CN114350696A

CN114350696A - 可溶性幽门螺杆菌疫苗重组抗原UreA的重组载体、表达纯化方法及其用途

Info

Publication number: CN114350696A
Application number: CN202111571620.7A
Authority: CN
Inventors: 刘开云; 郭刚; 谭润卿; 刘宇; 李彦; 王宁; 孙敏
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2021-12-21
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-12-21
Also published as: CN114350696B

Abstract

本发明属于生物技术及生物制药技术领域，涉及一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白UreA。针对目前重组蛋白UreA一般以包涵体或融合蛋白的形式表达、纯化难度大、难以大量获得可溶性UreA蛋白的问题，本发明提供了一种可单独高效表达可溶性UreA蛋白的重组载体、宿主细胞、表达纯化方法。本发明将密码子优化后的UreA核苷酸序列导入表达载体pET28a(+)中，经诱导表达，可得到可溶性的重组表达蛋白UreA，并且表达量高，获得的重组蛋白纯度高。本发明首次获得了单独高效表达的可溶性重组UreA，并且工艺简单，重复性好，蛋白表达量占大肠杆菌蛋白总量的22％，且经纯化后蛋白纯度高于98％，为后续对UreA进行更有效和深入的研究提供了基础。

Description

可溶性幽门螺杆菌疫苗重组抗原UreA的重组载体、表达纯化方法及其用途

技术领域

本发明属于生物技术及生物制药技术领域，涉及一种重组抗原蛋白，具体涉及一种表达可溶性的幽门螺杆菌重组抗原蛋白UreA的重组载体、表达纯化方法及其用途。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，以下简称Hp)是一种寄生于人体胃肠道的条件致病菌，属于革兰氏阴性菌，被公认为与多种消化道疾病，特别是消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌及黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤等的发生有着非常密切的联系。幽门螺杆菌的感染严重危害着人们的健康，而临床上针对于幽门螺杆菌感染的传统治疗方法常用“三联”、“四联”疗法，虽然在一定程度上可以治愈感染，但治疗过程中仍存在着抗生素用药量多，治疗费用昂贵、复发率居高不下等亟待解决的问题。

经过数十年的科学研究，已有大量的实验证明，免疫接种可以有效预防甚至治疗Hp感染所带来的一系列疾病。1993年Czinn等用猫胃螺旋杆菌裂解物口服免疫小鼠诱导黏膜产生高水平的分泌性IgA(SIgA)，同时发现还可以预防猫胃螺旋杆菌的再感染，首次证实了疫苗的保护作用，随后针对幽门螺杆菌的疫苗被越来越多的学者开始研究。因此疫苗接种有望成为未来预防和治疗幽门螺杆菌感染最有效也是最有前景的手段之一。

随着分子生物学的不断发展，基因工程疫苗的研究成为了目前的研究热点。Hp存在着多种抗原成分，而Hp感染和致病的作用因子可以分为定植因子和毒性因子两类，其中尿素酶既能影响Hp在体内的定植，又是重要的毒性分子。Hp尿素酶能通过分解尿素产生的氨有效抵抗胃酸杀伤，同时在Hp中含量丰富，在菌体表面广泛表达并高度保守，具有相对分子质量大、可形成颗粒状结构等特点，是Hp亚单位疫苗中最有希望的保护性抗原之一。

尿素酶的分子量为550kDa，其单体由UreA、UreB两个亚单位构成，两个亚单位在尿素酶中的比例为1:1。尿素酶的完整体结构由12聚体构成，分子量大，结构复杂，重组表达完整尿素酶工艺复杂、难度较大，而UreA、UreB作为亚单位抗原已经被充分证实其免疫效果，且工艺更简单，因此，UreA、UreB作为亚单位抗原，研究其在幽门螺杆菌疫苗中的作用更为简单。

但现有研究多集中在对UreB抗原的研究中，由于UreA抗原可溶表达难度大、纯化难度大，关于UreA抗原的研究相对较落后。

现有研究中，Michetti,Pierre等人曾经以原核表达载体pEV40重组表达UreA，经包涵体复性获得UreA亚单位抗原，以霍乱毒素为佐剂灌胃免疫BalB/c小鼠，获得较高保护率，说明UreA亚单位疫苗具有极大的免疫潜力。而目前针对UreA重组抗原的克隆表达还存在许多需要解决的问题，尿素酶蛋白结构疏水性强，重组大肠杆菌多为包涵体或融合蛋白形式表达，且表达量较低，一般不超过20％。并且，包涵体表达的蛋白需要经过多个步骤的复性，制作工艺复杂、成本高且获得的抗原活性较低；而融合表达的蛋白也存在着结构复杂，纯化困难等问题。除此之外，UreA蛋白分子较小，结构呈哑铃状，极易与其他小分子蛋白或核酸杂质发生裹缠，导致纯化难度大，其纯化存在很大困难。

