KR101839496B1 - 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질 - Google Patents

디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질 Download PDF

Info

Publication number
KR101839496B1
KR101839496B1 KR1020147000012A KR20147000012A KR101839496B1 KR 101839496 B1 KR101839496 B1 KR 101839496B1 KR 1020147000012 A KR1020147000012 A KR 1020147000012A KR 20147000012 A KR20147000012 A KR 20147000012A KR 101839496 B1 KR101839496 B1 KR 101839496B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
gly
ala
val
leu
Prior art date
Application number
KR1020147000012A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140068843A (ko
Inventor
샤오웨이 리
쿠이링 송
춘얀 양
잉 구
웬신 루오
닝샤오 시아
Original Assignee
시아먼 유니버시티
시아맨 이노박스 바이오테크 코. 엘티디.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 시아먼 유니버시티, 시아맨 이노박스 바이오테크 코. 엘티디. filed Critical 시아먼 유니버시티
Publication of KR20140068843A publication Critical patent/KR20140068843A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101839496B1 publication Critical patent/KR101839496B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55544—Bacterial toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16311—Influenzavirus C, i.e. influenza C virus
    • C12N2760/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16311—Influenzavirus C, i.e. influenza C virus
    • C12N2760/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/28011—Hepeviridae
    • C12N2770/28111—Hepevirus, e.g. hepatitis E virus
    • C12N2770/28122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/28011—Hepeviridae
    • C12N2770/28111—Hepevirus, e.g. hepatitis E virus
    • C12N2770/28134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 융합 단백질 중 항원보강제로서 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 CRM197 또는 그의 단편, 및 융합된 표적 단백질, 예를 들어 HEV 캡시드 단백질, 또는 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편의 면역원성을 증대시키기 위한 그의 용도를 제공한다. 또한 표적 단백질과 상기 CRM197 또는 그의 단편을 융합 발현시켜 융합 단백질을 형성시킴을 포함하는, 상기 표적 단백질의 면역원성을 증대시키기 위한 방법을 제공한다. 또한 상기 CMR197 또는 그의 단편 및 표적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 CRM197 또는 그의 단편은 상기 표적 단백질의 면역원성을 증대시킨다. 본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 구조물 및 벡터, 및 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

