CN108949877B - 一种从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，包括以下步骤：步骤(1)：将新鲜大蒜剥去外皮，高温灭菌、干燥、粉碎，获得物料A；步骤(2)：将物料A置于容器中加水，并添加5‑10％氢氧化钠溶液调节pH至7.5‑8.5，在室温下浸泡60‑90min，在20‑60℃下超声提取，抽滤，获得抽滤液，调节所述抽滤液pH至7.0‑8.0，加入复合蛋白酶溶液，搅拌酶解，再加入活性炭进行搅拌脱色，获得脱色液；步骤(3)将步骤(2)中所述脱色液进行板过滤、浓缩、干燥，粉碎，得大蒜低聚肽产品。本发明提取方法，提取率高、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及生物提取技术领域，更具体的说是涉及一种从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法。
背景技术
目前，低聚肽作为一种易吸收、见效快的多功能保健品，深受人们的喜爱，而大蒜因其独特的营养成分，其提取的大蒜低聚肽更具有特殊的功效。
但是，现有技术中，提取大蒜低聚肽多采用水高温热回流或者用水低温热回流的方法进行提取，采用水高温热回流进行提取会将原料中大量淀粉提取出来，进而严重影响后续的分离；采用水低温热回流提取，导致提取率低。
因此，如何提供一种高效提取分离大蒜低聚肽的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种高效提取分离大蒜低聚肽的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将新鲜大蒜剥去外皮，高温灭菌、干燥、粉碎，获得物料A；
步骤(2)：将物料A置于容器中加水，并添加5-10％氢氧化钠溶液调节pH至7.5-8.5，在室温下浸泡60-90min，在20-60℃下超声提取，抽滤，获得抽滤液，调节所述抽滤液pH至7.0-8.0，加入复合蛋白酶溶液，搅拌酶解，再加入活性炭进行搅拌脱色，获得脱色液；
步骤(3)将步骤(2)中所述脱色液进行板过滤、浓缩、干燥，粉碎，得大蒜低聚肽产品。
本发明的有益效果：本发明首先对剥皮后的大蒜进行高温灭菌，可以将其中的蒜氨酸转化为更稳定、且保持特殊生物活性的S-烯丙基半胱氨酸，有效的增加了提取率，并且去除产品中的酸辣味；再采用5-10％的氢氧化钠溶液50℃进行超声提取，提取过程中淀粉不易提出，且使有效成分提取率增高；解决了用水高温热回流提取易将原料中大量淀粉提取出来而严重影响后续的分离和用水低温热回流导致的提取率低的问题。采用超滤膜过滤，不仅可以有效除去提取物中大分子量的杂质，并且操作简单；再进行纳滤分离技术，不仅具有浓缩作用，且可以去除无机盐、酸根离子或碱根离子等成分，本发明操作简单、成本低、且提取率高。
优选的，步骤(1)中高温灭菌温度为127-130℃；高温灭菌时间为60-75min；干燥温度为90-95℃；干燥时间为6.0-7.0h；粉碎至10目。
优选的，步骤(2)具体包括：
步骤(2.1)，将物料A置于容器中加水，并添加5-10％氢氧化钠溶液调节pH至7.5-8.5，在室温下浸泡60-90min，在20-60℃下超声提取，抽滤，获得滤饼A和滤液A；
步骤(2.2)，将步骤(2.1)中的滤饼A再加水，在20-60℃下超声提取，抽滤，获得滤饼B和滤液B；
步骤(2.3)将滤液A及滤液B混合，调节滤液pH至7.0-8.0，加入复合蛋白酶溶液，搅拌酶解，再加入活性炭进行搅拌脱色，获得滤液。
优选的，步骤(2.1)中超声提取时间为45-60min；步骤(2.2)中超声提取时间为30-45min。
优选的，步骤(2.1)中加水质量与所述物料A质量比为：18-20：1；步骤(2.2)中加水质量与物料A质量比为：15-18：1。
优选的，复合蛋白酶配比为：中性蛋白酶:碱性蛋白酶＝1:1。
优选的，步骤(2)中复合蛋白酶溶液中复合蛋白酶含量为2-3‰(v/v)。
