KR101784201B1

KR101784201B1 - 개똥쑥 발효 추출물을 유효성분으로 하는 피부개선용 조성물

Info

Publication number: KR101784201B1
Application number: KR1020160023895A
Authority: KR
Inventors: 안인숙
Original assignee: (주)진셀팜
Priority date: 2016-02-29
Filing date: 2016-02-29
Publication date: 2017-10-12
Also published as: KR20170103046A

Abstract

본 발명은 개똥쑥 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

개똥쑥 발효 추출물을 유효성분으로 하는 피부개선용 조성물{COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN CONDITIONS CONTAINING FERMENTED EXTRACTS OF ARTEMISIA ANNUA AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 개똥쑥 발효 추출물을 유효성분으로 하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

급속한 산업화와 더불어 공기 오염과 오존층의 파괴로 인한 UV 양의 증가로 인한 활성산소종과 같은 강력한 산화 물질들의 발생은 인간에게 피부노화, 색소 침착 등을 유발하고 있다. 이러한 다양한 산화물질들로부터 피부를 보호하는 목적으로 비타민C, 토코페롤, 코엔자임 Q10과 같은 다양한 항산화제가 화장료 제조에 이용되어 사용되어 오고 있다. 최근에는 한약재를 포함한 다양한 식물에 미백, 항노화, 항주름, 항산화와 같은 생리 활성 물질들이 존재함이 밝혀짐에 따라 천연화장품이나 한방 화장품 제조에 이들의 추출물들이 다양하게 이용되고 있다.

개똥쑥(Artemisia annua)이란 잔잎쑥, 개땅쑥, 또는 청호쑥으로 불리우는 초롱꽃목 국화과의 한해살이 풀을 말한다. 길가나 빈터, 강가에서 약 1m 가량으로 자라며, 쑥 중에서 잎의 뒷면이 푸른색을 띄기 때문에 청호라 불리운다. 한방에서는 발열 감기, 학질, 소아경기, 소화불량 및 이질 등의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

발효란, 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 의미한다. 미생물을 통한 발효과정을 거친 원료는 발효 전보다 최소 2배에서 최대 수 십배의 효과가 증대되는 것으로 알려져 있다. 발효를 거친 대사 물질은 피부에 좋은 각종 아미노산, 유기산, 항산화물질을 함유하여 피부대사를 촉진시켜 피부결을 탄력있고 매끄럽게 가꿔준다. 또한 발효과정을 거치면서 입자가 작아지고 중금속 등의 독성이 분해되어 흡수율이 좋을 뿐 아니라 피부트러블이나 알레르기 부작용을 완화해준다고 보고되고 있다.

피부상태 개선에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 이를 위한 새로운 방법의 필요성은 여전히 존재한다. 따라서, 본 발명에서는 상기 필요성에 대하여 새로운 천연 발효 추출물을 적용하고자 하는 것이다.

대한민국 공개특허 제10-2016-0004701호 대한민국 특허등록 제10-2015-0097336호

본 발명은 개똥쑥 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 일 실시예는 개똥쑥 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 “개똥쑥 추출물”은 당업계에 공지된 추출법에 의하여 파쇄한 개똥쑥을 추출 용매에 혼합한 후 추출함으로써 제조될 수 있다. 상기 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매일 수 있고, 바람직하게는 멸균수 또는 60% 에탄올일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 추출 용매 중 2 이상의 서로 다른 용매를 혼합하여 사용하거나 순차적으로 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 “개똥쑥 발효 추출물”은 개똥쑥 추출물을 자연적으로, 또는 장치, 구체적으로는 회전감압농축기 및 동결건조기를 사용하여 건조시킨 후, 상기 개똥쑥 추출 건조물을 용매, 바람직하게는 정제수에 일정농도, 바람직하게는 1 내지 10중량%로 희석한 후 발효용 미생물을 접종하고 발효시켜 제조되는 발효 추출물일 수 있다.

또한, 상기 발효용 미생물은 당해 발효관련 업계에서 일반적으로 사용되는 공지되어 있는 발효용 미생물을 지칭하며, 구체적으로 유산균, 효소, 효모, 진균, 방선균 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 발효용 미생물은 Lactobacillus plantarum, Lactobacillus kimchicus 또는 Leuconostoc mesenteroides의 유산균일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 발효 추출물은 조성물 총 질량에 대하여 0.1 내지 10중량%, 바람직하게는 1 내지 5중량%, 가장 바람직하게는 2중량% 함유될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 피부개선은 항산화, 진피세포 성장 촉진, 콜라겐 증가, 콜라겐분해효소 감소, 면역세포 활성 억제, 염증 억제, 피부 유수분 조절, 피부 주름 개선, 진피치밀도 증가, 표피탄력 개선, 진피탄력 개선, 피부장벽 회복, 피부결 개선 및 피부홍반 감소로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 또다른 일 실시예는 상기 피부개선용 화장료 조성물을 함유하는 화장품을 제공한다.