Description

디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질{FUSION PROTEIN COMPRISING DIPHTHERIA TOXIN NON-TOXIC MUTANT CRM197 OR FRAGMENT THEREOF}
본 발명은 분자 바이러스학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 융합된 표적 단백질(예를 들어 HEV 캡시드 단백질, 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편)의 면역원성을 증대시키기 위한, 융합 단백질 중 분자내 항원보강제로서 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 CRM197 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 표적 단백질(예를 들어 HEV 캡시드 단백질, 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편)의 면역원성을 증대시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 표적 단백질과 CRM197 또는 그의 단편을 융합 발현시켜 융합 단백질을 형성시킴을 포함한다. 본 발명은 또한 CMR197 또는 그의 단편 및 표적 단백질(예를 들어 HEV 캡시드 단백질, 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편)을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이며, 여기에서 상기 CRM197 또는 그의 단편은 상기 표적 단백질의 면역원성을 증대시킨다. 본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 구조물 및 벡터, 및 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약학 조성물 또는 백신의 제조에 있어서 상기 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.
디프테리아 독소(DT)는 예의 연구되었다. 구조에 대한 연구는 디프테리아 독소가 3 개의 도메인, 즉 N-말단 촉매 도메인 C(aa 1-190, C 도메인)(또한 단편 A라 칭함), 중간 막관통 도메인 T(aa 201-384, T 도메인), 및 C-말단 수용체 결합 도메인 R(aa 386-535, R 도메인)로 이루어짐을 보인다(문헌[Choe S, Bennett M, Fujii G, et al., Nature. 1992. 357:216-222]). 디프테리아 독소의 앞의 2 개 도메인과 인터류킨 2(IL-2)와의 융합에 의해 제조된 ONTAK(DAB389-IL-2)은 성인 피부 T-세포 림프종의 치료에 대해서 1999년에 FDA에 의해 판매가 승인되었다. 이는 상기 디프테리아 독소의 3 개 도메인이 각각 별도로 사용될 수 있고 그들 각자의 역할을 수행할 수 있음을 입증한다.
CRM197(교차-반응 물질 197)은 디프테리아 독소 무독성 돌연변이체(문헌[Uchida, T., A.M, Pappenheimer, Jr., R. Gregory, et al., J. Biol. Chem. 1973. 248:3838-3844])로, 단일의 뉴클레오타이드 돌연변이에 의해 52번 위치의 아미노산 잔기가 Gly가 Glu로 변화됨으로써(문헌[G. Giannini, R.Rappuoli, G. Ratti et al., Nucleic Acids Research. 1984. 12: 4063-4070]) 야생형 유전자 암호화 DT와 상이하다.
연구들은 CRM197이 야생형 DT(즉 상기 3 개의 도메인을 갖는)의 구조와 유사한 구조를 갖지만, 그의 단편 A는 NAD에 대한 결합 능력을 상실하고, EF2에 결합할 수 없으며, 이에 의해 천연 DT가 갖는 세포독성을 상실함을 보이며, 이는 52번 위치의 아미노산 잔기 Gly가 NAD에 대한 DT의 결합에 중요한 역할을 함을 가리킨다(문헌[K.Moyner, G.Christiansen, Acta path microbial immunolscand sect C. 1984, 92:17-23]). 비록 CRM197이 상기 세포독성을 상실하지만, 상기 CRM197은 야생형 DT의 경우에 필적하는 강한 면역원성을 유지한다. 따라서, CMR197은 접합 백신의 제조를 위해서 다른 합텐들을 가교결합시키기 위한 단백질 담체로서 일반적으로 사용된다.
1985년대 초에, 포터(Porter) 등은 Hib 표면상의 폴리사카라이드를 각각 CRM197 및 DT 단백질 담체에 가교결합시켜 백신으로 제조하였으며, 면역원성에 있어서 이들의 차이를 연구하였다. 상기 실험 결과는 상기 두 가교결합된 백신들 간에 면역 효과에 있어서 현저한 차이가 없고, 이들은 모두 유아에서 강한 면역 반응과 면역 기억의 발생을 자극함을 입증하였다(문헌[Porter Anderson, Micheal E. Pichichero and Richard A. J. Clin. Invest. 1985: 52-59]). 다양한 단백질들에 가교결합된 폐렴구균 접합 백신들을 비교한 후에, CRM197이 단백질 담체로서 사용되는 백신이 동물 실험 및 임상 시험에서 양호한 면역 효과를 가지며, CRM197이 독성 부작용 없이 안전함을 발견하였다(문헌[Black, S., H. Shinefield, et al. Pediatr Infect Dis J, 2000, 19(3); 187-195]). 현재, CRM197이 단백질 담체로서 사용된 폐렴구균 접합 백신들을 주로 PCV7, PCV9, PCV13 등으로 지칭한다. 임상 시험들의 결과는 이들 백신이 2세 미만의 아동에서 양호한 면역원성과 안전성을 가짐을 보였다(문헌[Barricarte, A., J. Castilla, et al. Clin Infect Dis, 2007, 44(11): 1436-1441]; 문헌[Madhi, S., P. Adrian, et al. Vaccine, 2007, 25(13): 2451-2457]; 문헌[Duggan, S. T. Drugs, 2010, 70(15): 1973-1986]). 유행성 수막염 접합 백신은 CRM197을 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 표면 상의 폴리사카라이드에 가교결합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, CRM197이 단백질 담체로서 사용되는 메닌지텍(Meningitec)(와이에쓰 파마슈티칼스(Wyeth Pharmaceuticals)), 멘쥬게이트(Menjugate)(노바티스 백신즈(Novartis vaccines)), 및 멘베오(Menveo)(노바티스 백신즈)와 같은 백신들을 상업적으로 입수할 수 있다.
CRM197은 비록 효소 활성 및 세포독성을 상실하지만, DT의 특이적인 수용체, 즉 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자(HB-EGF)에 여전히 결합할 수 있다. 상기 수용체의 발현은 DT와 같은 암성 조직에서 일반적으로 상향 조절되기 때문에, CRM197은 또한 항-종양 효과를 갖는다(문헌[Buzzi, S., D. Rubboli, et al. Immunotherapy, 2004, 53(11)]). 상기 연구들은 또한 CRM197이 혈액-뇌-장벽(BBB)을 통과할 수 있고 따라서 약물의 뇌로의 전달에 담체로서 사용될 수 있음을 발견하였다(문헌[Gaillard, P. J., and A. G. de Boer. J Control Release, 2006, 116(2): 60-62]).
CRM197이 다수의 작용들을 갖는 것으로, 특히 강한 면역원성을 가지며 면역보강제로서 사용될 수 있는 것으로 보고되었지만, CRM197을 융합 단백질에서 상기에 융합된 표적 단백질의 면역원성을 증대시키기 위한 분자내 항원보강제로서 사용할 수 있음은 아직 보고되어 있지 않다.
본 발명은 분자 바이러스학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 융합된 표적 단백질(예를 들어 HEV 캡시드 단백질, 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편)의 면역원성을 증대시키기 위한, 융합 단백질 중 분자내 항원보강제로서 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 CRM197 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 일례로서 E형 간염 캡시드 단백질을 사용하여, CRM197 또는 그의 단편이 융합 단백질에서 상기에 융합된 단백질의 면역원성을 증대시킬 수 있고, 이에 의해 분자내 항원보강제로서 사용될 수 있음을 최초로 입증한다.
본 발명은 CRM197 및 그의 단편을 표적 단백질의 면역원성을 증대시키기 위한 분자내 항원보강제로서 사용할 수 있음을 최초로 입증한다. 따라서, 본 발명은 CRM197 및 그의 단편의 신규의 용도를 제공하고, 표적 단백질의 면역원성을 증대시키는 신규의 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 표적 단백질 단독에 비해 더 강한 면역원성을 나타내므로, 본 발명은 약제 또는 백신의 제조에 새로운 선택권을 제공하며 상응하는 질병의 보다 유효한 치료 및 예방을 성취할 수 있다.
도 1은 실시예 2에서 제조된 융합 단백질의 클론 디자인을 도시하며, 여기에서 사용된 링커(링커, 또한 본 출원에서 간단히 L이라 지칭됨)는 15 개 아미노산 잔기로 이루어진 가요성 단편이며, 그의 서열은 GGGGSGGGGSGGGG이고; 사용된 CRM197은 535 개 아미노산을 포함하며, 그의 서열은 서열번호 2에 나타내고; 389는 CRM197의 1 내지 389 번 위치의 아미노산 잔기(aa 1-389)를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하며; A는 CRM197의 1 내지 190 번 위치의 아미노산 잔기(aa 1-190)를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하고; E2는 HEV 캡시드 단백질의 394 내지 606 번 위치의 아미노산 잔기(aa 394-606)를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하고; E2s는 HEV 캡시드 단백질의 455 내지 606 번 위치의 아미노산 잔기(aa 455-606)를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
도 2는 실시예 2에서 제조된 융합 단백질의 발현, 정제 및 재생의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시하며, 여기에서 도 2A에 사용된 샘플은 초음파 처리 후 파괴된 세균을 원심분리함으로써 수득한 침전물(즉 봉입체)이고, 도 2B에 사용된 샘플은 4M 유레아 용해된 상등액이며, 도 2C에 사용된 샘플은 8M 유레아 용해된 상등액이며, 도 2D에 사용된 샘플은 PBS 내로 재생된 단백질이다. 레인 M: 단백질 분자 중량 마커; 레인 1: CRM197-L-E2; 레인 2: CRM197-L-E2s; 레인 3: 389-L-E2; 레인 4: 389-L-E2s; 레인 5: 389-E2s; 레인 6: A-L-E2; 레인 7: A-L-E2s; 레인 8: A-E2s. 상기 결과는 제조된 융합 단백질들이 모두 봉입체에서 발현될 수 있으며, A-L-E2 및 A-L-E2s는 4M 및 8M 유레아에 용해된 반면, 다른 융합 단백질들은 오직 8M 유레아에만 용해됨을 보였다. 또한, 상기 결과들은 또한 투석 및 재생 후, 약 80%의 순도의 융합 단백질이 수득됨을 보였다.
도 3은 크로마토그래피에 의해 정제된 융합 단백질 A-L-E2의 SDS-PAGE 결과를 도시하며, 여기에서 레인 1은 크로마토그래피에 의해 정제 후 PBS로 재생된 A-L-E2를 지칭하고, 레인 2는 10 분간 비등수에서 비등된 레인 1의 A-L-E2 샘플을 지칭한다. 상기 결과는 2-단계 크로마토그래피 후, A-L-E2가 90% 이상의 순도에 도달할 수 있음을 보였다.
도 4는 실시예 2에서 제조된 융합 단백질 및 HEV 중화 단클론 항체 8C11을 사용한 웨스턴 블럿팅의 결과를 도시한다. 레인 M: 단백질 분자량 마커; 레인 1: 대조용 단백질 HEV-239; 레인 2: 대조용 단백질 E2; 레인 3: CRM197-L-E2; 레인 4: CRM197-L-E2s; 레인 5: 389-L-E2; 레인 6: 389-L-E2s; 레인 7: 389-E2s; 레인 8: A-L-E2; 레인 9: A-L-E2s; 레인 10: A-E2s. 상기 결과는 상기 시험된 융합 단백질들이 모두 HEV-특이성 중화 단클론 항체 8C11과 현저한 반응성을 가짐을 보였다.
도 5는 실시예 2에서 제조된 융합 단백질 및 HEV-특이성 단클론 항체를 사용한 간접적인 ELISA의 결과를 도시한다. 가로좌표는 ELISA의 HEV-특이성 단클론 항체 또는 CRM197 다클론 항혈청을 지칭하고, 세로좌표는 동일한 항체 희석에서 ELISA에 의해 측정된 OD 값을 지칭한다. 도 5A는 E2를 포함하는 융합 단백질의 ELISA 결과를 도시하고, 도 5B는 E2s를 포함하는 융합 단백질의 ELISA 결과를 도시한다. 상기 결과는 E2s 단백질과 CRM197 또는 그의 단편과의 융합 후에, E2s 단백질과 HEV-특이성 단클론 항체와의 반응성이 현저하게 증대되었음을 보였으며, 여기에서 A-L-E2s 및 A-E2S의 반응성이 가장 현저하게 증대되었고; E2 단백질과 HEV-특이성 단클론 항체와의 반응성은, E2 단백질과 CRM197 또는 그의 단편과의 융합 후, 유지되었거나 증대되었다.
도 6은 단백질 A-L-E2, HEV-239 또는 E2 및 HEV-특이성 단클론 항체를 사용한 간접적인 ELISA의 결과를 도시하며, 여기에서 컷오프 값은 평균 음의 값의 3 배로서 정의된다. 상기 결과는 A-L-E2와 HEV-특이성 단클론 항체와의 반응성이 HEV-239 및 E2의 경우에 필적할만함을 보였다.
도 7은 융합 단백질 A-L-E2의 침강 속도(SV)의 분석 결과를 도시한다. 상기 결과는 상기 융합 단백질 A-L-E2가 주로 이량체의 형태로 존재하고, 사량체는 소량으로 존재함을 보였다.
도 8은 실시예 2에서 제조된 융합 단백질과 HEV-239 간의 면역원성의 비교를 도시한다. 1차 면역을 0 주째에 수행하였으며, 추가 면역을 2 주 및 4 주째에 수행하였고, 여기에서 상기 1차 면역과 추가 면역 모두에 대한 용량은 5 ㎍ 또는 0.5 ㎍이었다. 도 8A는 5 ㎍-용량 그룹에서 면역 혈청의 항체 역가의 비교 결과를 도시하고, 도 8B는 0.5 ㎍-용량 그룹에서 면역 혈청의 항체 역가의 비교 결과를 도시한다. 상기 결과들은 HEV에 대한 혈청전환이 5 ㎍- 및 0.5 ㎍-용량 그룹들에서 4 주째에 마우스 혈청 중에서 발생하였고, 상기 항체 역가는 5 또는 6 주째에 최고값에 도달함을 보였다. 특히, 5 ㎍-용량 그룹에서, A-L-E2가 사용될 때 최고의 항체 역가가 획득되었으며, 이는 6 주째에 106에 도달하였고; 상기 융합 단백질들에 의해 유도된 항체 역가는 HEV-239 단백질의 경우보다 더 높거나 이에 필적하였다. 0.5 ㎍-용량 그룹에서, 상기 융합 단백질의 항체 역가는 HEV-239의 경우보다 현저하게 더 높았으며, 5 주째에 A-L-E2 단백질에 의해 유도된 항체 역가는 106에 도달하였다. 또한, 5 ㎍- 및 0.5 ㎍-용량 그룹들에서 E2 및 E2s를 사용하는 경우 면역 혈청에서 혈청전환은 일어나지 않았다. 상기 결과로부터 보이는 바와 같이, 실시예 2에서 제조된 융합 단백질의 면역원성은 항원 단백질(E2 및 E2s) 단독보다 현저하게 더 높았으며, 이는 본 발명의 CRM197 또는 그의 단편이 상기와 함께 융합된 항원 단백질의 면역원성을 현저하게 증대시켰고, 상기를 분자내 항원보강제로서 사용할 수 있음을 가리킨다.
도 9는 실시예 6에서 제조된 융합 단백질의 클론 디자인을 도시하며, 여기에서 사용된 링커(링커, 또한 본 출원에서 간단히 L이라 지칭됨)는 10 개 아미노산 잔기로 이루어진 가요성 단편이며, 그의 서열은 GGGGSGGGGS이고; 사용된 CRM197은 535 개 아미노산을 포함하며, 그의 서열은 서열번호 2에 나타내고; 389는 CRM197의 1 내지 389 번 위치의 아미노산 잔기(aa 1-389)를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하며; A는 CRM197의 1 내지 190 번 위치의 아미노산 잔기(aa 1-190)를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하고; M2는 인플루엔자 바이러스 M2 단백질을 지칭하고, 그의 서열은 서열번호 32에 나타내고; M2e는 인플루엔자 바이러스 M2 단백질의 1 내지 24 번 위치의 아미노산 잔기(aa 1-24)를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
도 10은 실시예 6에서 제조된 융합 단백질의 발현, 정제 및 재생의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시하며, 여기에서 레인 M은 단백질 분자량 마커이다.
도 10A는 초음파 처리 후 파괴된 세균을 원심분리시킴으로써 수득한 침전물(즉 봉입체) 및 상등액인 샘플들을 사용하였다:
레인 1: CRM197-L-M2e에 의해 형질전환된 세균으로부터 수득된 봉입체;
레인 2: CRM197-L-M2e에 의해 형질전환된 세균으로부터 수득된 상등액;
레인 3: 389-L-M2e에 의해 형질전환된 세균으로부터 수득된 봉입체;
레인 4: 389-L-M2e에 의해 형질전환된 세균으로부터 수득된 상등액;
레인 5: A-L-M2e에 의해 형질전환된 세균으로부터 수득된 봉입체;
레인 6: A-L-M2e에 의해 형질전환된 세균으로부터 수득된 상등액.
도 10B는 초음파 처리 후 파괴된 세균을 원심분리시킴으로써 수득한 침전물(즉 봉입체) 및 상등액인 샘플들을 사용하였다:
레인 1: M2e-L-A에 의해 형질전환된 세균으로부터 수득된 봉입체;
레인 2: M2e-L-A에 의해 형질전환된 세균으로부터 수득된 상등액;
레인 3: M2e-L-389에 의해 형질전환된 세균으로부터 수득된 봉입체;
레인 4: M2e-L-389에 의해 형질전환된 세균으로부터 수득된 상등액;
레인 5: M2e-L-CRM197에 의해 형질전환된 세균으로부터 수득된 봉입체;
레인 6: M2e-L-CRM197에 의해 형질전환된 세균으로부터 수득된 상등액.
도 10C는 단리되고 PBS로 재생된 융합 단백질인 샘플들을 사용하였으며, 여기에서 β-머캅토에탄올을 SDS-PAGE 분석 동안 사용하지 않았고, 상기 단백질 샘플들을 비등(10 분간)에 의해 처리하거나 처리하지 않았다:
레인 1: A-L-M2e 단백질, 비등에 의해 처리되지 않음;
레인 2: A-L-M2e 단백질, 비등에 의해 처리됨;
레인 3: 389-L-M2e 단백질, 비등에 의해 처리되지 않음;
레인 4: 389-L-M2e 단백질, 비등에 의해 처리됨;
레인 5: CRM197-L-M2e 단백질, 비등에 의해 처리되지 않음;
레인 6: CRM197-L-M2e 단백질, 비등에 의해 처리됨.
도 10D는 단리되고 PBS로 재생된 융합 단백질인 샘플들을 사용하였으며, 여기에서 β-머캅토에탄올을 SDS-PAGE 분석 동안 사용하였고, 상기 단백질 샘플들을 비등(10 분간)에 의해 처리하거나 처리하지 않았다:
레인 1: A-L-M2e 단백질, 비등에 의해 처리되지 않음;
레인 2: A-L-M2e 단백질, 비등에 의해 처리됨;
레인 3: 389-L-M2e 단백질, 비등에 의해 처리되지 않음;
레인 4: 389-L-M2e 단백질, 비등에 의해 처리됨;
레인 5: CRM197-L-M2e 단백질, 비등에 의해 처리되지 않음;
레인 6: CRM197-L-M2e 단백질, 비등에 의해 처리됨.
도 10E는 단리되고 PBS로 재생된 융합 단백질인 샘플들을 사용하였으며, 여기에서 β-머캅토에탄올을 SDS-PAGE 분석 동안 사용하지 않았고, 상기 단백질 샘플들을 비등(10 분간)에 의해 처리하거나 처리하지 않았다:
레인 1: M2e-L-A 단백질, 비등에 의해 처리되지 않음;
레인 2: M2e-L-A 단백질, 비등에 의해 처리됨;
레인 3: M2e-L-389 단백질, 비등에 의해 처리되지 않음;
레인 4: M2e-L-389 단백질, 비등에 의해 처리됨;
레인 5: M2e-L-CRM197 단백질, 비등에 의해 처리되지 않음;
레인 6: M2e-L-CRM197 단백질, 비등에 의해 처리됨.
도 10F는 단리되고 PBS로 재생된 융합 단백질인 샘플들을 사용하였으며, 여기에서 β-머캅토에탄올을 SDS-PAGE 분석 동안 사용하였고, 상기 단백질 샘플들을 비등(10 분간)에 의해 처리하거나 처리하지 않았다:
레인 1: M2e-L-A 단백질, 비등에 의해 처리되지 않음;
레인 2: M2e-L-A 단백질, 비등에 의해 처리됨;
레인 3: M2e-L-389 단백질, 비등에 의해 처리되지 않음;
레인 4: M2e-L-389 단백질, 비등에 의해 처리됨;
레인 5: M2e-L-CRM197 단백질, 비등에 의해 처리되지 않음;
레인 6: M2e-L-CRM197 단백질, 비등에 의해 처리됨.
도 10A 내지 10F에 도시된 결과들은 상기 제조된 융합 단백질들이 모두 봉입체에서 발현될 수 있으며, 정제 및 재생 후, 약 80%의 순도를 갖는 융합 단백질들이 수득될 수 있음을 가리켰다.
도 11은 실시예 6에서 제조된 융합 단백질 및 항-M2e 단클론 항체 5D1 및 CRM197 단클론 항체 1E6을 사용하는 웨스턴 블럿팅의 결과를 도시한다. 도 11A, 11B, 11C 및 11D에서 레인 1 내지 6에 의해 나타낸 샘플들은 각각 도 10C, 10D, 10E 및 10F에서 레인 1 내지 6에 의해 나타낸 샘플들에 상응하며, 여기에서 항-M2e 특이성 단클론 항체 5D1이 사용되었다. 도 11E, 11F, 11G 및 11H에서 레인 1 내지 6에 의해 나타낸 샘플들은 각각 도 10C, 10D, 10E 및 10F에서 레인 1 내지 6에 의해 나타낸 샘플들에 상응하며, 여기에서 CRM197 특이성 단클론 항체 1E6이 사용되었다. 상기 결과는 상기 시험된 융합 단백질들이 모두 항-M2e 특이성 단클론 항체 5D1 및 CRM197 특이성 단클론 항체 1E6과 현저한 반응성을 가짐을 보였다.
도 12는 실시예 6에서 제조된 융합 단백질 및 다양한 항-M2e 특이성 단클론 항체를 사용하는 간접적인 ELISA의 결과를 도시한다. 가로좌표는 ELISA를 위한 항-M2e 특이성 단클론 항체 및 항-CRM197 특이성 단클론 항체를 지칭하고, 세로좌표는 동일한 항체 희석에서 ELISA에 의해 측정된 OD 값을 지칭한다. 도 12A는 M2e가 CRM197 또는 그의 단편의 C-말단에 융합된 융합 단백질의 ELISA 결과를 도시하고, 도 12B는 M2e가 CRM197 또는 그의 단편의 N-말단에 융합된 융합 단백질의 ELISA 결과를 도시한다. 상기 결과는 M2e 단백질 및 CRM197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질이 M2e 단백질 단독에 비해, 다양한 항-M2e 특이성 단클론 항체와의 반응성을 유지하거나 증대시킴을 보였다.
도 13은 실시예 6에서 제조된 융합 단백질의 침강 속도(SV)의 분석 결과를 도시하며, 여기에서 도 13A: CRM197-L-M2e; 도 13B: 389-L-M2e; 도 13C: A-L-M2e; 도 13D: M2e-L-CRM197; 도 13E: M2e-L-389; 도 13F: M2e-L-A이다. 상기 결과는 융합 단백질 A-L-M2e 및 M2e-L-A가 주로 단량체 및 사량체의 형태로 존재하였고; 389-L-M2e가 주로 이량체 및 중합체의 형태로 존재하였으며; M2e-L-389가 주로 단량체 및 중합체의 형태로 존재하였고; CRM197-L-M2e가 주로 이량체 및 중합체의 형태로 존재하였으며; M2e-L-CRM197이 주로 단량체 및 중합체의 형태로 존재하였음을 보였다.
도 14는 실시예 6 및 GST-M2e에서 제조된 융합 단백질들 간의 면역원성의 비교를 도시한다. 1차 면역을 0 주째에 수행하였으며, 추가 면역을 2 주 및 4 주째에 수행하였고, 여기에서 상기 1차 면역과 추가 면역 모두에 대한 용량은 5 ㎍ 또는 0.5 ㎍이었다. 도 14A는 5 ㎍-용량 그룹에서 면역 혈청의 항체 역가의 비교 결과를 도시하고, 도 14B는 0.5 ㎍-용량 그룹에서 면역 혈청의 항체 역가의 비교 결과를 도시한다. 상기 결과들은 상기 2차 추가 면역 후에, 상기 융합 단백질들에 의해 유도된 항체 역가가 5 ㎍- 및 0.5 ㎍-용량 그룹들에서 GST-M2e 단독보다 현저하게 더 높음을 보였다. 상기 결과로부터 보이는 바와 같이, 실시예 6에서 제조된 융합 단백질의 면역원성은 항원 단백질(GST-M2e) 단독보다 현저하게 더 높았으며, 이는 본 발명의 CRM197 또는 그의 단편(상기 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 배치되었는지에 상관 없이)이 상기와 함께 융합된 항원 단백질의 면역원성을 현저하게 증대시켰고, 상기를 분자내 항원보강제로서 사용할 수 있음을 가리킨다.
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 기술 용어들은 당해 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 더욱이, 본 발명에 사용된 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 생물 화학 및 면역학의 실험 작업은 상응하는 분야에 광범위하게 사용되는 통상적인 작업들이다. 한편으로, 본 발명의 보다 양호한 이해를 위해서, 관련 용어의 정의 및 설명을 하기와 같이 제공한다.
본 발명에 따라, "CRM197"이란 용어는 디프테리아 독소 무독성 돌연변이체를 지칭하며, 52번 아미노산 잔기가 Gly에서 Glu로 변화된 것이 야생형 디프테리아 독소와 다르다(문헌[G. Giannini, R.Rappuoli, G. Ratti et al., Nucleic Acids Research. 1984. 12: 4063-4070]). 디프테리아 독소는 당해 분야의 숙련가에 의해 널리 공지되어 있으며(예를 들어 문헌[Choe S, Bennett M, Fujii G, et al., Nature. 1992. 357:216-222]을 참조하시오), 그의 아미노산 서열을 진뱅크(GenBank) 수납 번호 AAV70486.1을 참조하여 찾을 수 있다.
본 발명에서, CRM197의 예시적인 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타낸다. 따라서, 본 발명에서 CRM197의 서열이 수반될 때, 이를 서열번호 2에 나타낸 서열로서 개시한다. 예를 들어, "CRM197의 1 내지 190 번 위치의 아미노산 잔기"란 표현에서, 1 내지 190 번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 2의 1 내지 190 번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 돌연변이 또는 변이(비제한적으로 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다)가 자연적으로 발생하거나 또는 CRM197의 생물학적 성질에 영향을 미치지 않으면서 서열번호 2에 인위적으로 도입됨을 이해한다. 따라서, 본 발명에서 "CRM197"이란 용어는 서열번호 2에 나타낸 폴리펩타이드 및 그의 천연 또는 인공 변체를 포함하여 모든 상기와 같은 폴리펩타이드 및 변체를 포함하고자 하며, 여기에서 상기 변체들은 CRM197의 생물학적 성질을 유지한다, 즉 강한 면역원성을 가지며 세포독성이 없다. 또한, CRM197의 서열 단편들을 개시하는 경우, 이들 단편은 서열번호 2에 나타낸 폴리펩타이드의 서열 단편 뿐만 아니라 상기 폴리펩타이드의 천연 또는 인공 변체의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, "CRM197의 1 내지 190 번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 2의 1 내지 190 번 위치의 아미노산 잔기 및 서열번호 2에 나타낸 폴리펩타이드의 변체(천연 또는 인공)의 상응하는 단편을 포함하고자 한다.
본 발명에 따라, E형 간염 바이러스(HEV) 캡시드 단백질은 HEV ORF2에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다. HEV ORF2의 서열은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어 DDBJ 수납 번호 D11092를 참조하시오). 본 발명에서, HEV ORF2의 서열이 수반되는 경우, 이를 DDBJ 수납 번호 D11092에 나타낸 서열로서 개시한다. 예를 들어 "HEV ORF2에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 368 내지 606 번 위치의 아미노산 잔기"란 표현에서, 368 내지 606 번 위치의 아미노산 잔기는 D11092에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 368 내지 606 번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 돌연변이 또는 변이(비제한적으로 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다)가 자연적으로 발생하거나 또는 HEV ORF2 또는 그에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 생물학적 성질(예를 들어 항원성 및 면역원성)에 영향을 미치지 않으면서 이들에 인위적으로 도입됨을 이해한다. 따라서, 본 발명에서 "HEV ORF2"란 용어는 D11092에 나타낸 서열 및 그의 천연 또는 인공 변체를 포함하여 모든 상기와 같은 폴리펩타이드 및 변체를 포함하고자 한다. 또한, HEV ORF2(또는 그에 의해 암호화된 폴리펩타이드)의 서열 단편들을 개시하는 경우, 이들 단편은 D11092(또는 그에 의해 암호화된 폴리펩타이드)의 서열 단편 뿐만 아니라 D11092(또는 그에 의해 암호화된 폴리펩타이드)의 천연 또는 인공 변체의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, "HEV ORF2에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 368 내지 606 번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 D11092에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 368 내지 606 번 위치의 아미노산 잔기 및 D11092에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 변체(천연 또는 인공)의 상응하는 단편을 포함하고자 한다. HEV 캡시드 단백질(D11092의 ORF2에 의해 암호화된 폴리펩타이드)의 예시적인 아미노산 서열을 서열번호 31에 개시한다.
본 발명에 따라, 인플루엔자 바이러스 M2 단백질은 A형 또는 B형 인플루엔자 바이러스 게놈의 7번째 구획에 의해 암호화된 단백질 또는 C형 인플루엔자 바이러스 게놈의 6번째 구획에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다. 인플루엔자 바이러스 M2 단백질의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 32에 개시된다.
본 발명에 따라, "상응하는 서열 단편" 또는 "상응하는 단편"이란 표현은 서열들을 최적으로 정렬시킬 때, 즉 서열들을 최고의 일치율을 획득하기 위해서 정렬시킬 때 상기 서열들의 같은 위치에 배치되는 단편들을 지칭한다.
본 발명에 따라, 단백질/폴리펩타이드의 배경 설명에 사용 시, "변체"란 용어는 그의 아미노산 서열이 기준 단백질/폴리펩타이드(예를 들어 본 발명의 CRM197)와 하나 이상(예를 들어 1 내지 10, 또는 1 내지 5 또는 1 내지 3 개)의 아미노산이 상이하거나(예를 들어 보존적인 아미노산 치환), 또는 기준 단백질/폴리펩타이드(예를 들어 본 발명의 CRM197)에 대해 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 일치성을 갖고, 상기 기준 단백질/폴리펩타이드의 필수적인 특성을 유지하는 단백질을 지칭한다. 본 발명에서, CRM197의 필수적인 특성은 강한 면역원성을 가지며 세포독성이 없음을 지칭할 수 있고, HEV 캡시드 단백질 및 인플루엔자 바이러스 M2 단백질의 필수적인 특성은 그의 항원성 및/또는 면역원성을 지칭할 수 있다.
본 발명에 따라, "일치성"이란 용어는 2 개의 폴리펩타이드 간의 또는 2 개의 핵산 간의 합치 정도를 지칭한다. 비교를 위한 2 개의 서열이 어떤 부위에서 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛을 갖는 경우(예를 들어 2 개의 DNA 분자가 각각 어떤 부위에서 아데닌을 갖거나, 또는 2 개의 폴리펩타이드가 각각 어떤 부위에서 리신을 갖는 경우), 상기 두 분자는 상기 부위에서 일치한다. 2 개 서열간의 일치율은 전체 비교 부위의 수에 대해서 상기 두 서열에 의해 공유되는 일치하는 부위의 수 x 100의 함수이다. 예를 들어 두 서열의 10 개 부위 중 6 개가 합치하는 경우, 이들 두 서열은 60%의 일치성을 갖는다. 예를 들어, DNA 서열: CTGACT 및 CAGGTT는 50%의 일치성을 공유한다(6 개의 부위 중 3 개가 합치된다). 일반적으로, 2 개 서열의 비교를 최대의 일치성을 생성시키는 방식으로 수행한다. 상기와 같은 정렬은 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 니들맨(Needleman) 등의 방법(문헌[J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970])에 근거한 얼라인(Align) 프로그램(DNAstar, Inc.)을 사용함으로써 수행될 수 있다. 2 개 아미노산 서열간의 일치율을 이 메이어스(E. Meyers)와 더블유 밀러(W. Miller)의 연산(문헌[Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)])을 사용하여 측정할 수 있으며, 상기 연산은 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 벌점 및 4의 갭 벌점을 사용하여 얼라인 프로그램(버전 2.0)에 통합되었다. 또한, 2 개 아미노산 서열 간의 일치율을 니들맨과 분취(Wunsch)의 연산(문헌[J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)])을 사용하여 측정할 수 있으며, 상기 연산은 블로슘(Blossum) 62 행렬 또는 PAM250 행렬, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램(http://www.gcg.com에서 입수할 수 있다)에 통합되었다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "보존적인 치환"이란 용어는 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩타이드의 필수적인 특성에 부정적인 영향을 미치지 않거나 상기 특성을 변화시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 예를 들어, 보존적인 치환을 당해 분야에 공지된 표준 기법, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 및 PCR-매개된 돌연변이에 의해서 도입시킬 수 있다. 보존적인 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 물리적으로 또는 작용적으로 상기 상응하는 아미노산 잔기와 유사한(예를 들어 유사한 크기, 모양, 전하, 화학적 성질, 예를 들어 공유 결합 또는 수소 결합을 형성하는 능력 등) 잔기로 치환되는 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 그룹들이 당해 분야에 정의되었다. 이들 그룹은 알칼리성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 아스파트산 및 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 그룹으로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 아미노산 보존적인 치환을 식별하기 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993)]; 문헌[Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999)]; 및 문헌[Burks et al., Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997)](이들은 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오)
본 발명에 따라, "면역원성"이란 용어는 유기체 중에서 특이 항체 또는 감작 림프구의 형성을 자극하는 능력을 지칭한다. 이는 항원이, 항체 및 감작 림프구와 같은 면역학적 효과기 물질을 최종적으로 생성시키도록 특이적인 면역세포를 자극하여 상기 면역세포를 활성화시키고, 증식시키고 분화시키는 성질을 지칭할 뿐만 아니라, 유기체를 항원으로 자극한 후에 상기 유기체의 면역계에 항체 또는 감작 T 림프구가 형성될 수 있는 특이적인 면역 반응을 지칭한다. 면역원성은 항원의 가장 중요한 성질이다. 항원이 숙주에서 면역 반응의 생성을 성공정으로 유도할 수 있는지의 여부는 3 가지 인자, 즉 항원의 성질, 숙주의 반응성, 및 면역 수단에 따라 변한다.
본 발명에 따라, "면역원성 단편"이란 용어는 상기 단편이 유래된 단백질의 면역원성을 적어도 부분적으로 유지하는, 상기와 같은 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 예를 들어 HEV 캡시드 단백질의 면역원성 단편은 면역원성을 적어도 부분적으로 유지하는 HEV 캡시드 단백질의 단편들, 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같은 HEV-239, E2 또는 E2s(문헌[Li et al., J Biol Chem. 280(5): 3400-3406 (2005)]; 문헌[Li et al., PLoS Pathogens. 5(8): e1000537 (2009)]을 참조하시오)을 지칭하며; 인플루엔자 바이러스 M2 단백질의 면역원성 단편은 면역원성을 적어도 부분적으로 유지하는 M2 단백질의 단편, 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같은 M2e(문헌[Fiers W et al., Vaccine.27(45) :6280-6283(2009)]을 참조하시오)를 지칭한다.
본 발명에 따라, HEV-239(또는 간단히 239)는 HEV ORF2에 의해 암호화된 폴리펩타이드(즉 HEV 캡시드 단백질)의 368 내지 606 번 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩타이드를 지칭하고; E2는 HEV ORF2에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 394 내지 606 번 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩타이드를 지칭하며; E2s는 HEV ORF2에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 455 내지 606 번 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 발명에 따라, "M2e"란 용어는 인플루엔자 바이러스 M2 단백질의 1 내지 24 번 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 발명에서, "폴리펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 동일한 의미를 가지며 호환적으로 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명에서, 아미노산을 일반적으로 당해 분야에 널리 공지된 1 글자 암호 및 3 글자 암호에 의해 나타낸다. 예를 들어, 알라닌을 A 또는 Ala에 의해 나타낼 수 있다.
본 발명에 따라, "이 콜라이 발현 시스템"이란 용어는 이 콜라이(균주)와 벡터로 이루어진 발현 시스템을 지칭하며, 여기에서 상기 이 콜라이(균주)는 시중에서 입수할 수 있고, 비제한적으로 GI698, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3), BLR (DE3) 등을 포함한다.
본 발명에 따라, "벡터"란 용어는 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 비히클을 지칭한다. 상기 벡터가 상기 중에 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용하는 경우, 상기 벡터를 발현 벡터라 칭한다. 상기 벡터를 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있으며, 상기 벡터는 숙주 세포에서 발현된 운반된 유전 물질 요소들을 가질 수 있다. 벡터는 당해 분야의 숙련가에 의해 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로 플라스미드, 파지, 코스미드 등을 포함한다.
본 발명에 따라, "크로마토그래피"란 용어는 비제한적으로 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어 양이온-교환 크로마토그래피), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 흡수성 크로마토그래피(예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피), 젤 여과 크로마토그래피(젤 배제 크로마토그래피), 및 친화성 크로마토그래피를 포함한다.
본 발명에 따라, "약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제"란 용어는 환자 및 활성 성분과 약물학적으로 및/또는 생리학적으로 상용성이며, 당해 분야에 널리 공지된(예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995]을 참조하시오) 담체 및/또는 부형제, 예를 들어 비제한적으로 pH 조절제, 계면활성제, 항원보강제, 및 이온 강도 향상제를 포함한다. 예를 들어, pH 조절제는 비제한적으로 포스페이트 완충제를 포함하고; 계면활성제는 비제한적으로 음이온 계면활성제, 양이온 계면활성제, 또는 비-이온성 계면활성제(예를 들어 트윈-80)를 포함하며; 이온 강도 향상제는 비제한적으로 염화 나트륨을 포함한다.
본 발명에 따라, "항원보강제"란 용어는, 항원과 함께 유기체로 전달되거나 또는 상기 유기체에 미리 전달될 때 상기 유기체에서 항원에 대한 면역 반응을 증대시키거나 면역 반응의 유형을 변화시킬 수 있는 비-특이적인 면역-강화제를 지칭한다. 다수의 항원보강제, 예를 들어 비제한적으로 알루미늄 항원보강제(예를 들어 수산화 알루미늄), 프로인트 항원보강제(예를 들어 프로인트 완전 항원보강제 및 프로인트 불완전 항원보강제), 코리네박테리움 파르븀, 리포폴리사카라이드, 사이토킨 등이 존재한다. 프로인트 항원보강제가 현재 동물 실험에서 가장 통상적으로 사용되는 항원보강제이다. 수산화 알루미늄 항원보강제는 임상 시험에 더 통상적으로 사용된다.
본 발명에 따라, "분자내 항원보강제"란 용어는 표적 단백질(즉 항원)과 융합 단백질을 형성하고, 상기 항원과 동일한 분자(즉 상기 및 항원을 포함하는 융합 단백질) 중에 존재하고, 상기 항원의 항원보강제로서 작용하여 상기 항원의 면역원성을 증대시키는, 상기와 같은 항원보강제를 지칭한다. 즉, 분자내 항원보강제는, 일반적으로 폴리펩타이드 단편이라 지칭되는, 함께 융합되고 발현된 표적 단백질(항원)의 면역원성을 증대시킬 수 있는 항원보강제이다. 본 발명에서, 분자내 항원보강제는 특히 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 CRM197 또는 그의 단편을 지칭한다.
2 개 이상 단백질의 융합 발현에 의해 융합 단백질을 형성시키는 기법들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]; 및 문헌[F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995]을 참조하시오). 일반적으로, 2 개 이상의 단백질을 암호화하는 DNA 단편들을 재조합 DNA 기법에 의해 함께 인프레임 결합시키고, 융합 단백질을 단백질 발현에 의해 수득한다. 임의로, 2 개 이상의 단백질의 융합 발현에 링커를 사용할 수도, 사용하지 않을 수도 있다.
본 발명에 따라, "링커"란 용어는 2 개의 분자들(예를 들어 단백질들)을 결합시키기 위한 짧은 펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, 융합 단백질, 예를 들어 표적 단백질 1-링커-표적 단백질 2를, 각각 결합시키려는 2 개의 표적 단백질을 암호화하는 2 개의 DNA 단편 사이에 짧은 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 도입, 및 그의 단백질 발현에 의해 수득한다. 당해 분야의 숙련가에 의해 널리 공지된 바와 같이, 링커는 비제한적으로 가요성 결합 펩타이드, 예를 들어 Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, Gly-Gly-Ser-Ser 및 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3를 포함한다.
본 발명에 따라, "유효량"이란 용어는 기대되는 효과를 성취하거나 적어도 부분적으로 성취하기에 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 질병(예를 들어 HEV 또는 인플루엔자 바이러스 감염) 예방에 유효한 양은 질병(예를 들어 HEV 또는 인플루엔자 바이러스 감염)의 발생을 예방하거나, 억제하거나 지연시키기에 유효한 양을 지칭한다. 질병을 치료하기에 유효한 양은 병에 걸린 환자에게서 상기 질병 및 그의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 차단하기에 유효한 양을 지칭한다. 상기와 같은 유효량의 측정은 당해 분야의 숙련가의 능력 내에 있다. 예를 들어, 치료학적 용도에 유효한 양은 치료하려는 질병의 중증도, 환자의 면역계의 일반적인 상태, 환자의 일반적인 조건, 예를 들어 연령, 체중 및 성별, 약물의 투여 수단, 동시에 사용되는 추가적인 요법 등에 따라 변한다.