本发明中复合蛋白酶酶解技术可以有效的水解蛋白使其转化为蛋白低聚肽，使蛋白肽转化率得到大幅度提高。
优选的，所述酶解温度为35-45℃，所述酶解时间为3-5h。
优选的，步骤(3)中所述脱色液与活性炭质量比为：100：1-2；所述脱色温度为55-65℃；脱色时间为45-60min。
优选的，步骤(3)中所述过滤步骤为：依次进行板框过滤、陶瓷膜过滤，再用5000d超滤膜过滤，最后再用纳滤膜过滤。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法具有以下效果：
1、先将新鲜大蒜进行高温处理，使其鲜大蒜中具有特殊生物活性、且极易于酶解的蒜氨酸转化为具有稳定性能、且保持特殊生物活性的S-烯丙基半胱氨酸，有效的增加了提取率，并且提取剩余物无蒜辣味，可以用于生产出无蒜辣味的大蒜低聚肽而在食品、保健品中得以应用；
2、采用稀碱水超声提取，解决用水高温热回流提取易将原料中大量淀粉提取出来而严重影响后续的分离和用水低温热回流提取提取率低的不足，稀碱水超声提取仅在50℃左右提取，淀粉不易提出，且因超声提取的特殊能力使有效成分提取率增高；
3、采用经过大量实验确定的复合蛋白酶酶解技术来水解蛋白使其转化为蛋白低聚肽，蛋白肽转化率得到大幅度提高。
4、采用小分子量超滤膜过滤来替代现有技术中的酒精醇沉或澄清剂沉淀，可有效的减少操作过程的步骤及损耗，使滤液更有利于后续有效成分的分离；
5、采用纳滤分离技术，不仅起到了浓缩作用，且有效的去除一些作为食品、保健品使用时不应带入的一些无机盐、酸根离子或碱根离子等成分，生产出符合食品、保健品使用的功能原料，而且设备成本和使用成本大大降低。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将新鲜大蒜剥去外皮，放入高压灭菌器中，127℃下蒸60min，取出，放入鼓风干燥箱中于90℃下鼓风干燥6.0h，取出自然放凉，用粉碎机粉成过20目筛的粉末，获得物料A备用；
步骤(2)：称取5.0kg物料A于提取器中，加入自来水90L，并添加5％氢氧化钠溶液调节pH至7.5，在室温下浸泡60min，50℃超声提取45min，抽滤，获得滤饼A和滤液A；
步骤(3)：将步骤(2)中的滤饼A再加75L入自来水，50℃超声提取30min，抽滤，获得滤饼B和滤液B；
步骤(4)将滤液A及所述滤液B混合，调节混合滤液pH至7.0，加入2‰(v/v)的复合蛋白酶，其中复合蛋白酶中配比为：中性蛋白酶:碱性蛋白酶＝1:1，35℃搅拌酶解3h，在加入液体量1.0％粉状活性炭板于55℃搅拌脱色45min，获得滤液C；
步骤(5)将步骤(4)中所述滤液C进行板框过滤，陶瓷膜过滤，滤液先用5000d超滤膜过滤，滤液再用纳滤膜过滤，滤余液在通过旋转蒸发浓缩器浓缩至稠膏状，在真空干燥器中60℃真空干燥，粉碎，得大蒜低聚肽产品,312.06g。
实施例2
从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将新鲜大蒜剥去外皮，放入高压灭菌器中，127℃下蒸75min，取出，放入鼓风干燥箱中于95℃下鼓风干燥6.5h，取出自然放凉，用粉碎机粉成过20目筛的粉末，获得物料A备用；
步骤(2)：称取50kg物料A于提取器中，加入1000L自来水，并添加5％氢氧化钠溶液调节pH至8.0，在室温下浸泡75min，50℃超声提取60min，抽滤，获得滤饼A和滤液A；
步骤(3)：将步骤(2)中的滤饼A再加900L入自来水，50℃超声提取45min，抽滤，获得滤饼B和滤液B；
步骤(4)将滤液A及所述滤液B混合，调节混合滤液pH至7.5，加入2.5‰(v/v)的复合蛋白酶，其中复合蛋白酶中配比为：中性蛋白酶:碱性蛋白酶＝1:1，40℃搅拌酶解4h，在加入液体量1.5％粉状活性炭板于60℃搅拌脱色60min，获得滤液C；
步骤(5)将步骤(4)中所述滤液C进行板框过滤，陶瓷膜过滤，滤液先用5000d超滤膜过滤，滤液再用纳滤膜过滤，滤余液在通过旋转蒸发浓缩器浓缩至稠膏状，在真空干燥器中60℃真空干燥，粉碎，得大蒜低聚肽产品4062.8g。
