CN117802010B - 发酵乳杆菌发酵滤液、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种发酵乳杆菌发酵滤液,由保藏编号为CGMCC No.21381的发酵乳杆菌在培养基中培养,分离后得到。实验结果表明,本发明制备得到的发酵滤液能够表现出更高的DPPH自由基清除率,具有更强的抗氧化能力,能提供更强的美白作用;本发明制备得到的发酵滤液能够明显抑制酪氨酸酶活性,具有更优秀的美白效果;本发明制备的发酵滤液在不影响细胞状态的前提下,可以显著抑制酪氨酸酶的活性并且降低黑色素含量,效果与0.2mg/ml曲酸相当。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域,尤其涉及发酵乳杆菌发酵滤液、其制备方法及其应用。
背景技术
曲酸是一种有机酸,主要由青霉属和曲霉属等多种真菌发酵而来,是祛斑美白类化妆品中目前研究最多的酪氨酸酶抑制剂。酪氨酸酶的活性部位含有铜离子,当紫外线照射时,铜离子能激活酪氨酸酶,由于曲酸能够和金属离子形成螯合物,所以它能捕获铜离子,阻止铜离子的激活作用,进而抑制酶的活性,防止黑色素产生。
2017年,世界卫生组织国际癌症研究机构将曲酸列为第3类致癌物质。因此,需要研发新的美白类成分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵乳杆菌发酵滤液、其制备方法及其应用,本发明提供的发酵乳杆菌发酵滤液在美白,包括抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素含量等方面具有显著的效果。
本发明提供了一种发酵乳杆菌发酵滤液,由保藏编号为CGMCC No .21381的发酵乳杆菌在培养基中培养,分离后得到;
所述培养基包括:5~15g/L的酵母粉;5~15g/L小麦蛋白胨;10~15g/L的葡萄糖;1~3g/L的K2HPO4•7H2O;1~3g/L的乙酸钠;1~3g/L的柠檬酸三铵;0.1~1g/L的MgSO4•7H2O;0.01~0.1g/L的MnSO4•4H2O和1~5g/L的吐温80。
保藏编号为CGMCC No .21381的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) SYSUZG3具有抑菌、止痒、祛痘等功效,但是其在MRS培养基中获得的发酵滤液在美白方面功效不显著。基于此,申请人对MRS培养基进行了调整,获得了具有显著美白作用的发酵乳杆菌发酵滤液。
在一些具体的实现方式中,所述培养基包括:8~12g/L的酵母粉;8~12g/L小麦蛋白胨;11~14g/L的葡萄糖;1.5~2.5g/L的K2HPO4•7H2O;1.5~2.5g/L的乙酸钠;1.5~2.5g/L的柠檬酸三铵;0.2~0.8g/L的MgSO4•7H2O;0.03~0.08g/L的MnSO4•4H2O和1.5~4g/L的吐温80。
在一些具体的实现方式中,所述培养基包括:10g/L的酵母粉;10g/L小麦蛋白胨;12g/L的葡萄糖;2.0g/L的K2HPO4•7H2O;2.0g/L的乙酸钠;2.0g/L的柠檬酸三铵;0.5g/L的MgSO4•7H2O;0.05g/L的MnSO4•4H2O和2.0g/L的吐温80。
在一些具体的实现方式中,所述发酵乳杆菌发酵滤液中不含有活菌。
本发明还提供了一种发酵乳杆菌发酵滤液的制备方法,包括以下步骤:
将保藏编号为CGMCC No .21381的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)在培养基中培养,分离后得到;
所述培养基包括:5~15g/L的酵母粉;5~15g/L小麦蛋白胨;10~15g/L的葡萄糖;1~3g/L的K2HPO4•7H2O;1~3g/L的乙酸钠;1~3g/L的柠檬酸三铵;0.1~1g/L的MgSO4•7H2O;0.01~0.1g/L的MnSO4•4H2O和1~5g/L的吐温80。
在一些具体的实现方式中,所述培养基包括:10g/L的酵母粉;10g/L小麦蛋白胨;12g/L的葡萄糖;2.0g/L的K2HPO4•7H2O;2.0g/L的乙酸钠;2.0g/L的柠檬酸三铵;0.5g/L的MgSO4•7H2O;0.05g/L的MnSO4•4H2O和2.0g/L的吐温80。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的发酵乳杆菌发酵滤液或上述技术方案所述的制备方法得到的发酵乳杆菌发酵滤液在制备美白产品中的应用。
在一些具体的实现方式中,所述美白为抗氧化。
在一些具体的实现方式中,所述美白为抑制酪氨酸酶活性。
在一些具体的实现方式中,所述美白为抑制黑色素含量。