본 발명은 적어도 부분적으로 발명자들의 놀라운 발견, 즉 CRM197 또는 그의 단편의 표적 단백질(예를 들어 HEV 캡시드 단백질, 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편)과의 융합 발현 후에, CRM197 또는 그의 단편이 상기 표적 단백질의 면역원성을 현저하게 증대시킴을 기본으로 한다. 즉, CRM197 또는 그의 단편을 표적 단백질과의 융합 발현에 의해 상기 표적 단백질의 면역원성을 증대시키기 위한 분자내 항원보강제로서 사용할 수 있다.
따라서, 하나의 태양에서, 본 발명은 CRM197 또는 그의 단편 및 표적 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이며, 여기에서 상기 CRM197 또는 그의 단편은 상기 표적 단백질의 면역원성을 증대시킨다.
바람직한 실시태양에서, 상기 CRM197의 단편은 예를 들어 CMR197의 촉매 도메인 C(aa 1-190, 또한 본 출원에서는 단편 A라 칭한다), 막관통 도메인 T(aa 201-384), 및/또는 수용체 결합 도메인 R(aa 386-535)을 포함한다. 예를 들어, CRM197의 단편은 단편 A, 또는 단편 A 및 막관통 도메인 T를 포함할 수도 있다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, CRM197의 단편은 CRM197의 aa 1-190을 포함한다, 예를 들어 CRM197의 aa 1-389를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, CRM197의 단편은 CRM197의 aa 1-190 또는 aa 1-389로 이루어진다. 본 출원에서, CRM197의 예시적인 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타내며, 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1에 나타낸다.
바람직한 실시태양에서, 상기 표적 단백질은 HEV 캡시드 단백질, 인플루엔자 바이러스 M2 단백질, 또는 그의 면역원성 단편일 수 있다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, HEV 캡시드 단백질의 면역원성 단편은 예를 들어 HEV-239(HEV 캡시드 단백질의 aa 368-606), E2(HEV 캡시드 단백질의 aa 394-606) 또는 E2s(HEV 캡시드 단백질의 aa 455-606) 등을 포함하거나 이들일 수 있다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, M2 단백질의 면역원성 단편은 M2e(M2 단백질의 aa 1-24)를 포함하거나 상기일 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질에서, CRM197 또는 그의 단편을, 임의로 링커를 통해 표적 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 결합시킬 수 있다. 2 개의 펩타이드 단편을 결합시키기 위한 링커는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로 가요성 결합 펩타이드, 예를 들어 Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, Gly-Gly-Ser-Ser 및 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 등을 포함한다. 상기와 같은 링커는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 그의 선택은 당해 분야의 숙련가의 능력 내에 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질은 CRM197 또는 그의 단편, 및 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편을 포함할 수 있으며, 이들은 임의로 링커를 통해 함께 결합된다. 예를 들어 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 융합 단백질은 CRM197 또는 그의 단편, 및 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편을 포함할 수 있으며, 이들은 임의로 링커를 통해 함께 결합된다. 예를 들어 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 34, 36, 38, 40, 42, 또는 44에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질에서, CRM197 또는 그의 단편은 놀랍게도, 융합된(임의로 링커를 통해) 표적 단백질(예를 들어 HEV 캡시드 단백질, 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편)의 면역원성을 현저하게 증대시키며, 따라서 상기를 분자내 항원보강제로서 사용할 수도 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구조물을 또한 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 구조물을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 클로닝 벡터, 또는 발현 벡터일 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지 등일 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 구조물 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 유기체를 제공한다. 상기 숙주 세포는 비제한적으로 원핵생물 세포, 예를 들어 이 콜라이 세포, 및 진핵생물 세포, 예를 들어 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포(예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 마우스 세포, 인간 세포 등)를 포함한다. 본 발명의 세포는 세포주, 예를 들어 293T 세포일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 유기체는 식물 또는 동물이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 상기 융합 단백질에 사용된 표적 단백질에 따라, 본 발명의 약학 조성물 또는 백신은 다양한 질병(즉 상기 표적 단백질에 의해 예방되거나 치료될 수 있는 질병)의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있다. 예를 들어, 상기 사용된 표적 단백질이 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편인 경우에, 본 발명의 약학 조성물을 사용하여 HEV 감염 및 HEV 감염과 관련된 질병, 예를 들어 E형 간염을 예방 및/또는 치료할 수 있고; 상기 사용된 표적 단백질이 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편인 경우, 본 발명의 약학 조성물을 사용하여 인플루엔자 바이러스 감염 및 인플루엔자와 같은 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 질병을 예방 및/또는 치료할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 상기 표적 단백질에 의해 예방되거나 치료될 수 있는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조에 있어서 본 발명의 융합 단백질의 용도에 관한 것이다. 상기 융합 단백질에 사용된 표적 단백질에 따라, 본 발명의 약학 조성물을 사용하여 다양한 질병을 예방 및/또는 치료할 수 있다. 예를 들어, 사용된 표적 단백질이 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편인 경우, 본 발명의 약학 조성물을 사용하여 HEV 감염 및 HEV 감염과 관련된 질병, 예를 들어 E형 간염을 예방 및/또는 치료할 수 있고; 상기 사용된 표적 단백질이 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편인 경우, 본 발명의 약학 조성물을 사용하여 인플루엔자 바이러스 감염 및 인플루엔자와 같은 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 질병을 예방 및/또는 치료할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, HEV 감염 및/또는 HEV 감염과 관련된 질병, 예를 들어 E형 간염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 융합 단백질은 CRM197 또는 그의 단편 및 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편(이들은 임의로 링커를 통해 함께 결합된다)을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 인틀루엔자 바이러스 감염 및 인플루엔자와 같은 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 융합 단백질은 CRM197 또는 그의 단편 및 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편(이들은 임의로 링커를 통해 함께 결합된다)을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 표적 단백질의 면역원성을 증대시키기 위해서, 상기 정의된 바와 같은 CRM197 또는 그의 단편 및 상기 표적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 수득함을 포함하는, 상기 표적 단백질의 면역원성을 증대시키는 방법을 제공한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 융합 단백질을, CRM197 또는 그의 단편을, 임의로 링커를 사용하여 표적 단백질과 융합 발현시킴으로써 수득할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 표적 단백질은 상술한 바와 같은 HEV 캡시드 단백질, 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편이다.
따라서, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편의 면역원성을 증대시키기 위해서, CRM197 또는 그의 단편 및 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 수득함을 포함하는, 상기 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편의 면역원성을 증대시키는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 융합 단백질을, CRM197 또는 그의 단편을, 임의로 링커를 사용하여 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편과 융합 발현시킴으로써 수득할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편의 면역원성을 증대시키기 위해서, CRM197 또는 그의 단편 및 상기 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 수득함을 포함하는, 상기 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편의 면역원성을 증대시키는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 융합 단백질을, CRM197 또는 그의 단편을, 임의로 링커를 사용하여 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편과 융합 발현시킴으로써 수득할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 CRM197 또는 그의 단편 및 표적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 수득함을 특징으로 하는, 상기 표적 단백질의 면역원성의 증대에 있어서 CRM197 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다.
바람직한 실시태양에서, 상기 융합 단백질을, CRM197 또는 그의 단편을 임의로 링커를 사용하여 표적 단백질과 융합 발현시킴으로써 수득할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 표적 단백질은 HEV 캡시드 단백질, 인플루엔자 바이러스 M2 단백질, 또는 그의 면역원성 단편이다.
따라서, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 CRM197 또는 그의 단편 및 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 수득함을 특징으로 하는, 상기 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편의 면역원성의 증대에 있어서 CRM197 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 융합 단백질을, CRM197 또는 그의 단편을 임의로 링커를 사용하여 상기 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편과 융합 발현시킴으로써 수득할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 CRM197 또는 그의 단편 및 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 수득함을 특징으로 하는, 상기 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편의 면역원성의 증대에 있어서 CRM197 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 융합 단백질을, CRM197 또는 그의 단편을 임의로 링커를 사용하여 상기 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편과 융합 발현시킴으로써 수득할 수 있다.
본 발명은 CRM197 및 그의 단편을 표적 단백질의 면역원성을 증대시키기 위한 분자내 항원보강제로서 사용할 수 있음을 최초로 입증한다. 따라서, 본 발명은 CRM197 및 그의 단편의 신규의 용도를 제공하고, 표적 단백질의 면역원성을 증대시키는 신규의 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 표적 단백질 단독에 비해 더 강한 면역원성을 나타내므로, 본 발명은 약제 또는 백신의 제조에 새로운 선택권을 제공하며 상응하는 질병의 보다 유효한 치료 및 예방을 성취할 수 있다.
예를 들어, CRM197(또는 그의 단편) 및 HEV 캡시드 단백질(또는 그의 면역원성 단편)을 포함하는 본 발명의 융합 단백질은 HEV 캡시드 단백질(또는 그의 면역원성 단편) 단독에 비해 더 강한 면역원성을 나타내며, 따라서 상기 융합 단백질은 약학 조성물의 제조에 유용할 수 있고 HEV 감염 및 HEV 감염과 관련된 질병, 예를 들어 E형 간염을 보다 유효하게 예방하고 치료할 수 있다.
예를 들어, CRM197(또는 그의 단편) 및 인플루엔자 바이러스 M2 단백질(또는 그의 면역원성 단편)을 포함하는 본 발명의 융합 단백질은 인플루엔자 바이러스 M2 단백질(또는 그의 면역원성 단편) 단독에 비해 더 강한 면역원성을 나타내며, 따라서 상기 융합 단백질은 약학 조성물의 제조에 유용할 수 있고 인플루엔자 바이러스 감염 및 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 질병, 예를 들어 인플루엔자를 보다 유효하게 예방하고 치료할 수 있다. 예를 들어, M2e 단백질을 CRM197(또는 그의 단편)의 N-말단에 융합시키는 경우, 상기와 같이 형성된 융합 단백질은 사량체 또는 다른 중합체 형태를 형성할 수 있으며, 시험관 내에서 보호성 단클론 항체 O19(문헌[Fu et al., Virology, 2009, 385:218-226]을 참조하시오)와 양호한 반응성을 갖고(도 12B를 참조하시오) 생체 내에서 양호한 면역원성을 갖는다(도 14를 참조하시오). 따라서, 상기와 같이 형성된 융합 단백질은 일반적인 인플루엔자 백신의 개발에 유용하다.
서열 정보의 명세
본 발명에 수반되는 바와 같은 서열들의 정보를 하기 표에 제공한다.
Figure 112014000075865-pct00001
본 발명의 실시태양들을 도면 및 실시예를 참조하여 상세히 추가로 개시한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 하기의 도면 및 실시예가 본 발명의 범위를 한정한다기 보다는 단지 본 발명을 예시하고자 하는 것임을 알 것이다. 하기의 도면 및 바람직한 실시태양들의 상세한 설명에 따라, 본 발명의 다양한 목적 및 이점들이 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
발명을 수행하기 위한 구체적인 방식
본 발명을 하기의 실시예들(이들은 단지 본 발명을 예시하기 위해 사용되며 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다)을 참조로 예시한다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용된 분자 생물학적 실험 방법 및 면역학적 분석을 실질적으로 문헌[Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], 및 [F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995]에 개시된 바와 같은 방법에 따라 수행하며; 제한 엔도뉴클레아제들을 상기 제품의 제조자가 권하는 조건 하에서 사용한다. 제조자가 명확히 지시되지 않은, 본 발명에 사용된 시약들은 당해 분야에 통상적인 제품이거나 또는 상업적으로 입수할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 상기 실시예들이 본 발명을 예시하기 위해 사용되나, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 안다.
실시예 1. CRM197 유전자의 클론
ATCC(NO 53281)로부터 수득된 디프테리아 바실러스 C7(β197) 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였으며, 여기에서 순방향 프라이머는 CRM197F(서열번호 19)이고 역방향 프라이머는 CRM197R(서열번호 20)이었다. 상기 PCR 반응을 하기의 조건 하에 PCR 기구(바이오메트라(Biometra) 3)에서 수행하여 CRM197을 암호화하는 완전 길이 유전자를 제조하였다.
Figure 112014000075865-pct00002
PCR 증폭 후에, 길이 약 1.6 kb의 생성물을 수득하였다. 서열화 후에, 상기 증폭 생성물(즉 CRM197의 완전 길이 유전자)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1)을 수득하였으며, 이에 의해 암호화된 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타내었다.
실시예 2. CRM197 또는 그의 단편 및 HEV 캡시드 단백질 단편을 포함하는 융합 단백질의 디자인 및 클론
본 실시예에서, 상기 융합 단백질들을 발현하는 벡터를 예시적으로 제작하였다. 제조된 다양한 예시적인 융합 단백질들의 클론 디자인을 도 1에 도시하며, 여기에서 상기 융합 단백질들은 각각, 임의로 링커를 사용하여, CRM197 또는 그의 단편 및 HEV 캡시드 단백질 단편을 포함한다.
링커를 포함하는 융합 단백질의 클론
실시예 1에서 수득된 증폭 생성물(즉 CRM197의 완전 길이 유전자)을 주형으로서 사용하였다. 순방향 프라이머는 CRM197F(서열번호 19)였으며, 그의 5' 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 부위 CAT ATG가 도입되었고, 여기에서 ATG는 이 콜라이 시스템 중의 개시 코돈이었다. 역방향 프라이머들은 각각 CRM197-링커 R(서열번호 21), 389-링커 R(서열번호 22), 및 A-링커 R(서열번호 23)이었으며, 이들의 5' 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 부위 GGA TCC가 도입되었다. 상기 PCR 반응을 하기의 조건 하에서 PCR 유전자증폭기(바이오메트라 T3)에서 수행하였다. 상기 사용된 프라이머들의 서열을 표 1에 나타내었다.
Figure 112014000075865-pct00003
상기 증폭 생성물들은 각각 약 1600bp, 1200bp 및 600bp 길이의 DNA 단편이었다.
또한, pTO-T7-E2(문헌[Li, et al. JBC.2005. 28(5): 3400-3406])를 주형으로서 사용하였다. 순방향 프라이머들은 각각 E2F(서열번호 24) 및 E2sF(서열번호 25)였으며, 이들의 5' 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 부위 GGA TCC가 도입되었다. 역방향 프라이머는 Drp59R(서열번호 26)이었으며, 그의 5' 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 부위 GAA TTC가 도입되었다. 상기 PCR 반응을 하기의 조건 하에서 PCR 유전자증폭기(바이오메트라 T3)에서 수행하였다.
Figure 112014000075865-pct00004
상기 증폭 생성물들은 각각 약 600bp 및 450bp 길이의 DNA 단편이었다.
상기 수득된 바와 같은 증폭 생성물들을 각각 상업적으로 입수할 수 있는 pMD 18-T 벡터(TAKARA 캄파니에 의해 제조됨)에 결합시키고, pMD 18-T-CRM197-L, pMD 18-T-389-L 및 pMD 18-T-A-L 뿐만 아니라 pMD 18-T-E2 및 pMD 18-T-E2s으로서 표시하였다. 각각 NdeI/BamHI 및 BamHI/EcoRI 효소 절단에 의해 확인된 바와 같이, 양성 클론 pMD 18-T-CRM197-L, pMD 18-T-389-L, pMD 18-T-A-L, pMD 18-T-E2 및 pMD 18-T-E2s이 수득되었다.
M13(+) 프라이머에 의해 입증된 바와 같이, 정확한 관심 뉴클레오타이드 서열들을 각각 상기 수득된 pMD 18-T-CRM197-L, pMD 18-T-389-L, pMD 18-T-A-L, pMD 18-T-E2 및 pMD 18-T-E2s에 삽입하였다.
상기 플라스미드 pMD 18-T-CRM197-L, pMD 18-T-389-L 및 pMD 18-T-A-L을 NdeI/BamHI 효소에 의해 절단하였다. 효소 절단에 의해 수득된 단편들을 NdeI/BamHI 효소에 의해 절단된 원핵생물 발현 벡터 pTO-T7 내에 결합시키고(문헌[Luo Wenxin et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16:53-57]) 이 콜라이 ER2566(인비트로젠 캄파니(Invitrogen Co.)로부터 구입하였다) 내로 형질전환시켰으며; NdeI/BamHI 효소 절단에 의해 확인된 바와 같이, 플라스미드의 추출 후에, 양성 플라스미드 pTO-T7-CRM197-L, pTO-T7-389-L 및 pTO-T7-A-L(이들 내로 각각 CRM197-L, 389-L 및 A-L이 삽입되었다)가 수득되었다.
pTO-T7-CRM197-L, pTO-T7-389-L, pTO-T7-A-L, pMD 18-T-E2 및 pMD 18-T-E2s를 BamHI/EcoRI 효소에 의해 절단하였다. 상기 수득된 각각의 E2 및 E2s 단편들을 각각 BamHI/EcoRI 효소에 의해 절단된 벡터 pTO-T7-CRM197-L, pTO-T7-389-L 및 pTO-T7-A-L 내에 결합시켰다. NdeI/EcoRI 효소 절단에 의해 확인된 바와 같이, 양성 발현 벡터 pTO-T7-CRM197-L-E2, pTO-T7-CRM197-L-E2s, pTO-T7-389-L-E2, pTO-T7-389-L-E2s, pTO-T7-A-L-E2 및 pTO-T7-A-L-E2s(이들 내로 CRM197-L-E2(서열번호 3, 4), CRM197-L-E2s(서열번호 5, 6), 389-L-E2(서열번호 7, 8), 389-L-E2s(서열번호 9, 10), A-L-E2(서열번호 11, 12) 또는 A-L-E2s(서열번호 13, 14)가 각각 삽입되었다)가 수득되었다.
링커 부재 하의 융합 단백질 389-E2s 및 A-E2s의 클론
389-E2s 및 A-E2s를 발현하는 벡터를 3 개의 PCR 반응에 의해 제조하였다. 첫 번째 PCR 반응에 대해서, CRM197의 완전 길이 유전자를 주형으로서 사용하였다. 순방향 프라이머는 CRM197F이었으며, 그의 5' 말단에 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 부위 CAT ATG를 도입시켰고, 여기에서 ATG는 이 콜라이 시스템 중의 개시 코돈이었다. 역방향 프라이머들은 각각 389-E2s R(서열번호 27) 및 A-E2s R(서열번호 28)이었다. 상기 증폭을 수행하여 융합 단백질들의 N-말단 단편들을 수득하였다. 두 번째 PCR 반응에 대해서, CRM197의 완전 길이 유전자를 주형으로서 사용하였다. 순방향 프라이머는 각각 389-E2s F(서열번호 29) 및 A-E2s F(서열번호 30)이었다. 역방향 프라이머는 DrP59 R이었으며, 그의 5' 말단에 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 부위 GAA TTC를 도입시켰다. 증폭을 수행하여 상기 융합 단백질들의 C-말단 단편들을 수득하였다. 상기 첫 번째 및 두 번째 PCR 반응을 하기의 조건 하에서 PCR 유전자증폭기(바이오메트라 T3)에서 수행하였다.
Figure 112014000075865-pct00005
세 번째 PCR 반응에 대해서, 상기 첫 번째 및 두 번째 PCR 반응의 증폭 생성물들을 주형으로서 사용하였으며(예를 들어, 프라이머로서 389-E2sF 및 389-E2sR을 사용하여 수득된 2 개의 단편을 389-E2s의 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다), CRM197F 및 DrP59R을 프라이머로서 사용하였다. 증폭을 하기의 조건 하에서 PCR 유전자증폭기(바이오메트라 T3)에서 수행하였다.
Figure 112014000075865-pct00006
상기 증폭 생성물들은 각각 약 1600bp 및 1000bp의 DNA 단편들이었다. 상기 수득된 증폭 생성물들을 각각 상업적으로 입수할 수 있는 pMD 18-T 벡터(TAKARA 캄파니에 의해 제조된 것) 내에 결합시켰다. NdeI/EcoRI 효소 절단에 의해 확인된 바와 같이, 양성 클론 pMD 18-T-389-E2s 및 pMD 18-T-A-E2s를 수득하였다.
M13(+) 프라이머에 의해 입증된 바와 같이, 서열번호 15 및 서열번호 17의 정확한 뉴클레오타이드 서열(이들은 각각 서열번호 16 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 암호화하였다)을 각각 상기 수득된 pMD 18-T-389-E2s 및 pMD 18-T-A-E2s 내에 삽입하였다.
상기 플라스미드 pMD 18-T-389-E2s 및 pMD 18-T-A-E2s를 NdeI/EcoRI 효소에 의해 절단하였다. 이어서 효소 절단에 의해 수득된 단편들을 NdeI/EcoRI 효소에 의해 절단된 원핵생물 발현 벡터 pTO-T7 내로 결합시켰다(문헌[Luo Wenxin et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16:53-57]). NdeI/EcoRI 효소 절단에 의해 확인된 바와 같이, 상기 양성 플라스미드 pTO-T7-389-E2s 및 pTO-T7-A-E2s(여기에 각각 389-E2s 및 A-E2s가 삽입되었다)가 수득되었다.
본 실시예에 사용된 프라이머의 서열들을 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머 서열
SEQ ID NO: Primer Name Primer sequence (5' - 3')
19 CRM197F CATATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCT
20 CRM197R GAATTCCCCACTACCTTTCaGCTTTTG
21 CRM197-linker R GGATCCACCGCCACCGCTGCCACCGCCACCGCTGCCACCGCCACCGCTTTTGAT
22 389-linker R GGATCCACCGCCACCGCTGCCACCGCCACCGCTGCCACCGCCACCAAATGGTTGC
23 A-linker R GGATCCACCGCCACCGCTGCCACCGCCACCGCTGCCACCGCCACCACGATTTCCTGCAC
24 E2F GGATCCCAGCTGTTCTACTCTCGTC
25 E2sF GGATCCTCCCCAGCCCCATCGCGC
26 Drp59R GAATTCCTAGCGCGGAGGGGGGGCT
27 389-E2s R GATGGGGCTGGGGAAAATGGTTG
28 A-E2s R GATGGGGCTGGGGAACGATTTCCTGCAC
29 389-E2s F CGCAACCATTTTCCCCAGCCC
30 A-E2s F GAAATCGTTCCCCAgCCCCAT
1 ㎕의 플라스미드 pTO-T7-CRM197-L-E2, pTO-T7-CRM197-L-E2s, pTO-T7-389-L-E2, pTO-T7-389-L-E2s, pTO-T7-389-E2s, pTO-T7-A-L-E2, pTO-T7-A-L-E2s 및 pTO-T7-A-E2s(0.15 ㎎/㎖)를 별도로 사용하여, 염화 칼슘 방법에 의해 제조된 컴피턴트 이 콜라이 ER2566(인비트로젠으로부터 구입된 것) 40 ㎕를 형질전환시키고, 이어서 상기 세균을 가나마이신(100 ㎎/㎖의 최종 농도에서, 이하 동일)을 함유하는 고체 LB 배지(상기 LB 배지의 성분: 10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 분말, 및 10 g/L NaCl, 이하 동일) 상에 도말하였다. 상기 플레이트를 개별적인 콜로니들이 명확히 관찰될 때까지 약 10 내지 12 시간 동안 37 ℃에서 정적으로 배양하였다. 상기 플레이트로부터의 개별적인 콜로니를 가나마이신을 함유하는 4 ㎖ 액체 LB 배지를 함유하는 튜브로 옮겼다. 상기 배양물을 37 ℃에서 10 시간 동안 180 rpm에서 진탕 배양기에서 배양시키고, 이어서 1 ㎖의 세균 용액을 취하여 -70 ℃에서 보관하였다.
실시예 3. 실시예 2에서 제조된 융합 단백질의 발현 및 정제
융합 단백질의 발현 및 봉입체의 정제
-70 ℃에서 초저온 냉동기로부터 취한 5 ㎕ 세균 용액을 가나마이신 함유 액체 LB 배지 5 ㎖에 시딩하고, 이어서 OD600이 약 0.5에 도달할 때까지 진탕 하에 37 ℃, 180 rpm에서 배양하였다. 생성 용액을 가나마이신 함유 500 ㎖ LB 배지로 옮기고, 이어서 4 내지 5 시간 동안 진탕 하에 37 ℃, 180 rpm에서 배양하였다. OD600이 약 1.5에 도달했으면, IPTG를 0.4 mM의 최종 농도로 가하고, 상기 세균을 37 ℃에서 4 시간 동안 진탕 하에 유도하였다.
유도 후에, 원심분리를 8000 g에서 5 분간 수행하여 세균을 수거하고, 이어서 상기 세균을 빙욕에서 용해 용액에 1 g 세균 대 10 ㎖ 용해 용액(20 mM 트리스 완충제 pH 7.2, 300 mM NaCl)의 비로 재-현탁시켰다. 상기 세균을 초음파 분쇄기(소닉스(Sonics), VCX750 유형 초음파 분쇄기)(조건: 작동 시간 15 분, 펄스 2s, 중단 기간 4s, 출력 55%)로 처리하였다. 상기 세균 용해물을 12000 rpm, 4 ℃에서 5 분간 원심분리시키고(이하 동일), 상등액을 버리고, 침전물(즉 봉입체)을 유지시켰으며; 동일한 부피의 2% 트리톤-100을 세척에 사용하고, 생성 혼합물을 30 분 동안 진동 하에 두고, 원심분리시키고, 상등액은 버렸다. 상기 침전물을 30 분간 진동 하에서 완충제 I(20 mM 트리스-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA)에 재-현탁시키고, 원심분리시키고, 상등액은 버렸다. 이어서 상기 침전물을 진동 하에 37 ℃에서 30 분간 2M 유레아에 재-현탁시키고, 원심분리시키고, 상등액과 침전물을 수득하였다. 상기 상등액을 유지시키고; 상기 침전물을 동일한 부피의 4M 유레아에, 진동 하에 37 ℃에서 30 분 동안 재-현탁시키고, 12000 rpm, 4 ℃에서 15 분간 원심분리시켜 상등액과 침전물을 수득하였다. 상기 상등액(즉 4M 유레아-용해된 상등액)을 유지시키고; 상기 침전물을 동일한 부피의 8M 유레아에, 진동 하에 37 ℃에서 30 분 동안 재-현탁시키고, 원심분리시키고, 상기 상등액(즉 8M 유레아-용해된 상등액)을 유지시켰다.
상기 수득된 분획들의 SDS-PAGE 분석 결과들(쿠마씨 브릴리언트 블루 염색을 가시화에 사용하였다, 이하 동일, 문헌[The Molecular Cloning Experiment Guide, 2nd edition]의 방법을 참조하시오)을 도 2에 도시하였다. 상기 결과는 상기 융합 단백질이 봉입체에서 발현되었으며(도 2A 참조), CRM197-L-E2, 389-L-E2, A-L-E2, 및 A-E2s는 주로 4M 유레아에 용해되었고(도 2B 참조), CRM197-L-E2s, 389-L-E2s, A-L-E2s, 및 389-E2s는 주로 8M 유레아에 용해되었음을 보였다(도 2C 참조). 상기 융합 단백질을 함유하는 4M 유레아-용해된 상등액 또는 8M 유레아-용해된 상등액을 각각 PBS에 투석시켜 약 80%의 순도를 갖는 융합 단백질들을 수득하였다(도 2D 참조).
음이온 교환 크로마토그래피에 의한 융합 단백질 A-L-E2의 정제
샘플: 상기 수득된 바와 같은 약 80%의 순도를 갖는 A-L-E2 단백질의 용액.
장비: GE 헬쓰케어(즉 원래 애머샨 파마시아 캄파니(Amershan Pharmacia Co.))에 의해 제조된 AKTA 익스플로러 100 예비 액체 크로마토그래피 시스템
크로마토그래피 매질: Q 세파로스 패스트 플로우(GE 헬쓰케어 캄파니)
컬럼 부피: 15 ㎜ x 20 ㎝
완충제: 20 mM 포스페이트 완충제 pH 7.7 + 4M 유레아
20 mM 포스페이트 완충제 pH 7.7 + 4M 유레아 + 1M NaCl
유속: 6 ㎖/분
검출기 파장: 280 ㎚
용출 프로토콜: 관심 단백질을 150 mM NaCl로 용출시키고, 바람직하지 않은 단백질은 300 mM NaCl로 용출시키며, 150 mM NaCl로 용출시킨 분획을 수거한다.
소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 융합 단백질 A-L-E2의 정제
장비: GE 헬쓰케어(즉 원래 애머샨 파마시아 캄파니)에 의해 제조된 AKTA 익스플로러 100 예비 액체 크로마토그래피 시스템
크로마토그래피 매질: 페닐 세파로스 패스트 플로우(GE 헬쓰케어 캄파니)
컬럼 부피: 15 ㎜ x 20 ㎝
완충제: 20 mM 포스페이트 완충제 pH 7.7 + 4M 유레아 + 0.5M (NH4)2SO4
20 mM 포스페이트 완충제 pH 7.7 + 4M
유속: 5 ㎖/분
검출기 파장: 280 ㎚
샘플: 선행 단계에서 수득된 바와 같은 150 mM NaCl에 의해 용출된 분획을 완충제(20 mM 포스페이트 완충제 pH 7.7 + 4M 유레아 + 0.5M (NH4)2SO4)에 투석시키고 이어서 샘플로서 사용하였다.
용출 프로토콜: 바람직하지 않은 단백질을 0.3M (NH4)2SO4)로 용출시키고, 관심 단백질은 0.1M 및 0M (NH4)2SO4로 용출시키며, 0.1M 및 0M (NH4)2SO4로 용출시킨 분획을 수거한다.
0.1M 및 0M (NH4)2SO4에 의해 용출된 분획을 투석시키고 PBS 내로 재생시키고, 이어서 10 ㎕를 SDS-PAGE 분석을 위해 취하고, 쿠마씨 브릴리언트 블루 염색에 의해 전기영동 밴드들을 가시화하였다. 상기 결과는 상기 정제 단계 후에, 융합 단백질 A-L-E2가 90% 이상의 순도를 가짐을 보였다(도 3 참조).
실시예 4. 실시예 2에서 제조된 융합 단백질들의 성질의 분석
웨스턴 블럿팅에 의한 상기 융합 단백질과 항체와의 반응성의 측정
상기 융합 단백질과 HEV 중화 단클론 항체 8C11(문헌[Zhang et al., Vaccine. 23(22): 2881-2892 (2005)]을 참조하시오) 및 항-CRM197 다클론 항혈청(이를 당해 분야에 널리 공지된 방법들을 통해 마우스를 CRM197로 면역시킴으로써 제조하였으며, 상기 혈청의 반응성을 상업적으로 입수할 수 있는 CRM197에 의해 확인하였다)과의 반응성을 웨스턴 블럿팅에 의해 측정하였다. 상기 투석되고 재생된 샘플들을 SDS-PAGE 분리 후 블럿팅을 위해 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 옮기고; 5% 탈지 우유를 사용하여 상기 멤브레인을 2 시간 동안 차단시키고, 이어서 일정한 비로 희석한 단클론 항체 8C11을 가하고(단클론 항체를 1:500으로 희석하고, 다클론 항혈청을 1:1000으로 희석하였다), 상기 반응을 1 시간 동안 수행하였다. 상기 멤브레인을 TNT(50 mmol/L 트리스·Cl(pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 0.05% 트윈 20)로 3 회, 매번 10 분씩 세척하였다. 이어서 염소 항-마우스 알칼리성 포스파타제(KPL 제품)를 가하고, 상기 반응을 1 시간 동안 수행하고, 이어서 상기 멤브레인을 TNT로 3 회, 매번 10 분씩 세척하였다. NBT 및 BCIP(PROTOS 제품)를 가시화에 사용하였다. 상기 융합 단백질 및 HEV 중화 단클론 항체 8C11을 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 측정된 바와 같은 결과를 도 4에 도시하였다. 상기 결과는 시험된 융합 단백질들이 모두 HEV 중화 단클론 항체 8C11과 현저한 반응성을 가짐을 보였다.
ELISA 에 의한 상기 융합 단백질과 다양한 HEV 특이 항체들과의 반응성의 측정
상기 융합 단백질 및 대조용 단백질 E2 및 HEV-239와 다양한 HEV 특이 항체들(문헌[Gu Ying et al., Chinese Journal of Virology, 19(3): 217-223(2003)])과의 반응성을 간접적인 ELISA에 의해 측정하였다. 상기 투석되고 재생된 샘플을 1X PBS(1 ㎍/㎖)로 희석하고, 이어서 96-웰 미세플레이트(베이징 완타이 캄파니(Beijing Wantai Co.))에 100 ㎕/웰로 가하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 상기 코팅 용액을 버리고, 상기 플레이트를 PBST(PBS + 0.05% 트윈-20)로 1 회 세척하고, 이어서 차단 용액(PBS 중의, 2% 젤라틴, 5‰ 카제인, 1 ‰ 프로클린(Proclin)300)을 200 ㎕/웰로 가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 상기 검출이 수행되었으면 상기 차단 용액을 버리고, 일정한 비로 희석된 상기 HEV 단클론 항체(E2s 및 그의 융합 단백질이 검출되면, 이들을 1:10000으로 희석하고; E2 및 그의 융합 단백질이 검출되면, 이들을 1:100000으로 희석하였으며; A-L-E2, 239 및 E2 단백질의 반응성을 비교한 경우, 상기 단클론 항체들을 10 배로 연속 희석시켰으며, 여기에서 1 ㎎/㎖을 초기 농도로 사용하였고, 초기 농도의 상기 다클론 항체를 동일한 방식으로 희석하였다)를 100 ㎕/웰로 가하였다. 상기 혼합물을 37 ℃에서 1 내지 2 시간 동안 배양하였다. 이어서 상기 플레이트를 PBST로 5 회 세척하고, 이어서 HRP-표지된 염소 항 마우스(KPL 제품)(1:5000)를 100 ㎕/웰로 가하고 37 ℃에서 30 분간 배양하고; 이어서 상기 플레이트를 PBST로 5 회 세척하고, 이어서 HRP 기질(베이징 완타이 캄파니)을 100 ㎕/웰로 가하고, 37 ℃에서 15 분 동안 배양하였다. 2M 황산을 50 ㎕/웰로 가하여 상기 반응을 중지시키고, 이어서 미세플레이트 판독기(선라이즈 타입(Sunrise Type), 테칸 캄파니(Tecan Co.) 제품)를 사용하여 OD450/620 값을 판독하였다. 상기 융합 단백질을 상기 단클론 항체와 함께 사용하는 상기 ELISA의 결과를 도 5에 도시하였다. 상기 결과는 E2s 단백질과 상기 단클론 항체와의 반응성이, CRM197 또는 그의 단편과의 융합 후에 현저하게 증대되었음을 보였으며, 여기에서 A-L-E2s 및 A-E2s의 반응성이 가장 현저하게 증대되었고; E2 단백질과 HEV-특이성 단클론 항체와의 반응성은, CRM197 또는 그의 단편과의 융합 후에, 유지되거나 증대되었다.
크로마토그래피에 의해 정제된 융합 단백질 A-L-E2의 반응성의 분석
2-단계 크로마토그래피에 의해 정제된 융합 단백질 A-L-E2의 반응성을 간접적인 ELISA에 의해 분석하였다(선행 단계의 구체적인 공정을 참조하시오). 상기 ELISA 결과를 도 6에 도시하였다. 상기 결과는 A-L-E2와 HEV 특이성 단클론 항체와의 반응성이 대조용 단백질 HEV-239 및 E2의 경우에 필적할만함을 보였다.
융합 단백질 A-L-E2의 침강 속도(SV)의 분석
본 실험에 사용된 기구는 US 벡크만(Beckman) XL-A 분석 초원심분리기였으며, 여기에는 광학 검출 시스템 및 An-50Ti 및 An-60Ti 회전기가 구비되었다. 상기 침강 속도(SV) 방법(c(s) 연산, 문헌[P. Schuck et al., Biophys J 78: 1606-1619(2000)]을 참조하시오)을 사용하여 융합 단백질 A-L-E2의 침강 계수를 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 7에 도시하였다. 상기 결과는 상기 융합 단백질 A-L-E2가 주로 이량체의 형태로 존재하며, 일부 이량체들은 추가로 중합되어 사량체를 형성할 수도 있음을 보였다.
실시예 5. 실시예 2에서 제조된 융합 단백질들의 면역원성의 분석
융합 단백질들에 의해 유도된 항체 역가
본 실험에 사용된 마우스는 6주된 암컷 BALB/C 마우스였다. 알루미늄 항원보강제를 사용함으로써, 마우스를, 각각 실시예 3의 방법에 의해 제조되고 PBS로 재생시킨 융합 단백질, 및 대조용 단백질 HEV-239, E2 및 E2s의 복강내 주사에 의해 면역시켰다. 상기 주사 부피는 1 ㎖이었으며, 2 개의 용량 그룹(5 ㎍-용량 그룹 또는 0.5 ㎍-용량 그룹)을 사용하였다. 1차 면역을 0 주째에 수행하였으며, 추가 면역을 2 주 및 4 주째에 수행하였다.
HEV-239를 사용하여 플레이트를 코팅하고, 상기 융합 단백질 및 대조용 단백질에 의해 유도된 바와 같은 혈청 중 항체 역가를 상술한 바와 같이 유사한 간접적인 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 면역 후 3 개월 내 혈청 항체 역가의 검출 결과를 도 8에 도시하였다. 상기 결과들은 혈청전환이 5 ㎍- 및 0.5 ㎍-용량 그룹 모두에서 4 주째에 마우스 혈청 중에서 발생하였고, 상기 항체 역가는 5 또는 6 주째에 최고값에 도달함을 보였다. 특히, 5 ㎍-용량 그룹에서, A-L-E2가 사용될 때 최고의 항체 역가가 획득되었으며, 이는 6 주째에 106에 도달하였고; 상기 융합 단백질들에 의해 유도된 항체 역가는 HEV-239 단백질의 경우보다 더 높거나 이에 필적하였다. 0.5 ㎍-용량 그룹에서, 상기 융합 단백질의 항체 역가는 HEV-239의 경우보다 현저하게 더 높았으며, 5 주째에 A-L-E2 단백질에 의해 유도된 항체 역가는 106에 도달하였다. 또한, 5 ㎍- 및 0.5 ㎍-용량 그룹들에서 E2 및 E2s를 사용하는 경우 면역 혈청에서 혈청전환은 일어나지 않았다. 상기 결과로부터 보이는 바와 같이, 상기 제조된 융합 단백질의 면역원성은 항원 단백질(E2 및 E2s) 단독보다 현저하게 더 높았으며, 이는 본 발명의 CRM197 또는 그의 단편이 상기와 함께 융합된 항원 단백질의 면역원성을 현저하게 증대시켰고, 상기를 분자내 항원보강제로서 사용할 수 있음을 가리킨다.
융합 단백질 A-L-E2의 중간 유효 용량(ED50)에 대한 조사
본 실험에서, 융합 단백질의 면역원성을 중간 유효 용량(ED50)을 측정함으로써 조사하였다. 사용된 실험 동물은 3 내지 4주 된 암컷 BLAB/c 마우스였다. A-L-E2를 알루미늄 항원보강제와 혼합하고, 초기 용량은 1 ㎍/마우스였으며, 1:3으로 연속 희석시켜 총 8 개의 용량 그룹을 생성시켰다. 또한, HEV-239(HEV 재조합 백신)를 대조용으로서 사용하였으며, 초기 용량은 1.6 ㎍/마우스였고, 1:4로 연속 희석시켜 총 4 개의 용량 그룹을 생성시켰다. 6 마리의 마우스를 각 그룹에 사용하였다. 상기 면역을 1회 복강 내 주사에 의해 수행하였다.
말초 정맥혈을 면역 후 4 주째에 채혈하고, 혈청을 분리시키고, 혈청학적 전환률을 상술한 바와 같이 ELISA에 의해 측정하였다. 100 배 희석된 혈청의 ELISA 값이 컷오프 값(즉 평균 음의 값의 3 배)보다 더 높은 경우, 상기 혈청은 양성으로서 간주되었다. 중간 유효 용량(ED50)을 리드-뮌히(Reed-Muench) 방법에 의해 계산하였다. 융합 단백질 A-L-E2의 혈청학적 전환률을 표 2에 도시하였으며, HEV-239 백신의 혈청학적 전환율은 표 3에 도시하였다.
마우스에서 HEV 항체의 혈청전환을 유도하기 위한 A-L-E2의 ED50
용량(Dose)
(μg)		 마우스의 수 혈청전환을 갖는 마우스의 수 혈청학적 전환률 ED50(μg)
1.0000 6 6 100% 0.0064
0.3333 6 6 100%
0.1111 6 6 100%
0.0370 6 6 100%
0.0123 6 6 100%
0.0041 6 1 16.7%
0.0013 6 0 0%
0.0005 6 0 0%
마우스에서 HEV 항체의 혈청전환을 유도하기 위한 HEV-239의 ED50
용량(Dose)
(μg)		 마우스의 수 혈청전환을 갖는 마우스의 수 혈청학적 전환률 ED50(μg)
1.6 6 6 100% 0.071
0.4 6 5 83.3%
0.1 6 4 66.7%
0.025 6 0 0%
상기 결과는 HEV-239의 ED50이 A-L-E2의 경우의 11 배임을 보였으며, 이는 본 발명의 CRM197 또는 그의 단편이 상기와 융합된 항원 단백질의 면역원성을 현저하게 증대시켰고 분자내 항원보강제로서 사용될 수 있음을 가리킨다. 한편으로, 상기 융합 단백질 A-L-E2의 면역원성은 입자와 같은 바이러스의 형태에서 HEV-239 백신의 경우보다 현저하게 더 높았기 때문에, 상기 융합 단백질은 E형 간염에 보다 유효한 신규 백신의 제조에 사용될 수 있다.
