CN113121667B - 一种细胞膜成孔蛋白LjGSDM及其表达与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种细胞膜成孔蛋白LjGSDM及其表达与应用。本发明从日本七鳃鳗的肠组织中克隆得到了LjGSDM基因，其DNA序列如SEQ ID NO:2所示，该基因编码的蛋白LjGSDM，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。本发明的基因LjGSDM编码的蛋白能够识别并结合到细菌细胞膜上，并通过寡聚成孔将细胞膜裂解从而杀死细菌。同时LjGSDM不能从细胞外裂解细胞，用药时对宿主的细胞没有毒性是比较安全的杀菌肽，可用于制备治疗感染性疾病的药物。

Description

一种细胞膜成孔蛋白LjGSDM及其表达与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种细胞膜成孔蛋白LjGSDM及其表达与应用。

背景技术

七鳃鳗(Lampetra japonicum)是一种古老的无颌类脊椎动物，体型细长类似鳗鱼，在眼睛的后面身体两侧各有七个鳃孔，所以由此得名。根据现存的七鳃鳗化石人们发现其出现在恐龙之前，是目前海洋动物中最原始的脊椎动物。是无脊椎动物进化成鱼类的一个中间点，在脊椎动物演化的过程中地位非常特殊。近年来，关于七鳃鳗的抗菌免疫方面的研究引起了广泛的关注，并在七鳃鳗中发现了不少具有重要意义的免疫相关基因。

细胞焦亡(Pyroptosis)是近年来新命名的一种程序性细胞死亡方式，它由Gasdermin家族蛋白介导在机体的抗菌感染过程中发挥关键作用。Gasdermin家族蛋白是介导细胞焦亡的核心分子，在高等哺乳动物中除了PJVK以外，Gasdermin家族蛋白的每个GSDM分子都有两个结构域：N-terminal成孔结构域和C-terminal抑制结构域。正常状态下这两个结构域相互“勾连”起来，处于自抑制状态。当被Caspase切割活化后会释放N-terminal成孔结构域。N端成孔结构域具有亲脂性能够与细胞内膜上的脂质结合并在细胞膜上聚集打孔。所以Gasdermin家族蛋白的N-terminal成孔结构域具有诱导细胞焦亡以及杀菌的作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种细胞膜成孔蛋白LjGSDM及其表达与应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种LjGSDM蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明在七鳃鳗的基因组中发现了Gasdermin家族蛋白的同源基因LjGSDM，但是LjGSDM只有一个成孔结构域没有抑制结构域，而且在静息状态下它在机体中的表达水平非常低，基因克隆的难度非常大。但是当七鳃鳗受到细菌感染后LjGSDM的表达水平会显著增加，特别是在腮和肠中上调表达的最为显著。同时我们还发现七鳃鳗的LjGSDM与其他Gasdermin家族蛋白不同，它不经过切割活化就能够特异性的识别并结合到细菌的细胞膜上，通过在细胞膜上寡聚成孔而裂解原生质体和细菌，对细菌的杀伤作用非常大。但是由于宿主细胞外膜与细菌细胞膜所含的脂质不同，LjGSDM不能够从细胞外裂解细胞，对宿主的细胞没有毒性，属于比较安全的抗菌肽。这种特性使得LjGSDM蛋白在制备治疗感染性疾病的药物以及在水产养殖业、医药卫生等领域具有广阔的开发应用前景。

本发明LjGSDM蛋白由289个氨基酸编码，等电点和分子量分别为8.7和31081.98道尔顿。

本发明同时提供一种LjGSDM基因，编码所述的LjGSDM蛋白。

作为本发明所述LjGSDM基因的优选实施方式，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供包含所述LjGSDM基因的重组载体。

作为本发明所述重组载体的优选实施方式，所述载体为真核表达载体。

本发明提供包含所述LjGSDM基因的重组细胞。

作为本发明所述重组细胞的优选实施方式，所述细胞为HEK293T细胞。

本发明还提供一种表达LjGSDM蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)用权利要求4或5所述的重组载体转化适于其表达的细胞，获得重组细胞；