상기 화장품은 연고, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 세럼, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이의 제형을 가질 수 있으며, 바람직하게는 스킨토너, 수분크림 또는 크림의 제형을 가지나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 개똥쑥 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물의 피부개선에 관한 새로운 용도를 제공한다. 본 발명의 발효 추출물은 항산화, 진피세포 성장 촉진, 콜라겐 증가, 콜라겐분해효소 감소, 면역세포 활성 억제, 염증 억제, 피부 유수분 조절, 피부 주름 개선, 진피친밀도 증가, 표피탄력 개선, 진피탄력 개선, 피부장벽 회복, 피부결 개선 및 피부홍반 감소 등의 피부개선 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명의 개똥쑥 발효 추출물, α-토코페롤 및 BHT의 활성산소 분해 효과를 보여준다.
도 2는 본 발명의 개똥쑥 발효 추출물의 농도에 따른 인간진피섬유아세포(normal Human Dermal Fibroblasts, nHDF)의 세포활성도를 보여준다.
도 3 및 도 4는 각각 인간진피섬유아세포에서 COL1A1 및 콜라겐 분해효소인 MMP1의 발현 변화를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 개똥쑥 발효 추출물의 농도에 따른 마우스 면역세포(mouse macrophage, RAW 264.7)의 세포활성도를 보여준다.
도 6은 본 발명의 개똥쑥 발효 추출물의 농도에 따른 면역세포 내에서 루시퍼라아제(luciferase)의 활성도를 나타낸다.
도 7 및 도 8은 각각 본 발명의 개똥쑥 발효 추출물의 농도에 따른 IL-1β 와 TNF-α 유전자 발현 변화를 나타낸다.
도 9 내지 도 17은 각각 본 발명의 개똥쑥 발효 추출물을 함유하는 크림 및 토너의 사용기간에 따른, 피시험자의 피부 수분량, 피부 유분량, 피부 주름 정도, 진피치밀도, 표피 탄력도, 진피 탄력도, 경피수분손실량, 피부결 개선 정도 및 피부 홍반 정도의 변화를 나타낸다.

이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 시료의 제조

1.1. 개똥쑥 발효 추출물의 제조

개똥쑥 추출물을 당업계에서 통상적으로 이용하는 에탄올 추출법을 사용하여 수득하였다. 구체적으로, 먼저 건조된 개똥쑥 전초를 메탄올을 이용하여 수세하였다. 파쇄한 개똥쑥 100g을 60% 에탄올 1L에 10중량% 비율로 혼합하였다. 상기 혼합된 원료를 상온에서 48시간 동안 교반하여 추출하였다. 상기 개똥쑥 추출물을 250메쉬 및 0.5㎛ 여과지로 여과하여 액상추출물을 수득하였다. 회전감압농축기와 동결건조기를 이용하여, 상기 여과된 액상추출물로부터 추출 건조물을 획득하였다. 상기 추출 건조물을 정제수를 이용하여 5중량%로 희석한 뒤, 기 공지된 미생물 Leuconostoc mesenteroides를 접종하여 30℃에서 24시간 동안 및 15℃에서 48시간 동안 발효하였다. 상기 발효시킨 추출물을 500메쉬 및 0.2㎛ 여과지로 여과하여 액상 발효 추출물을 수득하였다. 이와 같이 조성된 본 발명에 따른 조성물에 대한 관련 시험예를 실시한 결과, 피부 안정성에서 이상이 없는 것으로 확인되었다.

1.2. 스킨토너의 제조

본 발명의 조성물을 포함하는 스킨토너를 만들기 위한 성분의 구성은 하기 표 1에 나타내었으며, 다음 과정을 거쳐 제조하였다. A상(수상)은 상온에서, B상(알코올상)은 히터를 이용하여 50℃로 가온하여 완전 용해시켰다. A상에 B상을 혼합시키고, 디스퍼(Disper)를 이용하여 1000rpm으로 10분간 가용화시켰다. 교반 혼합과정을 거쳐 냉각, 여과하고, pH 5.2 상태를 유지시켜 스킨토너를 완성하였다. 개똥쑥 발효 추출물은 2중량%의 양을 첨가하여 제조하였다.