실시예 6. CRM197 또는 그의 단편 및 인플루엔자 바이러스 M2e 단백질을 포함하는 융합 단백질의 디자인 및 클론
본 실시예에서, 상기 융합 단백질들을 발현하는 벡터를 예시적으로 제작하였다. 제조된 다양한 예시적인 융합 단백질들의 클론 디자인을 도 9에 도시하며, 여기에서 상기 융합 단백질들은 각각, 임의로 링커를 사용하여, CRM197 또는 그의 단편 및 인플루엔자 바이러스 M2e 단백질을 포함한다.
융합 단백질의 클론
CRM197 또는 그의 단편의 C-말단에 융합된 M2e
실시예 1에서 수득된 증폭 생성물(즉 CRM197의 완전 길이 유전자)을 주형으로서 사용하였다. 순방향 프라이머는 CRM197F1(서열번호 45)였으며, 그의 5' 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 부위 CAT ATG가 도입되었고, 여기에서 ATG는 이 콜라이 시스템 중의 개시 코돈이었다. 역방향 프라이머들은 각각 CRM197-링커 R1(서열번호 46), 389-링커 R1(서열번호 47), 및 A-링커 R1(서열번호 48)이었으며, 이들의 5' 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 부위 GGA TCC가 도입되었다. 상기 PCR 반응을 하기의 조건 하에서 PCR 유전자증폭기(바이오메트라 T3)에서 수행하였다. 상기 사용된 프라이머들의 서열을 표 4에 나타내었다.
Figure 112014000075865-pct00007
상기 증폭 생성물들은 각각 약 1600bp, 1200bp 및 600bp 길이의 DNA 단편이었다.
또한, 플라스미드 PHW2000(우리 실험실에 보관되어 있다, M2의 완전 길이 유전자를 포함한다)을 주형으로서 사용하였다. 순방향 프라이머는 M2eF1(서열번호 49)였으며, 그의 5' 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 부위 GGA TCC가 도입되었다. 역방향 프라이머는 M2eR(서열번호 50)이었으며, 그의 5' 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 부위 GAA TTC가 도입되었다. 상기 PCR 반응을 하기의 조건 하에서 PCR 유전자증폭기(바이오메트라 T3)에서 수행하였다. 상기 사용된 프라이머들의 서열을 표 4에 나타내었다.
Figure 112014000075865-pct00008
상기 증폭 생성물들은 각각 약 70bp 길이의 DNA 단편이었다.
상기 수득된 바와 같은 증폭 생성물들을 각각 상업적으로 입수할 수 있는 pMD 18-T 벡터(TAKARA 캄파니에 의해 제조됨)에 결합시키고, pMD 18-T-CRM197-L1, pMD 18-T-389-L1 및 pMD 18-T-A-L1 뿐만 아니라 pMD 18-T-M2e로서 표시하였다. 각각 NdeI/BamHI 및 BamHI/EcoRI 효소 절단에 의해 확인된 바와 같이, 양성 클론 pMD 18-T-CRM197-L1, pMD 18-T-389-L1, pMD 18-T-A-L1, 및 pMD 18-T-M2e가 수득되었다.
M13(+) 프라이머에 의해 입증된 바와 같이, 정확한 관심 뉴클레오타이드 서열들을 각각 상기 수득된 pMD 18-T-CRM197-L1, pMD 18-T-389-L1, pMD 18-T-A-L1, 및 pMD 18-T-M2e에 삽입하였다.
상기 플라스미드 pMD 18-T-CRM197-L1, pMD 18-T-389-L1 및 pMD 18-T-A-L1을 NdeI/BamHI 효소에 의해 절단하였다. 효소 절단에 의해 수득된 단편들을 NdeI/BamHI 효소에 의해 절단된 원핵생물 발현 벡터 pTO-T7 내에 결합시키고(문헌[Luo Wenxin et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16:53-57]) 이 콜라이 ER2566(인비트로젠 캄파니로부터 구입하였다) 내로 형질전환시켰으며; NdeI/BamHI 효소 절단에 의해 확인된 바와 같이, 플라스미드의 추출 후에, 양성 플라스미드 pTO-T7-CRM197-L1, pTO-T7-389-L1 및 pTO-T7-A-L1(이들 내로 각각 단편 CRM197-L1, 389-L1 및 A-L1이 삽입되었다)가 수득되었다.
pTO-T7-CRM197-L1, pTO-T7-389-L1, pTO-T7-A-L1, 및 pMD 18-T-M2e를 BamHI/EcoRI 효소에 의해 절단하였다. 상기 수득된 M2e 단편을 각각 BamHI/EcoRI 효소에 의해 절단된 벡터 pTO-T7-CRM197-L1, pTO-T7-389-L1 및 pTO-T7-A-L1 내에 결합시켰다. NdeI/EcoRI 효소 절단에 의해 확인된 바와 같이, 양성 발현 벡터 pTO-T7-CRM197-L-M2e, pTO-T7-389-L-M2e, 및 pTO-T7-A-L-M2e(이들 내로 CRM197-L-M2e(서열번호 33, 34), 389-L-M2e(서열번호 35, 36), 또는 A-L-M2e(서열번호 37, 38)가 각각 삽입되었다)가 수득되었다.
CRM197 또는 그의 단편의 N-말단에 융합된 M2e
플라스미드 PHW2000(우리 실험실에 보관되어 있다, M2의 완전 길이 유전자를 포함한다)을 주형으로서 사용하였다. 순방향 프라이머는 M2eF2(서열번호 51)였으며, 그의 5' 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 NdeI CAT ATG가 도입되었고, 여기에서 ATG는 이 콜라이 시스템 중의 개시 코돈이었다. 역방향 프라이머는 M2e-링커 R(서열번호 52)이었으며, 그의 5' 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 BamHI GGA TCC가 도입되었다. 상기 PCR 반응을 하기의 조건 하에서 PCR 유전자증폭기(바이오메트라 T3)에서 수행하였다.
Figure 112014000075865-pct00009
상기 증폭 생성물들은 약 100bp 길이의 DNA 단편들이었다.
또한, 실시예 1에서 수득된 증폭 생성물(즉 CRM197의 완전 길이 유전자)을 주형으로서 사용하였다. 순방향 프라이머는 CRM197F2(서열번호 53)였으며, 그의 5' 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 부위 GGA TCC가 도입되었다. 역방향 프라이머는 CRM197 R2(서열번호 54), 389 R(서열번호 55) 및 A R(서열번호 56)이었으며, 이들의 5' 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 부위 GAA TTC가 도입되었다. 상기 PCR 반응을 하기의 조건 하에서 PCR 유전자증폭기(바이오메트라 T3)에서 수행하였다. 상기 사용된 프라이머들의 서열을 표 4에 나타내었다.
Figure 112014000075865-pct00010
상기 증폭 생성물들은 각각 약 1600bp, 1200bp 및 600bp 길이의 DNA 단편이었다.
상기 수득된 바와 같은 증폭 생성물들을 각각 상업적으로 입수할 수 있는 pMD 18-T 벡터(TAKARA 캄파니에 의해 제조됨)에 결합시키고, 각각 pMD 18-T-M2e-L 뿐만 아니라 pMD 18-T-CRM197, pMD 18-T-389 및 pMD 18-T-A로서 표시하였다. 각각 NdeI/BamHI 및 BamHI/EcoRI 효소 절단에 의해 확인된 바와 같이, 양성 클론 pMD 18-T-CRM197, pMD 18-T-389, pMD 18-T-A, 및 pMD 18-T-M2e-L이 수득되었다.
M13(+) 프라이머에 의해 입증된 바와 같이, 정확한 관심 뉴클레오타이드 서열들을 각각 상기 수득된 pMD 18-T-CRM197, pMD 18-T-389, pMD 18-T-A, 및 pMD 18-T-M2e-L에 삽입하였다.
상기 플라스미드 pMD 18-T-M2e-L을 NdeI/BamHI 효소에 의해 절단하였다. 이어서 효소 절단에 의해 수득된 단편들을 NdeI/BamHI 효소에 의해 절단된 원핵생물 발현 벡터 pTO-T7 내에 결합시키고(문헌[Luo Wenxin et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16:53-57]) 이 콜라이 ER2566(인비트로젠 캄파니로부터 구입하였다) 내로 형질전환시켰으며; NdeI/BamHI 효소 절단에 의해 확인된 바와 같이, 플라스미드의 추출 후에, 양성 플라스미드 pTO-T7-M2e-L(상기 내로 M2e-L이 삽입되었다)이 수득되었다.
pTO-T7-M2e-L, pMD 18-T-CRM197, pMD 18-T-389 및 pMD 18-T-A를 BamHI/EcoRI 효소에 의해 절단하였다. 상기 수득된 단편 CRM197, 389 및 A를 각각 BamHI/EcoRI 효소에 의해 절단된 벡터 pTO-T7-M2e-L 내에 결합시켰다. NdeI/EcoRI 효소 절단에 의해 확인된 바와 같이, 양성 발현 벡터 pTO-T7-M2e-L-CRM197, pTO-T7-M2e-L-389, 및 pTO-T7-M2e-L-A(이들 내로 M2e-L-CRM197(서열번호 39, 40), M2e-L-389(서열번호 41, 42), 및 M2e-L-A(서열번호 43, 44)가 각각 삽입되었다)가 수득되었다.
본 실시예에 사용된 프라이머의 서열들을 하기 표 4에 나타내었다.
프라이머 서열
SEQ ID NO: Primer names Primer sequences (5' - 3')
45 CRM197F1 CATATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAA
46 CRM197-linker R1 GGATCCGCTGCCACCGCCACCGCTGCCACCGCCACCGCTTTTGAT
47 389-linker R1 GGATCCGCTGCCACCGCCACCGCTGCCACCGCCACCAAATGGTTG
48 A-linker R1 GGATCCGCTGCCACCGCCACCGCTGCCACCGCCACCACGATTTCC
49 M2e F1 GGATCCATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCT
50 M2e R GAATTCTTAATCACTTGAACCGTTGCATCTGCACCCCCA
51 M2e F2 CATATGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCT
52 M2e-Linker R GGATCCGCTGCCACCGCCACCGCTGCCACCGCCACCATCACTTGA
53 CRM197F2 GGATCCGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAA
54 CRM197 R2 GAATTCTAAGCTTTTGATTTCAAAAAATAGCGATAGCTTAGA
55 389 R GAATTCTAAAAATGGTTGCGTTTTATGCCCCGGAGAATACGC
56 A R GAATTCTAAACGATTTCCTGCACAGGCTTGAGCCATATACTC
1 ㎕의 플라스미드 pTO-T7-CRM197-L-M2e, pTO-T7-389-L-M2e, pTO-T7-A-L-M2e, pTO-T7-M2e-L-CRM197, pTO-T7-M2e-L-389 및 pTO-T7-M2e-L-A(0.15 ㎎/㎖)를 별도로 사용하여, 염화 칼슘 방법에 의해 제조된 컴피턴트 이 콜라이 ER2566(인비트로젠으로부터 구입된 것) 40 ㎕를 형질전환시키고, 이어서 상기 세균을 가나마이신(100 ㎎/㎖의 최종 농도에서, 이하 동일)을 함유하는 고체 LB 배지(상기 LB 배지의 성분: 10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 분말, 및 10 g/L NaCl, 이하 동일) 상에 도말하였다. 상기 플레이트를 개별적인 콜로니들이 명확히 관찰될 때까지 약 10 내지 12 시간 동안 37 ℃에서 정적으로 배양하였다. 상기 플레이트로부터의 개별적인 콜로니를 가나마이신을 함유하는 4 ㎖ 액체 LB 배지를 함유하는 튜브로 옮겼다. 상기 배양물을 37 ℃에서 10 시간 동안 180 rpm에서 진탕 배양기에서 배양시키고, 이어서 1 ㎖의 세균 용액을 취하여 -70 ℃에서 보관하였다.
실시예 7. 실시예 6에서 제조된 융합 단백질의 발현, 단리 및 재생
-70 ℃에서 초저온 냉동기로부터 취한 5 ㎕ 세균 용액을 가나마이신 함유 액체 LB 배지 5 ㎖에 시딩하고, 이어서 OD600이 약 0.5에 도달할 때까지 진탕 하에 37 ℃, 180 rpm에서 배양하였다. 생성 용액을 가나마이신 함유 500 ㎖ LB 배지로 옮기고, 이어서 4 내지 5 시간 동안 진탕 하에 37 ℃, 180 rpm에서 배양하였다. OD600이 약 1.5에 도달했으면, IPTG를 0.4 mM의 최종 농도로 가하고, 상기 세균을 37 ℃에서 4 시간 동안 진탕 하에 유도하였다.
유도 후에, 원심분리를 8000 g에서 5 분간 수행하여 세균을 수거하고, 이어서 상기 세균을 빙욕에서 용해 용액에 1 g 세균 대 10 ㎖ 용해 용액(20 mM 트리스 완충제 pH 7.2, 300 mM NaCl)의 비로 재-현탁시켰다. 상기 세균을 초음파 분쇄기(소닉스, VCX750 유형 초음파 분쇄기)(조건: 작동 시간 15 분, 펄스 2s, 중단 기간 4s, 출력 55%)로 처리하였다. 상기 세균 용해물을 12000 rpm, 4 ℃에서 5 분간 원심분리시키고(이하 동일), 상기 세균을 초음파 처리에 의해 파괴시킨 후에 상등액 및 침전물(즉 봉입체)을 각각 수거하였다. 동일한 부피의 2% 트리톤-100을 상기 침전물의 세척에 사용하고, 생성 혼합물을 30 분 동안 진동 하에 두고, 원심분리시키고, 상등액은 버렸다. 상기 침전물을 30 분간 진동 하에서 완충제 I(20 mM 트리스-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA)에 재-현탁시키고, 원심분리시키고, 상등액은 버렸다. 이어서 상기 침전물을 진동 하에 37 ℃에서 30 분간 2M 유레아에 재-현탁시키고, 원심분리시키고, 상등액과 침전물을 수득하였다. 상기 상등액을 유지시키고; 상기 침전물을 동일한 부피의 4M 유레아에, 진동 하에 37 ℃에서 30 분 동안 재-현탁시키고, 12000 rpm, 4 ℃에서 15 분간 원심분리시켜 상등액과 침전물을 수득하였다. 상기 상등액(즉 4M 유레아-용해된 상등액)을 유지시키고; 상기 침전물을 동일한 부피의 8M 유레아에, 진동 하에 37 ℃에서 30 분 동안 재-현탁시키고, 원심분리시키고, 상기 상등액(즉 8M 유레아-용해된 상등액)을 유지시켰다.
상기 수득된 분획들을 SDS-PAGE(쿠마씨 브릴리언트 블루 염색을 가시화에 사용하였다, 이하 동일, 문헌[The Molecular Cloning Experiment Guide, 2nd edition]의 방법을 참조하시오)에 의해 분석하였다. 상기 결과는 상기 융합 단백질이 봉입체에서 발현되었으며(도 10A 및 10B 참조), CRM197-L-M2e, 389-L-M2e, M2e-L-CRM197 및 M2e-L-389는 주로 8M 유레아에 용해되었고, A-L-M2e 및 M2e-L-A는 주로 4M 유레아에 용해되었음을 보였다. A-L-M2e 또는 M2e-L-A를 함유하는 4M 유레아-용해된 상등액 또는 CRM197-L-M2e, 389-L-M2e, M2e-L-CRM197 또는 M2e-L-389를 함유하는 8M 유레아-용해된 상등액을 각각 PBS에 투석시켜 약 80%의 순도를 갖는 융합 단백질들을 수득하였다(도 10C 내지 10F 참조).
실시예 8: 실시예 6에서 제조된 융합 단백질의 성질 분석
웨스턴 블럿팅에 의한 항체와 융합 단백질과의 반응성의 측정
상기 융합 단백질과 인플루엔자 바이러스 M2e 단클론 항체 5D1 및 CRM197 단클론 항체 1E6(실험실에서 제조된 것)와의 반응성을 웨스턴 블럿팅에 의해 측정하였다. 상기 투석되고 재생된 샘플들을 SDS-PAGE 분리 후 블럿팅을 위해 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 옮기고; 5% 탈지 우유를 사용하여 상기 멤브레인을 2 시간 동안 차단시키고, 이어서 1:500으로 희석한 단클론 항체 5D1을 가하였다. 상기 반응을 1 시간 동안 수행하였다. 이어서 상기 멤브레인을 TNT(50 mmol/L 트리스·Cl(pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 0.05% 트윈 20)로 3 회, 매번 10 분씩 세척하였다. 이어서 염소 항-마우스 알칼리성 포스파타제(KPL 제품)를 가하였다. 상기 반응을 1 시간 동안 수행하고, 이어서 상기 멤브레인을 TNT로 3 회, 매번 10 분씩 세척하였다. NBT 및 BCIP(PROTOS 제품)를 가시화에 사용하였다. 상기 융합 단백질 및 인플루엔자 바이러스 M2e 단클론 항체 5D1(도 11A 내지 11D) 또는 CRM197 단클론 항체 IE6(도 11E 내지 11H)을 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 측정된 바와 같은 결과를 도 11에 도시하였다. 상기 결과는 시험된 융합 단백질들이 모두 인플루엔자 바이러스 M2e-특이성 단클론 항체 5D1 및 CRM197 특이성 단클론 항체 1E6과 현저한 반응성을 가짐을 보였다.
ELISA에 의한 상기 융합 단백질과 다양한 M2e 특이성 단클론 항체 및 CRM197 특이성 단클론 항체들과의 반응성의 측정
상기 융합 단백질 및 대조용 단백질 GST-M2e와 다양한 M2e 특이 항체 및 CRM197 특이성 단클론 항체 IE6(본 실험에 사용된 항체들은 종래 기술에서 공지되었거나 또는 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 실험실에서 제조되었다)과의 반응성을 간접적인 ELISA에 의해 측정하였다. 예를 들어, O19 항체는 종래 기술에서 공지된 인플루엔자에 대한 보호 항체이다(문헌[Fu et al., Virology, 2009, 385:218-226]을 참조하시오). 상기 투석되고 재생된 샘플을 1X PBS(1 ㎍/㎖)로 희석하고, 이어서 96-웰 미세플레이트(베이징 완타이 캄파니)에 100 ㎕/웰로 가하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 상기 코팅 용액을 버리고, 상기 플레이트를 PBST(PBS + 0.05% 트윈-20)로 1 회 세척하고, 이어서 차단 용액(PBS 중의, 2% 젤라틴, 5‰ 카제인, 1 ‰ 프로클린300)을 180 ㎕/웰로 가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 상기 검출이 수행되었으면 상기 차단 용액을 버리고, 일정한 비로 희석된 상기 항-M2e 항체 또는 CRM197 항체(0.002 ㎎/㎖을 2 배 구배 희석을 위한 초기 농도로 사용하였다)를 100 ㎕/웰로 가하였다. 상기 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 플레이트를 PBST로 5 회 세척하고, HRP-표지된 염소 항 마우스(KPL 제품)(1:5000)를 100 ㎕/웰로 가하고 37 ℃에서 30 분간 배양하였다. 상기 플레이트를 PBST로 5 회 세척하고, 이어서 HRP 기질(베이징 완타이 캄파니)을 100 ㎕/웰로 가하고, 37 ℃에서 15 분 동안 배양하였다. 2M 황산을 50 ㎕/웰로 가하여 상기 반응을 중지시키고, 이어서 미세플레이트 판독기(선라이즈 타입, 테칸 캄파니 제품)를 사용하여 OD450/620 값을 판독하였다. 상기 융합 단백질을 상기 항체들과 함께 사용하는 상기 ELISA의 결과를 도 12A 및 12B에 도시하였다. 상기 결과는 M2e 단백질 단독에 비해, M2e 단백질과 다양한 항-M2e 특이성 단클론 항체들과의 반응성이, CRM197 또는 그의 단편과의 융합 후에 유지되거나 증대됨을 보였다.
융합 단백질들의 침강 속도(SV)의 분석
본 실험에 사용된 기구는 US 벡크만 XL-A 분석 초원심분리기였으며, 여기에는 광학 검출 시스템 및 An-50Ti 및 An-60Ti 회전기가 구비되었다. 상기 침강 속도(SV) 방법(c(s) 연산, 문헌[P. Schuck et al., Biophys J 78: 1606-1619(2000)]을 참조하시오)을 사용하여 융합 단백질들의 침강 계수를 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 13A 내지 13F에 도시하였다. 상기 결과는 실시예 6에서 제조된 융합 단백질들 가운데, A-L-M2e 및 M2e-L-A가 주로 단량체 및 사량체의 형태로 존재하고; 389-L-M2e는 주로 이량체 및 중합체의 형태로 존재하며; M2e-L-389는 주로 단량체 및 중합체의 형태로 존재하고; CRM197-L-M2e는 주로 이량체 및 중합체의 형태로 존재하며; M2e-L-CRM197은 주로 단량체 및 중합체의 형태로 존재함을 보였다.
실시예 9. 실시예 6에서 제조된 융합 단백질들의 면역원성의 분석
본 실험에 사용된 마우스는 6주된 암컷 BALB/C 마우스였다. 알루미늄 항원보강제를 사용함으로써, 마우스를, 각각 실시예 6에서 제조되고 PBS로 재생시킨 융합 단백질, 및 대조용 단백질 GST-M2e의 복강내 주사에 의해 면역시켰다. 상기 주사 부피는 1 ㎖이었으며, 2 개의 용량 그룹(5 ㎍-용량 그룹 또는 0.5 ㎍-용량 그룹)을 사용하였다. 1차 면역을 0 주째에 수행하였으며, 추가 면역을 2 주 및 4 주째에 수행하였다.
GST-M2e를 사용하여 플레이트를 코팅하고, 상기 융합 단백질 및 대조용 단백질에 의해 유도된 바와 같은 혈청 중 항체 역가를 상술한 바와 같이 유사한 간접적인 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 면역 후 4 개월 내 혈청 항체 역가의 검출 결과를 도 14A 및 14B에 도시하였다. 상기 결과들은 2차 추가 면역 후에, 상기 제조된 융합 단백질들의 면역원성이 항원 단백질(GST-M2e) 단독보다 현저하게 더 높았으며, 이는 본 발명의 CRM197 또는 그의 단편(상기 융합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 배치되는 것에 관계없이)이 상기와 함께 융합된 항원 단백질의 면역원성을 현저하게 증대시켰고, 상기를 분자내 항원보강제로서 사용할 수 있음을 가리킨다.
본 발명의 특정한 실시태양들을 상세히 개시하였지만, 당해 분야의 숙련가들은 명세서에 개시된 교시들에 따라, 다양한 변형 및 변화를 일반적으로 개시된 바와 같은 본 발명의 진의 또는 범위로부터 이탈됨 없이 수행할 수 있고, 상기와 같은 변형 및 변화가 본 발명의 범위 내에 있음을 알 것이다. 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위 및 그의 임의의 등가물에 의해 제공된다.
<110> XIAMEN UNIVERSITY <120> Fusion Protein Comprising Diphtheria Toxin Non-Toxic Mutant CRM197 or Fragment Thereof <130> IEC120063PCT <150> CN 201110145419.2 <151> 2011-06-01 <160> 56 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1605 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM197 <400> 1 ggcgctgatg atgttgttga ttcttctaaa tcttttgtga tggaaaactt ttcttcgtac 60 cacgggacta aacctggtta tgtagattcc attcaaaaag gtatacaaaa gccaaaatct 120 ggtacacaag gaaattatga cgatgattgg aaagagtttt atagtaccga caataaatac 180 gacgctgcgg gatactctgt agataatgaa aacccgctct ctggaaaagc tggaggcgtg 240 gtcaaagtga cgtatccagg actgacgaag gttctcgcac taaaagtgga taatgccgaa 300 actattaaga aagagttagg tttaagtctc actgaaccgt tgatggagca agtcggaacg 360 gaagagttta tcaaaaggtt cggtgatggt gcttcgcgtg tagtgctcag ccttcccttc 420 gctgagggga gttctagcgt tgaatatatt aataactggg aacaggcgaa agcgttaagc 480 gtagaacttg agattaattt tgaaacccgt ggaaaacgtg gccaagatgc gatgtatgag 540 tatatggctc aagcctgtgc aggaaatcgt gtcaggcgat cagtaggtag ctcattgtca 600 tgcataaatc ttgattggga tgtcataagg gataaaacta agacaaagat agagtctttg 660 aaagagcatg gccctatcaa aaataaaatg agcgaaagtc ccaataaaac agtatctgag 720 gaaaaagcta aacaatacct agaagaattt catcaaacgg cattagagca tcctgaattg 780 tcagaactta aaaccgttac tgggaccaat cctgtattcg ctggggctaa ctatgcggcg 840 tgggcagtaa acgttgcgca agttatcgat agcgaaacag ctgataattt ggaaaagaca 900 actgctgctc tttcgatact tcctggtatc ggtagcgtaa tgggcattgc agacggtgcc 960 gttcaccaca atacagaaga gatagtggca caatcaatag ctttatcgtc tttaatggtt 1020 gctcaagcta ttccattggt aggagagcta gttgatattg gtttcgctgc atataatttt 1080 gtagagagta ttatcaattt atttcaagta gttcataatt cgtataatcg tcccgcgtat 1140 tctccggggc ataaaacgca accatttctt catgacgggt atgctgtcag ttggaacact 1200 gttgaagatt cgataatccg aactggtttt caaggggaga gtgggcacga cataaaaatt 1260 actgctgaaa ataccccgct tccaatcgcg ggtgtcctac taccgactat tcctggaaag 1320 ctggacgtta ataagtccaa gactcatatt tccgtaaatg gtcggaaaat aaggatgcgt 1380 tgcagagcta tagacggtga tgtaactttt tgtcgcccta aatctcctgt ttatgttggt 1440 aatggtgtgc atgcgaatct tcacgtggca tttcacagaa gcagctcgga gaaaattcat 1500 tctaatgaaa tttcgtcgga ttccataggc gttcttgggt accagaaaac agtagatcac 1560 accaaggtta attctaagct atcgctattt tttgaaatca aaagc 1605 <210> 2 <211> 535 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM197 <400> 2 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg 180 185 190 Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val 195 200 205 Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly 210 215 220 Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu 225 230 235 240 Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu 245 250 255 His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val 260 265 270 Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val 275 280 285 Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu 290 295 300 Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala 305 310 315 320 Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser 325 330 335 Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp 340 345 350 Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe 355 360 365 Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His 370 375 380 Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr 385 390 395 400 Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His 405 410 415 Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val 420 425 430 Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr 435 440 445 His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile 450 455 460 Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly 465 470 475 480 Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser 485 490 495 Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu 500 505 510 Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser 515 520 525 Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser 530 535 <210> 3 <211> 2292 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM197-L-E2 <400> 3 atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60 taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120 tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagagt tttatagtac cgacaataaa 180 tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240 gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300 gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360 acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420 ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480 agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540 gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600 tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct 660 ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct 720 gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa 780 ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg 840 gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag 900 acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt 960 gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg 1020 gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat 1080 tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg 1140 tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt cttcatgacg ggtatgctgt cagttggaac 1200 actgttgaag attcgataat ccgaactggt tttcaagggg agagtgggca cgacataaaa 1260 attactgctg aaaatacccc gcttccaatc gcgggtgtcc tactaccgac tattcctgga 1320 aagctggacg ttaataagtc caagactcat atttccgtaa atggtcggaa aataaggatg 1380 cgttgcagag ctatagacgg tgatgtaact ttttgtcgcc ctaaatctcc tgtttatgtt 1440 ggtaatggtg tgcatgcgaa tcttcacgtg gcatttcaca gaagcagctc ggagaaaatt 1500 cattctaatg aaatttcgtc ggattccata ggcgttcttg ggtaccagaa aacagtagat 1560 cacaccaagg ttaattctaa gctatcgcta ttttttgaaa tcaaaagcgg tggcggtggc 1620 agcggtggcg gtggcagcgg tggcggtgga tcccagctgt tctactctcg tcccgtcgtc 1680 tcagccaatg gcgagccgac tgttaagctt tatacatctg tagagaatgc tcagcaggat 1740 aagggtattg caatcccgca tgacatcgac ctcggggagt ctcgtgtagt tattcaggat 1800 tatgacaacc aacatgagca ggaccgaccg acaccttccc cagccccatc gcgccctttt 1860 tctgtcctcc gagctaatga tgtgctttgg ctttctctca ccgctgccga gtatgaccag 1920 tccacttacg gctcttcgac cggcccagtc tatgtctctg actctgtgac cttggttaat 1980 gttgcgaccg gcgcgcaggc cgttgcccgg tcactcgact ggaccaaggt cacacttgat 2040 ggtcgccccc tttccaccat ccagcagcat tcaaagacct tctttgtcct gccgctccgc 2100 ggtaagctct ccttttggga ggcaggtact actaaagccg ggtaccctta taattataac 2160 accactgcta gtgaccaact gctcgttgag aatgccgctg ggcatcgggt tgctatttcc 2220 acttacacca ctagcctggg tgctggcccc gtctctattt ccgcggttgc tgttttagcc 2280 ccccctccgc gc 2292 <210> 4 <211> 764 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM197-L-E2 <400> 4 Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu 1 5 10 15 Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile 20 25 30 Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp 35 40 45 Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys 85 90 95 Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe 115 120 125 Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val 180 185 190 Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp 195 200 205 Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His 210 215 220 Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser 225 230 235 240 Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu 245 250 255 Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro 260 265 270 Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln 275 280 285 Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala 290 295 300 Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly 305 310 315 320 Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu 325 330 335 Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val 340 345 350 Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu 355 360 365 Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly 370 375 380 His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn 385 390 395 400 Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly 405 410 415 His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly 420 425 430 Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys 435 440 445 Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala 450 455 460 Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val 465 470 475 480 Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser 485 490 495 Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val 500 505 510 Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu 515 520 525 Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 530 535 540 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val 545 550 555 560 Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn 565 570 575 Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly 580 585 590 Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp 595 600 605 Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg 610 615 620 Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln 625 630 635 640 Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val 645 650 655 Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu 660 665 670 Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln 675 680 685 Gln His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser 690 695 700 Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn 705 710 715 720 Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg 725 730 735 Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser 740 745 750 Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg 755 760 <210> 5 <211> 2109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM197-L-E2s <400> 5 atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60 taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120 tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagagt tttatagtac cgacaataaa 180 tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240 gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300 gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360 acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420 ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480 agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540 gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600 tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct 660 ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct 720 gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa 780 ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg 840 gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag 900 acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt 960 gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg 1020 gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat 1080 tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg 1140 tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt cttcatgacg ggtatgctgt cagttggaac 1200 actgttgaag attcgataat ccgaactggt tttcaagggg agagtgggca cgacataaaa 1260 attactgctg aaaatacccc gcttccaatc gcgggtgtcc tactaccgac tattcctgga 1320 aagctggacg ttaataagtc caagactcat atttccgtaa atggtcggaa aataaggatg 1380 cgttgcagag ctatagacgg tgatgtaact ttttgtcgcc ctaaatctcc tgtttatgtt 1440 ggtaatggtg tgcatgcgaa tcttcacgtg gcatttcaca gaagcagctc ggagaaaatt 1500 cattctaatg aaatttcgtc ggattccata ggcgttcttg ggtaccagaa aacagtagat 1560 cacaccaagg ttaattctaa gctatcgcta ttttttgaaa tcaaaagcgg tggcggtggc 1620 agcggtggcg gtggcagcgg tggcggtgga tcctccccag ccccatcgcg ccctttttct 1680 gtcctccgag ctaatgatgt gctttggctt tctctcaccg ctgccgagta tgaccagtcc 1740 acttacggct cttcgaccgg cccagtctat gtctctgact ctgtgacctt ggttaatgtt 1800 gcgaccagcg cgcaggccgt tgcccggtca ctcgactgga ccaaggtcac acttgatggt 1860 cgcccccttt ccaccatcca gcagcattca aagaccttct ttgtcctgcc gctccgcggt 1920 aagctctcct tttgggaggc aggtactact aaagccgggt acccttataa ttataacacc 1980 actgctagtg accaactgct cgttgagaat gccgctgggc atcgggttgc tatttccact 2040 tacaccacta gcctgggtgc tggccccgtc tctatttccg cggttgctgt tttagccccc 2100 cctccgcgc 2109 <210> 6 <211> 703 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM197-L-E2s <400> 6 Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu 1 5 10 15 Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile 20 25 30 Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp 35 40 45 Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys 85 90 95 Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe 