CN116919859A - 姬松茸金花茶发酵物及其制备方法、应用 - Google Patents

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CN116919859A CN202310730269.4A CN202310730269A CN116919859A CN 116919859 A CN116919859 A CN 116919859A CN 202310730269 A CN202310730269 A CN 202310730269A CN 116919859 A CN116919859 A CN 116919859A
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Abstract

本发明提供一种姬松茸金花茶发酵物及其制备方法、应用。该姬松茸金花茶发酵物的制备方法，包括将姬松茸菌液接种至发酵底物中进行发酵培养后取上清液即得；所述发酵底物包括适量配比的马铃薯葡萄糖液体培养基和金花茶粉末。本发明利用姬松茸液体发酵适当配比的含金花茶粉的组合物，可取得协同功效，特别是选用新采集的保藏编号为CGMCC No.23250姬松茸菌种，在合适条件下发酵主要由新鲜土豆匀浆或滤液或马铃薯葡萄糖水、金花茶粉、大豆肽以及适量葡萄糖组成的复合底物，制得性能良好的复合发酵物，具有良好的促进细胞增殖、抗炎等功效，用于化妆品安全无副作用，肤感好，具有良好的修复效果，能增强皮肤弹性，还能长效吸收。

Description

姬松茸金花茶发酵物及其制备方法、应用
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种姬松茸金花茶发酵物及其制备方法、应用。
背景技术
姬松茸(学名：Agaricus blazei Murill)，又名巴西蘑菇，别名姬菇、小松菇、小松口蘑、阳光蘑菇、柏氏蘑菇、巴氏蘑菇；在真菌分类上属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、蘑菇科、蘑菇属真菌。该菌属于中高温菇类，菌丝生长温度10-33℃，37℃时菌丝细胞死亡，最适宜的生长温度为22-27℃，子实体发生的温度范围约20-33℃，适温22-25℃。
姬松茸是一种珍贵的食药兼用真菌。菌肉脆味美有杏仁味，营养丰富，具有很高的抗癌活性和增强细胞的免疫功能，降血糖、血压，降低胆固醇，抗动脉血管硬化以及改善骨质增生，美容，安神等作用。从中提取的姬松茸多糖，也具有突出的抗肿瘤作用，免疫调节作用，增强骨髓造血功能、抑菌作用。因此，姬松茸的深加工产品琳琅满目等。国际上对姬松茸多糖的研究主要集中在日本。在我国，姬松茸最初是在1992年由福建省农科院从日本引进，经过多年发展，对其研究逐渐深入。但市场仍然期待有更多的性能优良的姬松茸新菌种及其提取物、制品涌现。
金花茶(Camellia petelotii(Merr.)Sealy)为山茶科山茶属木本植物，是中国特有的茶花品种，素有“茶族皇后”称号，分布于广西、广东等地。金花茶是广西壮族民间的传统用药，在《广西中药材标准》、《广西民族药简编》、《广西药用植物园药用植物名录》、《现代本草纲目》、《广西药用植物名录》中均有记载。金花茶叶传统药用价值为清热解毒、利尿消肿，咽喉炎、肾炎、痢疾、水肿，尿路感染，治疗高血压，预防肿瘤(水煎服或当茶饮)，花用于便血，月经不调。对于金花茶提取物在化妆品方面的应用的探索主要集中于金花茶花和叶的水提物，其中金花茶花水提物的功效在于补水保湿，而金花茶叶水提物的功效在于美白，可参见如下专利文献，CN201510266489.1《金花茶叶提取物的应用、美白护肤组合物及其制备方法》、CN 201510266465.6《金花茶花提取物的应用、保湿护肤组合物及其制备方法》、CN201510266489.1《金花茶叶提取物的应用、美白护肤组合物及其制备方法》。然而却少有金花茶发酵提取物的报道。
本申请人发现利用该姬松茸液体发酵适当配比的含金花茶粉(叶)的组合物，可取得协同功效，所得发酵物具有更为优良的性能，特别是采用申请人在云南大理野外采集筛选出的姬松茸菌株JSR-1进行发酵所得发酵物具有更可观的化妆品应用前景。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供了一种姬松茸金花茶发酵物及其制备方法、应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：
