KR101509220B1

KR101509220B1 - 커피박 발효물을 이용한 면역 증진용 조성물의 제조 방법

Info

Publication number: KR101509220B1
Application number: KR20130069257A
Authority: KR
Inventors: 서형주; 박으뜸; 변정훈
Original assignee: 주식회사 제이아트팩토리
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2015-04-10
Also published as: KR20140146470A

Abstract

본 발명은 커피박을 준비하는 단계; 상기 커피박을 채유하는 단계; 및 상기 채유박에 균을 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 면역 증진용 조성물의 제조 방법에 대한 것이다.

Description

커피박 발효물을 이용한 면역 증진용 조성물의 제조 방법{A PREPARATION METHOD OF IMMUNE-BOOSTING COMPOSITION USING FERMENTED COFFEE SPENT}

본 발명은 커피박 발효물을 이용한 면역 증진용 조성물의 제조 방법에 대한 것이다.

커피는 전 세계적으로 가장 널리 음용되고 있는 기호식품으로 우리나라에서도 커피전문점 확산과 자가소비 증가 등 커피시장이 지속적으로 성장하고 있다.

커피 제조 후의 폐기물인 커피박(coffee spent)의 생성은 세계적으로 연간 6백만 톤 이상으로 추산되며(Tokimoto, T., Kawasaki, N., Nakamura, T. Akutagawa, J. and Tanada. S. 2005. Removal of lead ions in drinking water by coffee grounds as vegetable biomass. J. Colloid Interf. Sci. 281:56-61.), 이의 재활용 연구가 활발히 이루어지고 있다. 특히 커피박을 연료소재, 사료 또는 비료 첨가물(Saenger, M., Hartge, E. Werther, J. Ogada, T. and Siagi, Z. 2001. Combustion of coffee husks. Renew. Energ. 23:103-121.), 기능성 물질 소재원(Simoes, J., Madureira, P., Nunes, F. M., Domingues, M. R. Vilanova, M. and Coimbra, M. A. 2009. Immunostimulatory properties of coffee mannans. Mol. Nut. Food Res. 53:1036-1043.), 바이오디젤 원료(Franca, A. S., Oliveira, L. S. and Ferreira, M. E. 2009. Kinetics and equilibrium studies of methylene blue adsorption by spent coffee grounds. Desalination 249:267-272.)로서 이용하는 연구가 이루어지고 있다.

국내에 수입되는 생두의 양은 96,000톤, 원두(배전두)의 양은 3,500톤으로 커피 소비량 순위 세계 11위를 기록할 정도로 커피시장은 빠르게 성장하고 있다. 커피 원두 1톤당 부산물로 생산되는 커피박은 약 1.65톤(평균 고형분 함량 33wt%, 밀도 490 kg/m3)이므로, 매년 수입되는 원두, 생두로부터 약 130,000톤의 커피박이 발생할 것으로 추정된다.

한편, 대식세포(macrophage)는 세균이나 이물질을 탐식, 제거하는 과정에서 여러 가지를 분비하여 면역현상을 조절하며, 항원에 대한 면역작용의 중추적인 역할을 하는 세포로써, 항원제시와 림프구의 비특이적인 면역작용에 관계하며，종양세포에 대해서는 직접적인 상해활성을 나타낸다. 또한, TLR(toll like receptor)에 반응하는 물질(LPS 혹은 천연물)은 macrophage를 활성화하여 T세포와 B세포의 증식, 식균 작용을 위한 대식세포의 활성화, 미생물 감염에 대한 방어 등의 2차 면역반응을 조절할 수 있는 IL-1，IL-6, IL-10, lL-12 및 TNF-α와 같은 사이토카인을 생산한다고 알려져 있다. IL-6 및 TNF-α는 대식세포에 의해 유도되는 대표적인 사이토카인으로서 세균감염에 따른 염증반응에 있어서 중추적인 역할을 하며 염증병소에서 그 양이 증가되는 것으로 알려져 있다. IL-6는 IL 1과 협동적으로 작용하여 T 세포와 B 세포의 분화에 관여하고 항암효과가 있다고 보고되었으며, TNF-α는 특정 암세포에 대한 세포독성과 항 바이러스성 작용이 있고, 급성 및 만성 염증질환에서 일어나는 여러 가지 생체반응에도 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 한편, IL-12는 NK cell의 활성화 및 Th1 type의 면역 반응을 유도하는 사이토카인으로써 암세포와 같은 세포성 외래물질에 대한 반응성을 높이는 작용을 한다고 알려져 있다.