目前，UreA重组抗原的表达多以包涵体或融合蛋白形式表达，还未见有单独高效表达UreA重组抗原的表达方法，表达后的UreA蛋白纯化难度也很大，急需开发一种能够单独高效表达UreA重组抗原并且能简单纯化该蛋白的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：目前可溶性幽门螺杆菌疫苗重组抗原UreA的表达均只能以包涵体或融合蛋白的形式表达，表达量低，步骤工艺复杂，并且表达后的纯化难度较大等问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的重组载体。所述的重组载体是将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的UreA基因导入表达载体中构建而得的。

SEQ ID NO:2UreA基因的核苷酸序列

CCATGGGCAAACTGACCCCGAAAGAACTGGACAAACTGATGCTGCACTACGCTGGTGAACTGGCTCGTAAACGTAAAGAAAAAGGTATCAAACTGAACTACGTTGAAGCTGTTGCTCTGATCTCTGCTCACATCATGGAAGAAGCTCGTGCTGGTAAAAAAACCGCTGCTGAACTGATGCAGGAAGGTCGTACCCTGCTGAAACCGGACGACGTTATGGACGGTGTTGCTTCTATGATCCACGAAGTTGGTATCGAAGCTATGTTCCCGGACGGTACCAAACTGGTTACCGTTCACACCCCGATCGAAGCTAACGGTAAACTGGTTCCGGGTGAACTGTTCCTGAAAAACGAAGACATCACCATCAACGAAGGTAAAAAAGCTGTTTCTGTTAAAGTTAAAAACGTTGGTGACCGTCCGGTTCAGATCGGTTCTCACTTCCACTTCTTCGAAGTTAACCGTTGCCTGGACTTCGACCGTGAAAAAACCTTCGGTAAACGTCTGGACATCGCTTCTGGTACCGCTGTTCGTTTCGAACCGGGTGAAGAAAAATCTGTTGAACTGATCGACATCGGTGGTAACCGTCGTATCTTCGGTTTCAACGCTCTGGTTGACCGTCAGGCTGACAACGAATCTAAAAAAATCGCTCTGCACCGTGCTAAAGAACGTGGTTTCCACGGTGCTAAATCTGACGACAACTACGTTAAAACCATCAAAGAACTCGAG

TGA。

其中，下划线代表酶切位点，双下划线代表组氨酸标签。

进一步的，所述的表达载体为原核载体。更进一步的，所述的表达载体为质粒。再进一步的，所述的表达载体为pET28a(+)。本发明通过筛选得出，采用pET28a(+)质粒获得的表达效果最好，同时pET28a(+)载体序列中除了组氨酸标签序列没有其他的标签或融合蛋白基因序列，获得的UreA蛋白最接近原始蛋白氨基酸序列和蛋白结构。

本发明还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。

进一步的，所述的宿主细胞为大肠杆菌。更进一步的，所述的大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。

本发明还提供了一种上述可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法，包括以下步骤：

a、构建质粒并原核表达

将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的目的基因连接在表达载体质粒中，构成重组载体，转化至外源蛋白表达的宿主菌中进行诱导表达；

b、菌体破碎、离心

收集表达后的菌体用破菌液重悬混匀，冰水浴后采用高压均质仪破菌，离心，收集上清液；

c、Ni柱亲和纯化

将收集到的上清液进行Ni亲和填料纯化，使用A1液、A2液平衡层析柱，使用B液洗脱；

所述A1液组成为：pH8.0-9.0的20-50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，0.3-0.5M NaCl，0.5-1.5M尿素；A2液组成为：pH8.0-9.0的20-50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，0.3-0.5M NaCl；B液组成为pH8.0-9.0的20-50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，0.3-0.5M NaCl，0.5-1M咪唑。

d、脱盐纯化

对步骤c洗脱的蛋白质采用G25凝胶填料进行纯化，使用C液对目的蛋白进行脱盐纯化，得到重组可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA；所述C液的组成为pH8.0-9.0的20-50mMNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，0.135M NaCl。