一种姬松茸金花茶发酵物的制备方法，将姬松茸菌液接种至发酵底物中进行发酵培养后取上清液即得；所述发酵底物包括适量配比的马铃薯葡萄糖液体培养基和金花茶粉末。本申请所述的金花茶粉末是指山茶科山茶属木本植物金花茶(Camellia petelotii(Merr.)Sealy)的干燥叶粉碎所得的粉末材料。
上述姬松茸金花茶发酵物的制备方法，作为一种优选实施方式，所述发酵底物中，以水添加量100重量份为基准，包括葡萄糖0.5～2份(比如0.8份、1份、1.2份、1.5份、1.8份等)、大豆肽0～0.5份(比如0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.45份等)、新鲜土豆0.5～5份(比如0.8份、1份、2份、3份、4份等)、金花茶粉末0.1～3.0份(比如0.1份、1.5份、2份、2.5份等)。比如，发酵底物的制备可以采用如下方法：往水中添加0.5％～2％葡萄糖、0～0.5％的大豆肽(DD)、0.5％～5％土豆、0.1％～3.0％金花茶粉末，匀浆灭菌得到发酵底物。
上述姬松茸金花茶发酵物的制备方法，作为一种优选实施方式，具体包括如下步骤：
1)姬松茸菌液的制备：将姬松茸菌株接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基活化，然后将得到的单菌落接种至葡萄糖马铃薯液体培养基扩大培养得到所述姬松茸菌液；
2)发酵底物的制备：按比例往水中添加适量葡萄糖、大豆肽、新鲜土豆、金花茶粉末，匀浆，灭菌得到所述发酵底物；
3)发酵培养：将所述姬松茸菌液接种至所述发酵底物，经所述发酵培养后，取上清液，即得所述姬松茸金花茶发酵物。
上述姬松茸金花茶发酵物的制备方法，作为一种优选实施方式，所述姬松茸菌株为保藏编号为CGMCC No.23250的姬松茸菌株JSR-1。申请人从云南省大理市(100.2305,25.59238)采集野生真菌子实体，挑取其菌盖和菌柄交接处组织，然后置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d得到菌丝，挑出菌丝纯化两次获得真菌的纯化菌株，得到上述姬松茸菌株JSR-1，并提交保藏，保藏编号为CGMCC No.23250。
上述姬松茸金花茶发酵物的制备方法，作为一种优选实施方式，所述姬松茸菌液的制备方法包括：将所述姬松茸菌株接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基活化，然后将得到的菌落菌毛接种至葡萄糖马铃薯液体培养基扩大培养至菌球分散较多，静置后约占液体总体积三分之一至二分之一时即得所述姬松茸菌液。
上述姬松茸金花茶发酵物的制备方法，作为一种优选实施方式，所述姬松茸菌液以0.5～20％的比例接种至所述发酵底物。
上述姬松茸金花茶发酵物的制备方法，上述姬松茸金花茶发酵物的制备方法，所述发酵培养的温度是20～30℃(比如22℃、25℃、28℃等)、时间3～10d(比如4天、5天、6天、7天、8天、9天等)。
一种姬松茸金花茶发酵物，为根据上述方法制得的姬松茸金花茶发酵液。
一种姬松茸金花茶发酵物，为采用上述姬松茸金花茶发酵液经冷冻干燥所制得的姬松茸金花茶发酵冻干粉。
一种上述姬松茸金花茶发酵物在制造化妆品上的应用。
将上述姬松茸金花茶发酵液和其他原料配制成姬松茸金花茶发酵护肤水，包括上述姬松茸金花茶发酵液50wt％以上(比如55wt％、60wt％、70wt％、80wt％、90wt％、95wt％等)。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明利用姬松茸液体发酵适当配比的含金花茶粉(叶)的组合物，可以取得协同功效，特别是选用新采集的保藏编号为CGMCC No.23250姬松茸菌种，在合适条件下，发酵主要由新鲜土豆匀浆(0.5％～5％)或滤液或马铃薯葡萄糖水(商品名)、金花茶粉、大豆肽(DD)以及适量葡萄糖组成的复合底物，制备出性能良好的复合发酵物，具有良好的促进细胞增殖、抗炎等功效。
2、采用本发明方法得到的姬松茸金花茶发酵物用于化妆品安全无副作用，肤感好，具有良好的修复效果，能增强皮肤弹性，还能长效吸收。