1.3. 수분크림의 제조

본 발명의 조성물을 포함하는 수분크림을 만들기 위한 성분구성은 하기 표 2에 나타내었다. 구체적으로, A상을 80℃로 가온하여 교반하고, B상을 80℃로 가온하여 용해한 후 A상에 투입하여 2000rpm에서 10분 정도 유화시켰다. C상을 고르게 혼합한 후, 80℃에서 A+B상에 투입하여 2000rpm에서 5분 정도 중화시켰다. 서서히 교반하면서 30℃로 냉각하고, pH 6.15로 조정하였다. 개똥쑥 발효 추출물은 2중량％의 양을 첨가하여 제조하였다.

1.4. 크림의 제조

본 발명의 조성물을 포함하는 크림을 제조하기 위한 성분구성은 하기 표 3에 나타내었다. 구체적으로, A상을 80℃로 가온하여 교반하고, B상을 80℃로 가온하여 용해시킨 후 A상에 투입하여 2000rpm에서 10분 정도 유화시켰다. C상을 고르게 혼합한 후, 80℃에서 A+B상에 투입하여 2000rpm에서 5분 정도 중화시켰다. 이어서, 서서히 고르게 혼합 교반하면서 30℃로 냉각하고 pH 6.23로 조정하였다. 개똥쑥 발효 추출물은 2중량％의 양을 첨가하여 제조하였다.

2. 실험 방법 및 결과

실시예 1. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 활성산소 분해 효과 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 확인하기 위하여, 피부 노화에 주요한 역할을 하는 활성산소종이 개똥쑥 추출물 및 개똥쑥 발효 추출물에 의하여 제거되는지 조사하였다.

개똥쑥 발효 추출물의 활성산소 분해 효과를 확인하기 위하여 자유라디칼인 1,1-다이페닐-2-피크릴 하이드라질(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, DPPH)을 이용한 자유라디칼 소거활성 측정방법을 이용하였다. 시험관에 4mL 메탄올을 넣고 개똥쑥 추출물과 개똥쑥 발효 추출물을 농도별로 첨가한 다음 0.15mM DPPH 용액 1mL를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 기질과 DPPH가 없는 Initial(Ai)과 blank(Ab)를 측정하였고, 양성대조군은 α-토코페롤, BHT 및 개똥쑥 추출물을 상호 비교하였다.

분석 결과, 본 발명에 의한 개똥쑥 발효 추출물이 양성대조군인 α-토코페롤, BHT와 개똥쑥 추출물보다 저농도에서 높은 활성산소 분해능을 나타냈다(하기 표 4 및 도 1 참조). 따라서, 개똥쑥 발효 추출물에 의하여 활성산소의 분해가 촉진되는 것으로 피부미용 개선에 효과가 있음을 확인하였다.

	농도(mg/L)
	0	1	10	100
개똥쑥 발효 추출물	0	47.15	58.49	91.9
개똥쑥 추출물	0	40.5	49.8	84.3
α-토코페롤	0	34.7	48.6	80.7
BHT	0	28.5	40.8	68.8

실시예 2. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 인간진피섬유아세포의 생장 촉진 효과 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 확인하기 위하여, 진피의 구성성분인 콜라겐을 합성하는 섬유아세포 생장이 개똥쑥 발효 추출물에 의하여 촉진되는지 실험하였다.

인간진피섬유아세포(nHDF)는 Lonza사에서 구매하여 사용하였다. 세포배양액은 둘베코수정이글배지(Dulbeco'sodified Eagle'sedium, DMEM; Gibco)에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco), 10% 페니실린(100 unit/mL) 및 스트렙토마이신(100g/mL)을 첨가하여 사용하였다. 배양은 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ 인큐베이터의 조건에서 이루어졌으며, 3 내지 10세대 사이의 세포를 실험에 사용하였다. 인간진피섬유아세포인 nHDF 세포에 개똥쑥 추출물과 개똥쑥 발효 추출물을 처리하였을 때, 세포독성이 어느 정도 발생되는지 확인하기 위하여, 개똥쑥 추출물과 개똥쑥 발효 추출물을 각각의 농도로 처리 후에 24시간 동안 세포를 배양하였고, 이후 세포의 MTT를 이용하여 활성도(viability)를 측정하였다.

분석 결과, 처리시간에 따른 증가 폭의 차이를 보이지만, 대조군(무처리군)에 비하여, 세포 성장이 개똥쑥 추출물 처리 후의 증가율에 비해 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 증가율이 더욱 높은 것을 확인하였다(하기 표 5 및 6, 및 도 2 참조).