115 120 125 Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val 180 185 190 Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp 195 200 205 Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His 210 215 220 Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser 225 230 235 240 Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu 245 250 255 Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro 260 265 270 Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln 275 280 285 Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala 290 295 300 Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly 305 310 315 320 Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu 325 330 335 Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val 340 345 350 Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu 355 360 365 Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly 370 375 380 His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn 385 390 395 400 Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly 405 410 415 His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly 420 425 430 Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys 435 440 445 Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala 450 455 460 Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val 465 470 475 480 Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser 485 490 495 Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val 500 505 510 Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu 515 520 525 Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 530 535 540 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser 545 550 555 560 Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu 565 570 575 Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser 580 585 590 Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Ser Ala Gln Ala Val Ala 595 600 605 Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser 610 615 620 Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly 625 630 635 640 Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr 645 650 655 Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala 660 665 670 Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly 675 680 685 Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg 690 695 700 <210> 7 <211> 1854 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 389-L-E2 <400> 7 atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60 taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120 tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagagt tttatagtac cgacaataaa 180 tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240 gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300 gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360 acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420 ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480 agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540 gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600 tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct 660 ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct 720 gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa 780 ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg 840 gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag 900 acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt 960 gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg 1020 gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat 1080 tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg 1140 tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt ggtggcggtg gcagcggtgg cggtggcagc 1200 ggtggcggtg gatcccagct gttctactct cgtcccgtcg tctcagccaa tggcgagccg 1260 actgttaagc tttatacatc tgtagagaat gctcagcagg ataagggtat tgcaatcccg 1320 catgacatcg acctcgggga gtctcgtgta gttattcagg attatgacaa ccaacatgag 1380 caggaccgac cgacaccttc cccagcccca tcgcgccctt tttctgtcct ccgagctaat 1440 gatgtgcttt ggctttctct caccgctgcc gagtatgacc agtccactta cggctcttcg 1500 accggcccag tctatgtctc tgactctgtg accttggtta atgttgcgac cggcgcgcag 1560 gccgttgccc ggtcactcga ctggaccaag gtcacacttg atggtcgccc cctttccacc 1620 atccagcagc attcaaagac cttctttgtc ctgccgctcc gcggtaagct ctccttttgg 1680 gaggcaggta ctactaaagc cgggtaccct tataattata acaccactgc tagtgaccaa 1740 ctgctcgttg agaatgccgc tgggcatcgg gttgctattt ccacttacac cactagcctg 1800 ggtgctggcc ccgtctctat ttccgcggtt gctgttttag ccccccctcc gcgc 1854 <210> 8 <211> 618 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 389-L-E2 <400> 8 Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu 1 5 10 15 Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile 20 25 30 Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp 35 40 45 Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys 85 90 95 Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe 115 120 125 Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val 180 185 190 Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp 195 200 205 Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His 210 215 220 Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser 225 230 235 240 Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu 245 250 255 Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro 260 265 270 Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln 275 280 285 Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala 290 295 300 Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly 305 310 315 320 Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu 325 330 335 Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val 340 345 350 Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu 355 360 365 Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly 370 375 380 His Lys Thr Gln Pro Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser Ala 405 410 415 Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln 420 425 430 Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu Ser 435 440 445 Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp Arg Pro 450 455 460 Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn 465 470 475 480 Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr 485 490 495 Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu 500 505 510 Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp 515 520 525 Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln His 530 535 540 Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp 545 550 555 560 Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr 565 570 575 Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala 580 585 590 Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser 595 600 605 Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg 610 615 <210> 9 <211> 1671 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 389-L-E2s <400> 9 atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60 taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120 tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagagt tttatagtac cgacaataaa 180 tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240 gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300 gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360 acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420 ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480 agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540 gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600 tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct 660 ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct 720 gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa 780 ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg 840 gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag 900 acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt 960 gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg 1020 gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat 1080 tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg 1140 tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt ggtggcggtg gcagcggtgg cggtggcagc 1200 ggtggcggtg gatcctcccc agccccatcg cgcccttttt ctgtcctccg agctaatgat 1260 gtgctttggc tttctctcac cgctgccgag tatgaccagt ccacttacgg ctcttcgacc 1320 ggcccagtct atgtctctga ctctgtgacc ttggttaatg ttgcgaccag cgcgcaggcc 1380 gttgcccggt cactcgactg gaccaaggtc acacttgatg gtcgccccct ttccaccatc 1440 cagcagcatt caaagacctt ctttgtcctg ccgctccgcg gtaagctctc cttttgggag 1500 gcaggtacta ctaaagccgg gtacccttat aattataaca ccactgctag tgaccaactg 1560 ctcgttgaga atgccgctgg gcatcgggtt gctatttcca cttacaccac tagcctgggt 1620 gctggccccg tctctatttc cgcggttgct gttttagccc cccctccgcg c 1671 <210> 10 <211> 557 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 389-L-E2s <400> 10 Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu 1 5 10 15 Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile 20 25 30 Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp 35 40 45 Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys 85 90 95 Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe 115 120 125 Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val 180 185 190 Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp 195 200 205 Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His 210 215 220 Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser 225 230 235 240 Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu 245 250 255 Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro 260 265 270 Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln 275 280 285 Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala 290 295 300 Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly 305 310 315 320 Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu 325 330 335 Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val 340 345 350 Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu 355 360 365 Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly 370 375 380 His Lys Thr Gln Pro Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu 405 410 415 Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp 420 425 430 Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser 435 440 445 Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Ser Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser 450 455 460 Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile 465 470 475 480 Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu 485 490 495 Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr 500 505 510 Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His 515 520 525 Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val 530 535 540 Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg 545 550 555 <210> 11 <211> 1257 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-L-E2 <400> 11 atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60 taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120 tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagagt tttatagtac cgacaataaa 180 tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240 gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300 gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360 acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420 ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480 agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540 gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtggtggcg gtggcagcgg tggcggtggc 600 agcggtggcg gtggatccca gctgttctac tctcgtcccg tcgtctcagc caatggcgag 660 ccgactgtta agctttatac atctgtagag aatgctcagc aggataaggg tattgcaatc 720 ccgcatgaca tcgacctcgg ggagtctcgt gtagttattc aggattatga caaccaacat 780 gagcaggacc gaccgacacc ttccccagcc ccatcgcgcc ctttttctgt cctccgagct 840 aatgatgtgc tttggctttc tctcaccgct gccgagtatg accagtccac ttacggctct 900 tcgaccggcc cagtctatgt ctctgactct gtgaccttgg ttaatgttgc gaccggcgcg 960 caggccgttg cccggtcact cgactggacc aaggtcacac ttgatggtcg ccccctttcc 1020 accatccagc agcattcaaa gaccttcttt gtcctgccgc tccgcggtaa gctctccttt 1080 tgggaggcag gtactactaa agccgggtac ccttataatt ataacaccac tgctagtgac 1140 caactgctcg ttgagaatgc cgctgggcat cgggttgcta tttccactta caccactagc 1200 ctgggtgctg gccccgtctc tatttccgcg gttgctgttt tagccccccc tccgcgc 1257 <210> 12 <211> 419 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A-L-E2 <400> 12 Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu 1 5 10 15 Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile 20 25 30 Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp 35 40 45 Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys 85 90 95 Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe 115 120 125 Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Gly 180 185 190 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu 195 200 205 Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys 210 215 220 Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile 225 230 235 240 Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr 245 250 255 Asp Asn Gln His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser 260 265 270 Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu 275 280 285 Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro 290 295 300 Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala 305 310 315 320 Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly 325 330 335 Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu 340 345 350 Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala 355 360 365 Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val 370 375 380 Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro 405 410 415 Pro Pro Arg <210> 13 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-L-E2s <400> 13 atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60 taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120 tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagagt tttatagtac cgacaataaa 180 tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240 gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300 gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360 acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420 ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480 agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540 gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtggtggcg gtggcagcgg tggcggtggc 600 agcggtggcg gtggatcctc cccagcccca tcgcgccctt tttctgtcct ccgagctaat 660 gatgtgcttt ggctttctct caccgctgcc gagtatgacc agtccactta cggctcttcg 720 accggcccag tctatgtctc tgactctgtg accttggtta atgttgcgac cagcgcgcag 780 gccgttgccc ggtcactcga ctggaccaag gtcacacttg atggtcgccc cctttccacc 840 atccagcagc attcaaagac cttctttgtc ctgccgctcc gcggtaagct ctccttttgg 900 gaggcaggta ctactaaagc cgggtaccct tataattata acaccactgc tagtgaccaa 960 ctgctcgttg agaatgccgc tgggcatcgg gttgctattt ccacttacac cactagcctg 1020 ggtgctggcc ccgtctctat ttccgcggtt gctgttttag ccccccctcc gcgc 1074 <210> 14 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A-L-E2s <400> 14 Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu 1 5 10 15 Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile 20 25 30 Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp 35 40 45 Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys 85 90 95 Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe 115 120 125 Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Gly 180 185 190 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro 195 200 205 Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp 210 215 220 Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser 225 230 235 240 Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala 245 250 255 Thr Ser Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr 260 265 270 Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe 275 280 285 Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr 290 295 300 Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln 305 310 315 320 Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr 325 330 335 Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val 340 345 350 Leu Ala Pro Pro Pro Arg 355 <210> 15 <211> 1626 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 389-E2s <400> 15 atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60 taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120 tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagagt tttatagtac cgacaataaa 180 tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240 gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300 gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360 acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420 ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480 agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540 gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600 tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct 660 ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct 720 gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa 780 ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg 840 gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag 900 acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt 960 gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg 1020 gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat 1080 tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg 1140 tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt tccccagccc catcgcgccc tttttctgtc 1200 ctccgagcta atgatgtgct ttggctttct ctcaccgctg ccgagtatga ccagtccact 1260 tacggctctt cgaccggccc agtctatgtc tctgactctg tgaccttggt taatgttgcg 1320 accagcgcgc aggccgttgc ccggtcactc gactggacca aggtcacact tgatggtcgc 1380 cccctttcca ccatccagca gcattcaaag accttctttg tcctgccgct ccgcggtaag 1440 ctctcctttt gggaggcagg tactactaaa gccgggtacc cttataatta taacaccact 1500 gctagtgacc aactgctcgt tgagaatgcc gctgggcatc gggttgctat ttccacttac 1560 accactagcc tgggtgctgg ccccgtctct atttccgcgg ttgctgtttt agccccccct 1620 ccgcgc 1626 <210> 16 <211> 542 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 389-E2s <400> 16 Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu 1 5 10 15 Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile 20 25 30 Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp 35 40 45 Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys 85 90 95 Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe 115 120 125 Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val 180 185 190 Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp 195 200 205 Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His 210 215 220 Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser 225 230 235 240 Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu 245 250 255 Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro 260 265 270 Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln 275 280 285 Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala 290 295 300 Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly 305 310 315 320 Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu 325 330 335 Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val 340 345 350 Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu 355 360 365 Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly 370 375 380 His Lys Thr Gln Pro Phe Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val 385 390 395 400 Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr 405 410 415 Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp 420 425 430 Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Ser Ala Gln Ala Val Ala Arg 435 440 445 Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr 450 455 460 Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys 465 470 475 480 Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn 485 490 495 Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly 500 505 510 His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro 515 520 525 Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg 530 535 540 <210> 17 <211> 1029 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-E2s <400> 17 atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60 taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120 tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagagt tttatagtac cgacaataaa 180 tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240 gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300 gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360 acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420 ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480 agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540 gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgttccccag ccccatcgcg ccctttttct 600 gtcctccgag ctaatgatgt gctttggctt tctctcaccg ctgccgagta tgaccagtcc 660 acttacggct cttcgaccgg cccagtctat gtctctgact ctgtgacctt ggttaatgtt 720 gcgaccagcg cgcaggccgt tgcccggtca ctcgactgga ccaaggtcac acttgatggt 780 cgcccccttt ccaccatcca gcagcattca aagaccttct ttgtcctgcc gctccgcggt 840 aagctctcct tttgggaggc aggtactact aaagccgggt acccttataa ttataacacc 900 actgctagtg accaactgct cgttgagaat gccgctgggc atcgggttgc tatttccact 960 tacaccacta gcctgggtgc tggccccgtc tctatttccg cggttgctgt tttagccccc 1020 cctccgcgc 1029 <210> 18 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A-E2s <400> 18 Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu 1 5 10 15 Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile 20 25 30 Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp 35 40 45 Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys 85 90 95 Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe 115 120 125 Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Ser 180 185 190 Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu 195 200 205 Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser 210 215 220 Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val 225 230 235 240 Ala Thr Ser Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val 245 250 255 Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr 260 265 270 Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly 275 280 285 Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp 290 295 300 Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala 325 330 335 Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg 340 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 catatgggcg ctgatgatgt tgttgattct tct 33 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gaattcccca ctacctttca gcttttg 27 <210> 21 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ggatccaccg ccaccgctgc caccgccacc gctgccaccg ccaccgcttt tgat 54 <210> 22 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ggatccaccg ccaccgctgc caccgccacc gctgccaccg ccaccaaatg gttgc 55 <210> 23 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ggatccaccg ccaccgctgc caccgccacc gctgccaccg ccaccacgat ttcctgcac 59 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ggatcccagc tgttctactc tcgtc 25 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ggatcctccc cagccccatc gcgc 24 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gaattcctag cgcggagggg gggct 25 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gatggggctg gggaaaatgg ttg 23 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gatggggctg gggaacgatt tcctgcac 28 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 cgcaaccatt ttccccagcc c 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gaaatcgttc cccagcccca t 21 <210> 31 <211> 660 <212> PRT <213> Hepatitis E virus <400> 31 Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met 