본 발명자들은 커피박의 활용 방법에 대하여 연구하던 중, 커피박으로부터 커피 오일을 제거하는 경우 균의 발효 효율이 현저히 증가하며, 특정 균으로 채유된 커피박을 발효시킬 경우 커피박 발효물의 면역활성이 증가하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 면역 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 커피박 발효물을 이용한 면역 증진용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 면역 증진용 조성물은 TNF-α, IL-12, IL-6 등 사이토카인 생산 활성이 높으면 면역 증진능을 갖는다.

도 1은 커피박 발효물 내 총 당 함량을 나타낸다. 막대들은 3회 반복 시험의 평균±SD 값을 나타낸다. 서로 다른 문자들은 Duncan's multiple range test에 의한 샘플들 간의 중요한 차이들을 가리킨다(p<0.05).
도 2는 커피박 발효물 내 환원당 함량을 나타낸다. 막대들은 3회 반복 시험의 평균±SD 값을 나타낸다. 서로 다른 문자들은 Duncan's multiple range test에 의한 샘플들 간의 중요한 차이들을 가리킨다(p<0.05).
도 3은 커피박 발효물 내 우론산 함량을 나타낸다. 막대들은 3회 반복 시험의 평균±SD 값을 나타낸다. 서로 다른 문자들은 Duncan's multiple range test에 의한 샘플들 간의 중요한 차이들을 가리킨다(p<0.05).
도 4는 커피박 발효물 내 폴리페놀 함량을 나타낸다. 막대들은 3회 반복 시험의 평균±SD 값을 나타낸다. 서로 다른 문자들은 Duncan's multiple range test에 의한 샘플들 간의 중요한 차이들을 가리킨다(p<0.05).
도 5는 커피박 발효물의 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸다(각각 a 및 b). half maximal inhibitory concentration(IC50)는 ABTS 및 DPPH 라디칼이 50%까지 소거되는 효과적인 농도이다.
도 6은 커피박 발효물의 FRAP 값을 나타낸다. 막대들은 3회 반복 시험의 평균±SD 값을 나타낸다. 서로 다른 문자들은 Duncan's multiple range test에 의한 샘플들 간의 중요한 차이들을 가리킨다(p<0.05).
도 7은 커피박 발효물로부터 분리한 샘플들의 쥐 복막(peritoneal)의 대식세포에 의한 TNF-α 생산능을 나탄낸다. 배지는 음성 대조군(negative control, NC)로서 사용되었다. 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide)(LPS)는 양성 대조군으로 사용되었으며(그래프 내 control로 표시(커피박 비발효군)), 그 농도는 5 μg/mL였다. 서로 다른 문자를 갖는 값들은 Duncan's multiple range test에 의한 샘플들 간에 중요한 차이가 있는 것이다(p<0.05).
도 8은 커피박 발효물로부터 분리한 샘플들의 쥐 복막(peritoneal)의 대식세포에 의한 IL-12 생산능을 나탄낸다. 배지는 음성 대조군(negative control, NC)로서 사용되었다. 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide)(LPS)는 양성 대조군으로 사용되었으며(그래프 내 control로 표시(커피박 비발효군)), 그 농도는 5 μg/mL였다. 서로 다른 문자를 갖는 값들은 Duncan's multiple range test에 의한 샘플들 간에 중요한 차이가 있는 것이다(p<0.05).
도 9는 커피박 발효물로부터 분리한 샘플들의 쥐 복막(peritoneal)의 대식세포에 의한 IL-6 생산능을 나탄낸다. 배지는 음성 대조군(negative control, NC)로서 사용되었다. 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide)(LPS)는 양성 대조군으로 사용되었으며(그래프 내 control로 표시(커피박 비발효군)), 그 농도는 5 μg/mL였다. 서로 다른 문자를 갖는 값들은 Duncan's multiple range test에 의한 샘플들 간에 중요한 차이가 있는 것이다(p<0.05).

본 발명은

커피박을 준비하는 단계;

상기 커피박을 채유하는 단계; 및

상기 채유박에 균을 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 면역 증진용 조성물의 제조 방법에 대한 것이다.

