекомбинантного антиангиогенного пептида TMS.
Пример 3.
Оценка антиангиогенной активности рекомбинантного пептида Тумастина in vitro
Для подтверждения антиангиогенной активности Тумастина проводят стандартный комплекс тестов, позволяющий оценить действие на ранних этапах ангиогенеза (пролиферация эндотелиальных клеток и образование капилляроподобных структур). Антиангиогенные свойства Тумастина изучают в диапазоне концентраций от 0.1 нМ до 20 нМ (Мирошников А.И., Лихванцева В.Г., Степанова Е.В., Арутюнян Е.В., Осипов Р.А., Бейрахова К.А., Степаненко В.Н., Белоус О.В. Офтальмохирургия. 2011. №1. Р. 76-82). В работе используют иммортализованную культуру эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 (O'Connel K., Edidin М. 1990. V. 144. №2. Р. 521-525).
С помощью стандартного МТТ-теста по выживаемости эндотелиальных клеток мыши SVEC4-10 оценивают цитотоксичность пептида TMS. К эндотелиальным клеткам (6×104 в мл) после 24-часовой инкубации в среде DMEM, содержащей 0.1% эмбриональной сыворотки и 2 мМ глутамина, добавляют рекомбинантный пептид TMS в концентрациях от 0.1 до 20 нМ и инкубируют 2 дня. После чего вносят МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид) в конечной концентрации 0.5 мг/мл и инкубируют 4 часа. По окончании инкубации среду сливают, клетки растворяют в ДМСО. Оптическую плотность оценивают с помощью планшетного спектрофотометра при длине волны 540 нм. Выживаемость эндотелиальных клеток при инкубации с исследуемым пептидом TMS высокая: выживаемость клеток составляет 90±1% при максимальной концентрации пептида (20 нМ) и достигает 101±4% при минимальной концентрации (0.1 нМ).
С помощью модифицированного митогенного теста исследуют ингибирование bFGF-стимулированной пролиферации иммортализованной культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10. К эндотелиальным клеткам (15×103 в мл) после 24-часовой инкубации в среде DMEM, содержащей 0.1% эмбриональной сыворотки, 2 мМ глутамина и 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), добавляют рекомбинантный пептид TMS в концентрациях от 0.1 до 20 нМ и инкубируют в течение 6 дней (среду и исследуемый пептид меняют каждые 3 дня), после чего клетки окрашивают красителем Crystal Violet. Оптическую плотность оценивают с помощью планшетного спектрофотометра при длине волны 540 нм. Максимальное ингибирование (ИК50) пролиферации клеток наблюдают при концентрации пептида 10 нМ (50% от контроля). При более высоких концентрациях пептида антипролиферативный эффект менее выражен.
Для определения ингибирующего действия пептида TMS на образование трубочко-подобных структур эндотелиальные клетки (4×105 в мл) инкубируют вместе с исследуемым пептидом TMS в нецитотоксичных концентрациях 10 и 20 нМ в среде DMEM, содержащей 0.1% эмбриональной сыворотки, 2 мМ глутамина в течение 20 минут при 37°С. Аликвоту клеток (500 мкл) вносят в лунки, покрытые матригелем и инкубируют в СО2-инкубаторе в течение 4-5 часов. Оценивают длину трубочек и количество контактов между трубочками. Пептид TMS в концентрациях 10 и 20 нМ вызывает 50 и 80% ингибирование образования трубочко-подобных структур соответственно.

Claims (2)

1. Штамм Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS, продуцирующий в растворимой форме гибридный полипептид TrxTEVrs-TMS (SEQ ID NO: 3, 4), содержащий разделенные сайтом для расщепления протеиназой вируса гравировки табака (TEV-протеиназой) тиоредоксин и антиангиогенный пептид Тумастин (SEQ ID NO: 1, 2), представляющий собой модифицированный фрагмент [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, и полученный путем трансформации клеток штамма Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pTEV-TMS длиной 6440 п. о. с физической картой, приведенной на фиг. 1, содержащей последовательность гибридного гена TrxTEVrs-TMS с SEQ ID NO: 3, состоящего из слитых в рамке 5'-концевой последовательности, кодирующей N-концевой белок-носитель из тиоредоксина и сайт для расщепления TEV-протеиназой, и 3'-концевой последовательности с оптимизированными для экспрессии в Е. coli кодонами, кодирующей С-концевой отщепляемый антиангиогенный пептид TMS.
2. Способ получения рекомбинантного антиангиогенного пептида Тумастина - производного модифицированного фрагмента [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N- и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, включающий культивирование штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS по п. 1, разрушение клеточной биомассы в присутствии ингибитора протеаз, центрифугирование клеточного лизата и отделение клеточного супернатанта, содержащего гибридный белок, хроматографическую очистку гибридного белка на колонне с анионообменным сорбентом, протеолитическое расщепление с помощью TEV-протеиназы, хроматографическую очистку антиангиогенного пептида Тумастина.
RU2015147716A 2015-11-06 2015-11-06 ШТАММ Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TrxTEVrs-TMS, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ С ОБРАЗОВАНИЕМ АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА ТУМАСТИНА, ПРОИЗВОДНОГО ФРАГМЕНТА [L69K-95] ТУМСТАТИНА ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА RU2625008C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015147716A RU2625008C2 (ru) 2015-11-06 2015-11-06 ШТАММ Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TrxTEVrs-TMS, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ С ОБРАЗОВАНИЕМ АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА ТУМАСТИНА, ПРОИЗВОДНОГО ФРАГМЕНТА [L69K-95] ТУМСТАТИНА ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015147716A RU2625008C2 (ru) 2015-11-06 2015-11-06 ШТАММ Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TrxTEVrs-TMS, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ С ОБРАЗОВАНИЕМ АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА ТУМАСТИНА, ПРОИЗВОДНОГО ФРАГМЕНТА [L69K-95] ТУМСТАТИНА ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015147716A RU2015147716A (ru) 2016-01-20
RU2625008C2 true RU2625008C2 (ru) 2017-07-11