시간(hr)	개똥쑥 추출물 농도(mg/L)
시간(hr)	0	1	10	100
0	100	100	100	100
24	99.7	100.5	102.4	110.5
48	98.7	101.3	103.5	115.8
72	99.1	102.5	106.9	121.4

시간(hr)	개똥쑥 발효 추출물 농도(mg/L)
시간(hr)	0	1	10	100
0	100	100	100	100
24	101.2	100.9	105.4	115.4
48	99.8	102.1	109.9	121.8
72	99.5	103.4	113.8	131.5

실시예 3. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 Col1A1의 발현 증가 및 MMP1의 발현 감소 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부미용 개선 효과를 확인하기 위하여, 인간진피섬유아세포가 발현하는 대표적인 콜라겐(collagen) 중 하나인 COL1A1 및 콜라겐 분해효소인 MMP1의 발현 변화를 측정하였다. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 콜라겐 발현 변화 정도를 확인하기 위하여, 인간 진피섬유아세포에 개똥쑥 추출물과 개똥쑥 발효 추출물을 각각의 농도로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다.

이후, 유전자 발현 변화는, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 과정 중에 증폭되는 DNA 산물에 형광물질을 붙이고 형광물질을 지속적으로 검출하는 방식인, 정량실시간 PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)로 측정하였다. 개똥쑥 추출물 및 개똥쑥 발효 추출물에 의한 COL1A1과 MMP1 유전자 발현 변화를 정량적으로 확인하기 위하여 PCR 산물이 발산하는 형광값을 통하여 결과값을 확인하는 방식으로 SYBR 그린(green) Ⅰ(Invitrogen)을 사용하였다. PCR 튜브에 0.2μM 프라이머, 50mM KCl, 20mM Tris/HCl pH 8.4, 0.8mM dNTP, 0.5U Extaq DNA 폴리머라아제, 3mM MgCl₂, 1×그린을 혼합하여 반응액을 제조하였다. 반응액 제조 후, Linegene K(BioER)를 이용하여 94℃에서 3분 동안 1차 변성시킨 후, 변성, 어닐링, 중합을 각각 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 총 40사이클 수행하였고, 매 사이클이 끝난 후 형광강도를 측정하였다. PCR 결과는 각 결과별 용융곡선으로 검증하였다. 각 유전자의 역치 사이클(threshold cycle, Ct) 값을 β-액틴(actin)의 Ct값으로 표준화한 후, Ct값의 변화량을 비교하여 분석하였다. Ct값은 PCR 산물에 의하여 발생하는 형광의 양(증폭된 PCR 산물의 수)이 기본 값 이상의 일정한 기준 값에 도달했을 때의 사이클 수로서 Ct값을 통하여 유전자 발현량을 확인할 수 있었다. 실험에 사용한 각 유전자의 하기 표 7과 같다.

유전자	정방향 프라이머	역방향 프라이머
β-액틴	5-GGATTCCTATGTGGGCGACGA-3	5-CGCTCGGTGAGGATCTTCATG-3
COL1A1	5-AGGGCCAAGACGAAGACATC-3	5-AGATCACGTCATCGCACAACA-3
MMP1	5-TCTGACGTTGATCCCAGAGAGCAG-3	5-CAGGGTGACACCAGTGACTGCAC-3

분석 결과, Col1A1 mRNA의 발현이, 대조군 및 양성대조군(개똥쑥 추출물)에 비하여, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 농도의존적으로 증가하였다(하기 표 8 및 도 3 참조). 또한, MMP1 mRNA의 발현이, 대조군 및 양성대조군(개똥쑥 추출물)에 비하여, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 농도의존적으로 감소하였다(하기 표 9 및 도 4 참조).

Col1A1 발현(%)	농도 (mg/L)
Col1A1 발현(%)	0	1	10	100
개똥쑥 추출물	100	100.94	102.589	111.45
개똥쑥 발효 추출물	100	101.125	105.87	135.54

MMP1 발현(%)	농도 (mg/L)
MMP1 발현(%)	0	1	10	100
개똥쑥 추출물	100	94.57	86.15	76.58
개똥쑥 발효 추출물	100	91.123	74.54	66.38

실시예 4. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 면역세포의 생장 억제 효과 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 확인하기 위하여, 피부의 염증과 홍반에 작용하는 마우스 면역세포(mouse macrophage, RAW 264.7) 생장이 개똥쑥 추출물 및 개똥쑥 발효 추출물에 의하여 억제되는지 실험하였다. 마우스 면역세포는 한국세포주은행(KCTC)에서 구매하여 사용하였다. 세포배양액은 DMEM(Gibco)에 10% FBS(Gibco), 10% 페니실린(100unit/mL)과 스트렙토마이신(100g/mL)를 첨가하여 사용하였다. 배양은 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ 인큐베이터 조건에서 이루어졌으며, 3 내지 10세대 사이의 세포를 실험에 사용하였다. 마우스 면역세포인 RAW 264.7 세포에 개똥쑥 추출물과 개똥쑥 발효 추출물을 처리하였을 때, 세포독성이 어느 정도 발생되는지 확인하기 위하여, 개똥쑥 추출물과 개똥쑥 발효 추출물을 각각의 농도로 처리한 후 24시간 동안 세포를 배양하였고, 이후 세포의 활성도를 측정하였다.

