CN113598280B - 一种含富硒厚朴提取物的小鼠饲料及其在构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含富硒厚朴提取物的小鼠饲料及其在构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型中应用，属于实验动物饲料及模式动物构建技术领域。本发明的含富硒厚朴提取物的小鼠饲料，包括以下质量份的组分：基础日粮86份；猪胆盐1份；胆固醇1份；猪油10份；富硒厚朴提取物MBE 2份。制备获得的含富硒厚朴提取物的小鼠饲料在构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型中应用。构建获得无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型，具有肥胖症状，并且脂肪肝症状检测检测均显示无脂肪肝症状，模型小鼠构建成功。本发明获得的无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型，作为研究肥胖与脂肪肝诱发及下相关关联研究的模型动物，具有重要的科研价值。

Description

一种含富硒厚朴提取物的小鼠饲料及其在构建无脂肪肝症状 的肥胖小鼠模型中应用

技术领域

本发明属于实验动物饲料及模式动物构建技术领域，尤其涉及一种含富硒厚朴提取物的小鼠饲料及其在构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型中应用。

背景技术

肥胖对于人类健康以及畜牧业发展均具有重要影响，从人类健康角度看，随着人们生活水平的提高，肥胖的数量日益增多，肥胖引发的各种疾病如高血压、高血脂、非酒精性脂肪肝和糖尿病等在全球范围内出现流行趋势，严重威胁着人类的生命健康；尤其肥胖与脂肪肝之间的相互作用机理，对于肥胖影响人类健康具有重要意义。

从现代畜牧业的发展来看，人们对经济动物的需求由数量变为质量。对肉品质的要求从提高瘦肉率转变为增加肉的口感等性状。在提高瘦肉率的同时，增加肌间脂肪的含量，提升肉的嫩度和风味是现如今畜牧业的目标。肥胖症影响动物健康并引发并发症，影响经济效益；另一方面肌内脂肪的沉积提升肉品质，维持二者的稳态平衡来达到增加肉的品质和风味。而动物的肝脏健康对于需要增加脂肪肉质的畜牧动物饲养具有重要影响，因此提供无脂肪肝形状的肥胖动物模型，对于研究防治脂肪肝与肥胖的相互作用机制，对畜牧兽医产业意义重大。

中药厚朴是木兰科植物厚朴的树皮根皮，在我国已经作为临床药物应用了一千多年，具有很强的经济价值潜力和应用前景。厚朴生药至少含有200多种不同的化学成分，其主要成分有木脂素类、挥发油类、生物碱类、黄酮类、多糖、皂苷和许多微量元素。厚朴中主要活性成分厚朴酚以及和厚朴酚的发现使得对这个药材有了更加深入的研究。厚朴及其提取物有着广泛的生物活性和药理效果，目前发现的主要的药理作用有：抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤、舒张血管抗溃疡腹泻、镇静抗抑郁以及调节糖脂代谢等。厚朴提取物的主要成分厚朴酚与和厚朴酚在对抗肥胖和非酒精性脂肪肝方面的研究少有报道。

中国湖北恩施的紫油厚朴是中国境内质量最优的一批厚朴生药，拥有冠名紫油厚朴。紫油厚朴的产地在湖北省恩施土家族自治区双河县，该地区气候适合厚朴生长，土壤中的硒元素丰富，研究表明恩施双河县的土壤是富硒土壤，硒元素的含量在地区分布上存在差异，故恩施紫油厚朴的别名也叫恩施富硒紫油厚朴。恩施富硒紫油厚朴富含挥发油、木脂素以及多糖、并且具有较高的硒含量，在生药领域拥有很高的地位。但是针对恩施富硒紫油厚朴的研究和应用还比较少，恩施富硒紫油厚朴的经济价值还待开发。