커피박

본 발명의 커피박은 커피 원두로부터 커피액을 추출하고 남은 잔사이다. 상기 커피 원두는 커피 생두를 로스팅한 것이다.

채유

본 발명의 채유란 커피박으로부터 커피 오일을 제거하는 것을 의미한다. 상기 제거는 통계적으로 유의할 정도로 커피 오일이 커피박으로부터 제거되는 것을 의미한다. 상기 채유는 균의 발효를 증진시키기 위한 위한 것으로, 채유 공정을 거치지 않을 경우 균의 발효 효율이 낮아져, 산업적으로 이용가능할 만큼 균 배양 및 이에 따른 면역증진능이 이루어지지 않는다.

채유박

본 발명의 채유박은 채유 공정을 거치고 남은 커피박, 즉 채유에 의하여 커피 오일이 제거된 커피박을 가리킨다. 상기 채유 공정을 거친 커피박, 즉 채유박은 커피 오일이 제거되었는바, 균의 배양, 발효가 효과적으로 이루어지게 된다.

균의 접종 및 배양

본 발명은 상기 채유박에 균을 접종, 배양하여 커피박 발효물을 제조한다. 상기 균은 이노노투스 균, 모나스커스균 또는 코디셉스균이다.

상기 접종은 상기 채유박에 물 및 당을 첨가하고 균을 접종하여 수행하는 것이 균의 발효 효율상 바람직하다. 물 및 당을 추가로 첨가하지 않을 경우 발효가 산업적으로 효과적인 수준으로 이루어지지 않는다.

면역증진용 조성물

본 발명의 면역증진용 조성물은 항산화 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는 본 발명의 면역증진용 조성물은 ABTS 라디칼 소거 활성 및 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는다. 상기 면역 증진용 조성물은 식품 조성물 또는 사료 조성물이 될 수 있다.

식품 조성물

본 발명의 상기 식품이란 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품, 운동 보조제 등이나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 커피박 발효물을 첨가한 것도 포함된다.

본 발명의 커피박 발효물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 건강 유지 목적)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 커피박 발효물을 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.01 내지 70.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 30.00 중량%의 양으로 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10.00 중량%의 양으로 첨가할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 커피박 발효물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

상기 커피박 발효물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료, 파우더 제제 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

사료 조성물

본 발명의 커피박 발효물을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물은 통상적인 사료와 함께 배식할 수 있으며, 본 발명의 사료 조성물을 통상적인 사료 조성물에 첨가하여 기능성 사료 조성물을 제조하여 이용할 수도 있다. 또한 본 발명의 사료 조성물은 본 발명의 커피박 발효물 외 기능성 성분을 추가로 포함할 수도 있다. 상기 통상적인 사료 조성물과 본 발명의 커피박 발효물이 혼합된 기능성 사료 조성물의 제조 시, 본 발명의 커피박 발효물은 총 사료 조성물에 대하여 0.01 내지 30.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 20.00 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 사료 조성물의 상기 커피박 발효물의 유효용량은 상기 식품 조성물의 유효 용량에 준해서 사용할 수 있으나, 지속적인 면역 증강을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 가축 또는 가금을 대상으로 한다. 상기 가축 또는 가금은 소, 돼지, 닭, 말, 양, 당나귀, 노새, 멧돼지, 토끼, 메추라기, 집오리, 장닭, 투계용 닭, 비둘기, 칠면조, 개, 고양이, 원숭이, 햄스터, 생쥐, 래트, 구관조, 앵무새, 잉꼬, 카나리아 등이나 이들에 제한되는 것은 아니며 가정 내에서 사육 가능한 인간 이외의 포유 동물 또는 조류이면 본 발명의 사료 조성물의 대상이라 할 것이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<재료 및 방법>

pH 측정

시료 20 mL을 100 mL 삼각 플라스크에 넣고 pH meter (Orion Dual Star pH/ISE benchtop, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 측정하였다.

환원당 및 총 당 함량 측정

총 당은 Dubois 의 방법(Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers P, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical chemistry. 1956;28(3):350-6.)을 변형하여 측정하였다. 먼저, 시료 200 μL과 5%(v/v) 페놀 용액을 섞은 다음 95% 황산을 1 mL을 첨가한 후 20 분간 상온에 방치하였다. 그리고 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며 표준물질로는 글루코스를 이용하였다.