在一些具体的实现方式中,所述产品为化妆品或护肤品。
本发明中,按照化妆品分类原则,化妆品可分为:清洁类化妆品、护理类化妆品及美容/修饰类化妆品。
其中,所述清洁类化妆品是指以涂抹、喷洒或其他类似方法,施于人体表面(如表皮、毛发、指甲、口唇等),起到清洁卫生作用或消除不良气味的化妆品。所述护理类化妆品是指以涂抹、喷洒或其他类似方法,施于人体表面(如表皮、毛发、指甲、口唇等),起到保养作用的化妆品。所述美容/修饰类化妆品是指以涂抹、喷洒或其他类似方法,施于人体表面(如表皮、毛发、指甲、口唇等),起到美容、修饰、增加人体魅力作用的化妆品。
皮肤适用的清洁类化妆品包括但不限于洗面奶、卸妆水(乳)、清洁霜(蜜)、面膜、花露水、痒子粉、爽身粉或浴液;皮肤适用的护理类化妆品包括但不限于:护肤膏霜、乳液或化妆水;皮肤适用的美容/修饰类化妆品包括但不限于粉饼、胭脂、眼影、眼线笔(液)、眉笔、香水或古龙水;毛发适用清洁类化妆品包括但不限于洗发液、洗发膏或剃须膏;毛发适用的护理类化妆品包括但不限于护发素、发乳、发油/发蜡或焗油膏;毛发适用的美容/修饰类化妆品包括但不限于定型摩丝/发胶、染发剂、烫发剂、睫毛液(膏)、生发剂或脱毛剂;指甲适用的清洁类化妆品包括但不限于洗甲液;指甲适用的护理类化妆品包括但不限于护甲水(霜)、指甲硬化剂;指甲适用的美容/修饰类化妆品包括但不限于指甲油;口唇适用的清洁类化妆品包括但不限于唇部卸妆液;口唇适用的护理类化妆品包括但不限于润唇膏;口唇适用的及美容/修饰类化妆品包括但不限于唇膏、唇彩或唇线笔。
实验结果表明,本发明制备得到的发酵滤液能够表现出更高的DPPH自由基清除率,具有更强的抗氧化能力,能提供更强的美白作用;本发明制备得到的发酵滤液能够明显抑制酪氨酸酶活性,具有更优秀的美白效果;本发明制备的发酵滤液在不影响细胞状态的前提下,可以显著抑制酪氨酸酶的活性并且降低黑色素含量,效果接近0.2mg/ml曲酸。
附图说明
图1为DPPH自由基清除率的柱状图;
图2是发酵滤液对酪氨酸酶活性的抑制比例柱状图;
图3为实施例2的发酵滤液3%浓度时对α-MSH刺激的B16F10细胞的细胞形态图;
图4为实施例2的发酵滤液对α-MSH刺激的B16F10细胞对酪氨酸酶活性的抑制作用数据;
图5是实施例2的发酵滤液在α-MSH和UVB刺激的B16F10细胞上对黑色素含量的抑制作用图。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请提供的发酵乳杆菌发酵滤液、其制备方法及其应用进行进一步说明。
生物保藏说明:本申请涉及的发酵乳杆菌为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) SYSU ZG3,已于2020年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No .21381。
以下各实施例中,MRS培养基购自广州环凯生物,吐温80为食品级吐温80。
实施例1
按照表1所示的配方配制培养基:
表1 培养基配方
制备过程如下:
将各原料混合后,加1升去离子水溶解,115℃,30分钟灭菌。
对比例1
按照表1所示的配方制备培养基,制备过程与实施例1相同。
实施例2
(1)吸取1毫升甘油管保藏的1级菌种SYSU ZG3转接MRS培养基,放置37℃培养箱静止培养20~24小时;
(2)吸取5%接种量的2级菌种进入大三角摇瓶,采用实施例1制备的培养基,37℃培养箱静止培养20~24小时;
(3)大三角摇瓶中菌种5%接种量接种到5L种子罐,采用实施例1制备的培养基,37℃,80转/分钟培养12小时;
(4)种子罐5%接种量接种至250升生产罐,50转/分钟,采用实施例1制备的培养基中培养,37℃,培养20~24小时后检测OD*10>0.4,判定培养合格。放罐。
(5)10000转/分离心分离上清和菌泥,上清液冻干干燥浓缩五倍,得到浓缩发酵滤液。
对比例2
与实施例2的区别在于,采用对比例1的培养基代替实施例1的培养基,得到浓缩发酵滤液。
对比例3
与实施例2的区别在于,采用二裂酵母进行发酵,二裂酵母来源于CLR。
对比例4
与对比例2的区别在于,采用二裂酵母进行发酵,二裂酵母来源于CLR。
对比例5
与实施例2的区别在于,采用来源于CLR的发酵乳杆菌进行发酵。
对比例6
与对比例2的区别在于,采用来源于CLR的发酵乳杆菌进行发酵。
试验例1 抗氧化实验
(1)储备液配制:95%乙醇:取95 ml乙醇于量筒中,加超纯水至100 ml制得。
0.03% DPPH储备液:称取15 mg DPPH粉末置50 ml棕色容量瓶中,加入约40 ml95%乙醇,超声使其完全溶解,定容至刻度线处,摇匀,作为DPPH储备液:
(2)0.03‰DPPH工作液:根据所需DPPH溶液量,量取1/10体积的0.03%DPPH储备液稀释制得0.03‰DPPH工作液。
(3)阳性对照物L-抗坏血酸用纯水稀释成:0.1mg/mL、0.05 mg/mL、0.025 mg/mL、0.0125 mg/mL系列浓度梯度以验证试验系统。
(4)受试物用纯水稀释成多级浓度样品。参照表2,于96孔板设立样品管(T)、样品本底(T0)、DPPH管(C)和溶剂本底(C0),每一样品的每个受试浓度的样品孔(T)需设立3个平行孔,同时DPPH管(C)也需设立3支平行孔。
(5)在样品管(T)和样品本底(T0)中各加入50 μL相同浓度的样品溶液及100 μL纯水,DPPH管(C)和溶剂本底(C0)则分别加入150 μL 纯水。
(6)在样品管(T)和DPPH管(C)中各加入50 μL DPPH乙醇溶液 ,样品本底(T0)与溶剂本底(C0)以50 μL 95%乙醇代替。
(7)室温静置反应5 min,测OD517。
(8)计算DPPH自由基清除率:清除率(%)=(1-)×100%
其中公式中T为样品孔吸光值,即样品与DPPH反应后溶液吸光值;T0为样品本底吸光值;C为DPPH孔吸光值3次平均值,即未加样品时DPPH溶液的吸光值;C0为溶剂本底吸光值。
(9)统计学分析和作图:均采用GraphPad Prism 9软件进行统计分析及作图。数据若满足正态分布和方差齐性,用配对t检验进行组内实验前后比较,用单因素方差分析 进行组间均数比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
表2 DPPH自由基清除率测定实验样品配液表
结果参见表3和图1,表3为DPPH自由基清除率的数值表,图1为DPPH自由基清除率的柱状图,其中改良前滤液是采用对比例1提供的培养基得到的发酵滤液,改良后滤液是采用实施例1提供的培养基得到的发酵滤液。
表3 DPPH自由基清除率的数值表
由表3和图1可知,采用实施例1提供的培养基得到的发酵滤液比采用对比例1提供的培养基得到的发酵滤液表现出更高的DPPH自由基清除率,说明工艺改良后的浓缩发酵滤液具有更强的抗氧化能力,可能能提供更强的美白作用。
试验例2 美白测试实验
2.1 化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验
(1)阳性对照物曲酸用PBS稀释成:1mg/mL、0.2 mg/mL、0.04 mg/mL、0.008 mg/mL系列浓度梯度以验证试验系统。
(2)受试物用PBS稀释成多级浓度样品。参照表4,于96孔板设立样品管(T)、样品本底(T0)、酶反应管(C)和溶剂本底(C0),每一样品的每个受试浓度的样品孔(T)需设立3个平行孔,同时酶反应管(C)也需设立3支平行孔。
(3)在样品管(T)和样品本底(T0)中各加入50μL相同浓度的样品溶液,酶反应管(C)和溶剂本底(C0)则分别加入50μL PBS。
(4)在样品管(T)和酶反应管(C)中各加入25μL酪氨酸酶溶液 ,样品本底(T0)与溶剂本底(C0)以25μL PBS代替,将样品和酪氨酸酶充分混匀,置于37℃孵育10min。
(5)依次在各管中加入100μL的L-DOPA溶液,反应5min,测OD475。
(6)计算酪氨酸酶抑制率:抑制率(%)=(1-)×100%;
其中公式中T为样品孔吸光值,即样品与酪氨酸酶反应后溶液吸光值;T0为样品本底吸光值;C为酶反应孔吸光值3次平均值,即未加样品时酪氨酸酶和多巴反应的吸光值;C0为溶剂本底吸光值。
(7)统计学分析和作图:均采用GraphPad Prism 9软件进行统计分析及作图。数据若满足正态分布和方差齐性,用配对t检验进行组内实验前后比较,用单因素方差分析 进行组间均数比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
表4 酪氨酸酶活性测定实验样品配液表
结果参见表5和图2,表5是发酵滤液对酪氨酸酶活性的抑制比例数据,图2是发酵滤液对酪氨酸酶活性的抑制比例柱状图。
表5 发酵滤液对酪氨酸酶活性的抑制比例数据
由表5和图2可知,与工艺改良前的浓缩发酵滤液相比,工艺改良后的浓缩发酵滤液能够明显抑制酪氨酸酶活性,说明工艺改良后的浓缩发酵滤液有更优秀的美白效果,并且工艺改良后的浓缩发酵滤液在浓度为3%时对酪氨酸酶活性的抑制作用更优,可以产生更好的美白效果。
2.2体外B16小鼠黑色素瘤细胞酪氨酸酶和黑色素含量试验
(1)取生长状态良好的小鼠黑色素瘤细胞B16 F10,以每孔105个细胞接种于6孔板中。