(2)将重组细胞进行培养后，裂解细胞回收并纯化得到所表达的LjGSDM蛋白。

作为本发明所述方法的优选实施方式，具体包括以下步骤：

(1)将权利要求2或3所述的LjGSDM基因克隆到真核表达载体pFXB-5’Flag，得到表达载体pFXB-LjGSDM；

(2)将pFXB-LjGSDM转化HEK293T细胞，转染后将转染了目的基因的293T细胞传入细胞培养皿；

(3)细胞在细胞培养皿中生长20-30h后，去除细胞培养基，再向细胞培养皿中加入含有蛋白酶抑制剂的IP裂解液对细胞进行裂解；

(4)将细胞裂解液转入离心管，离心后取上清液，加入

M2Affinity Gel、4℃旋转过夜；

(5)次日将结合了目的蛋白的Affinity Gel离心去上清，并用IP裂解液洗涤；

(6)向洗涤后的Affinity Gel中加入IP裂解液和3×FLAG peptide竞争1h后，离心收集上清蛋白溶液。

本发明还摸索和优化了LjGSDM蛋白的纯化条件。由于LjGSDM的杀菌作用太强，目前不能在细菌中大量表达，所以我们在真核细胞中表达并纯化了LjGSDM蛋白，并得到较纯的LjGSDM蛋白。

本发明的表达质粒复制方法：参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecularcloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl₂的方法将目的质粒转化E.coli.DH5α菌株，并用含有氨苄青霉素(100μg/mL)的2×YT培养基37℃培养转化菌株。最后按照Omega公司质粒提取试剂盒的说明书提取目的质粒。

本发明还提供所述LjGSDM蛋白在制备杀菌产品或治疗感染性疾病药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过细菌刺激从七鳃鳗的肠组织中克隆得到了LjGSDM基因，并构建了表达载体。后续通过细胞LDH、IL-6释放实验、LjGSDM与细胞膜脂质结合实验、细菌原生质体裂解和杀菌实验分析发现，LjGSDM不经过切割活化就能够直接寡聚并定位到细胞膜，并在细胞膜上打孔导致原生质体的裂解和细菌的死亡。但是由于细胞外膜与细菌细胞膜脂质的不同，LjGSDM只能特异的结合在细菌细胞膜上并不能从宿主的细胞外膜上成孔。所以，LjGSDM只能特异性的裂解外源感染的细菌，在使用时对宿主细胞却没有毒性。

附图说明

图1：扩增得到的LjGSDM基因全长片段；其中M：DNA分子量标准(DL2000)；1-4号泳道是七鳃鳗的肠组织扩增的LjGSDM基因全长片段。

图2：重组真核表达载体pFXB-LjGSDM的构建图。

图3：纯化的LjGSDM蛋白电泳图；其中，1号泳道是纯化的LjGSDM蛋白电泳后的考马斯亮蓝染色图；2号泳道是用Flag标签抗体对纯化蛋白做的WB鉴定图。

图4：LjGSDM在细胞中的定位情况分析。

图5：纯化出的LjGSDM蛋白与细胞膜脂质的结合情况分析。

图6：LjGSDM对细菌原生质体的裂解情况分析；其中A：纯化的LjGSDM蛋白裂解原生质体的曲线图；B：纯化的LjGSDM蛋白裂解原生质体的比例图。

图7：LjGSDM的杀菌能力分析；其中A：LjGSDM转化到BL21(DE3)后细菌在平板上的生长情况；B：平板上生长的细菌菌落个数的统计图。

图8：LjGSDM从细胞内裂解细胞的情况分析；其中A：LjGSDM转染到HeLa细胞后细胞中LDH的释放情况分析；B：LjGSDM转染到HeLa细胞后细胞IL-6的释放情况分析。