환원당은 Miller의 방법(Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical chemistry. 1959;31(3):426-8.)을 변형하여 측정하였다. 시료 1 mL에 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) 시약 3 mL을 테스트 튜브에 넣고 끓는 물에서 5분간 가열하고 냉각한 뒤에 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 글루코스를 이용하였다.

우론산 정량

우론산(Uronic acid, 산성당)는 Blumenkrantz 의 방법(Blumenkrantz N, Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids. Analytical biochemistry. 1973;54(2):484-9.)을 이용하여 수행하였다. 먼저, 1.2 mL sodium tetraborate (0.0125M in H2SO4)에 200 μL의 시료를 넣고 끓는물에서 5분간 반응을 하고 식힌 뒤 m-하이드록시디페닐(hydroxydiphenyl) 용액 (0.15% in 0.5% NaOH)을 20 μL 첨가 하여 520 nm에서 흡광도를 측정한다. 표준물질로는 갈라투론산(galacturonic acid)을 이용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Singleton의 방법(Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos RM. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent. Methods in enzymology. 1999;299:152-78.)을 변형하여 수행하였다. 먼저, 증류수 800 μL에 시료 10 μL를 넣고 0.9 N Folin-Ciocalteu 시약 50 μL, 20% sodium carbonate 용액150 μL와 각각 섞은 다음 2시간 동안 암소에 방치하였다. 이는 Folin-Ciocalteu 시약이 커피박 배양액의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 이용한 것으로 반응액의 흡광도는 750 nm에서 측정하였다. 표준물질로 갈산(gallic acid)을 희석하여 사용하였으며, 검량선 작성 후 총 폴리페놀성 화합물 함량은 시료 1 g중 mg gallic acid equivalent (GAE)로 나타내었다.

항산화 활성

ABTS 라디칼 소거활성

ABTS 라디칼 소거능은 Re 등(Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine. 1999;26(9):1231-7.)의 방법을 이용하여 측정하였다. 7mM 2.45 mM potassium persulfate를 첨가하여 암소에서 12～16시간 방치한 후 414 nm에서 흡광도가 1.4～1.5가 되도록 증류수로 희석시킨 ABTS(2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, Sigma-Aldrich) 라디칼 용액 200 μL에 시료 10 μL을 60분간 반응시킨 후 414 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단위는 라디칼을 50% 저하시키는 시료의 농도인 Half maximal inhibitory concentration (IC50)로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거활성

DPPH 라디칼 소거능 측정은 Cheung 등(Cheung L, Cheung PC, Ooi VE. Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts. Food Chemistry. 2003;81(2):249-55.)의 방법을 변형하여 수행하였다. DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, Sigma-Aldrich)을 에탄올에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 100 μL와 시료 100 μL을 30분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단위는 라디칼을 50% 저하시키는 시료의 농도인 Half maximal inhibitory concentration (IC50)로 나타내었다.

FRAP

FRAP(Ferric ion reducing antioxidant power) assay는 Benzie의 방법(Benzie IF, Strain J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Analytical biochemistry. 1996;239(1):70-6.)을 이용하여 활성을 측정하기 위한 반응액으로 acetate buffer (pH 3.6, 300 mM) : 10 mM의 TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) : 20 mM의 FeCl3·6H2O를 10:1:1(v/v/v)의 비율로 실험 직전에 혼합하였다. 반응액 180 μL과 시료 6 μL를 섞고 5분간 상온에서 방치한 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 환원력은 Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate (FeSO4·7H2O, Sigma-Aldrich)를 희석한 것을 이용하여 표준곡선을 작성한 뒤 시료 FRAP value (mmol FeSO4·7H2O/g dry weight)로 나타내었다.