本发明的姬松茸新菌株保藏日期为2021年9月13日，保藏编号为CGMCC No.23250，分类命名为：巴氏蘑菇(Agaricus blazei)JSR-1，又称姬松茸JSR-1，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
附图说明
图1示出了实施例2中21-25号菌种提取的姬松茸多糖的体外自由基清除能力测定结果；
图2示出了实施例2的UVB损伤保护实验中对胞内蛋白(FLG、AQP3)的检测结果；
图3示出了实施例2的UVB损伤保护实验中对胞内炎症因子(KLK7、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8)的检测结果；
图4示出了实施例2的UVB损伤修复实验中对胞内炎症因子(KLK7、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8)的检测结果；
图5示出了实施例2的UVB损伤修复实验中对胞内蛋白(FLG、AQP3)的检测结果；
图6示出了实施例2的UVA修复实验中对Col-1、ELN、MMP-1、GSH-Px的检测结果；
图7示出了实施例3制得的金花茶发酵液的细胞增殖和毒性实验结果；
图8示出了实施例3制得的金花茶发酵液的抗炎性能测试的结果；
图9示出了实施例3制得的四种金花茶发酵液的透皮吸收性能测试的结果；
图10示出了实施例4制得的两种配方的姬松茸金花茶发酵护肤水照片；
图11示出了实施例4制得的两款护肤水和SKⅡ的感官测试评价结果；
图12示出了实施例4制得的姬松茸金花茶发酵护肤水(配方1)的对皮肤经皮水分散失量(TEWL)的影响；
图13示出了实施例4制得的姬松茸金花茶发酵护肤水(配方1)对皮肤弹性指标R2的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、姬松茸JSR-1(CGMCC No.23250)的分离、鉴定和保藏
1、菌种的分离
本申请人从云南省大理市(100.2305,25.59238)采集野生真菌子实体，挑取其菌盖和菌柄交接处组织，然后置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d，得到菌丝。挑出菌丝纯化两次，获得真菌的纯化菌株JSR-1。每次纯化的步骤为：将菌丝置于装有PDA加富培养基的斜面培养基上，25℃暗培养5d。
2、形态学鉴定
取液体菌丝接种于PDA培养基上，25℃培养3天后，菌丝形态特征明显，初期菌丝呈浓密和放射生长，后期随着菌丝体向前生长后菌丝集中成白点，菌丝表现和背面呈白色。有分枝，弯曲。
3、分子系统发育分析
采用真菌DNA小提试剂盒I型(离心柱型)产品编号：D301-02进行基因组DNA提取。采用ITS通用引物序列为ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC为引物进行PCR反应。反应程序为：95℃预变性1min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环，72℃终延伸5min。对得到的PCR产物进行测序，测序结果表明JSR-1的rDNA-ITS序列与NCBI数据库中已公开的rDNA-ITS序列进行在线同源性比对，结果显示此菌种(JSR-1)所测得的ITS序列部分与Agaricus sp.(伞菌属)Agaricus subrufescens strain的ITS序列具有86.2％的同源性。将其命名为：巴西蘑菇(Agaricus blazei)JSR-1，又称姬松茸JSR-1。
4、巴氏蘑菇JSR-1的菌种保藏
JSR-1已于2021年09月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.23250。JSR-1的全称为巴氏蘑菇(Agaricus blazei)JSR-1CGMCC No.23250。
实施例2、菌种筛选对比实验