厚朴提取物的提取方法看，由于厚朴的品种、药用植物的部位以及提取方法的不同差异，厚朴提取物中的和厚朴酚与厚朴酚的含量会因为这些因素发生至少10倍以上的变化。例如，不同坡位对厚朴的生长和不同部位中生物活性有效成分的蓄积也会有较大影响。传统的中药制剂法-水煎法对厚朴中的活性成分的转化率非常低，通常只有5%-10%左右。现代医药常用的有碱提酸沉法，根据厚朴的基本主要成分大多溶于碱的特性将提取物溶于碱水中，再根据其不溶于酸的特性调整提取液的pH值使产物沉淀，由于原料简单便宜，操作并不复杂，这种方法常用于药企生产。但碱提酸沉法的弊端也很明显，酸碱的腐蚀对仪器和环境的伤害较大，且此法虽使厚朴提取物简单易得但产率很低纯度不高已经慢慢地被制药企业放弃。新兴的超声提取法虽提取率高操作简单快速（约30min提取一次）但用料比巨大（约1：30）且仪器和仪器维护比较昂贵（吴巧凤等 2018），目前该法还在发展阶段。还有新兴的二氧化碳超临界萃取仪有着同样的问题。目前，采用的醇提法，不仅提取率高，转化率高产率大且不会破坏产物结构被广泛应用于实验室和工业生产。

综上，鉴于肥胖及其与相关及疾病如脂肪肝的关联性的研究具有重要意义。探究构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型对于上述研究肥胖与脂肪肝发生的相互关联显得尤为重要。

发明内容

基于此，鉴于肥胖及其与相关疾病如脂肪肝的关联性的研究具有重要意义，本发明实施例的首要目的在于提供一种含富硒厚朴提取物的小鼠饲料，该中小鼠饲料具有富硒厚朴提取物成分，用于构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型的模式动物。

本发明实施例的另一目的在于提供上述含富硒厚朴提取物的小鼠饲料在构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型中应用，并提供了构建的具体方法步骤，构建获得的无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型可以用于研究肥胖与脂肪肝发生的相互关联。

本发明实施例提供一种含富硒厚朴提取物的小鼠饲料，包括以下质量份的组分：

基础日粮 86份；

猪胆盐 1份；

胆固醇 1份；

猪油 10份；

富硒厚朴提取物MBE 2份。

其中，所述的富硒厚朴提取物MBE，通过以下步骤制备获得：

1）粉碎提取：取富硒厚朴粉碎后，过100目筛网，按厚朴纤维：75乙醇为1：2浸泡24h后药液也汇入提取溶剂乙醇；料液比1：8加入厚朴中粉，浸泡24-48小时后汇入提取罐，用脱脂纱布防止漏出，加压0.03 MPa，温度60℃回流提取三次，每次1.5 h；

2）除杂：趁热取滤液，放置冷却；加入2%活化后的活性炭、4%明胶、4%壳聚糖进行除杂去鞣制色素，静置24小时后过滤取滤液；

3）浓缩：-0.08 MPa，55℃减压浓缩至原体积的八分之一即为富硒厚朴浸膏，半成品置于四度冰箱备用；

4）再浓缩：采用实验室用循环水真空泵接旋转蒸发仪最大量程-0.01Mpa，55℃减压浓缩至浓稠无醇味，获得浓缩品；

5）制剂：可溶性淀粉，与步骤4）获得浓缩品，按照1：1包裹制剂，真空干燥，获得富硒厚朴提取物MBE。

步骤1）中所述的厚朴纤维为未能通过筛网的厚朴纤维。

步骤1）中所述的富硒厚朴选取含硒量≥0.35mg/kg 的恩施富硒紫油厚朴；优选为含硒量为0.35mg/kg-0.45mg/kg的恩施富硒紫油厚朴。

步骤5）所述真空干燥时所用的干燥剂为无水氯化钙。

所述基础日粮的营养成分质量份数为：

水分 8-10份；

粗蛋白 20-25份；

粗脂肪 4-5份；

粗纤维 4-5份；

粗灰分 6-8份；

赖氨酸 1.2-1.42份；

蛋+胱氨酸 0.78-1.10份；

色氨酸 0.27-0.34份；

钙 1.2-1.8份；

磷 0.8-1.2份；

另含有如下总质量含量的维生素成分：

维生素A 12500IU/kg；

维生素D 15000IU/kg；

维生素C 1250-1500IU/kg。

进一步的，所述的富硒厚朴提取物MBE中厚朴酚含量为160.875 mg/mL和厚朴酚含量为57.75 mg/mL。

上述的含富硒厚朴提取物的小鼠饲料在构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型中应用。

其中，所述的含富硒厚朴提取物的小鼠饲料在构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型中应用，具体构建步骤如下：

取六周大小的小鼠，适应性喂食一周后随机分组；采用含富硒厚朴提取物的小鼠饲料进行自由采食饲喂，自由饮水；饲喂2.5个月后，获得无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型。