커피박 발효물의 일반 분석 및 구성당 분석

중성당 함량은 갈락토스(galactose)를 표준물질로 하여 phenolsulfuric acid법으로(Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Biochem. 28:350-356 (1956)), 산성당 함량은 galacturonic acid를 표준물질로 하여 m-hydroxybiphenyl법으로(Blumenkrantz N, Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids. Anal. Biochem. 54:484-489 (1973)), 단백질 함량은 표준물질로 bovine serum albumin을 사용하여 Bradford법(Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254 (1976))으로, 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid(KDO) 및 2-keto-3-deoxy-D-lyxo-heptulosaric acid (DHA)의 신속한 정량을 위해서는 thiobarbituric acid(TBA) 비색정량법(Karkhanis YD, Zeltner JY, Jackson JJ, Carlo DJ. A new and improved microassay to determine 2-keto-3-deoxyoctonate in lipopolysaccharide of Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 85:595-601 (1978))을 실험실 여건에 맞게 변형하여 사용하였다. 한편, 구성당 분석은 다당 시료를 2 M 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) (TFA)으로 121 ℃에서 1.5시간 가수분해한 후, 각각 alditol acetate 유도체로 전환시킨 다음 GC로 분석하였다. GC의 분석은 SP-2380 capillary column(0.2 μm film, 0.25 mm i.d.×30 m, Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 GC ACME-6100(Young-Lin Co.)을 이용하였으며 표준 온도조건[60 ℃ (1분), 60 ℃ → 220 ℃(30 ℃/분), 220 ℃(12분), 220 ℃ → 250 ℃ (8 ℃/분), 250 ℃ (15분)]에서 분석을 실시하였다. 구성당의 mole %는 피크의 면적비, flame ionization detector(FID)에 대한 반응계수 및 각 구성당의 alditol acetate 유도체의 분자량으로부터 계산하였다.

대식세포로부터 생산된 사이토카인 측정

BALB/c mouse의 복강에 5% thioglycollate 배지(Sigma)를 1 mL 주입하고 72시간 내에 유도된 대식세포(macrophage)를 회수한 후(Hwang YC, Shin KS. Characterization of immune-stimulating polysaccharides isolated from Korean persimmon vinegar. Korean J. Food Sci. Technol. 40:220-227 (2008)), RPMl 1640으로 2~3회 세척하고, 세포 수를 2×10⁶ cell/mL로 조정하여 96 well plate에 100 μL씩 분주하였다. 이를 5% CO2 인큐베이터에서 배양 (37℃, 24 h)하여 대식세포 monolayer를 형성시키고 상둥액올 제거한 후, 미부착 대식세포 RPMI 1640-FBS 배지를 이용하여 세척하였다. 여기에 RPMI 1640-FBS 각 well 당 100 μL를 분주하고, 다양한 농도로 희석된 시료를 100 μL씩 첨가하여 37℃，5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 대식세포에 의해 유도, 분비된 배양 상등액 중의 사이토카인(IL-6, IL-12, TNF-α) 함량은 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 키트(BD Bio-sciences, San Diego, CA, USA)를 이용，제조사의 지침에 따라 분석하였다.

통계분석

자료 처리는 SPSS 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였다. 각 항목에 대한 평균(mean) 및 표준편차(standard deviation, SD)를 산출하였고 통계적 유의성은 5% 수준에서(p<0.05) Duncan’s multiple range test로 검정하였다.

<실험예 1> 커피박 채유 여부에 따른 발효 특성

커피박의 일반성분을 측정한 결과, 약 17%의 지방을 함유하고 있었다.. 따라서 커피박으로부터 지방 제거 전과 후의 발효 특성을 검토하였다. 이때, 발효 특성을 평가하기 위하여 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) M2와 KCTC3099를 이용하였다. 지방을 제거한 커피박 15 g 및 지방을 제거하지 않은 커피박 15g에 각각 포도당 3 g에 증류수 300 mL 가하여 현탁하였다. 그리고 121 ℃에서, 20 분간 살균하여 발효 특성을 평가하였다.

상기 락토바실러스 브레비스 M2와 KCTC3099를 접종하고 3일간 배양한 후에 pH 변화를 측정한 결과, 지방제거 전처리 과정(채유 과정)을 거치지 않은 경우 3일 배양 후의 pH 변화가 없었으나, 지방 제거 전처리 과정을 거친 커피박을 사용할 경우 비발효물(대조군(커피박 비발효군))은 5.02인 반면 발효 후에는 각각 3.89와 3.50으로 pH의 변화를 보였다(표 1). 이는 유산균이 증식하면서 pH 변화를 초래한 것으로, 커피박을 이용한 발효물 제조시, 커피박으로부터 지방을 제거한 후 발효하는 것이 효과적인 것을 확인하였다.

그러므로 커피박을 채유하여 채유박의 형태로 전처리한 후 균을 접종, 균들의 최적 배양 조건 하 발효하여 후속 시험들을 수행하였다.