巴氏蘑菇(姬松茸)21-25号(其中21、22号采集自云南省大理市；23、24号为购买的普通巴氏蘑菇(姬松茸)菌种，购于普通微生物菌种保藏管理中心，编号分别为GCMCC5.485和GCMCC5.787；25号来源于福建农科院；其中21号为菌种JSR-1)，用PDA平板对这5种巴氏蘑菇(姬松茸)菌种进行活化，取单菌落转移至马铃薯葡萄糖液体培养基中进行扩大培养，培养条件是28℃、150rpm培养5d，获得发酵液，随后经过浓缩、冻干步骤，获得五种发酵物冻干粉，并以编号命名21～25。对所得五种发酵物冻干粉进行测试和评价。
一、体外自由基清除能力测定
1、测定总抗氧化能力(ABTS法)。
ABTS工作液的配制：将5mL 7mmol/L ABTS水溶液和88μL 140mmol/L过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS·+储备液。使用前用无水乙醇稀释成工作液，使其在734nm下的吸光度在0.70±0.02。
样品测定：取4mL ABTS工作液，加入40μL待测液，准确震荡30s，测定反应6min后734nm波长下的吸光度A样品。按照下式计算清除率：ABTS清除率/％＝(1-A样品/0.700)×100。
2、测定其清除1-二苯基-2-三硝基苦肼自由基(DPPH·)的能力。
实验方法参照文献(吴迪，刘平平，李萌，王昌涛，赵丹，张佳婵.葛根水提液测定其及葛根发酵液的体外抗氧化及抗衰老功效评价[J].食品工业科技，2019，40(12):285-290+294.)，具体是：用无水乙醇配制浓度为4mg/mL的DPPH·溶液，向2mLDPPH·溶液中加入2mL样品，混匀，静置30min，3000r/min离心10min，取上清液于517nm处测吸光值。
待测物质清除DPPH·的能力可以用清除率来表示，清除率越大，清除的能力越强。其公式为：清除率I＝[I-(Ai-Aj)/A0]×100％；其中：Ai-2mL DPPH·溶液+2mL样品；Aj-2mLDPPH·溶液的溶剂+2mL样品；A0-2mL DPPH·溶液+2mL样品的溶剂。
3、测定其清除羟自由基(·OH)的能力。
实验方法参照文献并稍作修改(赵丹，许丹妮，王冬冬，张佳婵，李萌，王昌涛.灵芝发酵液的成分检测及美白与抗衰老功效评价[J].日用化学工业，2016，46(04):226-230+242.)。具体是：向1mL样品中加入6mmol/L的FeSO4溶液1mL，混匀后加入6mmol/L的H2O2溶液1mL，混匀后静置10min，加入6mmol/L的水杨酸溶液1mL，混匀后37℃水浴中反应30min，3000r/min离心10min，取上清于510nm处测吸光值。
自由基清除实验结果参见下表1和图1，可以看出，第25号菌种提取的姬松茸多糖的自由基清除能力较佳。
表1五种姬松茸多糖的自由基清除能力
二、抗炎功效：UVB和UVA损伤保护、损伤修复性能测试
损伤保护性能测试实验中，设置空白对照组(Control，无样品无UVB)、模型组(Model，无样品有UVB)、样品组(Samples，有样品先保护再加UVB损伤)、阳性对照组(Positive control，甘草酸二钾，剂量1％)。
选择生长良好的HaCaT细胞，控制细胞数为1.5x106个·mL-1，铺设于6孔板中，每孔2mL，然后在37℃，5％CO2培养箱过夜，加入21-25号姬松茸多糖样品保护8h，选择20mJ/cm2的UVB(致损伤剂量)照射HaCaT细胞，照射之后加入无血清培养基培养24h。收集细胞上清，并用裂解液裂解贴壁细胞，离心后取上清保存于-20℃冰箱中用于检测胞内炎症因子表达量和蛋白含量。
损伤修复性能测试测试实验中，设置空白对照组(Control：无UVB/UVA无样品)、模型组(Model：有UVB/UVA无样品)、样品组(Samples：UVB/UVA损伤后加入样品修复)、阳性对照组(Positive control，甘草酸二钾，剂量1％)。
选择生长良好的HaCaT细胞，控制细胞数为1.5x106个·mL-1，铺设于6孔板中，每孔2mL，然后在37℃，5％CO2培养箱过夜，选择20mJ/cm2的UVB照射HaCaT细胞(先诱导损伤)，照射之后加入21-25号姬松茸多糖样品修复24h。收集细胞上清，并用裂解液裂解贴壁细胞，离心后取上清保存于-20℃冰箱中用于检测胞内炎症因子表达量和蛋白含量。
1、UVB损伤保护功能测试