분석 결과, 세포의 성장이, 대조군(무처리군)에 비하여, 개똥쑥 추출물 및 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 모두 농도의존적으로 감소하였다(하기 표 10 및 11, 및 도 5 참조).

시간 (hr)	개똥쑥 추출물 농도 (mg/L)
시간 (hr)	0	1	10	100
0	100	100	100	100
24	99.23	98.56	97.24	96.58
48	99.15	97.97	94.48	92.85
72	98.57	97.55	91.19	88.15

시간 (hr)	개똥쑥 발효 추출물 농도 (mg/L)
시간 (hr)	0	1	10	100
0	100	100	100	100
24	99.48	98.91	98.15	97.47
48	99.84	98.54	95.59	93.81
72	99.04	97.92	92.54	90.15

실시예 5. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 NF-κB 전사 억제 효과 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 확인하기 위하여, 면역반응에서 중요한 역할을 하는 사이토카인의 전사요인인 NF-κB의 전사능력이 개똥쑥 추출물 및 개똥쑥 발효 추출물에 의하여 억제되는지 실험하였다.

면역세포에 개똥쑥 추출물과 개똥쑥 발효 추출물을 처리하였을 때 NF-κB 전사능력이 어느 정도 억제되는지 확인하기 위하여, NF-κB 리포터(reporter) 분석을 진행하였다. NF-κB에 의하여 전사가 진행된다고 알려진 유전자의 프로모터 영역을 루시퍼라아제(luciferase) 유전자가 포함된 벡터에 클로닝하여 면역세포에 삽입시켰다. NF-κB 전사를 유도하는 LPS를 처리하여 NF-κB 전사능력을 활성화시킨 후, 개똥쑥 추출물과 개똥쑥 발효 추출물을 각각의 농도로 처리하고 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 루시퍼라아제 활성은 IgGκ 체인 유전자의 NF-κB 결합 부위인 IgGκ-NF-κB 부위(서열 5-GGGGACTTTCC-3) 올리고뉴클레오티드가 최소(minimal) IL-8 프로모터(위치 67 내지 +44)의 상류(upstream)에 위치하도록 구축된 루시퍼라아제 리포터 유전자 조립(construct)을 이용하였으며, 리포펙타민 플러스(lipofectamine plus, Gibco-BRL)를 이용하여 시약 매뉴얼에 따라 유전자를 면역세포에 삽입시켰다. 유전자가 삽입된 면역세포에 LPS를 처리하여 NF-κB의 전사능력을 활성화시킨 후, 개똥쑥 발효 추출물을 0, 1, 10, 100㎎/L의 농도로 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양된 면역세포는 채집 시점에 0.1mL 용해 버퍼(0.1M HEPES, pH 7.6, 1% Triton-X, 1mM DTT 및 2mM EDTA)를 직접 첨가하여 세포 용해물을 채집한 후, 4℃에서 10분간 14,000rpm으로 원심분리하여 세포 단백을 수득하였다. 브래드포드 분석(Bradford assay; Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 단백 농도를 측정한 후, 20μg의 단백질을 루시퍼라아제 분석 혼합물(25mM 글리실글리신(glycylglycine), 15mM MgSO₄, 1mg/mL BSA, 5mM ATP 및 1mM D-루시퍼린(luciferin; Analytical Luminescence Laboratory))에 첨가하고, 모노라이트(Monolight) 2010(Analytical Luminescence Laboratory)을 이용하여 20초간 발광도를 3회 반복 측정하여 평균값을 얻었다.

분석 결과, 개똥쑥 추출물을 처리 후 LPS에 의하여 증가된 NF-κB의 참여성(transactivity)의 감소율에 비해, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 LPS에 의하여 증가된 NF-κB의 참여성(transactivity)의 감소율이 증가하는 것을 확인하였다(하기 표 12 및 도 6 참조).

			개똥쑥 추출물			개똥쑥 발효 추출물
추출물 농도 (mg/L)	0	0	1	10	100	1	10	100
LPS	-	+	+	+	+	+	+	+
루시퍼라아제 활성도(배수)	1	5.48	5.12	4.58	3.27	4.79	3.97	2.44

실시예 6. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 염증성 사이토카인 합성 억제 효과 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 확인하기 위하여, 면역반응을 유도하는 염증성 사이토카인의 합성이 개똥쑥 추출물 및 개똥쑥 발효 추출물에 의하여 억제되는지 확인하였다.