本实施例获得的无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型，作为研究肥胖与脂肪肝诱发及下相关联系研究的模型动物，具有重要的科研价值。

本发明与现有技术相比，具有以下的优点和有益效果：

1. 本发明的富硒厚朴提取物MBE将乙醇作为提取溶剂不仅提取效率很高而且可以回收再利用，大大降低成本提高了效率；除杂的步骤使厚朴粗提取产物内的重油、鞣质和色素的成分大大降低，有利于产品适口性和安全性的提升；并且本发明的提取方法模拟了工业化的提取制作流程，为工业化提取探索了提取条件。

2. 本发明的制备获得的富硒厚朴提取物MBE中厚朴酚含量为160.875 mg/mL和厚朴酚含量为57.75 mg/mL，高含量的厚朴酚与和厚朴酚能够显著发挥富硒厚朴提取物在构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型中的有效作用。

3. 本发明提供的含富硒厚朴提取物的小鼠饲料，通过富硒厚朴提取物MBE、基础日粮、猪胆盐、胆固醇、猪油的组分组合，实现肥胖小鼠构建，并且构建获得的肥胖小鼠模型没有伴随有脂肪肝症状，所构建获得小鼠模型用于研究肥胖与脂肪肝之间的相关关联性具有重要价值。

4. 本发明构建获得的无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型，从肝脏脂肪变性程度、肝脏指数、肝脏中甘油三酯含量、肝脏中脂滴积累和脂滴生成、脂肪的病例变化、血液中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）的含量检测等上述肝脏脂肪化或病变的指标进行检测，从检测结果看，上述指标均与正常对照的ND组形状指标一致，与高脂饮食组HFD组均有显著差异，综上，成功构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型。

附图说明

图1为本发明实施例1的ND组、HFD组和MBE+HFD组小鼠的体重数据柱状图；其中数据表示为mean±SEM ，ns表示无显著差异（p>0.05）; **表示差异极显著（p<0.01）;***表示差异极其显著（p<0.001）。

图2为本发明实施例1的小鼠腹部脂肪堆积对比图。其中，从左到右为ND组、HFD组和MBE+HFD组。

图3为本发明实施例1的小鼠肝脏采集图。

图4为本发明实施例1的小鼠肝脏指数结果图。其中，数据表示为mean±SEM ，ns表示无显著差异（p>0.05）；*表示差异显著（p<0.05）；肝脏指数=肝脏重量÷机体重量×100%。

图5为本发明实施例1的小鼠肝脏甘油三酯含量检测结果图。其中，数据表示为mean±SEM ，*表示差异显著（p<0.05），**表示差异极显著（p<0.01）,***表示差异极其显著（p<0.001）。

图6为本发明实施例1的小鼠肝脏冰冻切片油红O染色效果图。

图7为本发明实施例1的小鼠肝脏病理切片HE染色效果图。

图8为本发明实施例1的小鼠血液化学指标检测结果图；其中，数据表示为mean±SEM ，ns表示无显著差异（P>0.05）;*表示差异显著（P<0.05）。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验药材：本实施例中选用的富硒厚朴为恩施富硒紫油厚朴：产于恩施双河紫油厚朴GAP基地，5-10年生厚朴干皮为原料生药，委托湖北九资河药业采购。实验检测和鉴定厚朴生药原材料的厚朴酚类含量为11.976%，远大于2020年版《中国药典》所要求的生药中厚朴酚类含量大于等于2%和厚朴饮片中厚朴酚类含量大于等于1.5%的标准，质量优良。

实验动物：本实施例所用小鼠为C57BJ/6小鼠：性别公，购自湖北省疾控中心。

本实施例中所用的富硒厚朴选取含硒量为0.35mg/kg-0.45mg/kg的富硒厚朴。硒含量测定，参照中国药典中的硒测定方法测出。上述含硒量为0.35mg/kg-0.45mg/kg的富硒厚朴，在构建实施例1的无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型中的效果最优。在模型构建时间内，对高脂饮食中的肥胖影响不大，同时对高脂饮食中的脂肪肝形状得到较好的控制。

实施例

一、本实施例通过以下步骤制备获得一种富硒厚朴提取物MBE，具体制备步骤如下：

1）粉碎提取：取富硒厚朴粉碎后，过100目筛网，按厚朴纤维：75乙醇为1：2浸泡24h后药液也汇入提取溶剂乙醇；料液比1：8加入厚朴中粉，浸泡24-48小时后汇入提取罐，用脱脂纱布防止漏出，加压0.03 MPa，温度60℃回流提取三次，每次1.5 h；