图9：LjGSDM从细胞外裂解细胞的能力分析；其中，纯化的LjGSDM蛋白加入到细胞培养基后细胞LDH释放(细胞膜裂解)的情况分析。

具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

本发明的日本七鳃鳗采集自中国哈尔滨。

实施例1：日本七鳃鳗肠组织总RNA的提取和cDNA的合成

(1)取1ml浓度为1mg/ml的革兰氏阴性菌(E.coil.)注射七鳃鳗尾静脉，连续注射三天。随后取七鳃鳗的肠组织置于1.5ml EP管中，加入1ml Trizol，再加入两粒高温干烤过的磁珠在组织震荡仪上震荡5min。加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀，室温静置15min。

(2)使用低温离心机4℃、12000g将样品离心5min，小心吸取上层的水相到一个新的1.5ml EP管。

(3)加入等体积的已经预冷的异丙醇并上下颠倒混匀，室温静置10min。

(4)用低温离心机4℃、12000g将样品离心15min吸除上清。

(5)向样品中加入75％的乙醇上下颠倒混匀。

(6)用低温离心机4℃、12000g将样品离心5min后去除酒精，并在室温干燥2-5min。

(7)晾干酒精后，向样品中加入10μl DEPC水溶解RNA。并对RNA的浓度和纯度进行检测。

(8)取1μg总RNA，按照TOYOBO公司的cDNA一链合成试剂盒(ReverTra Ace-α-^TM，code No.FSK-100)说明书合成cDNA一链。

实施例2：LjGSDM基因全长序列的扩增及分析

根据基因序列信息设计LjGSDM基因序列的PCR引物如表1所示。

采用Takara的LA Taq聚合酶扩增LjGSDM的全长基因，结果扩增得到了870bp左右的基因片段，电泳图谱如图1。将扩增得到的目的片段连接到pGEM-T载体后转化大肠杆菌DH5α，挑选重组克隆测序。对测序结果进行分析表明，扩增得到的基因片段是LjGSDM基因的全长序列。

表1 LjGSDM基因序列的PCR引物

实施例3：重组pFXB-LjGSDM真核表达载体的构建

根据LjGSDM的基因序列合成一对新的PCR引物，引物序列如表2所示，上游引物含BamH I切割位点，下游引物含EcoRⅠ切割位点。

以含有LjGSDM基因的pGEM-T载体为模板，PCR扩增得到特异扩增的单一条带，产物大小在870bp左右。将PCR扩增产物克隆到真核表达载体pFXB-5’Flag上，得到重组表达载体pFXB-LjGSDM(其构建过程如图2所示)。表达载体中的LjGSDM基因序列经测序鉴定正确。

表2构建真核表达载体的引物

注：引物序列中下划线表示酶切位点。

实施例4：日本七鳃鳗LjGSDM的真核表达以及纯化

我们在研究中发现LjGSDM在转化到BL21(DE3)后，由于LjGSDM的杀菌作用细菌很难生长。所以我们选择真核表达来纯化LjGSDM蛋白。由于LjGSDM转染到293T细胞后细胞死亡的比例较低，所以我们将pFXB-LjGSDM载体转染到293T细胞来纯化蛋白。蛋白的具体纯化方法如下：

(1)将293T细胞均匀的铺到6孔的细胞培养板中，待细胞长到80-90％时，用Lipofectamine 3000将真核表达载体pFXB-LjGSDM转染到细胞中。

(2)转染24h后将转染了目的基因的293T细胞传入10cm细胞培养皿。

(3)细胞在10cm的细胞培养皿中生长24h后，小心的去除细胞培养基(完全去除)，再向细胞培养皿中加入1ml加了蛋白酶抑制剂的IP裂解液，冰上裂解30min。

(4)将细胞裂解液转入1.5ml离心管，4℃、12000rpm离心15min。

(5)将上清转移到新的1.5ml离心管弃去沉淀，向离心管中加入40μl

M2Affinity Gel(Sigma-Aldrich)、4℃旋转过夜。

(6)次日将结合了目的蛋白的Affinity Gel 4℃、2500rpm离心去上清，并用IP裂解液洗涤5次。

(7)向洗涤后的Affinity Gel中加入100μl IP裂解液和终浓度为5μg/μl的3×FLAG peptide(Sigma-Aldrich)竞争1h。

(8)4℃、2500rpm离心5min并收集上清蛋白溶液。用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白浓度进行测定。纯化的LjGSDM蛋白电泳图如图3所示。