개똥쑥 발효 추출물에 의한 염증성 사이토카인의 발현 변화 정도를 확인하기 위하여, LPS를 처리한 면역세포에 개똥쑥 추출물과 개똥쑥 발효 추출물을 각각의 농도로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 유전자 발현 변화를 qRT-PCR로 측정하였다. 개똥쑥 추출물 및 개똥쑥 발효 추출물에 의한 IL-1β 와 TNF-α 유전자 발현 변화를 정량적으로 확인하기 위하여, PCR 산물이 발산하는 형광값을 통하여 결과값을 확인하는 방식으로 SYBR 그린 Ⅰ(Invitrogen)을 사용하였다. PCR 튜브에 0.2μM 프라이머, 50mM KCl, 20mM Tris/HCl pH 8.4, 0.8mM dNTP, 0.5U Extaq DNA 폴리머라아제, 3mM MgCl₂, 1×그린을 혼합하여 반응액을 제조하였다. 반응액을 제조 후 Linegene K(BioER)를 이용하여 94℃에서 3분 동안 1차 변성시킨 후, 변성, 어닐링, 중합을 각각 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 총 40사이클 수행하였고, 매 사이클이 끝난 후 형광강도를 측정하였다. PCR 결과는 각 결과별 용융곡선으로 검증하였다. 각 유전자의 역치 사이클(Ct)값을 β-액틴의 Ct값으로 표준화한 후, Ct값의 변화량을 비교하여 분석하였다. Ct값은 PCR 산물에 의하여 발생하는 형광의 양(증폭된 PCR 산물의 수)이 기본 값 이상의 일정한 기준 값에 도달했을 때의 사이클 수로서 Ct값을 통하여 유전자 발현량을 확인할 수 있었다. 실험에 사용한 각 유전자의 프라이머는 하기 표 13과 같다. 양성대조군은 L-NG-모노메틸아르기닌 및 아세테이트 염(L-NG-Monomethylarginine, Acetate Salt; L-NMMA)을 사용하였다.

유전자	순방향 프라이머	역방향 프라이머
β-액틴	5-CCAAGGCCAACCGCCGC-3	5-AGGGTACATGGTGCCGCC-3
IL-1β	5-CTCAATGGACAGAATATCAACCAACA-3	5-ACAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTTG-3
TNF-α	5-TGCCTATGTCTCAGCCTCTTC-3	5-GAGGCCATTTGGGAACTTCT-3

분석 결과, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 농도의존적으로 LPS에 의하여 증가된 IL-1β mRNA의 발현이 LPS 처리군 및 양성대조군(개똥쑥 추출물 처리군)에 비하여 감소하였다(하기 표 14 및 도 7 참조). 또한, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 농도의존적으로 LPS에 의해서 증가된 TNF-α mRNA의 발현이 LPS 처리군 및 양성대조군(개똥쑥 추출물 처리군)에 비하여 감소하였다(하기 표 15 및 도 8 참조).

			개똥쑥 추출물			개똥쑥 발효 추출물
추출물 농도 (mg/L)	0	0	1	10	100	1	10	100
LPS	-	+	+	+	+	+	+	+
IL-1β mRNA 발현 (배수)	1	4.89	3.48	3.08	1.98	3.18	2.85	1.47

			개똥쑥 추출물			개똥쑥 발효 추출물
추출물 농도 (mg/L)	0	0	1	10	100	1	10	100
LPS	-	+	+	+	+	+	+	+
TNF-α mRNA 발현 (배수)	1	4.52	3.92	3.28	2.54	3.57	2.99	2.12

실시예 7. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 유수분 지수 변화 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 확인하기 위하여, 수분측정기(corneometer) 및 피지측정기(sebumeter)를 이용하여 피부 유수분을 분석하였다.

먼저, 개똥쑥 발효 추출물이 피부 유수분 개선에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 대조군, 양성대조군 및 실험군에게 각각 2주 및 4주간 크림 및 토너를 사용하게 한 후 피부 수분지수를 수분측정기(MPA5, Courage-Khazaka Electronic GmbH)를 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. 수분측정기를 이용하여 동일한 시험담당자가 피시험자의 측정부위인 우측 볼 부위를 3회 연속하여 측정하였다. 피부 유분지수는 피지측정기(MPA5, Courage-Khazaka Electronic GmbH)를 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. 피지측정기를 이용하여 동일한 시험담당자가 피시험자의 측정부위인 이마부위를 측정하였다.

분석 결과, 피부 수분이, 대조군(무처리군)에 비하여, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 시간의존적으로 증가하였다(하기 표 16 및 도 9 참조). 또한, 유분의 경우도, 피부 유분이, 대조군(무처리군)에 비하여, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 농도의존적으로 증가하였다(하기 표 17 및 도 10 참조).