(2)对于进行黑色素含量测定的细胞,待细胞贴壁后,向除NC孔之外的其他孔进行UVB紫外照射,剂量为50 mJ/cm2,并加入α-MSH诱导B16 F10产黑色素,并加入各适宜浓度的待测样品处理24 h。曲酸为阳性对照。对于进行酪氨酸酶抑制实验的细胞,待细胞贴壁后,向除NC孔之外的其他孔加入α-MSH诱导B16 F10产黑色素,并加入各适宜浓度的待测样品处理24 h。
(3)收集用于酪氨酸酶检测的细胞,用PBS洗两次细胞,每孔加入终浓度为1%的Triton X-100溶液500 μL。
(4)于-80℃冰箱放置30 min,取出后室温放置使其融化,进而完全破裂细胞。离心取上清。
(5)每管加入500 μL的L-DOPA,于37℃放置30min,测OD475。
(6)计算酪氨酸酶活性抑制率:抑制率(%)=()×100%,n为其他组。
(7)PBS洗2次后,消化收集用于黑色素检测的细胞,3200 rpm离心3 min,弃上清。
(8)加入1mL PBS重悬,离心3200 rpm,3 min,弃上清。
(9)加入100 μL含有10% DMSO的1 mol/L的NaOH,混匀。100℃水浴孵育45 min~1h,离心12000 rpm,1 min。
(10)取96孔板,每孔加入50 μl上清液,测OD475。
(11)计算黑色素含量:黑色素含量(%)=()×100%,n为其他组。
(12)统计学分析和作图:均采用GraphPad Prism 9软件进行统计分析及作图。数据若满足正态分布和方差齐性,用配对t检验进行组内实验前后比较,用单因素方差分析进行组间均数比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
结果参见表6、表7、图3、图4和图5,表6为实施例2的发酵滤液在α-MSH刺激的B16F10细胞上对酪氨酸酶活性的抑制作用数据,表7为实施例2的发酵滤液在α-MSH和UVB刺激的B16F10细胞上对黑色素含量的抑制作用数据,图3为实施例2的发酵滤液3%浓度时在α-MSH刺激的B16F10细胞的细胞形态图,图4为实施例2的发酵滤液α-MSH刺激的B16F10细胞对酪氨酸酶活性的抑制作用数据,其中图4中A图是测试照片,图4中B图是抑制作用柱状图,图5是实施例2的发酵滤液在α-MSH和UVB刺激的B16F10细胞上对黑色素含量的抑制作用图,其中,图5中A图是细胞内黑色素含量的图片,图5中B图是抑制作用柱状图。
表6 发酵滤液对酪氨酸酶活性的抑制作用数据
表7 发酵滤液对黑色素含量的抑制作用数据
由表6、表7、图3、图4和图5可知,改良后的3%浓缩发酵滤液在不影响细胞状态的前提下,可以显著抑制酪氨酸酶的活性并且降低黑色素含量,说明改良后的3%浓缩发酵滤液在美白上有优秀效果,效果接近0.2mg/ml曲酸。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种发酵乳杆菌发酵滤液,由保藏编号为CGMCC No .21381的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)在培养基中培养,10000转/分离心分离后得到;所述培养基包括:10g/L的酵母粉;10g/L小麦蛋白胨;12g/L的葡萄糖;2.0g/L的K2HPO4·7H2O;2.0g/L的乙酸钠;2.0g/L的柠檬酸三铵;0.5g/L的MgSO4·7H2O;0.05g/L的MnSO4·4H2O和2.0g/L的吐温80。
2.一种发酵乳杆菌发酵滤液的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将保藏编号为CGMCC No .21381的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)在培养基中培养,10000转/分离心分离后得到;
所述培养基包括:10g/L的酵母粉;10g/L小麦蛋白胨;12g/L的葡萄糖;2.0g/L的K2HPO4·7H2O;2.0g/L的乙酸钠;2.0g/L的柠檬酸三铵;0.5g/L的MgSO4·7H2O;0.05g/L的MnSO4·4H2O和2.0g/L的吐温80。
3.权利要求1所述的发酵乳杆菌发酵滤液或权利要求2所述的制备方法得到的发酵乳杆菌发酵滤液在制备美白产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述美白为抗氧化。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述美白为抑制酪氨酸酶活性。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述美白为抑制黑色素含量。
7.根据权利要求3~6任意一项所述的应用,其特征在于,所述产品为化妆品。
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