KLK7、IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-6均为炎症因子，数值升高表示促炎作用，数值降低表示抗炎作用。UVB损伤保护模型胞内炎症因子(KLK7、IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-6)检测结果参见表2和图3，可以看出21号菌和25号菌提取的多糖具有较优的抗炎保护性能。
表2对比五种姬松茸多糖的UVB损伤保护作用检测结果
丝聚蛋白(filaggrin,FLG)是人体皮肤角质层中连接角蛋白纤维的重要分子，在FLG单体协助连接下，角蛋白纤维规则地聚集，在表皮的最外层形成坚实的物理屏障，可以防止表皮水分的丢失和外界过敏物质的入侵。AQP3为水通道蛋白3，与水分子的运输有关，数值升高表示有助于水分进入细胞，与保湿作用相关。UVB损伤保护模型胞内蛋白检测结果参见表3和图2，可以看出21号菌提取的姬松茸多糖表现更优。
表3对比五种姬松茸多糖的UVB损伤保护作用检测结果
2、UVB损伤修复功能测试
UVB损伤修复模型胞内炎症因子检测结果参见表4和图4，可以看出21号姬松茸提取的多糖具有更优的UVB损伤修复性能，24号和25号姬松茸提取的多糖也具有较佳的UVB损伤修复性能。
表4对比5种姬松茸多糖的UVB损伤修复作用检测结果
UVB损伤修复模型胞内蛋白检测结果参见表5和图5，可以看出21-25号姬松茸提取多糖都具有较佳表现。
表5对比5种姬松茸多糖的UVB损伤修复作用检测结果
三、抗衰老功效：UVA损伤保护性能测试
UVA损伤保护性能测试实验中，设置空白对照组(Control，无样品无UVA)、模型组(Model，无样品有UVA)、样品组(Samples，有样品先保护再加UVA损伤)、阳性对照组(Positive control，维生素C，0.100mg/mL)。
选择生长良好的人皮肤成纤维细胞(HSFs)，控制细胞数为1.5x106个·mL-1，铺设于6孔板中，每孔2mL，然后在37℃，5％CO2培养箱过夜，加入21-25号姬松茸多糖样品保护8h，选择7J/cm2的UVA(致损伤剂量)照射HSFs细胞，照射之后加入无血清培养基培养24h。收集细胞上清，并用裂解液裂解贴壁细胞，离心后取上清保存于-20℃冰箱中用于检测胞内抗氧化酶及蛋白含量。
检测指标：COL-I(胶原蛋白I，数值高越好)、ELN(弹性蛋白，数值高越好)、MMP-1(基质金属蛋白酶1，作用为分解胶原蛋白，数值低较好)、GSH-Px(谷胱甘肽过氧化物酶，属于抗氧化酶，数值越高越好)。
UVA损伤保护模型胞内蛋白检测结果参见表6和图6，可以看出21号姬松茸提取的多糖具有UVA损伤保护性能。
表6对比五种姬松茸多糖的UVA损伤保护作用检测结果
实施例3、姬松茸发酵实验
一种姬松茸金花茶发酵物的制备方法，包括如下步骤：
1)姬松茸菌液的制备：将保藏编号为CGMCC No.23250的姬松茸菌株JSR-1接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基活化，然后将得到的菌落菌毛接种至葡萄糖马铃薯液体培养基扩大培养至菌球分散较多，静置后约占液体总体积三分之一至二分之一时，得到可供下一步生产的姬松茸菌液；
2)发酵底物的制备：按照比例计算，1L水中添加10g土豆后匀浆，继续往匀浆液中加入5g金花茶粉末，20g葡萄糖和2gDD(配方记为：2％葡萄糖+0.2％的DD+1％土豆+0.5％金花茶粉末)，混匀，分装至三角烧瓶中，灭菌得发酵底物。
3)发酵培养：将步骤1)所得姬松茸菌液以3％的比例接种至步骤2)所得发酵底物中进行发酵培养，发酵培养的温度是28℃、时间5d，150rpm，结束后取上清液，即得姬松茸金花茶发酵物。部分制成冻干粉保存备用。
以未经发酵培养的底物和单纯土豆培养基发酵培养实验作为对照，具体底物配方和发酵工艺参见下表7。
表7姬松茸发酵实验的底物配方和发酵工艺表
检测发酵物中成分如下表8所示。
表8成分检测结果
实验组别 总糖(mg/ml) 多肽(100ug/mL) pH 固形物含量
未接种(未发酵)对照组 114.78 1.96 6.2 2.5％
单纯培养JSR-1 120.17 2.19 5.6 2.6％
金花茶发酵液 130.95 2.11 5.7 2.7％
实施例4、性能测试
对实施例3所得产物进行性能测试。
一、细胞增殖和毒性实验