<제조예> 커피박 발효물의 제조

커피원두로부터 커피를 추출하고 남은 커피박을 준비하고, 이를 roaster(하나로볶음디, 내쇼날이엔지)에서 로스팅(roasting, 조건: 곡물온도: 150℃, 솥바닥온도: 190℃)하였다. 그 후 expeller(하나로세미오토, 내쇼날이엔지)에서 기름을 추출(압력: 60 Mpa (휴렌체판: 100℃, 깨통온도:120℃, 유판온도: 100℃)하여 채유한 다음, 채유박을 커피박 발효물 제조에 사용하였다.

상기 채유박(이하, 실험예 2 내지 6에서 사용하는 용어 “커피박”은 채유박을 가리킨다) 15 g 또는 30 g에 증류수 300 mL과 글루코스를 3 g 넣어 배지를 만들었다. 균은 이노노투스 오블리쿠스(Inonotus obliquus), 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus), 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps millitaris), 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis)를 각각 접종하였고, 접종량은 wet base로 5%, 배양조건은 25℃에서 7일간 배양을 하였다. 성분 분석은 배양 후 얻어진 배양액을 이용하여 실험을 하였다.

<실험예 2> 커피박 발효물의 분석

<2-1> 커피박 발효물의 pH

상기 제조예에서 제조한 커피박 발효물의 pH를 측정하였다. 커피박의 발효과정에서 생성되는 유기산, 탄산가스 및 기타 산 물질은 pH에 영향을 미친다. 상기 커피박 발효물은 모두 약산성을 나타내었으며 15 g의 커피박으로 배지를 만든 경우는 I. 오블리쿠스 < M. 필로서스 < 대조군(커피박 비발효군) < C. 시넨시스 < C. 밀리타리스 순으로 pH가 나타났다. 30 g의 커피박으로 배지를 만든 경우는 M. 필로서스 < 대조군(커피박 비발효군) < I. 오블리쿠스 = C. 시넨시스 < C. 밀리타리스 순으로 나타났다(표 2).

<2-2> 커피박 발효물의 총 당 및 환원당

15 g의 커피박으로 배지를 만든 경우의 총 당 함량은 M. 필로서스 < C. 시넨시스 < C. 밀리타리스 < 대조군(커피박 비발효군) < I. 오블리쿠스 순으로 나타났고 30 g의 커피박으로 배지를 만든 경우는 M. 필로서스 < 대조군(커피박 비발효군) < I. 오블리쿠스 < C. 밀리타리스 < C. 시넨시스 순이었다(도 1). M. 필로서스로 커피박을 배양한 경우 다른 처리군에 비해 유의적으로 낮은 수치를 보이는데, 이로써 당의 분해로 pH가 낮아졌음을 추측할 수 있다.

15 g의 커피박으로 배지를 만든 경우의 환원당(Reducing sugar) 함량은 M. 필로서스 < I. 오블리쿠스 < C. 시넨시스 < C. 밀리타리스 < 대조군(커피박 비발효군) 순으로 나타났고, 30 g의 커피박으로 배지를 만든 경우는 M. 필로서스 < I. 오블리쿠스 < 대조군(커피박 비발효군) < C. 시넨시스 < C. 밀리타리스 순으로 환원당 함량이 나타났다(도 2). 총 당과 마찬가지로 환원당의 함량도 M. 필로서스균으로 커피박으로 배양한 경우 다른 처리군에 비해 유의적으로 낮은 수치를 보이므로 당의 분해로 pH가 낮아진 것으로 판단되었다.

<2-3> 커피박 발효물의 우론산(산성당) 함량

우론산(Uronic acid, 산성당)의 함량은 15 g의 커피박으로 배지를 만든 경우가 C. 시넨시스 < M. 필로서스 < 대조군(커피박 비발효군) < C. 밀리타리스 < I. 오블리쿠스 순으로 나타났고, 30 g의 커피박으로 배지를 만든 경우는 대조군(커피박 비발효군) < I. 오블리쿠스 < C. 밀리타리스 < C. 시넨시스 < M. 필로서스 순으로 나타났다(도 3).