	실험전	2주 후	4주 후
대조군	255	243	238
양성대조군	246	251	261
실험군	249	257	279

	실험전	2주 후	4주 후
대조군	335	330	319
양성대조군	329	342	356
실험군	324	355	381

실시예 8. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 주름 개선효과 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부주름 개선 효과를 확인하기 위하여, 피부 분석기를 이용하여 피부주름을 분석하였다.

먼저, 개똥쑥 발효 추출물이 피부주름 개선에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 대조군, 양성대조군 및 실험군에게 각각 2주 및 4주간 크림 및 토너를 사용하게 한 후 안면 주름 정도를 PRIMOS 라이트(Lite)(field of view 18吉flexible 3D measuring, GFMesstechnik GmbH)를 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. PRIMOS 라이트를 이용하여 동일한 시험담당자가 피시험자의 얼굴을 특수 제작된 PRIMOS 안면고정장비세트에 얼굴을 고정하고, 측정의 재현성을 위하여 측정 부위인 눈꼬리 끝부위가 PRIMOS 라이트의 초점 패턴과 맞도록 조정 후 측정하였다.

분석 결과, 눈꼬리 주름이, 대조군(무처리군)에 비하여, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 시간의존적으로 감소하였다(하기 표 18 및 도 11 참조).

	실험전	2주 후	4주 후
대조군	33.84	33.91	34.42
양성대조군	33.49	33.15	31.58
실험군	34.12	32.41	29.83

실시예 9. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 두께 개선효과 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 진피섬유아세포의 증식 증가 및 콜라겐의 발현 증가를 확인하였다. 이에 따라, 생성된 콜라겐에 의하여 진피층의 두께가 증가하는지를 분석하여, 개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 두께 개선효과를 확인하였다.

먼저, 개똥쑥 발효 추출물이 피부 두께에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 대조군, 양성대조군 및 실험군에게 각각 2주 및 4주간 크림 및 토너를 사용하게 한 후 DUB-피부 스캐너(tpm taberna pro medicum)를 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. DUB-피부 스캐너에 초음파 검사용 젤을 바르고 프로브를 피부와 직각이 되도록 한 후, 동일한 시험담당자가 피시험자의 안면 우측눈가에 동일한 압으로 눌러 측정하였다.

분석 결과, 피부 두께가, 대조군(무처리군)에 비하여, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 시간의존적으로 증가하였다(하기 표 19 및 도 12 참조).

	실험전	2주 후	4주 후
대조군	56.18	56.29	55.98
양성대조군	55.19	55.94	56.78
실험군	55.49	56.59	57.44

실시예 10. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 표피 탄력 개선효과 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 확인하기 위하여, 표피 탄력 개선효과를 확인하였다. 개똥쑥 발효 추출물이 표피 탄력에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 대조군, 양성대조군 및 실험군에게 각각 2주 및 4주간 크림 및 토너를 사용하게 한 후 표피 탄력의 변화정도를 피부탄력측정기(Ballistometer, Ballistometer BLS780, Dia-Stron Ltd.)로 측정하였다. 상기 피부탄력측정기는 프로브에 장착된 2㎜ 직경의 팔(arm)이 피부표면에 접촉할 때의 진동에너지를 수치화하여 표피탄력을 산정하며, 이에 대한 분석은 피부탄력측정기 전용 분석 프로그램인 MApp를 이용하였다. 표피 탄력을 측정하는 값으로는 회복계수인 CoR값(Coefficient of Restitution)을 사용하였으며, 동일한 시험담당자가 오른쪽 볼 부위에 고정 후 3회 반복하여 측정하였다.

분석 결과, 표피의 탄력이, 대조군(무처리군)에 비하여, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 시간의존적으로 증가하였다(하기 표 20 및 도 13 참조).

	실험전	2주 후	4주 후
대조군	0.59	0.61	0.68
양성대조군	0.61	0.68	0.72
실험군	0.57	0.69	0.84

실시예 11. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 진피 탄력 개선효과 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 확인하기 위하여, 진피 탄력 개선효과를 확인하였다. 개똥쑥 발효 추출물이 진피 탄력에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 대조군, 양성대조군 및 실험군에게 각각 2주 및 4주간 크림 및 토너를 사용하게 한 후 진피 탄력의 변화정도를 피부토크측정기(Dermal Torque Meter, Dermal Torque Meter DTM310, Dia-Stron Ltd.)로 측정하였다. 상기 피부토크측정기는 프로브에 내장된 토크모터에 의해 적용된 전단력 반응을 통하여 피부의 각도 변위를 측정하며, 토크모터는 수평 직경 20㎜인 토크디스크에 연결되어 회전력을 직접 피부에 전달한다. 또한, 프로브 헤드에 5㎜의 링 갭을 갖는 분리형 가드링을 장착하여 진피층에 회전력을 전달한다. 진피 탄력의 분석에는 회전으로 인한 변형에 대한 피부의 회복력을 나타내는 Ur/Ue값을 사용하였으며, 동일한 시험담당자가 프로브를 테이프로 오른쪽 볼 부위에 고정 후 3회 반복하여 측정하였다.