将对数生长期状态良好的HaCaT细胞以1.0×104个/孔的密度接种于96孔培养板中，37℃，5％CO2环境中培养过夜。分别加入不同浓度样品溶液，每个样品做7～8个不同浓度，每个浓度做六个平行，空白组未作处理，模型组以及各个样品组均首先UVA照射(44min，4J/cm2)，未接种对照组样品、单纯培养JSR-1、金花茶发酵液样品分别添加至细胞，培养24小时。每孔加入10μL CCK8溶液，培养2.5h后，于450nm处测量各孔的吸光值(OD值)。细胞存活率＝(测定孔OD值-空白对照OD值)/(细胞对照组OD值-空白对照OD值)*100％。
结果参见图7。可知，模型组细胞存活率显著性低于空白组，表示UVA建模成功。未接种对照组样品没有提高细胞存活率的作用，单纯培养JSR-1和金花茶发酵液都可以促进损伤的HaCaT细胞的增殖，其中，两者相比，金花茶发酵液具有比单纯培养JSR-1更好的增殖效果。
二、抗炎性能测试
取对数期HaCaT细胞，以1×105个/mL的密度将细胞悬浊液接种于6孔细胞培养板上，每孔加入2mL细胞悬液，孵箱培养24h，小心吸去上清。空白组加入DMEM溶液2mL；实验组加入含有样品(JSR-1和金花茶发酵液冻干粉，两者分别为单纯培养的JSR-1和金花茶发酵液经过冷冻干燥后的冻干粉粉末；金花茶提取物为购买自西安优硕生物科技有限公司的成品)的DMEM溶液2mL；阳性对照组加入甘草酸二钾(50μg/mL)的DMEM溶液2mL，用PBS小心冲洗2次，加入1mL PBS，置于UVA照射下(44min，4J/cm2)。每组样品重复3个平行。继续加入含样品或阳性药的培养基培养24h。细胞裂解液处理细胞，10000r/min 4℃下离心10min，取上清，得到细胞裂解上清液。取20μL细胞裂解液用BCA试剂盒检测样品中的总蛋白含量；取20μL细胞裂解液用BCA试剂盒检测样品中的总蛋白含量；按照ELISA试剂盒说明书进行实验操作后，计算炎症因子IL-8释放水平。炎症因子的释放量需要BCA含量校正。
结果参见图8。可知，模型组IL-8显著性高于Control，表示建模成功。阳性对照甘草酸二钾、JSR-1、金花茶发酵液冻干粉、金花茶提取物均有助于降低损伤的HaCaT细胞的炎性因子IL-8。并且金花茶发酵液比阳性对照甘草酸二钾更显著的降低IL-8的作用；与JSR-1相比，金花茶发酵液冻干粉显著性降低，表示具有比JSR-1更好的抗炎作用；并且与金花茶提取物相比，也具有更好的抗炎作用。
三、透皮吸收实验
实验过程：向体外渗透扩散装置恒温槽中加入适量水。开启电源和恒温槽磁力搅拌，设定恒温槽中水温为37±0.1℃。将制备好的鼠皮用铁夹子固定在两室扩散池之间，向垂直扩散池的接受池内加入5mL接受液，放入体外渗透扩散装置恒温槽中预热，设定接受池搅拌速度为400r/min。向供给池内分别加入供给液，以保鲜膜封住上口。开始记时，当样品渗透0、2、6、8小时时，分别取样500μl置具塞离心管中，每次取样的同时向接受池中补充等量的接受液并排除池中的气泡。将测定样品总糖含量。根据接受室总糖含量与原液总糖的比值记为透过率，并做出透过率与时间的曲线图。接受液为浓度为0.9％的NaCl溶液(生理盐水)；供给液分别为待检测样品，分别为实施例3制得的金花茶发酵液(本实验记为金花茶发酵液1)以及与实施例3相同比例底物分别接种22号菌种、灵芝菌种wG055(保藏编号CGMCCNo.17789)、裂褶菌菌种YSC1(保藏编号为CGMCC No.17788)的发酵所得样品即金花茶发酵液2、金花茶发酵液3、金花茶发酵液4。
发酵液状态及透皮吸收量见表9，图9。
表9透皮吸收结果
由图9和表9可知，金花茶发酵液1虽然在2h时透过率仅为2.60mg/cm2，但是随着透皮试验时间的延长，到4h时，达到5.45mg/cm2，8h达到7.27mg/cm2。这意味着，金花茶发酵液1有着较优的累计透过率，由其适用于长效营养化妆品。
四、透明质酸酶抑制率实验
分别以上述的金花茶发酵液1、金花茶发酵液2、金花茶发酵液3、金花茶发酵液4为研究对象，以1％的甘草酸二钾为阳性对照，以蒸馏水为阴性对照。按照表10实验步骤依次进行实验，并根据如下公式计算得透明质酸酶抑制率。实验结果见表11。
表10透明质酸酶抑制试验方法
透明质酸酶抑制率(％)＝(C-D)-(A-B)/(C-D)×100％