其中，上述可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法中，步骤a所述的幽门螺杆菌亚单位UreA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:1幽门螺杆菌亚单位UreA的氨基酸序列

MGKLTPKELDKLMLHYAGELARKRKEKGIKLNYVEAVALISAHIMEEARAGKKTAAELMQEGRTLLKPDDVMDGVASMIHEVGIEAMFPDGTKLVTVHTPIEANGKLVPGELFLKNEDITINEGKKAVSVKVKNVGDRPVQIGSHFHFFEVNRCLDFDREKTFGKRLDIASGTAVRFEPGEEKSVELIDIGGNRRIFGFNALVDRQADNESKKIALHRAKERGFHGAKSDDNYVKTIKELEHHHHHH。

其中，上述可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法中，步骤a所述的表达载体为pET28a(+)。

其中，上述可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法中，步骤a所述的表达宿主菌为E.coli BL21(DE3)。

其中，上述可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法中，步骤a所述诱导表达的条件为：在14-16℃、180-240rpm下，使用0.3-0.5mM IPTG诱导表达12-18h。

其中，上述可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法中，步骤b所述破菌液由20-50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液、0.3-0.5M NaCl和0.5-1.5M尿素、2mM MgCl、300-500U核酸酶组成，pH值为8.0-9.0。

其中，上述可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法中，步骤b所述的高压均质仪为ATS工业系统有限公司生产的型号为AH-1500的产品。

其中，上述可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法中，步骤b所述的破菌参数为：压力600bar，流速50mL/min，重复5次。

其中，上述可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法中，步骤b所述的高速离心是指在12000g下离心30min。离心机的型号为Beckman Coulter，JXN-26。

其中，上述可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法中，步骤c所述的镍亲和填料为Ni-Chargad Resin。

其中，上述方法中，步骤d所述的脱盐纯化使用填料为Bestdex G-25M(博格隆，货号AG0122)。

本发明还提供了一种由上述表达纯化方法制备得到的重组可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA。

本发明还提供了一种上述重组载体、宿主细胞、重组可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA在制备幽门螺杆菌疫苗中的用途。

本发明还提供了一种由上述重组可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA组成的幽门螺杆菌重组抗原蛋白疫苗。

本发明的有益效果为：

本发明专门针对表达宿主菌进行了UreA编码基因的密码子优化，并克隆表达了优化的基因，构建到pET28a(+)质粒中，使其在大肠杆菌中获得可溶重组表达，获得大量可溶性的重组UreA。本发明首次获得了单独高效表达的可溶性的重组UreA，相比现有必须以融合蛋白或包涵体形式来表达UreA，本发明工艺简单，重复性好，蛋白表达量占大肠杆菌蛋白总量的22％，且经纯化后蛋白纯度高于98％，纯化后的抗原具有较高免疫原性，为幽门螺杆菌尿素酶亚单位疫苗的研究提供依据。本发明首次实现了快速大量的获得纯度高的可溶性重组UreA蛋白，为后续对UreA进行更有效和深入的研究提供了基础。

附图说明

图1为pET28a(+)/UreA质粒双酶切鉴定结果，泳道1为酶切后鉴定结果，分离片段约为5000bp和750bp；

图2为UreA蛋白诱导鉴定结果，泳道1为破菌液，泳道2为破菌液上清，泳道3为破菌沉淀；

图3为Ni柱亲和层析后SDS-PAGE电泳结果，泳道1为上样，泳道2为流穿，泳道3为洗杂，泳道4-8为洗脱；

图4为脱盐层析后SDS-PAGE电泳结果，泳道1-4为洗脱；

图5所示为特异性抗体检测结果。

具体实施方式

本发明克隆表达了UreA基因，构建到pET28a(+)质粒上使其在大肠杆菌中获得可溶重组表达。

本发明实现UreA的单独可溶性表达主要在于选择了适宜的基因序列、表达载体和连接位点以及诱导培养条件。由于UreA蛋白的三级结构较复杂，选用正确的技术参数对重组蛋白的表达影响较大，分子生物学实验中选用的基因序列、表达载体和连接位点以及诱导培养条件都会影响重组蛋白的表达。本发明采用的核苷酸序列经过了专门的密码子优化，同时在构建时选用Nco I和Xho I作为酶切位点，连接到表达载体pET28a(+)，选用的重组表达菌株为E.coli BL21(DE3)，经0.3-0.5mM IPTG，14-16℃条件诱导，通过上述技术参数的共同配合，共同作用下才获得较高表达量的可溶重组UreA抗原蛋白。