实施例3
从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将新鲜大蒜剥去外皮，放入高压灭菌器中，127℃下蒸75min，取出，放入鼓风干燥箱中于95℃下鼓风干燥7.0h，取出自然放凉，用粉碎机粉成过20目筛的粉末，获得物料A备用；
步骤(2)：称取100kg物料A于提取器中，2000L加入自来水，并添加5％氢氧化钠溶液调节pH至8.5，在室温下浸泡90min，50℃超声提取60min，抽滤，获得滤饼A和滤液A；
步骤(3)：将步骤(2)中的滤饼A再加1800L入自来水，45℃超声提取30min，抽滤，获得滤饼B和滤液B；
步骤(4)将滤液A及所述滤液B混合，调节混合滤液pH至8.0，加入3‰(v/v)的复合蛋白酶，其中复合蛋白酶中配比为：中性蛋白酶:碱性蛋白酶＝1:1，45℃搅拌酶解5h，在加入液体量2.0％粉状活性炭板于65℃搅拌脱色60min，获得滤液C；
步骤(5)将步骤(4)中所述滤液C进行板框过滤，陶瓷膜过滤，滤液先用5000d超滤膜过滤，滤液再用纳滤膜过滤，滤余液在通过旋转蒸发浓缩器浓缩至稠膏状，在真空干燥器中60℃真空干燥，粉碎，得大蒜低聚肽产品7512.6g。
对比实施例1
从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：称取5.0kg剥去外皮的新鲜大蒜，置于提取器中，加入90L加入自来水，并添加5％氢氧化钠溶液调节pH至7.5，在室温下浸泡60min，50℃超声提取45min，抽滤，获得滤饼A和滤液A；
步骤(3)：将步骤(2)中的滤饼A再加75L入自来水，50℃超声提取30min，抽滤，获得滤饼B和滤液B；
步骤(4)将滤液A及所述滤液B混合，调节混合滤液pH至7.0，加入2‰(v/v)的复合蛋白酶，其中复合蛋白酶中配比为：中性蛋白酶:碱性蛋白酶＝1:1，35℃搅拌酶解3h，在加入液体量1.0％粉状活性炭板于55℃搅拌脱色45min，获得滤液C；
步骤(5)将步骤(4)中所述滤液C进行板框过滤，陶瓷膜过滤，滤液先用5000d超滤膜过滤，滤液再用纳滤膜过滤，滤余液在通过旋转蒸发浓缩器浓缩至稠膏状，在真空干燥器中60℃真空干燥，粉碎，得大蒜低聚肽产品。
对比实施例2
从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将新鲜大蒜剥去外皮，放入高压灭菌器中，127℃下蒸75min，取出，放入鼓风干燥箱中于95℃下鼓风干燥6.5h，取出自然放凉，用粉碎机粉成过20目筛的粉末，获得物料A备用；
步骤(2)：称取50kg物料A于提取器中，加入1000L自来水，并添加5％氢氧化钠溶液调节pH至8.0，在室温下浸泡75min，50℃超声提取60min，抽滤，获得滤饼A和滤液A；
步骤(3)：将步骤(2)中的滤饼A再加900L入自来水，50℃超声提取45min，抽滤，获得滤饼B和滤液B；
步骤(4)将滤液A及所述滤液B混合，调节混合滤液pH至7.5，加入2.5‰(v/v)的中性蛋白酶，40℃搅拌酶解4h，在加入液体量1.5％粉状活性炭板于60℃搅拌脱色60min，获得滤液C；
步骤(5)将步骤(4)中所述滤液C进行板框过滤，陶瓷膜过滤，滤液先用5000d超滤膜过滤，滤液再用纳滤膜过滤，滤余液在通过旋转蒸发浓缩器浓缩至稠膏状，在真空干燥器中60℃真空干燥，粉碎，得大蒜低聚肽产品。
对比实施例3
步骤(1)：称取5.0kg剥去外皮的新鲜大蒜，置于提取器中，加入90L加入自来水，并添加5％氢氧化钠溶液调节pH至7.5，在室温下浸泡60min，50℃超声提取45min，抽滤，获得滤饼A和滤液A；
步骤(3)：将步骤(2)中的滤饼A再加75L入自来水，50℃超声提取30min，抽滤，获得滤饼B和滤液B；
步骤(4)将滤液A及所述滤液B混合，调节混合滤液pH至7.0，加入2‰(v/v)的中性蛋白酶，35℃搅拌酶解3h，在加入液体量1.0％粉状活性炭板于55℃搅拌脱色45min，获得滤液C；