实施例5：日本七鳃鳗LjGSDM的细胞定位情况分析

将HeLa细胞均匀的铺到共聚焦细胞培养皿中，密度最好在40％左右。铺板24h后用Lipofectamine 3000转染试剂将LjGSDM的GFP载体(从日本七鳃鳗的cDNA上克隆得到目的基因LjGSDM，并将其连入带有GFP标签的真核表达载体pEZ-M98上得到)转染到细胞中。在转染后24h，轻轻吸除细胞培养基并用预冷的PBS洗涤细胞3次，向培养皿中加入1ml的4％多聚甲醛固定液，室温固定10min。然后用PBS洗涤3次，加入Hoechst 33342染色液，室温避光放置4-5min，然后用PBS避光洗涤细胞3次。最后用Leica的激光共聚焦显微镜观察蛋白的细胞定位并拍照。

结果如图4所示，绿色的LjGSDM蛋白聚集成点状分布在细胞膜上。

实施例6：日本七鳃鳗LjGSDM与细胞膜脂质结合的情况分析

根据(Echelon Biosciences Inc.)试剂盒说明书。将脂质阵列条放在封闭缓冲液PBST+3％BSA(sigma)中并完全覆盖，在室温轻轻搅拌1h。将2μg纯化的LjGSDM蛋白与封闭的脂质阵列条共孵育1h，用PBST洗涤3次后，用Flag标签抗体室温孵育后，用ECL化学发光仪检测蛋白与脂质的结合情况。

结果如图5所示，LjGSDM蛋白与细胞膜脂质心磷脂和PI(4)P结合较弱，而与PA、PI(4,5)P2和PI(3,4,5)结合较强。

实施例7：日本七鳃鳗LjGSDM对原生质体裂解的影响

将巨大芽孢杆菌(B.megaterium)接种到15ml肉汤培养基中，30℃培养过夜。次日将菌液室温6000g离心10min，弃去上清培养基。加入5ml PBS洗涤3次，最后将菌液重悬在蔗糖缓冲液中。在37℃下向巨大芽孢杆菌菌液中加入2mg/ml的溶菌酶，在倒置相差显微镜下观察，直到原生质体完全形成。

用蔗糖缓冲液稀释原生质体并用酶标仪检测OD600，直至OD600＝1.0。然后取200μl稀释的原生质体加到96孔板中，测量吸光度OD600即为A0。再向原生质体中加入1μM的LjGSDM蛋白在37℃下孵育30min。每隔5min测量一次吸光度OD600即为An，在孵育20min时为了使原生质体完全裂解加入10μl 2％(v/v)的Triton X-100。测量原生质体的吸光度OD600即为A100。利用公式Lysis(％)＝(A0-An)/(A0-A100)×100。计算原生质体的裂解百分比。

结果如图6所示，对照组原生质体的裂解比例在16％左右，而加入了LjGSDM蛋白后原生质体的裂解比例达到了33％，说明日本七鳃鳗的LjGSDM蛋白能够裂解原生质体。

实施例8：日本七鳃鳗LjGSDM的杀菌作用分析

构建LjGSDM基因的His标签的原核表达载体，转化到BL21(DE3)表达菌。挑取单克隆后接种LB培养基，置于37℃摇床、200rpm/min培养至OD600＝1.0时，取适量菌液稀释后均匀的涂布在加了或者不加IPTG的LB平板上，置于37℃培养12h。将平板分区统计出平板上长出的菌落个数并拍照。

结果如图7所示，对照组BL21(DE3)表达菌在平板上生长良好，但是表达LjGSDM的BL21(DE3)在平板上几乎没有菌落生长。说明日本七鳃鳗LjGSDM蛋白具有杀菌的能力。