另一方面，UreA蛋白分子结构复杂，易缠绕小分子蛋白杂质及核酸杂质，对于其纯化本发明也进行了深入的研究，最终得出：采用Ni亲和纯化，通过在破菌液及Ni柱纯化的平衡缓冲液中创新性的加入0.5-1.5M尿素以及300-500U的核酸酶，舒展复杂结构蛋白的分子结构，打开杂质蛋白与目的蛋白的结构缠绕，同时降解核酸杂质，减少杂质蛋白和核酸与Ni填料结合，从而达到提高目的蛋白洗脱纯度的效果。虽然本领域的其他技术人员也知晓用尿素可以通过破坏疏水键和氢键来破坏蛋白的三级和四级结构，从而使蛋白变性，但绝大多数的纯化过程中用到的尿素都是8-10M的高浓度尿素，用于进行包涵体溶解实验。本发明仅仅添加0.5-1.5M尿素，将UreA的结构进行适当舒展而不至于破坏，减少复杂的高级结构中缠绕的杂质蛋白，使His标签暴露更明显，从而使得Ni柱纯化能够更高效的去除杂质蛋白，使纯化获得的目的蛋白纯度提高。配合核酸酶快速降解核酸的作用，使得Ni填料结合的杂质大幅减少，获得的纯化蛋白经12％SDS-PAGE检测，呈单一目标蛋白条带，分子质量约为28KDa，灰度分析蛋白纯度为98.6％。将纯化后的UreA以氢氧化铝为佐剂注射免疫BalB/c小鼠，结果证明免疫小鼠血清中IgG水平显著高于阴性对照组(PBS组)P<0.01，说明使用本发明提供的纯化方法获得的UreA抗原可有效刺激机体产生较高的免疫应答，具有较高的免疫原性，为Hp重组亚单位基因工程疫苗的研发打下了基础。

下面将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明。

以下实施例中，所使用大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)购自成都博奥晨曦生物科技有限公司；DNA Marker、限制性内切酶Nco I和Xho I、核酸Marker为Takara公司产品，蛋白Marker为Thermo Fisher公司产品，质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。

实施例1 UreA基因的克隆构建

a、通过NCBI序列比对发现Hp不同菌株间UreA氨基酸序列高度保守，根据UreA的氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，序列为SEQ ID NO:2(下划线示酶切位点碱基序列，双下划线示组氨酸标签序列)。

b、对目的基因进行全基因合成，通过Xho I和Nco I的酶切位点连接到表达载体pET28a(+)，质粒测序结果与目的基因比对序列完全相同，经过结果分析确认无氨基酸突变。从重组pET28a(+)/UreA/E.coli Top 10菌株中提取重组质粒，进行双酶切验证，结果一致。结果如图1所示。

c、将重组质粒转化表达菌株E.coli BL21(DE3)，获得可以表达UreA的重组大肠杆菌pET28a(+)/UreA/E.coli BL21(DE3)。

实施例2 UreA蛋白的诱导表达

a、取过夜培养的pET28a(+)/UreA/E.coli BL21(DE3)菌液100μL加入10mL卡那霉素抗性的LB培养基中，220rpm 37℃过夜培养，取过夜培养的菌液200μL加入20mL卡那霉素抗性的LB培养基中，220rpm 37℃培养2-3h，二次活化至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入1M IPTG 10μL，使IPTG终浓度为0.5mM，再置于摇床220rpm、16℃诱导表达12h。

b、冷冻落地式离心机将诱导表达后的菌液以5000g离心10min，弃去上清，沉淀菌体加入4mL破菌液(pH 9.0的50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，0.5M NaCl)混匀，冰浴超声裂解10min(超声3s停止3s)，4℃、12000g离心30min，分离上清及沉淀。

c、加入4mL破菌液重悬沉淀，分别取裂菌液、上清、重悬沉淀各40μL加入10μL5×蛋白上样缓冲液(生工，货号：C508320-0010，100℃金属浴10min，12000g离心3min)。

d、将处理好的裂菌液、上清和沉淀分别取10μL作为样品上样，进行12％的SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后，通过凝胶扫描成像系统(BIO-RAD，ChemiDocTM MPImaging System)扫描成像。灰度分析结果表明，UreA在pET28a(+)/UreA/E.coli BL21(DE3)中为可溶性表达，表达量占总蛋白22％(如图2所示)。