<2-4> 커피박 발효물의 총 폴리페놀 함량

커피박 발효물에 함유된 총 폴리페놀 함량은 건조시료 g 당 gallic acid의 등량값으로 나타내었다. 처리군은 대조군에 비해 폴리페놀 함량이 높아지는 경향을 보였으며 특히 M. 필로서스로 배양한 경우 높은 폴리페놀 함량을 나타내었다(도 4).

<2-5> 커피박 발효물의 성분 분석

상기 <2-1> 내지 <2-4>의 커피박 발효물의 분석 결과를 종합하면, 하기 표 3과 같다.

1) 각각의 pH값은 5회 반복 측정한 평균값이다.

2) 값들은 3회 반복 실험한 평균±SD 값이다. 서로 다른 문자들은 Duncan's multiple range test에 의하여, 샘플들 간 유의한 차이들(p<0.05)을 가리킨다.

<실험예 3> 커피박 발효물의 ABTS와 DPPH 라디칼 소거능

대부분의 페놀성 물질은 유리 라디칼을 효과적으로 제거하지만 라디칼의 기질에 따라 선택적으로 작용하는 페놀성 물질이 존재하므로 본 연구에서는 ABTS와 DPPH의 라디칼 소거활성 모두를 측정하여 활성을 비교 평가하였다. ABTS와 DPPH 결과의 단위는 라디칼을 50% 저하시키는 시료의 농도인 IC50으로 나타내었다.

ABTS의 결과를 보면 15 g의 커피박으로 배지를 만든 경우는 대조군(커피박 비발효군)에 비해 M. 필로서스균으로 배양한 경우가 낮은 IC50값을 나타냈고, 30 g의 커피박으로 배지를 만든 경우는 C. 밀리타리스균으로 배양한 경우가 낮은 IC50값을 나타내므로, 이들이 각각 높은 라디칼 소거능을 갖는 것을 알 수 있었다(도 5a).

DPPH의 결과 15 g의 커피박으로 배지를 만든 경우는 대조군(커피박 비발효군)에 비해 M. 필로서스균으로 배양한 경우가 낮은 IC50값을 나타내었다. 그러나30 g의 커피박으로 배지를 만든 경우는 발효군은 대조군과 비교했을 때 유의적인 차이를 나타내지는 않았다(도 5b).

<실험예 4> 커피박 발효물의 FRAP 값

커피박 발효물의 FRAP 값(value)은 건조시료 g당 mmol FeSO4·7H2O 함량으로 나타내었다. 15 g의 커피박으로 배지를 만든 경우는 대조군에 비해 M. 필로서스균으로 배양한 경우 높은 FRAP 값을 보였으며, 30 g의 커피박으로 배지를 만든 경우는 C. 밀리타리스균으로 배양한 경우가 높은 FRAP 값을 나타내었다(도. 6).

<실험예 5> 커피박 발효물로부터 분리한 각 조다당들의 화학적 조성

15 g, 30 g의 커피박에 4 종류의 미생물을 접종하여 배양한 후, 발효시켜 각각의 조다당(10가지)를 추출하였다.

15 g의 커피박을 발효시켜 추출한 조다당의 일반 화학적 특성은 모든 시료들이중성당이 대부분을 차지하였으며, 특히 대조군(커피박 비발효군)에서 92.5%로 중성당 함량이 가장 높았고, 4 가지 시료 모두 대조군(커피박 비발효군)에 비해 중성당 함량이 낮았으며 특히, C. 시넨시스가 86.5%로 중성당 함량이 가장 낮았다. 한편, 각 시료들을 가수분해하여 alditol acetate 유도체로 전환하고 구성당을 분석한 결과, 4 가지 시료 모두 약간의 조성 차이는 있었지만, 동일하게 만노스(mannose)와 갈락토스(galactose)가 높은 비율로 함유하고 있었으며, M. 필로서스는 다른 시료에 비해 글루코스 함량이 높게 나왔다(표 4).