步骤(5)将步骤(4)中所述滤液C进行板框过滤，陶瓷膜过滤，滤液先用5000d超滤膜过滤，滤液再用纳滤膜过滤，滤余液在通过旋转蒸发浓缩器浓缩至稠膏状，在真空干燥器中60℃真空干燥，粉碎，得大蒜低聚肽产品。
提取方法效果测定
1.测定对象：对经过高温处理前后的新鲜大蒜原料、对比实施例1和
实施例1-3中获得的低聚肽产品中的蒜氨酸含量进行测定。
1.1具体试验方法如下：
1)色谱条件色谱柱:Zirchrom ODS250mmX4.6mm色谱柱；流动相：甲醇-水＝30:70；检测波长214nm；流速1.0mL.min-1；柱温25℃。
2)对照品溶液的制备：精密称取蒜氨酸0.0100g置25mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，配制成标准贮备液即0.40mg.mL-1。
3)原料溶液的制备：精确称取大蒜原料或物料A1.000g于组织破碎机中，加入5OmL甲醇，捣碎，将捣碎液倒入250mL烧杯，用30mL蒸馏水冲洗干净，用超声提取器超声0.5h，然后用100mL容量瓶定容，取上述原料溶液在4000rpm离心10min，取上清液100μL用流动相适当稀释后，微孔滤膜滤过，进样测定。
4)产品溶液的制备：精确称取产物0.0200g，加入4OmL甲醇，用超声溶解0.5h，然后用50mL容量瓶定容，取溶液100μL用流动相适当稀释后，微孔滤膜滤过，进样测定。
测试结果如表1所示，其中：大蒜原料1-3为从未经任何处理的新鲜大蒜原料中获取的3个试样；物料A1-3依次为本发明实施例1-3中新鲜大蒜原料经过高温处理获得的物料A；对照产物1-3为从对比实施例1中低聚肽产品中抽取的3个试样；高温产物11-13,21-23.31-33依次为分别本发明实施例1-3中每个实施例中的低聚肽产品中抽取3个样品。(注：经过本发明高温处理后，将大蒜中的蒜氨酸转化为S-烯丙基半胱氨酸，二者含量测定方法相同的，即表1中大蒜原料1-3和对照产物1-3对应的蒜氨酸为蒜氨酸，物料A1-3和高温产物11-33所对应的蒜氨酸实质上为S-烯丙基半胱氨酸。为了方便进行效果对比，在表1中统称为蒜氨酸。)
表1蒜氨酸含量
由上述列表中可以看出：相比于未经高温处理的大蒜原料中蒜氨酸含量，本发明高温处理后获得的物料A中蒜氨酸含量显著提高。并且，相比于对比实施例1中制得的低聚肽产品，实施例1-3中制得的低聚肽产品中蒜氨酸含量显著提高。显然，新鲜大蒜经过本发明高温处理后，再进一步加工成大蒜多肽产品，蒜氨酸含量得到了显著提高。
2.对实施例1-3中多肽含量的测定
2.1测定对象：未经高温的新鲜大蒜采用中性蛋白酶和复合蛋白酶进行酶解后的产品；物料A经过单独的中性蛋白酶和复合蛋白酶酶解后的产品；对比实施例2中制得的低聚肽产品和实施例2中制得的低聚肽产品；对比实施例1和对比实施例3中低聚肽产品。
2.2测定方法：BCA法测定低聚肽含量
2.3反应原理：蛋白中的肽键将Cu2+还原为Cu+
2.4试剂配制：A液:BCA-Na21g、Na2CO3·H2O2g、酒石酸钠0.16g、NaOH0.4g、NaHCO30.95g加入到80mL水中，用1mol/LNaOH溶液调pH值至11.25，定容至100mL；
B液:CuSO4·5H2O4g，加水定容至100mL即可。
2.5测定方法：取A液与B液混合，配制成工作液。取BSA标准品配制成1mg/mL的标准蛋白溶液，并绘制标准曲线。取样品溶液0.1mL与工作液2.0mL混合，37℃保温30min，于562nm处测定吸光度，根据标准曲线计算样品中蛋白的浓度。
测定结果如表2所示：其中，大蒜原料D为取未经任何处理的新鲜大蒜直接采用中性蛋白酶进行酶解后的产品、大蒜原料F为未经任何处理的新鲜大蒜采用本发明配制的复合蛋白酶经过酶解后的产品；
物料AD、物料AF分别为物料A经过中性蛋白酶、本发明复合蛋白酶酶解后的产品；
对照产物为F对比实施例1中制得的低聚肽产品，对照产物D为对比实施例3中制得的低聚肽产品；