2）除杂：趁热取滤液，放置冷却；加入2%活化后的活性炭、4%明胶、4%壳聚糖进行除杂去鞣制色素，静置24小时后过滤取滤液；

3）浓缩：-0.08 MPa，55℃减压浓缩至原体积的八分之一即为富硒厚朴浸膏，半成品置于四度冰箱备用；

4）再浓缩：旋转蒸发仪最大压力-0.01MPa，55℃减压浓缩至浓稠无醇味，获得浓缩品；

5）制剂：可溶性淀粉，与步骤4）获得浓缩品，按照1：1包裹制剂，采用无水氯化钙干燥剂，真空干燥，获得富硒厚朴提取物MBE。

二、富硒厚朴提取物MBE的鉴定和有效成分鉴定

将富硒厚朴提取物MBE处理后在319 nm和292 nm处检测波长，平行检测3次取平均。根据下列公式计算出浓度含量：

A1（总）=ε1（厚朴酚）×C（厚朴酚）+ε1（和厚朴酚）×C（和厚朴酚）

A2（总）=ε2（厚朴酚）×C（厚朴酚）+ε2（和厚朴酚）×C（和厚朴酚）

将吸光度A292=28.29、A319=27.12代入上述公式和标准曲线得：

表1 和厚朴酚、厚朴酚浓度测定结果

	浓度
		厚朴酚	160.875 mg/g
和厚朴酚	57.75 mg/g

综上表1结果显示，MBE中和厚朴酚含量为57.75 mg/g厚朴酚含量为160.875mg/g浓度较高，可以应用于后续实验。

所用的鉴定方法为：UV法检测厚朴酚与和厚朴酚，具体测定步骤如下：

2.1）标准品溶液的配置：

（1）厚朴酚标准溶液：精密称取20 mg厚朴酚于25 mL容量瓶，加入甲醇至刻度摇匀。吸取500 μL母液于10 mL容量瓶用甲醇稀释至刻度得40 μg/mL厚朴酚标准溶液。

（2）和厚朴酚标准溶液：精密称取20 mg和厚朴酚于25 mL容量瓶，加入甲醇至刻度摇匀。吸取300 μL母液于10 mL容量瓶用甲醇稀释至刻度得24 μg/mL和厚朴酚标准溶液。

2.2）厚朴生药磨粉供试品溶液制备：

厚朴生药磨粉，过100目筛网得粉末；精密称定0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，摇匀，密塞，浸渍24 h，滤过，精密量取滤液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。

2.3）厚朴样品检测：

取厚朴酚标准溶液1.2 μL于超微量分光光度计，在UV-vis400-750 nm区间扫描，选择最大吸收波长作为检测波长。取供试品溶液1.2 μL于超微量分光光度计，在UV-vis400-750 nm区间扫描得到最大吸收波长与标准溶液对比。取配得的厚朴酚标准溶液母液，加入甲醇配成浓度为0 mg/mL 、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL的梯度溶液。取供试品1.2 μL于超微量分光光度计，在UV-vis291 nm检测吸光度，并根据吸光度和浓度梯度做出厚朴酚标准曲线。

2.4）厚朴酚、和厚朴酚的解离：

由于厚朴酚、和厚朴酚互为同分异构体，有着相同的最大吸收波。所以根据他们的PKa值不同，调节溶液pH使其分开。按照10：1的比例加入pH 8.5磷酸二氢钾的氢氧化钠缓冲溶液到总体系为200 μL的和厚朴酚+厚朴酚标准溶液中，配成标准解离溶液，在UV-vis400-750 nm区间扫描得出最大波的位置。

2.5）厚朴酚、和厚朴酚标准曲线的建立：

配制厚朴酚、和厚朴酚与磷酸二氢钾的氢氧化钠缓冲溶液的标准溶液0 mg/mL 、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL。取供试品1.2 uL于超微量分光光度计，在UV-vis291 nm检测吸光度，并根据吸光度和浓度梯度做出和厚朴酚、厚朴酚在不同解离度下的标准曲线。