实施例3 UreA抗原的纯化制备

a、菌株放大培养：取过夜培养的pET28a(+)/UreA/E.coli BL21(DE3)菌液60mL加入6L卡那霉素抗性的TB培养基中，220rpm、37℃培养2h，培养至OD600为0.6-0.8时，将培养液冰浴5min降温，随后加入1M IPTG 3mL，使其IPTG终浓度为0.5mM，220rpm、16℃诱导表达12h。诱导后的菌液，用冷冻落地式离心机8000g离心15min收集菌体，再加入300mL破菌液(50mM Na₂CO₃-NaHCO₃，0.5M NaCl，1M尿素，2mM MgCl、500U核酸酶，pH9.0)重悬菌体后，将菌液进行高压均质仪破菌，12000g离心30min收集上清。

b、UreA纯化

(1)Ni柱亲和层析

破菌上清液抽滤瓶过0.45μm滤膜抽滤备用。纯化仪上使用A1液(50mM Na₂CO₃-NaHCO₃，0.5M NaCl，1M尿素，pH9.0)平衡Ni柱，取过滤后上清液上样，使用含1M尿素的A1液平衡层析柱，再使用不含尿素的A2液(50mM Na₂CO₃-NaHCO₃，0.5M NaCl，pH 9.0)平衡层析柱；然后使用10％B液(50mM Na₂CO₃-NaHCO₃，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH 9.0)+90％A2液洗脱杂质，再使用20％B液+80％A2液洗脱目的蛋白。纯化电泳结果如图3所示。

(2)脱盐柱层析

用C液平衡脱盐层析柱，取(1)中洗脱的蛋白样品上样，C液(pH 9.0的50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，0.135M NaCl)平衡洗脱，使蛋白与咪唑溶液分离，收集A280指示的蛋白洗脱峰，BCA法进行浓度测定后-80℃保存备用。纯化电泳结果如图4所示。

实施例4动物免疫

以实施例3中制备的重组蛋白作为抗原，配合氢氧化铝佐剂，通过肌肉注射免疫小鼠，免疫结束后检测小鼠血清中的特异性抗体，鉴定重组蛋白的免疫原性。

实验动物：BalB/c小鼠：40只，雌性，购自集萃药康有限公司，分组如表1所示。

表1实验分组

组别	动物只数	抗原及佐剂
			免疫组	20	UreA(50μg)+氢氧化铝佐剂
对照组	20	PBS+氢氧化铝佐剂

免疫方案：50μg抗原或等体积PBS和氢氧化铝佐剂1：1混合，4℃吸附30min，双侧大腿肌肉注射，50μL/侧，共100μL/鼠。分别于0、14、21、28天进行四次免疫。

实施例5特异性抗体检测

末次免疫5天后采集小鼠血液，ELISA检测UreA特异性血清IgG水平变化。

a、抗原包被：取包被液将UreA纯化蛋白稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜。

b、封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用。

c、标本稀释：将血清从1:1024开始进行系列倍比稀释至1:1048576。

d、加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做双重复，37℃孵育1h，PBST洗涤4次；

e、加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgG(生工，货号：D110087-0100)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；

f、显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；

g、结果判断：A_样品/A_阴性≥2.1为阳性。

其中，a中包被液为0.05mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na₂CO₃，35mMNaHCO₃)。b中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA。d中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20。e中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20+0.5％BSA。f中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1；TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO；底物缓冲液pH5.0为柠檬酸53mM，Na₂HPO₄·12H₂0 100 mM。f中终止液为2M H₂SO₄。

检测结果如图5所示：检测重组UreA蛋白免疫小鼠产生的最高抗体效价达到1：524288；UreA免疫小鼠对重组UreA的几何平均滴度为1：456419；免疫后抗体阳性率达到100％，说明本发明获得的重组UreA蛋白能够使免疫小鼠体产生免疫反应，产生特异性抗体，证明了本发明获得的UreA具有较高的免疫原性。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的重组载体、表达纯化方法及其用途

<141> 2021-12-21

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Lys Leu Thr Pro Lys Glu Leu Asp Lys Leu Met Leu His Tyr

1 5 10 15

Ala Gly Glu Leu Ala Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gly Ile Lys Leu Asn