实施例9：日本七鳃鳗LjGSDM从细胞内裂解细胞的情况分析

构建LjGSDM基因的Flag标签的真核表达载体，然后转染到HeLa细胞中。随后检测细胞培养液中LDH和IL-6的释放情况。

结果如图8所示，与对照组相比转染LjGSDM到细胞中以后细胞会释放大量的LDH和IL-6，说明此时细胞膜发生了破裂。

实施例10：日本七鳃鳗LjGSDM从细胞外成孔的能力分析

将HeLa细胞均匀的铺到96孔板，24h后将纯化的LjGSDM蛋白加入到细胞培养基中，23h后取出细胞培养板，加入10μl LDH释放试剂到“样品最大酶活性对照孔”中并吹打混匀。把细胞板放入培养箱，1h后取出并用离心机400g离心5min。每孔取120μl上清液到一个新的96孔板。

根据所需将试剂盒中INT溶液(10×)用稀释液稀释至1×。1×的INT溶液宜现配现用，配制后4℃保存当天用完。根据待测定的样品数，参考下表3在检测前新鲜配制适量的LDH检测工作液。LDH检测工作液必须现配现用，配制和使用过程中均要避光。

表3 LDH检测工作液配置表

样品测定：

向含有待测样品的96孔板的各孔中加入60μl LDH检测工作液。轻轻混匀并避光室温孵育30min。然后用酶标仪在490nm处测定吸光度。并根据以下公式计算LDH释放百分比：

LDH释放百分比＝[(样品孔吸光度－对照孔吸光度)/(样品最大酶活性对照孔吸光度－对照孔吸光度)]×100％

结果如图9所示，细胞LDH的释放情况与对照组相比没有发生显著变化，说明日本七鳃鳗LjGSDM蛋白不能从细胞外打孔。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种细胞膜成孔蛋白LjGSDM及其表达与应用

<130> 2021.03.23

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 289

<212> PRT

<213> 日本七鳃鳗（Lampetra japonica）

<400> 1

Met Phe Ala Ala Ala Thr Lys Asn Phe Val Thr Gln Val Gly Ser Asn

1 5 10 15

Gly Arg Leu Val Pro Val Pro Ser Leu Asn Glu Ala Asp Arg Tyr His

20 25 30

Pro Leu Ser Leu Val Thr Lys Lys Arg Arg Ser Trp Leu Trp Gln Lys

35 40 45

Ala Lys Tyr Ser Ser Thr Ser Phe Ala Leu Lys Asp Ile Leu Val Gly

50 55 60

Glu Lys Asp Ile Asp Ile Gly Ala Ala Asp Val Thr Ser Tyr Gln Leu

65 70 75 80

Val Asn Tyr Glu Asp Glu Ser Asp Gly Ala Pro Gly Arg Arg Glu Arg

85 90 95

His Gly Ser Glu Gly Val Leu Ala Gly Val Gly Phe Ser Val Ala His

100 105 110

Ser Glu Asn Val Ala Val His Ala Ser Leu Gly Ile Val Thr Lys His

115 120 125

Glu Leu Asp Val Pro Leu Leu Leu Arg Thr Gln Gly Arg Ala Ser Glu

130 135 140

Glu Gly Ala Arg Gln Gly Lys Gly Arg Asp Lys Thr Ile Val Ile Pro

145 150 155 160

Ala His Thr Thr Val Ala Phe Ser Val Phe Asp Leu Tyr Ile Arg Leu

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Gly Gly Cys Ala Arg Thr His Thr His Asp Phe Tyr

180 185 190

Glu Gln Thr Ala Thr Leu Thr Asp Leu Ser Gly Pro Ser Gly Val Gly

195 200 205

Ala Ser Ser Thr Ser Asn Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Phe Pro Pro