1 5 10 15 Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp Arg Val Asp Ser 35 40 45 Gln Pro Phe Ala Ile Pro Tyr Ile His Pro Thr Asn Pro Phe Ala Pro 50 55 60 Asp Val Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Arg Val Arg Gln Pro Ala 65 70 75 80 Arg Pro Leu Gly Ser Ala Trp Arg Asp Gln Ala Gln Arg Pro Ala Val 85 90 95 Ala Ser Arg Arg Arg Pro Thr Thr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Thr Ala 100 105 110 Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro Val Pro Asp Val Asp Ser Arg 115 120 125 Gly Ala Ile Leu Arg Arg Gln Tyr Asn Leu Ser Thr Ser Pro Leu Thr 130 135 140 Ser Ser Val Ala Thr Gly Thr Asn Leu Val Leu Tyr Ala Ala Pro Leu 145 150 155 160 Ser Pro Leu Leu Pro Leu Gln Asp Gly Thr Asn Thr His Ile Met Ala 165 170 175 Thr Glu Ala Ser Asn Tyr Ala Gln Tyr Arg Val Ala Arg Ala Thr Ile 180 185 190 Arg Tyr Arg Pro Leu Val Pro Asn Ala Val Gly Gly Tyr Ala Ile Ser 195 200 205 Ile Ser Phe Trp Pro Gln Thr Thr Thr Thr Pro Thr Ser Val Asp Met 210 215 220 Asn Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val Gln Pro Gly Ile 225 230 235 240 Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His Tyr Arg Asn Gln 245 250 255 Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr Ser Gly Val Ala Glu Glu Glu Ala Thr 260 265 270 Ser Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro Val Asn Ser Tyr 275 280 285 Thr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu Asp Phe Ala Leu 290 295 300 Glu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn Thr Asn Thr Arg Val 305 310 315 320 Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ala Arg His Arg Leu Arg Arg Gly Ala Asp 325 330 335 Gly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala Ala Thr Arg Phe Met Lys Asp 340 345 350 Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn Gly Val Gly Glu Ile Gly Arg Gly Ile 355 360 365 Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro 370 375 380 Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro 385 390 395 400 Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val 405 410 415 Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp 420 425 430 Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu 435 440 445 Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val 450 455 460 Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr 465 470 475 480 Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp 485 490 495 Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg 500 505 510 Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr 515 520 525 Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys 530 535 540 Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn 545 550 555 560 Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly 565 570 575 His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro 580 585 590 Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His Ser Ala Leu Ala 595 600 605 Leu Leu Glu Asp Thr Met Asp Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr Phe Asp 610 615 620 Asp Phe Cys Pro Glu Cys Arg Pro Leu Gly Leu Gln Gly Cys Ala Phe 625 630 635 640 Gln Ser Thr Val Ala Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Val Gly Lys 645 650 655 Thr Arg Glu Leu 660 <210> 32 <211> 97 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 32 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Gly Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Val Ala Ala Ser Ile 20 25 30 Ile Gly Ile Val His Leu Ile Leu Trp Ile Ile Asp Arg Leu Phe Ser 35 40 45 Lys Ser Ile Tyr Arg Ile Phe Lys His Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser 50 55 60 Thr Glu Gly Val Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Gln Asn Ala Val Asp Ala Asp Asp Asp His Phe Val Ser Ile Glu Leu 85 90 95 Glu <210> 33 <211> 1713 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM197-L-M2e <400> 33 atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60 taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120 tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagagt tttatagtac cgacaataaa 180 tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240 gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300 gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360 acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420 ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480 agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540 gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600 tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct 660 ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct 720 gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa 780 ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg 840 gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag 900 acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt 960 gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg 1020 gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat 1080 tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg 1140 tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt cttcatgacg ggtatgctgt cagttggaac 1200 actgttgaag attcgataat ccgaactggt tttcaagggg agagtgggca cgacataaaa 1260 attactgctg aaaatacccc gcttccaatc gcgggtgtcc tactaccgac tattcctgga 1320 aagctggacg ttaataagtc caagactcat atttccgtaa atggtcggaa aataaggatg 1380 cgttgcagag ctatagacgg tgatgtaact ttttgtcgcc ctaaatctcc tgtttatgtt 1440 ggtaatggtg tgcatgcgaa tcttcacgtg gcatttcaca gaagcagctc ggagaaaatt 1500 cattctaatg aaatttcgtc ggattccata ggcgttcttg ggtaccagaa aacagtagat 1560 cacaccaagg ttaattctaa gctatcgcta ttttttgaaa tcaaaagcgg tggcggtggc 1620 agcggtggcg gtggcagcat gagtcttcta accgaggtcg aaacgcctat cagaaacgaa 1680 tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat taa 1713 <210> 34 <211> 570 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRM197-L-M2e <400> 34 Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu 1 5 10 15 Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile 20 25 30 Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp 35 40 45 Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys 85 90 95 Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe 115 120 125 Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val 180 185 190 Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp 195 200 205 Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His 210 215 220 Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser 225 230 235 240 Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu 245 250 255 Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro 260 265 270 Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln 275 280 285 Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala 290 295 300 Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly 305 310 315 320 Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu 325 330 335 Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val 340 345 350 Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu 355 360 365 Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly 370 375 380 His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn 385 390 395 400 Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly 405 410 415 His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly 420 425 430 Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys 435 440 445 Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala 450 455 460 Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val 465 470 475 480 Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser 485 490 495 Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val 500 505 510 Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu 515 520 525 Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 530 535 540 Gly Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu 545 550 555 560 Trp Gly Cys Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp 565 570 <210> 35 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 389-L-M2e <400> 35 atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60 taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120 tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagagt tttatagtac cgacaataaa 180 tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240 gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300 gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360 acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420 ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480 agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540 gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600 tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct 660 ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct 720 gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa 780 ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg 840 gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag 900 acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt 960 gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg 1020 gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat 1080 tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg 1140 tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt ggtggcggtg gcagcggtgg cggtggcagc 1200 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgcct atcagaaacg aatgggggtg cagatgcaac 1260 ggttcaagtg attaa 1275 <210> 36 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 389-L-M2e <400> 36 Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu 1 5 10 15 Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile 20 25 30 Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp 35 40 45 Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys 85 90 95 Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe 115 120 125 Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val 180 185 190 Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp 195 200 205 Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His 210 215 220 Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser 225 230 235 240 Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu 245 250 255 Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro 260 265 270 Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln 275 280 285 Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala 290 295 300 Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly 305 310 315 320 Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu 325 330 335 Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val 340 345 350 Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu 355 360 365 Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly 370 375 380 His Lys Thr Gln Pro Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 405 410 415 Cys Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp 420 <210> 37 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-L-M2e <400> 37 atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60 taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120 tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagagt tttatagtac cgacaataaa 180 tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240 gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300 gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360 acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420 ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480 agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540 gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtggtggcg gtggcagcgg tggcggtggc 600 agcatgagtc ttctaaccga ggtcgaaacg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc 660 aacggttcaa gtgattaa 678 <210> 38 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A-L-M2e <400> 38 Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu 1 5 10 15 Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile 20 25 30 Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp 35 40 45 Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly 65 70 75 80 Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys 85 90 95 Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe 115 120 125 Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Gly 180 185 190 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val 195 200 205 Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Gly Ser Ser 210 215 220 Asp 225 <210> 39 <211> 1713 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M2e-L-CRM197 <400> 39 atgatgagtc ttctaaccga ggtcgaaacg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc 60 aacggttcaa gtgatggtgg cggtggcagc ggtggcggtg gcagcggcgc tgatgatgtt 120 gttgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct 180 ggttatgtag attccattca aaaaggtata caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat 240 tatgacgatg attggaaaga gttttatagt accgacaata aatacgacgc tgcgggatac 300 tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat 360 ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa gtggataatg ccgaaactat taagaaagag 420 ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa 480 aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct 540 agcgttgaat atattaataa ctgggaacag gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt 600 aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc 660 tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta ggtagctcat tgtcatgcat aaatcttgat 720 tgggatgtca taagggataa aactaagaca aagatagagt ctttgaaaga gcatggccct 780 atcaaaaata aaatgagcga aagtcccaat aaaacagtat ctgaggaaaa agctaaacaa 840 tacctagaag aatttcatca aacggcatta gagcatcctg aattgtcaga acttaaaacc 900 gttactggga ccaatcctgt attcgctggg gctaactatg cggcgtgggc agtaaacgtt 960 gcgcaagtta tcgatagcga aacagctgat aatttggaaa agacaactgc tgctctttcg 1020 atacttcctg gtatcggtag cgtaatgggc attgcagacg gtgccgttca ccacaataca 1080 gaagagatag tggcacaatc aatagcttta tcgtctttaa tggttgctca agctattcca 1140 ttggtaggag agctagttga tattggtttc gctgcatata attttgtaga gagtattatc 1200 aatttatttc aagtagttca taattcgtat aatcgtcccg cgtattctcc ggggcataaa 1260 acgcaaccat ttcttcatga cgggtatgct gtcagttgga acactgttga agattcgata 1320 atccgaactg gttttcaagg ggagagtggg cacgacataa aaattactgc tgaaaatacc 1380 ccgcttccaa tcgcgggtgt cctactaccg actattcctg gaaagctgga cgttaataag 1440 tccaagactc atatttccgt aaatggtcgg aaaataagga tgcgttgcag agctatagac 1500 ggtgatgtaa ctttttgtcg ccctaaatct cctgtttatg ttggtaatgg tgtgcatgcg 1560 aatcttcacg tggcatttca cagaagcagc tcggagaaaa ttcattctaa tgaaatttcg 1620 tcggattcca taggcgttct tgggtaccag aaaacagtag atcacaccaa ggttaattct 1680 aagctatcgc tattttttga aatcaaaagc taa 1713 <210> 40 <211> 570 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M2e-L-CRM197 <400> 40 Met Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp 1 5 10 15 Gly Cys Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val 35 40 45 Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn 65 70 75 80 Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp 85 90 95 Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala 100 105 110 Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala 115 120 125 Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser 130 135 140 Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys 145 150 155 160 Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala 165 170 175 Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys 180 185 190 Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg 195 200 205 Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn 210 215 220 Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp 225 230 235 240 Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys 245 250 255 Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr 260 265 270 Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr 275 280 285 Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr 290 295 300 Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val 305 310 315 320 Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr 325 330 335 Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala 340 345 350 Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile 355 360 365 Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu 370 375 380 Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile 385 390 395 400 Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser 405 410 415 Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser 420 425 430 Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu 435 440 445 Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile 450 455 460 Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys 465 470 475 480 Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys 485 490 495 Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val 500 505 510 Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg 515 520 525 Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile 530 535 540 Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser 545 550 555 560 Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser 565 570 <210> 41 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M2e-L-389 <400> 41 atgatgagtc ttctaaccga ggtcgaaacg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc 60 aacggttcaa gtgatggtgg cggtggcagc ggtggcggtg gcagcggcgc tgatgatgtt 120 gttgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct 180 ggttatgtag attccattca aaaaggtata caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat 240 tatgacgatg attggaaaga gttttatagt accgacaata aatacgacgc tgcgggatac 300 tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat 360 ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa gtggataatg ccgaaactat taagaaagag 420 ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa 480 aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct 540 agcgttgaat atattaataa ctgggaacag gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt 600 aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc 660 tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta ggtagctcat tgtcatgcat aaatcttgat 720 tgggatgtca taagggataa aactaagaca aagatagagt ctttgaaaga gcatggccct 780 atcaaaaata aaatgagcga aagtcccaat aaaacagtat ctgaggaaaa agctaaacaa 840 tacctagaag aatttcatca aacggcatta gagcatcctg aattgtcaga acttaaaacc 900 gttactggga ccaatcctgt attcgctggg gctaactatg cggcgtgggc agtaaacgtt 960 gcgcaagtta tcgatagcga aacagctgat aatttggaaa agacaactgc tgctctttcg 1020 atacttcctg gtatcggtag cgtaatgggc attgcagacg gtgccgttca ccacaataca 1080 gaagagatag tggcacaatc aatagcttta tcgtctttaa tggttgctca agctattcca 1140 ttggtaggag agctagttga tattggtttc gctgcatata attttgtaga gagtattatc 1200 aatttatttc aagtagttca taattcgtat aatcgtcccg cgtattctcc ggggcataaa 1260 acgcaaccat tttaa 1275 <210> 42 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M2e-L-389 <400> 42 Met Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp 1 5 10 15 Gly Cys Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val 35 40 45 Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn 65 70 75 80 Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp 85 90 95 Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala 100 105 110 Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala 115 120 125 Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser 130 135 140 Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys 145 150 155 160 Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala 165 170 175 Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys 180 185 190 Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg 195 200 205 Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn 210 215 220 Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp 225 230 235 240 Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys 245 250 255 Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr 260 265 270 Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr 275 280 285 Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr 290 295 300 Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val 305 310 315 320 Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr 325 330 335 Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala 340 345 350 Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile 355 360 365 Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu 370 375 380 Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile 385 390 395 400 Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser 405 410 415 Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe 420 <210> 43 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M2e-L-A <400> 43 atgatgagtc ttctaaccga ggtcgaaacg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc 60 aacggttcaa gtgatggtgg cggtggcagc ggtggcggtg gcagcggcgc tgatgatgtt 120 gttgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct 180 ggttatgtag attccattca aaaaggtata caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat 240 tatgacgatg attggaaaga gttttatagt accgacaata aatacgacgc tgcgggatac 300 tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat 360 ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa gtggataatg ccgaaactat taagaaagag 420 ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa 480 aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct 540 agcgttgaat atattaataa ctgggaacag gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt 600 aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc 660 tgtgcaggaa atcgttaa 678 <210> 44 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M2e-L-A <400> 44 Met Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp 1 5 10 15 Gly Cys Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val 35 40 45 Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn 65 70 75 80 Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp 85 90 95 Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala 100 105 110 Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala 115 120 125 Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser 130 135 140 Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys 145 150 155 160 Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala 165 170 175 Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys 180 185 190 Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg 195 200 205 Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn 210 215 220 Arg 225 <210> 45 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 catatgggcg ctgatgatgt tgttgattct tctaaatctt ttgtgatgga a 51 <210> 46 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 ggatccgctg ccaccgccac cgctgccacc gccaccgctt ttgat 45 <210> 47 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 ggatccgctg ccaccgccac cgctgccacc gccaccaaat ggttg 45 <210> 48 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 ggatccgctg ccaccgccac cgctgccacc gccaccacga tttcc 45 <210> 49 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 ggatccatga gtcttctaac cgaggtcgaa acgcct 36 <210> 50 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gaattcttaa tcacttgaac cgttgcatct gcaccccca 39 <210> 51 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 catatgatga gtcttctaac cgaggtcgaa acgcct 36 <210> 52 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ggatccgctg ccaccgccac cgctgccacc gccaccatca cttga 45 <210> 53 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ggatccggcg ctgatgatgt tgttgattct tctaaatctt ttgtgatgga a 51 <210> 54 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gaattctaag cttttgattt caaaaaatag cgatagctta ga 42 <210> 55 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gaattctaaa aatggttgcg ttttatgccc cggagaatac gc 42 <210> 56 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gaattctaaa cgatttcctg cacaggcttg agccatatac tc 42