2.6）富硒厚朴提取物MBE的解离和浓度检测：

取富硒厚朴提取物MBE 500 uL加入甲醇和磷酸二氢钾的氢氧化钠缓冲溶液稀释至10 mL做母液备用；再取4 uL母液和磷酸二氢钾的氢氧化钠缓冲溶液稀释至500 uL作工作液备用。取工作液1.2 uL于超微量分光光度计，在UV-vis下检测最大波峰并记录。

三、含富硒厚朴提取物的小鼠饲料的制备：

按照以下组分制备：将以下组分基础日粮：猪胆盐：胆固醇：猪油：富硒厚朴提取物MBE按照86份：1份：1份：10份：2份的比例混合均匀，压缩成条，获得含富硒厚朴提取物的小鼠饲料。-20℃保存备用。

其中，所述基础日粮的营养成分质量份数为：水分 8-10份；粗蛋白 20-25份；粗脂肪 4-5份；粗纤维 4-5份；粗灰分 6-8份；赖氨酸 1.2-1.42份；蛋+胱氨酸 0.78-1.10份；色氨酸 0.27-0.34份；钙 1.2-1.8份；磷 0.8-1.2份；另含有如下含量的维生素成分：维生素A12500IU/kg；维生素D 15000IU/kg；维生素C 1250-1500IU/kg。

对比例中所用的维持饲料为基础日粮。

对比例中所用的高脂饲料为，将以下组分基础日粮：猪胆盐：胆固醇：猪油按照86份：1份：1份：10份的比例混合均匀获得。

其中，ND组饲喂维持饲料，HFD组饲喂高脂饲料，MBE+HFD组饲喂含富硒厚朴提取物的小鼠饲料。

四、含富硒厚朴提取物的小鼠饲料用于构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型：

4.1）构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型及其对比小鼠饲养

为了探究富硒厚朴提取物MBE对高脂饮食刺激下小鼠肥胖和脂肪肝的影响，将体重为18±1g的C57/B6小鼠15只随机平均分配为三组，ND组饲喂维持饲料，HFD组饲喂高脂饲料，MBE+HFD组饲喂添加2% MBE的高脂饲料。小鼠造模周期为3个月，造模结束后解剖取血采集数据，进行分析。

具体的小鼠模型动物构建如下：从湖北省动物疾控中心购买C57/B6 18±0.5g六周大小的雄性小鼠15只，适应性喂食一周后配种合笼；取体重相近6周大的雄性小鼠，随机平均分为3组（ND组、HFD组、HFD+MBE组），每组5只；适应性饲喂一周后，按照ND组饲喂全价维持饲料，HFD组饲喂高脂饲料（基础日粮：猪胆盐：胆固醇：猪油按照86份：1份：1份：10份），HFD+MBE组饲喂添加了含富硒厚朴提取物的小鼠饲料；三组均自由采食，自由饮水；定期检测小鼠体重和记录采食量；分三组后饲喂2.5个月，乙醚麻醉，眼球静脉采血后脱颈处死，解剖剥离取肝脏组织并称重。

4.2）含富硒厚朴提取物的小鼠饲料饲养获得的肥胖小鼠的肥胖形状检测

饲养结果体型体重结果如图1所示， HFD组小鼠比ND组小鼠体重上升38.34%，上升极其显著（p<0.001）,MBE+HFD组小鼠较ND组小鼠体重上升具有显著性，属于肥胖范畴。如图2所示，从左到右为ND组、HFD组和MBE+HFD组，HFD组和MBE+HFD组小鼠腹部脂肪堆积层明显多于ND组小鼠。综上，高脂饮食（HFD组）和含富硒厚朴提取物的小鼠饲料饮食（MBE+HFD组）均成功诱导获得肥胖小鼠模型。

4.3）含富硒厚朴提取物的小鼠饲料构建的肥胖小鼠无脂肪肝症状：

4.3.1）肝脏脂肪变性程度检测：

三个月的高脂肪高胆固醇胆盐的饮食刺激下，成功建立了肥胖小鼠模型。如图3为各组小鼠肝脏脂肪变性状况，从左到右依次是ND组、HFD组和MBE+HFD组，HFD组小鼠肝脏明显灰白肥大，边缘脂肪粒明显；富硒厚朴提取物MBE刺激明显改善高脂饮食下小鼠的肝脏脂肪变性程度，MBE+HFD组与ND组肝脏肉眼观察无明显脂肪变性。