분석 결과, 진피의 탄력이, 대조군(무처리군)에 비하여, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 시간의존적으로 증가하였다(하기 표 21 및 도 14 참조).

	실험전	2주 후	4주 후
대조군	0.45	0.44	0.46
양성대조군	0.47	0.49	0.5
실험군	0.44	0.51	0.59

실시예 12. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 장벽 개선효과 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 확인하기 위하여, 피부 장벽 개선효과를 확인하였다.

먼저, 개똥쑥 발효 추출물이 피부 장벽 개선에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여, 상기 제조한 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 대조군, 양성대조군 및 실험군에게 각각 2주 및 4주간 크림 및 토너를 사용하게 한 후 표피수분손실량(TEWL: TransEpidermal Water Loss)을 수분손실측정기인 DermaLab USB TEWL 프로브(Cortex Technology, Inc.)를 이용하여 기기의 매뉴얼에 따라 측정하였다.

분석 결과, 경피수분 손실량이, 대조군(무처리군)에 비하여, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 시간의존적으로 감소하였다(하기 표 22 및 도 15 참조).

	실험전	2주 후	4주 후
대조군	33.58	33.51	33.64
양성대조군	33.15	32.96	31.59
실험군	32.97	31.94	30.86

실시예 13. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부결 개선효과 확인

개똥쑥 발효 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 확인하기 위하여, 피부결 개선효과를 확인하였다.

먼저, 개똥쑥 발효 추출물이 피부결 개선에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 대조군, 양성대조군 및 실험군에게 각각 2주 및 4주간 크림 및 토너를 사용하게 한 후 피부결 정도를 PRIMOS 라이트(field of view 45, flexible 3D measuring, GFMesstechnik GmbH)를 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. PRIMOS 라이트를 이용하여 동일한 시험담당자가 피시험자의 이마부위를 3회 연속하여 측정하여 동일한 부위를 측정하였다.

분석 결과, 피부결을 결정하는 피부에 생성된 주름의 깊이가, 대조군(무처리군)에 비하여, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 시간의존적으로 감소하였다(하기 표 23 및 도 16 참조).

	실험전	2주 후	4주 후
대조군	16.54	16.75	17.01
양성대조군	16.68	16.57	15.96
실험군	17.15	16.28	14.88

실시예 14. 개똥쑥 발효 추출물에 의한 홍반 개선효과 확인

상기 실시예 4, 5 및 6을 통하여 개똥쑥 발효 추출물에 의한 면역세포의 증식억제 및 염증성 사이토카인의 발현 감소를 확인하였다. 이에 따라, 감소된 사이토카인에 의하여 홍반이 감소하는지를 분석하여 개똥쑥 발효 추출물의 홍반 개선효과를 확인하였다.

먼저, 개똥쑥 발효 추출물이 홍반 개선에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 대조군, 양성대조군 및 실험군에게 각각 2주 및 4주간 크림 및 토너를 사용하게 한 후 분광광도계(Spectrophotometer CR-2600D, Konica Minolta)를 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. 동일한 시험담당자가 피시험자의 우측 볼 부위를 3회 연속으로 측정하여 그에 대한 평균값을 계산하여 분석에 사용하였다. 분광광도계에서 측정되는 값은 L*, a* 및 b*이며, a*값이 홍반을 나타내는 값으로 증가할수록 붉은기가 많은 상태를 나타낸다.

분석 결과, 홍반이, 대조군(무처리군)에 비하여, 개똥쑥 발효 추출물을 처리 후 시간의존적으로 감소하였다(하기 표 24 및 도 17 참조).

	실험전	2주 후	4주 후
대조군	12.85	12.69	12.44
양성대조군	12.64	12.15	11.57
실험군	12.74	11.94	11.15

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

개똥쑥 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역세포 활성 억제용 화장료 조성물로서,
상기 개똥쑥 발효 추출물이 개똥쑥으로부터 수득한 추출물의 건조물을 용매에 희석한 후 발효용 미생물을 접종하고 발효시켜 제조되는 발효 추출물이고,
상기 발효용 미생물이 Leuconostoc mesenteroides인 것을 특징으로 하는, 면역세포 활성 억제용 화장료 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 발효 추출물이 조성물 총 질량에 대하여 0.1 내지 10중량% 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 면역세포 활성 억제용 화장료 조성물.
삭제
제 1 항 또는 제 3 항에 따른 면역세포 활성 억제용 화장료 조성물을 함유하는 화장품.