Claims (23)

  1. CRM197 단편 및 표적 단백질을 포함하는 융합 단백질로, 상기 CRM197 단편이 상기 표적 단백질의 면역원성을 증대시키며,
    상기 CRM197의 단편이 서열번호 2의 aa 1-190 또는 aa 1-389로 이루어진 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 표적 단백질이 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편인 융합 단백질.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 HEV 캡시드 단백질의 면역원성 단편이 HEV 캡시드 단백질의 aa 368-606인 HEV-239, HEV 캡시드 단백질의 aa 394-606인 E2 또는 HEV 캡시드 단백질의 aa 455-606인 E2s를 포함하는 융합 단백질.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 표적 단백질이 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편인 융합 단백질.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 M2 단백질의 면역원성 단편이 M2 단백질의 aa 1-24인 M2e를 포함하는 융합 단백질.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 융합 단백질에서, 상기 CRM197 단편은 상기 표적 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 링커를 통해 결합 또는 비결합되는 융합 단백질.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 상기 CRM197 단편, 및 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편을 포함할 수 있고, 이들은 링커를 통해 함께 결합 또는 비결합되는 융합 단백질.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호 8, 10, 12, 14, 16 또는 18에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 CRM197 단편, 및 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편을 포함할 수 있고, 이들은 링커를 통해 함께 결합 또는 비결합되는 융합 단백질.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호 36, 38, 42, 또는 44에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중에서 선택된 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제 11 항의 폴리뉴클레오타이드을 포함하는 벡터.
  13. 제 11 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  14. 제 12 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포
  15. 제 1 항 내지 제 10 항 중에서 선택된 어느 한 항의 융합 단백질에, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  16. 표적 단백질에 의해 예방되거나 치료될 수 있는 질병의 예방 또는 치료를 위한 제 1 항의 융합 단백질.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 CRM197 단편 및 HEV 캡시드 단백질 또는 그의 면역원성 단편을 포함하고 HEV 감염 및 E형 간염과 같이 HEV 감염과 관련된 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 융합 단백질.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 HEV 감염과 관련된 질병은 E형 감염인 융합 단백질.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 CRM197 단편 및 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편을 포함하고,
    인플루엔자 바이러스 감염 및 인플루엔자와 같은 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 융합 단백질.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 질병은 인플루엔자인 융합 단백질.
  21. 표적 단백질의 면역원성을 증대시키기 위해서, 제 1 항에 정의된 바와 같은 CRM197 단편 및 상기 표적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 수득함을 포함하는, 상기 표적 단백질의 면역원성의 증대 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 CRM197 단편을, 링커를 사용하여 결합 또는 비결합하여 상기 표적 단백질과 융합 발현시킴으로써 수득하는 방법.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 상기 표적 단백질이 HEV 캡시드 단백질, 인플루엔자 바이러스 M2 단백질 또는 그의 면역원성 단편인 방법.
KR1020147000012A 2011-06-01 2012-06-01 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질 KR101839496B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110145419 2011-06-01
CN201110145419.2 2011-06-01
PCT/CN2012/076378 WO2012163289A1 (zh) 2011-06-01 2012-06-01 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167029198A Division KR101895768B1 (ko) 2011-06-01 2012-06-01 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140068843A KR20140068843A (ko) 2014-06-09
KR101839496B1 true KR101839496B1 (ko) 2018-03-19