高温产物D为对比实施例2中制得的低聚肽产品，高温产物F为实施例2制得的低聚肽产品。
表2蛋白多肽含量测定结果
上述新鲜大蒜原料、经过高温处理后的大蒜原料，即物料A，分别经过单酶和复合酶处理的对比；对比实施例1和对比实施例3中制得的低聚肽产品的对比；以及对比实施例2和实施例2中制得的低聚肽产品的对比，从观察列表中可以看出，实施例2相比于对比实施例2中制得的低聚肽产品多肽含量高；对比实施例1相比于对比实施例3中制得的低聚肽产品多肽含量高；而对于大蒜原料和物料A而言，也是采用本发明复合酶酶解后，蛋白多肽明显含量升高。
本发明中对新鲜大蒜原料进行高温处理有着非常重要的作用，其可以有效的提高大蒜多肽产品中蒜氨酸的含量，并且本发明中采用合适配比中性蛋白酶和碱性蛋白酶制得的复合酶也是至关重要的，其可以有效的提高蛋白多肽的提取率。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将新鲜大蒜剥去外皮，高温灭菌温度为127-130℃，高温灭菌时间为60-75min，干燥、粉碎，获得物料A；
步骤(2)：将物料A置于容器中加水，并添加5-10％氢氧化钠溶液调节pH至7.5-8.5，在室温下浸泡60-90min，在20-60℃下超声提取，抽滤，获得抽滤液，调节所述抽滤液pH至7.0-8.0，加入复合蛋白酶溶液，所述复合蛋白酶配比为：中性蛋白酶:碱性蛋白酶＝1:1，搅拌酶解，再加入活性炭进行搅拌脱色，获得脱色液；
所述复合蛋白酶溶液中复合蛋白酶含量为2-3‰(v/v)，所述酶解温度为35-45℃，所述搅拌酶解时间为3-5h；
步骤(3)将步骤(2)中所述脱色液进行板过滤、浓缩、干燥，粉碎，得大蒜低聚肽产品。
2.根据权利要求1所述的一种从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，其特征在于，步骤(1)中所述干燥温度为90-95℃；干燥时间为6.0-7.0h；所述粉碎至10目。
3.根据权利要求1所述的一种从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，其特征在于，步骤(2)具体包括：
步骤(2.1)，将物料A置于容器中加水，并添加5-10％氢氧化钠溶液调节pH至7.5-8.5，在室温下浸泡60-90min，在20-60℃下超声提取，抽滤，获得滤饼A和滤液A；
步骤(2.2)，将步骤(2.1)中的滤饼A再加水，在20-60℃下超声提取，抽滤，获得滤饼B和滤液B；
步骤(2.3)将所述滤液A及所述滤液B混合，调节滤液pH至7.0-8.0，加入复合蛋白酶溶液，搅拌酶解，再加入活性炭进行搅拌脱色，获得滤液。
4.根据权利要求3所述的一种从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，其特征在于，步骤(2.1)中所述超声提取时间为45-60min；步骤(2.2)中所述超声提取时间为30-45min。
5.根据权利要求3所述的一种从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，其特征在于，步骤(2.1)中所述加水质量与所述物料A质量比为：18-20：1；步骤(2.2)中所述加水质量与所述物料A质量比为：15-18：1。
6.根据权利要求1至5任一项所述的一种从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，其特征在于，步骤(3)中所述脱色液与活性炭质量比为：100：1-2；所述脱色温度为55-65℃；脱色时间为45-60min。
7.根据权利要求1至5任一项所述的一种从大蒜中提取分离大蒜低聚肽的方法，其特征在于，步骤(3)中所述过滤步骤为：依次进行板框过滤、陶瓷膜过滤，再用5000d超滤膜过滤，最后再用纳滤膜过滤。
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