20 25 30

Tyr Val Glu Ala Val Ala Leu Ile Ser Ala His Ile Met Glu Glu Ala

35 40 45

Arg Ala Gly Lys Lys Thr Ala Ala Glu Leu Met Gln Glu Gly Arg Thr

50 55 60

Leu Leu Lys Pro Asp Asp Val Met Asp Gly Val Ala Ser Met Ile His

65 70 75 80

Glu Val Gly Ile Glu Ala Met Phe Pro Asp Gly Thr Lys Leu Val Thr

85 90 95

Val His Thr Pro Ile Glu Ala Asn Gly Lys Leu Val Pro Gly Glu Leu

100 105 110

Phe Leu Lys Asn Glu Asp Ile Thr Ile Asn Glu Gly Lys Lys Ala Val

115 120 125

Ser Val Lys Val Lys Asn Val Gly Asp Arg Pro Val Gln Ile Gly Ser

130 135 140

His Phe His Phe Phe Glu Val Asn Arg Cys Leu Asp Phe Asp Arg Glu

145 150 155 160

Lys Thr Phe Gly Lys Arg Leu Asp Ile Ala Ser Gly Thr Ala Val Arg

165 170 175

Phe Glu Pro Gly Glu Glu Lys Ser Val Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly

180 185 190

Asn Arg Arg Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu Val Asp Arg Gln Ala Asp

195 200 205

Asn Glu Ser Lys Lys Ile Ala Leu His Arg Ala Lys Glu Arg Gly Phe

210 215 220

His Gly Ala Lys Ser Asp Asp Asn Tyr Val Lys Thr Ile Lys Glu Leu

225 230 235 240

Glu His His His His His His

245

<210> 2

<211> 746

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccatgggcaaactgaccccgaaagaactggacaaactgatgctgcactacgctggtgaac 60

tggctcgtaaacgtaaagaaaaaggtatcaaactgaactacgttgaagctgttgctctga 120

tctctgctcacatcatggaagaagctcgtgctggtaaaaaaaccgctgctgaactgatgc 180

aggaaggtcgtaccctgctgaaaccggacgacgttatggacggtgttgcttctatgatcc 240

acgaagttggtatcgaagctatgttcccggacggtaccaaactggttaccgttcacaccc 300

cgatcgaagctaacggtaaactggttccgggtgaactgttcctgaaaaacgaagacatca 360

ccatcaacgaaggtaaaaaagctgtttctgttaaagttaaaaacgttggtgaccgtccgg 420

ttcagatcggttctcacttccacttcttcgaagttaaccgttgcctggacttcgaccgtg 480

aaaaaaccttcggtaaacgtctggacatcgcttctggtaccgctgttcgtttcgaaccgg 540

gtgaagaaaaatctgttgaactgatcgacatcggtggtaaccgtcgtatcttcggtttca 600

acgctctggttgaccgtcaggctgacaacgaatctaaaaaaatcgctctgcaccgtgcta 660

aagaacgtggtttccacggtgctaaatctgacgacaactacgttaaaaccatcaaagaac 720

tcgagcaccaccaccaccaccactga 746

Claims

1.可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的UreA基因导入表达载体中构建而得的。

2.根据权利要求1所述的可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的重组载体，其特征在于：所述的表达载体为pET28a+。

3.包含权利要求1或2所述的可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的重组载体的宿主细胞。

4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为E.coli BL21 DE3。

5.权利要求1或2所述的可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法，包括以下步骤：

a、构建质粒并原核表达

b、菌体破碎、离心

c、Ni柱亲和纯化

d、脱盐纯化

对步骤c洗脱的蛋白质采用G25凝胶填料进行纯化，使用C液对目的蛋白进行脱盐纯化，得到重组可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA；所述C液的组成为pH8.0-9.0的20-50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，0.135M NaCl。

6.根据权利要求5所述的可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法，其特征在于：步骤a所述的幽门螺杆菌UreA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

7.根据权利要求5所述的可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法，其特征在于：步骤a所述诱导表达的条件为：在14-16℃、180-240rpm下，使用0.3-0.5mM IPTG诱导表达12-18h。

8.根据权利要求5所述的可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA的表达纯化方法，其特征在于：步骤b所述破菌液由20-50mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液、0.3-0.5M NaCl和0.5-1.5M尿素、2mM MgCl、300-500U核酸酶组成，pH值为8.0-9.0。

9.权利要求5-8任一项所述的表达纯化方法制备得到的重组可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA。

10.权利要求1或2所述的重组载体、权利要求3或4所述的宿主细胞、权利要求9所述的重组可溶性幽门螺杆菌重组抗原UreA在制备幽门螺杆菌疫苗中的用途。