4.3.2）肝脏的肝脏指数检测：

如图4所示，HFD组和ND组相比肝脏指数上调了16.02%，差异显著（p<0.05）; MBE+HFD组与HFD组相比小鼠肝脏指数下降了20.87%，差异显著（p<0.05）,与ND组无显著差异（ns>0.05）。综上所述，HFD+MBE组饲养（含富硒厚朴提取物的小鼠饲料）构建获得的肥胖小鼠模型并无脂肪肝症状。

4.3.3）肝脏中甘油三酯含量检测：

甘油三酯是脂滴的主要组成成分，甘油三酯的含量变化对判断和观察组织脂滴积累情况非常重要。MBE可能是通过影响甘油三酯的累积和合成来抑制肝脏中脂质积累。根据测得各组分吸光度计算得各组分小鼠肝脏的甘油三酯含量如图5所示，HFD组小鼠肝脏TG含量是ND组小鼠的1.6倍，上升极其显著（p<0.001）；HFD+MBE组饮食下小鼠的肝脏TG相较于HFD组下降了32.39%至正常水平，下调趋势非常显著（p<0.01）。综上所述，HFD+MBE组与高脂饮食组（HFD组）相比，其肝脏中甘油三酯水平显著降低，HFD+MBE组小鼠肝脏的甘油三酯水平与ND组小鼠的甘油三酯水平无显著差异（ns），无脂肪肝形状。

4.3.4）肝脏中脂滴积累和脂滴生成的情况检测：

如图6所示为肝脏冰冻切片油红O+苏木素染色。图6（A）、（B）和（C）依次为ND组小鼠肝脏冰冻切片油红染色在10倍、20倍和40倍视野下的采集图，视野范围内细胞排列紧密整齐，细胞核明显，没有明显的大脂滴出现；图6（D）、（E）和（F）依次为HFD组小鼠肝脏冰冻切片油红染色在10倍、20倍和40倍视野下的采集图，较ND组视野范围内出现密集且大小不一的红色脂滴，细胞排列混乱；图6（G）、（H）和（I）依次为MBE+HFD组小鼠肝脏冰冻切片油红染色在10倍、20倍和40倍视野下的采集图，视野内细胞排列紧密，较HFD组无明显大脂滴，脂滴数量和ND组对比无明显差异。综上结果，HFD+MBE组小鼠肝脏的脂滴积累情况与ND组小鼠的脂滴积累情况一致，无脂肪肝形状。

4.3.5）肝脏的病例变化的情况检测：

利用石蜡切片HE染色来探究ND组、HFD组和MBE+HFD组饮食下小鼠的肝脏的病理变化，结果如图7所示。图7（A）、（B）和（C）依次为ND组、HFD组和MBE+HFD组肝脏HE切片，由上至下为10倍和40倍视野，如图可清晰观察到HFD组较ND组小鼠有明显的肝脏脂肪变性、细胞肿胀和炎症浸润，箭头所指肝脏脂滴空泡数量多且大；MBE+HFD组小鼠肝脏脂滴空泡数量明显减少，没有明显的脂肪变性和炎症出现。综上，HFD+MBE组与ND组小鼠一致均无脂肪变性形状，无脂肪肝形状。

4.3.6）血液中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）的含量检测：

ALT和AST在肝细胞的线粒体中表达广泛，作为判断肝功能或肝炎的重要指标。检测了各组小鼠血液中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）的含量。如图8（A）所示为谷草转氨酶（AST）的水平，HFD组较ND组AST水平上调28.44%，上调趋势显著（p<0.05）； MBE和高脂的同时刺激下， MBE+HFD组小鼠的血液AST水平下降20.8%（p<0.05），且与ND组无显著差异（p>0.05）。如图8（B）所示，MBE+HFD组的MBE同时刺激显著降低由于高脂饮食引起的ALT水平的显著上调（p<0.05），MBE+HFD组小鼠ALT水平与ND组无显著差异（p>0.05）。综上，HFD+MBE组与ND组小鼠AST水平和ALT水平均无显著差异，HFD+MBE组小鼠无肝功能或肝炎指标均与ND组无显著差异，无脂肪肝形状。

HFD+MBE组饲养构建获得无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型。

本实施例获得的无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型，作为研究肥胖与脂肪肝诱发及下相关联系研究的模型动物，具有重要的科研价值。