210 215 220

Glu Glu Pro Gly Ala His Gln Arg Val Asn Leu Leu His Gln Gly Val

225 230 235 240

Ser Lys Gly Pro Cys Ala Leu Cys Gly Leu Gly Ala Arg Pro Arg Asp

245 250 255

Thr Val Tyr Gly Cys Leu Glu Cys Ala Trp Gly Gly His Lys Tyr Val

260 265 270

Arg Leu His Ala Val Pro Cys Phe Asp Leu Trp His Arg Lys Met Lys

275 280 285

Ser

<210> 2

<211> 870

<212> DNA

<213> 日本七鳃鳗（Lampetra japonica）

<400> 2

atgttcgccg cagccaccaa aaacttcgtg actcaagttg gcagcaacgg gcgtctggtg 60

cccgtgccga gcttgaacga ggccgaccgg taccacccgc tcagcctcgt caccaagaag 120

agacgctcct ggctctggca gaaggccaag tactcgtcca cgtccttcgc cctcaaggac 180

attttggttg gggagaagga catcgacatt ggtgccgcag acgtgacgtc gtaccagctg 240

gtgaactacg aggacgagtc ggacggcgcg ccgggtcgtc gcgagcgaca cggctccgag 300

ggcgtgctgg ccggcgtggg cttcagcgtg gcgcactccg agaacgtggc ggtgcacgcg 360

tccctgggca tcgtcaccaa gcacgagctc gacgtgcctc tcctcctccg cacgcaggga 420

agggcatcgg aggagggcgc ccgtcagggg aagggtcgcg acaagaccat cgtcatcccc 480

gcccacacca cggtcgcctt cagcgtcttc gacctctaca tccgcttgga cggatcgttc 540

ggtggctgcg cacgcacgca cacgcacgac ttctacgagc agacggccac gctcaccgac 600

ctgtcggggc ccagcggtgt cggggccagc agcaccagca acggcggcgg ccgcggtggc 660

ggcttcccgc cggaggagcc cggagcgcac cagcgcgtca acctgctgca ccagggcgtc 720

tccaagggtc catgcgccct ctgcggcctg ggcgcgcggc ccagggacac ggtgtacggc 780

tgcctcgagt gtgcgtgggg ggggcacaag tacgtgaggc tccacgcagt gccctgcttc 840

gacctctggc acaggaagat gaagagttga 870

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgttcgccg cagccaccaa aaactt 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tcaactcttc atcttcctgt gccaga 26

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cgcggatcca tgttcgccgc agccaccaaa aactt 35

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cggaattctc aactcttcat cttcctgtgc caga 34

Claims (10)

1.一种LjGSDM蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种LjGSDM基因，其特征在于，编码权利要求1所述的LjGSDM蛋白。

3.如权利要求2所述的LjGSDM基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

4.包含权利要求2或3所述LjGSDM基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述载体为真核表达载体。

6.包含权利要求2或3所述LjGSDM基因的重组细胞。

7.如权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞为HEK293T细胞。

8.一种表达LjGSDM蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用权利要求4或5所述的重组载体转化适于其表达的细胞，获得重组细胞；

(2)将重组细胞进行培养后，裂解细胞回收并纯化得到所表达的LjGSDM蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)将权利要求2或3所述的LjGSDM基因克隆到真核表达载体pFXB-5’Flag，得到表达载体pFXB-LjGSDM；

(2)将pFXB-LjGSDM转化HEK293T细胞，转染后将转染了目的基因的293T细胞传入细胞培养皿；

(3)细胞在细胞培养皿中生长20-30h后，去除细胞培养基，再向细胞培养皿中加入含有蛋白酶抑制剂的IP裂解液对细胞进行裂解；

(4)将细胞裂解液转入离心管，离心后取上清液，加入

M2 AffinityGel、4℃旋转过夜；

(5)次日将结合了目的蛋白的Affinity Gel离心去上清，并用IP裂解液洗涤；

(6)向洗涤后的Affinity Gel中加入IP裂解液和3×FLAG peptide竞争1h后，离心收集上清蛋白溶液。

10.权利要求1所述LjGSDM蛋白在制备杀菌产品或治疗感染性疾病药物中的应用。

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