Family

ID=47231505

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167029198A KR101895768B1 (ko) 2011-06-01 2012-06-01 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질
KR1020147000012A KR101839496B1 (ko) 2011-06-01 2012-06-01 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167029198A KR101895768B1 (ko) 2011-06-01 2012-06-01 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질

Country Status (10)

Country Link
US (3) US9512185B2 (ko)
EP (1) EP2716661B1 (ko)
JP (1) JP6048845B2 (ko)
KR (2) KR101895768B1 (ko)
CN (2) CN105693865B (ko)
AU (1) AU2012265320B2 (ko)
BR (1) BR112013030963B1 (ko)
MX (1) MX346245B (ko)
WO (1) WO2012163289A1 (ko)
ZA (1) ZA201400047B (ko)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105693865B (zh) 2011-06-01 2020-07-17 厦门大学 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白
AR095425A1 (es) * 2013-03-15 2015-10-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vacuna, uso y procedimiento para prevenir una infección por picornavirus
CN104140972B (zh) * 2013-05-07 2018-01-23 上海惠盾生物技术有限公司 白喉毒素突变体crm197的制备方法
US20160206732A1 (en) * 2013-05-14 2016-07-21 Shanghai Hycharm Inc. Epitope vaccine for low immunogenic protein and preparing method and usage thereof
CN103540616B (zh) * 2013-10-23 2015-08-12 中国人民解放军南京军区福州总医院 表达白喉毒素a片段的慢病毒载体系统及其制备与应用
BR102015020632A2 (pt) * 2015-08-26 2017-03-01 Da Silva Bastos Cesar sistema e processo de obtenção e gestão de volume e con-centração de sanitizante otimizado para a aplicação no procedimento de desinfeção de um módulo aplicador de substâncias in ovo tendo como paradigma a informação do tamanho médio dos ovos férteis vacinados e ou alimentados
FR3044312B1 (fr) * 2015-11-30 2017-12-08 Biomerieux Sa Polypeptides mutes de hev et leur utilisation pour le dosage d'anticorps anti-hev
US11203626B2 (en) 2016-03-10 2021-12-21 The Johns Hopkins University Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses
US11965009B2 (en) 2016-03-10 2024-04-23 The Johns Hopkins University Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses
CA3017143A1 (en) * 2016-03-10 2017-09-14 The Johns Hopkins University Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses
EP4147715A1 (en) * 2016-07-21 2023-03-15 VAC4all Pte. Ltd. Biofusion proteins as anti-malaria vaccines
CN106432512B (zh) * 2016-09-30 2022-03-01 康希诺生物股份公司 一种增强多糖抗原免疫原性蛋白载体及其制备方法与应用
CN106699895B (zh) * 2016-12-05 2020-08-04 上海科华生物工程股份有限公司 一种新型融合抗原和包含其的检测试剂盒及应用
MA47223A (fr) 2016-12-30 2019-11-06 Sutrovax Inc Conjugués polypeptide-antigène avec des acides aminés non naturels
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
CN107488218B (zh) * 2017-09-13 2021-06-01 华兰生物疫苗股份有限公司 一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗
CN107522777B (zh) * 2017-09-13 2021-06-11 华兰生物疫苗股份有限公司 用于预防或治疗流感病毒的多肽、免疫原性偶联物及用途
EP3574915A1 (en) * 2018-05-29 2019-12-04 Neovacs Immunogenic product comprising il-4 and/or il-13 for treating disorders associated with aberrant il-4 and/or il 13 expression or activity
AU2019299836A1 (en) * 2018-07-04 2021-02-25 Vaxcyte, Inc. Improvements in immunogenic conjugates
CN114835822B (zh) * 2022-04-22 2022-11-04 浙江洪晟生物科技股份有限公司 猪瘟病毒的多聚体疫苗及其制备方法
CN118027189A (zh) * 2024-04-11 2024-05-14 上海惠盾因泰生物科技有限公司 一种抗白喉毒素突变体抗体及crm197的纯化制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100316004B1 (ko) 1993-03-05 2002-02-19 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그 Crm단백질및디프테리아독소의생산을위한방법및플라스미드
WO2006037658A1 (en) * 2004-10-08 2006-04-13 Chiron Behring Gmbh & Co. Kg Combination vaccine

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997013855A1 (en) 1995-10-10 1997-04-17 Novartis Ag Melanoma-associated protein
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
UA81216C2 (en) * 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
ATE400296T1 (de) 1999-12-02 2008-07-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Zusammensetzungen und methoden zur stabilisierung von biologischen molekülen nach lyophilisierung
GB0112687D0 (en) 2001-05-24 2001-07-18 Microbiological Res Authority Pharmaceutical use of secreted bacterial effector proteins
JP2005524386A (ja) * 2001-11-08 2005-08-18 ▲養▼生堂有限公司 抗ｅ型肝炎ウイルスモノクローナル抗体、又は結合性を有するそのフラグメント、及びそれらの使用
MXPA05007890A (es) 2003-01-30 2005-09-21 Wyeth Corp Epitopos de proteccion cruzada de moraxella catarrhalis y sus metodos de uso.
US20060251675A1 (en) 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
UA84728C2 (ru) * 2003-12-17 2008-11-25 Вайет ПРОЦЕСС ОБРАЗОВАНИЯ ИММУНОГЕННОГО КОНЪЮГАТА, ИММУНОГЕННЫЙ КОНЪЮГАТ БЕЛКА Aβ С БЕЛКОМ-НОСИТЕЛЕМ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, КОТОРАЯ ЕГО СОДЕРЖИТ
EP1699822B1 (en) * 2003-12-30 2008-04-23 MERCK PATENT GmbH Il-7 fusion proteins with antibody portions, their preparation and their use
SI1740217T1 (sl) 2004-04-30 2011-10-28 Novartis Ag Konjugirano meningokokno cepljenje
GB0409750D0 (en) * 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination
GB0500787D0 (en) 2005-01-14 2005-02-23 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination
GB0428394D0 (en) * 2004-12-24 2005-02-02 Chiron Srl Saccharide conjugate vaccines
CN100999548B (zh) * 2006-01-10 2010-09-08 海南天源康泽医药科技有限公司 白喉毒素突变体crm197及其制备方法
CN100558747C (zh) * 2006-04-06 2009-11-11 海南天源康泽医药科技有限公司 以白喉毒素突变体crm197为载体的免疫原及其制备方法与应用
CN100579988C (zh) * 2007-04-02 2010-01-13 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 白喉毒素与gm-csf突变体的融合蛋白及其编码基因与应用
US8252897B2 (en) * 2007-06-21 2012-08-28 Angelica Therapeutics, Inc. Modified toxins
PT2167121E (pt) 2007-06-26 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacina compreendendo conjugados de polissacáridos capsulares de streptococcus pneumoniae
US8080244B2 (en) * 2008-11-21 2011-12-20 Los Alamos National Security, Llc Anti-influenza M2e antibody
CN107096020A (zh) * 2009-06-22 2017-08-29 惠氏有限责任公司 金黄色葡萄球菌抗原的免疫原性组合物
GB0913680D0 (en) * 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
WO2011036560A2 (en) 2009-09-23 2011-03-31 Novartis Ag Glycoconjugate compositions and methods for treatment of hiv
CN105693865B (zh) 2011-06-01 2020-07-17 厦门大学 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100316004B1 (ko) 1993-03-05 2002-02-19 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그 Crm단백질및디프테리아독소의생산을위한방법및플라스미드
WO2006037658A1 (en) * 2004-10-08 2006-04-13 Chiron Behring Gmbh & Co. Kg Combination vaccine

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Johnson YG, Toxins and signal transduction 1:pp.308-316 (1997).*

Also Published As

Publication number Publication date
CN102807621A (zh) 2012-12-05
BR112013030963A2 (pt) 2016-09-06
EP2716661A4 (en) 2015-01-14
EP2716661B1 (en) 2018-03-07
US20140134199A1 (en) 2014-05-15
AU2012265320A1 (en) 2014-01-16
MX2013014109A (es) 2014-06-05
KR101895768B1 (ko) 2018-09-07
BR112013030963B1 (pt) 2020-12-01
KR20160135331A (ko) 2016-11-25
US9764028B2 (en) 2017-09-19
US20170014506A1 (en) 2017-01-19
CN105693865A (zh) 2016-06-22
AU2012265320B2 (en) 2016-11-03
CN105693865B (zh) 2020-07-17
CN102807621B (zh) 2016-04-13
WO2012163289A1 (zh) 2012-12-06
JP6048845B2 (ja) 2016-12-21
US20170015713A1 (en) 2017-01-19
MX346245B (es) 2017-03-13
KR20140068843A (ko) 2014-06-09
ZA201400047B (en) 2015-06-24
US9512185B2 (en) 2016-12-06
EP2716661A1 (en) 2014-04-09
JP2014518061A (ja) 2014-07-28
US9757450B2 (en) 2017-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101839496B1 (ko) 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질
EP1251138A1 (en) Prion protein dimers useful for vaccination
KR101464842B1 (ko) ＥＢ 바이러스에 의해 유도된 종양에 대한 융합 폴리펩티드 및 콜리신 Ｉａ 돌연변이체
CN109456393B (zh) 肺炎链球菌蛋白在抗肺炎链球菌感染中的应用
AU2020411873A1 (en) Mutant RSV F protein and use thereof
JP7009625B2 (ja) Ｈ３ｎ２亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体及びその使用
JP2005523000A (ja) 多価連鎖球菌性ワクチン組成物および使用方法
KR102094569B1 (ko) 돼지의 부종병을 예방하는 백신
WO2023179588A1 (zh) 截短的水痘-带状疱疹病毒囊膜糖蛋白gE
KR20190110090A (ko) 폐렴구균 표면 단백질 a의 선택된 알파 나선 도메인 및 프롤린 풍부 도메인을 조합한 폐렴구균 백신
WO2023138333A1 (zh) 一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用
RU2691302C1 (ru) Иммуногенная композиция на основе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, а также на основе белковых антигенов и способ получения иммуногенной композиции
KR20150123356A (ko) 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물
US10376596B2 (en) Antimicrobial compositions comprising single domain antibodies and pseudomonas exotoxin
WO2023137519A1 (en) Chimeric polypeptides
WO2023137521A1 (en) Chimeric polypeptides
RU2794625C2 (ru) Пневмококковая вакцина, сочетающая выбранные альфа-спиральные домены и богатые пролином домены пневмококкового поверхностного белка а
AU2023208227A1 (en) Chimeric polypeptides
KR20230096564A (ko) A형 간염 바이러스 항원 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물
EP3415160B1 (en) Polypeptides derived from enterococcus and their use for vaccination and the generation of therapeutic antibodies
Ogun et al. The oligomerization domain of C4-binding protein acts as an adjuvant: a fusion protein of MSP119 with the murine C4bp domain protects mice against malaria.

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
J301 Trial decision

Free format text: TRIAL NUMBER: 2016101005992; TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20161019

Effective date: 20180207

S901 Examination by remand of revocation
GRNO Decision to grant (after opposition)
GRNT Written decision to grant