本发明与现有技术相比，具有以下的优点和有益效果：

1. 本发明的富硒厚朴提取物MBE将乙醇作为提取溶剂不仅提取效率很高而且可以回收再利用，大大降低成本提高了效率；除杂的步骤使厚朴粗提取产物内的重油、鞣质和色素的成分大大降低，有利于产品适口性和安全性的提升；并且本发明的提取方法模拟了工业化的提取制作流程，为工业化提取探索了提取条件。

2. 本发明的制备获得的富硒厚朴提取物MBE中厚朴酚含量为160.875 mg/mL和厚朴酚含量为57.75 mg/mL，高含量的厚朴酚与和厚朴酚能够显著发挥富硒厚朴提取物在构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型中的有效作用。

3. 本发明提供的含富硒厚朴提取物的小鼠饲料，通过富硒厚朴提取物MBE、基础日粮、猪胆盐、胆固醇、猪油的组分组合，实现肥胖小鼠构建，并且构建获得的肥胖小鼠模型没有伴随有脂肪肝症状，所构建获得小鼠模型用于研究肥胖与脂肪肝之间的相关关联性具有重要价值。

4. 本发明构建获得的无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型，从肝脏脂肪变性程度、肝脏指数、肝脏中甘油三酯含量、肝脏中脂滴积累和脂滴生成、脂肪的病例变化、血液中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）的含量检测等上述肝脏脂肪化或病变的指标进行检测，从检测结果看，上述指标均与正常对照的ND组形状指标一致，与高脂饮食组HFD组均有显著差异，综上，成功构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种含富硒厚朴提取物的小鼠饲料，其特征在于：包括以下质量份的组分：

基础日粮 86份；

猪胆盐 1份；

胆固醇 1份；

猪油 10份；

富硒厚朴提取物MBE 2份；

所述的富硒厚朴提取物MBE，通过以下步骤制备获得：

1）粉碎提取：取富硒厚朴粉碎后，过100目筛网，按厚朴纤维：75%乙醇为1：2浸泡24h后药液也汇入提取溶剂乙醇；料液比1：8加入厚朴中粉，浸泡24-48小时后汇入提取罐，用脱脂纱布防止漏出，加压0.03 MPa，温度60℃回流提取三次，每次1.5 h；

2）除杂：趁热取滤液，放置冷却；加入2%活化后的活性炭、4%明胶、4%壳聚糖进行除杂去鞣质色素，静置24小时后过滤取滤液；

3）浓缩：-0.08 MPa，55℃减压浓缩至原体积的八分之一即为富硒厚朴浸膏，半成品置于冰箱备用；

4）再浓缩：采用实验室用循环水真空泵接旋转蒸发仪最大量程-0.01Mpa，55℃减压浓缩至浓稠无醇味，获得浓缩品；

5）制剂：可溶性淀粉，与步骤4）获得浓缩品，按照1：1包裹制剂，真空干燥，获得富硒厚朴提取物MBE；

步骤1）中所述的富硒厚朴选取含硒量为0.35mg/kg-0.45mg/kg的恩施富硒紫油厚朴；

所述的富硒厚朴提取物MBE中厚朴酚含量为160.875 mg/mL和厚朴酚含量为57.75 mg/mL。

2.根据权利要求1所述的含富硒厚朴提取物的小鼠饲料，其特征在于：步骤5）所述真空干燥时所用的干燥剂为无水氯化钙。

3.根据权利要求1所述的含富硒厚朴提取物的小鼠饲料，其特征在于：所述基础日粮的营养成分质量份数为：

水分 8-10份；

粗蛋白 20-25份；

粗脂肪 4-5份；

粗纤维 4-5份；

粗灰分 6-8份；

赖氨酸 1.2-1.42份；

蛋氨酸+胱氨酸 0.78-1.10份；

色氨酸 0.27-0.34份；

钙 1.2-1.8份；

磷 0.8-1.2份；

另含有如下总质量含量的维生素成分：

维生素A 12500IU/kg；

维生素D 15000IU/kg；

维生素C 1250-1500IU/kg。

4.权利要求1-3任一项所述的含富硒厚朴提取物的小鼠饲料在构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型中应用。

5.根据权利要求4所述的含富硒厚朴提取物的小鼠饲料在构建无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型中应用，其特征在于：具体构建步骤如下：

取六周大小的小鼠，适应性喂食一周后随机分组，采用含富硒厚朴提取物的小鼠饲料进行自由采食饲喂，自由饮水；饲喂2.5个月后，获得无脂肪肝症状的肥胖小鼠模型。