式中：A—(透明质酸酶+样品+透明质酸钠)试样溶液的OD值；B—(醋酸缓冲液+样品+醋酸缓冲液)试样空白的OD值；C—(透明质酸酶+去离子水+透明质酸钠)对照溶液的OD值；D—(醋酸缓冲液+去离子水+醋酸缓冲液)对照空白的OD值。
表11透明质酸酶抑制实验结果
样品 菌种 透明质酸酶抑制能力
甘草酸二钾(1％) —— 82.88％ 阳性对照
蒸馏水 1.24％ 阴性对照
金花茶发酵液1 JSR-1 76.18％
金花茶发酵液2 22号 56.30％
金花茶发酵液3 灵芝 70.59％
金花茶发酵液4 裂褶菌 55.72％
从表11可以看出，金花茶发酵液1的抑制能力能达到76.18％，其次为金花茶发酵液3。由姬松茸的另一株22号菌发酵所得的金花茶发酵液2的抑制能力仅56.30％，用裂褶菌发酵所得的金花茶发酵液4的抑制能力也只有55.72％。
实施例5、姬松茸金花茶发酵护肤水的制备
用实施例3制得的金花茶发酵液来制备护肤水，成分配比见表12，操作步骤如下：
1)在称重过的烧杯中依次称取丁二醇、甘油和透明汉生胶，搅拌分散均匀后加入称取金花茶发酵液。搅拌加热升温至80-85℃。搅拌10-15分钟，转速35-40转/分钟，均匀透明后，搅拌降温；
2)降温至55-60℃，依次加入称取的海藻糖、α-甘露聚糖、燕麦β-葡聚糖、EDTA-2Na，搅拌溶解至均匀透明；
3)搅拌降温，45℃时分别加入防腐剂和增溶(增溶剂HPS)后的香精，搅拌溶解至透明；
4)搅拌降至室温后称量，添加去离子水补足重量，搅拌均匀。
表12护肤水配方
所得两个配方的姬松茸金花茶发酵护肤水产品照片参见图10。
实施例6、姬松茸金花茶发酵护肤水的性能测试
1、安全性检测
参照《化妆品安全技术规范(2015年版)》进行皮肤封闭型斑贴试验。按表13标准观察皮肤反应。并记录观察结果。表14为人体封闭斑贴试验结果，通过对30名志愿者的测试发现，三个配方样品均未出现阳性反应，说明样品较为安全。
表13皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
表14皮肤封闭型斑贴试验结果
2.感官测试
对三款产品进行感官测试，剖析水类产品在使用时的各项感官属性差异。以市售的竞品护肤水(SK II神仙水)为参照。
分析结果参见表15，图11。属性列表说明见表16。总体而言，三款爽肤水在感官差异上较为明显，但配方2与竞品之间没有差异。其中，配方1质地最厚，拉丝感最强，使用时涂抹较薄，使用后皮肤最光滑/最不粘手/残留物的量的最少(即时/1min/2min)，较不光亮(即时/1min/2min)，总体吸收速度更快；配方2较透明，产品水感最强，使用后皮肤较光亮(即时)；竞品较不透明，产品油感最强。
表15感官评价数据表(平均值)
表16属性列表说明
3.人体功效评价
志愿者选择：30名，根据赫尔辛基宣言，志愿者的选择遵循人体测试的医学和伦理学标准，所有志愿者的测试都必须出于志愿者本人自愿，并在测试前签署知情同意书。志愿者在签署知情同意书之前，测试人员需要告知志愿者本次测试的目的、可能的利益、潜在的风险和问题以及相关的权利和义务。
入选标准：符合下列所有条件的志愿者将被入选：1)年龄30～45岁的志愿者，男女不限；2)皮肤屏障脆弱，皮肤脸颊下方经皮水分散失量TEWL>15g/h/m2，眼角下方弹性指标R2<0.65；3)测试时志愿者身体健康；4)没有临床医生认为不适合参加测试的其他原因；5)自愿参加并签署知情同意书；6)能按测试方案要求完成规定内容。
排除标准：符合下列任一项者将被排除：1)患有严重系统疾病、免疫缺陷或自身免疫性疾病者；2)患有过敏性疾病或最近1～2年有过化妆品过敏者；3)计划怀孕或妊娠或哺乳期以及产后六个月内的妇女；4)对护肤品或局部药物过敏者；5)在过去8周内在测试部位局部或全身使用过维甲酸；6)在过去4周内在测试部位局部或全身使用过抗生素、类固醇或其它药品；7)现在或最近三个月受试部位参加其它测试者；8)测试区域患有皮肤科疾病或正在接受药物治疗者。
测试要求如下：1)测试环境：温度22±1℃；湿度50％-60％。2)测试区域：面部皮肤脸颊。3)测试时间点：基础值、使用后14天、使用后28天。4)测试指标：经皮水分散失量(TEWL)、R2。
测试结果：