Family

ID=55086950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015147716A RU2625008C2 (ru) 2015-11-06 2015-11-06 ШТАММ Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TrxTEVrs-TMS, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ С ОБРАЗОВАНИЕМ АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА ТУМАСТИНА, ПРОИЗВОДНОГО ФРАГМЕНТА [L69K-95] ТУМСТАТИНА ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2625008C2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2700452C1 (ru) * 2019-01-09 2019-09-17 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0722494B1 (en) * 1993-10-06 2006-04-26 New York University Method for producing transgenic plants that exhibit enhanced nitrogen assimilation
CN101519658A (zh) * 2008-02-26 2009-09-02 中国医学科学院放射医学研究所 肿瘤抑素t7肽及其衍生物t7-ngr的载体构建及表达

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0722494B1 (en) * 1993-10-06 2006-04-26 New York University Method for producing transgenic plants that exhibit enhanced nitrogen assimilation
CN101519658A (zh) * 2008-02-26 2009-09-02 中国医学科学院放射医学研究所 肿瘤抑素t7肽及其衍生物t7-ngr的载体构建及表达

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WALKER J.R. et al., Using protein-based motifs to stabilize peptides, J. Pept. Res., 2003, v.62, n.5, p.214-226. *
БЕЙРАХОВА К.А. Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом, Авто диссертации, Москва, 2012, 24 с. WALKER J.R. et al., Using protein-based motifs to stabilize peptides, J. Pept. Res., 2003, v.62, n.5, p.214-226. *
БЕЙРАХОВА К.А. Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом, Автореферат диссертации, Москва, 2012, 24 с. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2700452C1 (ru) * 2019-01-09 2019-09-17 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015147716A (ru) 2016-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7300060B2 (ja) ヒトコラーゲンｘｖｉｉ型ポリペプチド、その製造方法および使用
JP2024517995A (ja) 組換えｉ型ヒト化コラーゲンポリペプチド及びその製造方法並びに使用
AU767172B2 (en) Protein for blocking platelet adhesion
WO2016004906A2 (zh) 一种肿瘤血管阻断剂多肽、基因、表达载体及其应用
US11965003B2 (en) Recombinant lectin variants
JP2009517080A (ja) 非活性Ｗｎｔ抑制ポリペプチド及びその製造方法
EP1390403B1 (en) Peptides derived from neural thread proteins and their medical use
DK2995626T3 (en) BIFUNCTIONAL FUSION PROTEINS TO INHIBIT ANGIOGENESIS IN TUMOR ENVIRONMENTS AND ACTIVATE ADAPTIVE IMMUNE RESPONSE, AND THE GENES AND APPLICATIONS THEREOF
CA1340841C (en) Cecropin-like polypeptides with activity against gram-positive and gram-negative bacteria
US20160168554A1 (en) Bacterial hyaluronidase and process for its production
JP2002515403A (ja) インドリシジン類似体およびその使用方法
RU2625008C2 (ru) ШТАММ Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TrxTEVrs-TMS, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ С ОБРАЗОВАНИЕМ АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА ТУМАСТИНА, ПРОИЗВОДНОГО ФРАГМЕНТА [L69K-95] ТУМСТАТИНА ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИАНГИОГЕННОГО ПЕПТИДА
Tomisawa et al. Efficient production of a correctly folded mouse α-defensin, cryptdin-4, by refolding during inclusion body solubilization
JP2018526987A (ja) 腫瘍抑制ペプチド
Roberto et al. Cloning and expression of an acidic platelet aggregation inhibitor phospholipase A2 cDNA from Bothrops jararacussu venom gland
CA2237543A1 (en) New form of amphiregulin, methods for producing and using the same and compositions comprising the same
RU2664199C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная ДНК pERIG-PGS, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием антиангиогенного пептида пигастина - производного фрагмента [44-77] фактора роста пигментного эпителия человека, штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pERIG-PGS - продуцент указанного белка, и способ получения рекомбинантного антиангиогенного пептида
AU2016327453A1 (en) Generation of peptides
EP0473080B1 (en) Chondromodulin-I protein
KR102501639B1 (ko) 신규한 세포 내 단백질 전달 방법
Luo et al. Expression of soluble, biologically active recombinant human tumstatin in Escherichia coli
CN116785402B (zh) 预防和/或治疗乳腺癌的多肽及其应用
KR101990437B1 (ko) 항암 활성을 갖는 뱀허물쌍살벌 유래 펩타이드 및 이의 용도
Bakhshi et al. Purification and biological activity assessment: Comparison between two recombinant human epidermal growth factors with different molecular weights
JPH05213771A (ja) ヘパリン結合性神経突起の成長プロモーター因子