TEWL反映皮肤屏障的指标，数值越大，表示皮肤屏障受损；数值降低，表示皮肤屏障损伤好转。参见图12(p<0.05，表示与0D相比，具有显著性差异)可知，经过使用后，TEWL值由18.01g/h/m2显著性降低至16.34g/h/m2(14D)、15.49g/h/m2(28D)，表示该样品(即配方1的姬松茸金花茶发酵护肤水)具有修复功效。
R2值为弹性指标，越接近于1，表示弹性越好。参见图13(p<0.05，表示与0D相比，具有显著性差异)可知，样品使用后，R2值由0.60提高至0.64(14D)、0.65(28D)，表示皮肤弹性增强，样品(即配方1的姬松茸金花茶发酵护肤水)具有提高皮肤弹性的作用。
对比例1-4
参照实施例3的工艺，发明人还制备了黄瓜发酵液、苦瓜发酵液、刺玫果发酵液、薄荷发酵液。
参照实施例4中第一部分的方法进行细胞增殖和毒性实验。结果参见表17，可知相比其他发酵底物，实施例3制得的金花茶发酵液具有更优的促进损伤的HaCaT细胞增殖效果。
表17对比例1-4的发酵液制备工艺和性能测试结果
尽管上面已经通过本发明的具体实施例的描述对本发明进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本发明的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本发明所要求保护的范围内。

Claims (10)

1.一种姬松茸金花茶发酵物的制备方法，其特征在于，将姬松茸菌液接种至发酵底物中进行发酵培养后取上清液即得；所述发酵底物包括适量配比的马铃薯葡萄糖液体培养基和金花茶粉末。
2.根据权利要求1所述的姬松茸金花茶发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵底物中，以水添加量100重量份为基准，包括葡萄糖0.5～2份、大豆肽0～0.5份、新鲜土豆0.5～5份、金花茶粉末0.1～3.0份。
3.根据权利要求2所述的姬松茸金花茶发酵物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1)姬松茸菌液的制备：将姬松茸菌株接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基活化，然后将得到的单菌落接种至葡萄糖马铃薯液体培养基扩大培养得到所述姬松茸菌液；
2)发酵底物的制备：按比例往水中添加适量葡萄糖、大豆肽、新鲜土豆、金花茶粉末，匀浆，灭菌得到所述发酵底物；
3)发酵培养：将所述姬松茸菌液接种至所述发酵底物，经所述发酵培养后，取上清液，即得所述姬松茸金花茶发酵物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的姬松茸金花茶发酵物的制备方法，其特征在于，所述姬松茸菌株为保藏编号为CGMCC No.23250的姬松茸菌株JSR-1。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的姬松茸金花茶发酵物的制备方法，其特征在于，所述姬松茸菌液的制备方法包括：将所述姬松茸菌株接种于葡萄糖马铃薯琼脂培养基活化，然后将得到的菌落菌毛接种至葡萄糖马铃薯液体培养基扩大培养至菌球分散较多，静置后约占液体总体积三分之一至二分之一时即得所述姬松茸菌液。
6.根据权利要求5所述的姬松茸金花茶发酵物的制备方法，其特征在于，所述姬松茸菌液以0.5～20％的比例接种至所述发酵底物。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的姬松茸金花茶发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度是20～30℃、时间3～10d。
8.一种姬松茸金花茶发酵物，其特征在于，所述姬松茸金花茶发酵物为根据权利要求1-7中任一项所述的方法制得的姬松茸金花茶发酵液或由所述姬松茸金花茶发酵液经冷冻干燥所制得的姬松茸金花茶发酵冻干粉。
9.一种如权利要求8所述的姬松茸金花茶发酵物在制造化妆品上的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将如权利要求8姬松茸金花茶发酵液和其他原料配制成姬松茸金花茶发酵护肤水，所述姬松茸金花茶发酵护肤水包括所述姬松茸金花茶发酵液50wt％以上。
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