30 g의 커피박을 발효시켜 추출한 조다당의 일반 화학적 특성은 5 종류의 시료 모두 88% 이상 중성당이 차지하였으며, 특히 대조군(커피박 비발효군)에서 88.6%로 중성당 함량이 가장 낮았고, C. 시넨시스가 91.9%로 중성당 함량이 가장 높았다. 그러므로 커피박에 미생물을 이용하여 발효를 하지 않은 대조군 보다 미생물을 이용하여 발효를 거치면 중성당 함량이 높아진다는 것을 예상할 수 있었다. 또한, 단백질 함량을 측정한 결과 대조군(커피박 비발효군)에서 4.1%로 가장 높게 측정되었으며, 미생물에 의해 발효된 시료들은 모두 단백질이 미량 검출되었다. 한편, 각 시료들을 가수분해하여 alditol acetate 유도체로 전환하고 구성당을 분석한 결과, 5 가지 시료 모두 약간의 조성 차이는 있었지만, 동일하게 만노스와 갈락토스가 높은 비율로 함유하고 있었으며, 대조군(커피박 비발효군)에서 글루코스 함량이 가장 높게 나왔다. 이로써 미생물의 발효에 의해 글루코스가 미량 분해되었음을 추측할 수 있었다(표 5).

상기 결과를 종합해 보면, 15 g의 커피박과 30 g의 커피박에 따라 단백질의 함량은 다르게 나타났으나, 시료 모두 중성당(Neutral sugar)이 86% 이상 함유하고 있었으며, 구성당 분석 결과 대부분이 만노스와 갈락토스만으로 구성된 비교적 간단한 만노갈락탄(mannogalactan) 및 갈락토만난(galactomannan)의 구조라고 추정할 수 있었다. 또한, 만노스가 50%이상 검출된 것으로 봐서 아마 미생물 발효시 세포벽을 구성하고 있는 mannoprotein에 만노스가 분해되어 나타났다고 추정 할 수 있었다.

1) KDO는 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid를 가리킴.

2) 단당류들은 alditol acetate들을 이용하여 분석됨.

3) 몰%(Mole%)는 검출된 총 탄수화물(carbohydrate)로부터 계산됨.

1) KDO는 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid를 가리킴.

2) 단당류들은 alditol acetate들을 이용하여 분석됨.

3) 몰%(Mole%)는 검출된 총 탄수화물(carbohydrate)로부터 계산됨.

<실험예 6> 커피박 발효물로부터 분리한 각 조다당들의 대식세포 자극에 의한 사이토카인 생산 활성 측정

15 g, 30 g의 커피박에 4 종류의 미생물을 발효하여 추출한 조다당 10가지 시료의 자극에 의한 대식세포의 사이토카인 생산을 in vitro에서 측정하였다.

그 결과, IL-6의 경우, 15 g의 커피박에 4 종류의 미생물을 발효하여 추출한 조다당에서는 대조군(커피박 비발효군) 대비 I. 오블리쿠스 와 C. 밀리타리스가 높은 활성을 나타내었다. 특히 고농도에서 보다 저농도인 40 μg/mL에서 C. 밀리타리스가 가장 높은 활성을 나타내었고, 40 μg/mL이하의 농도에서는 I. 오블리쿠스 가 대조군(커피박 비발효군) 대비 가장 높은 활성을 나타내었다. 또한, 200 μg/mL의 농도 이상에서부터는 C. 시넨시스 를 제외한 모든 시료들이 비슷하게 LPS에 상당하는 높은 활성을 나타내었다.

30 g의 커피박에 4 종류의 미생물을 발효하여 추출한 조다당에서는 대조군(커피박 비발효군) 대비 모든 시료가 높은 활성을 나타내었으며, 특히 C. 밀리타리스가 40 μg/mL의 저농도에서 4.3배 높은 활성을 나타내었다. 15 g의 커피박에 4 종류의 미생물을 발효하여 추출한 조다당과 마찬가지로 200 μg/mL의 농도 이상에서부터는 C. 시넨시스 를 제외한 모든 시료들이 비슷하게 LPS에 상당하는 높은 활성을 나타내었다.

상기 결과들을 종합해 보면 15 g의 커피박 발효물과 30 g의 커피박 발효물 모두 IL-6에서는 40 μg/mL이하의 저농도에서는 15 g의 커피박 발효물이 높은 활성을 보였지만, 200 μg/mL이상의 농도에서는 LPS에 상당하는 높은 활성을 나타내었다(도 7).

IL-12의 경우, 15 g의 커피박에 4 종류의 미생물을 발효하여 추출한 조다당에서는 시료 모두 200 μg/mL의 농도에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, 대조군(커피박 비발효군) 대비 C. 시넨시스가 가장 높은 활성을 나타내었다. 또한, IL-6와 달리 저농도로 갈수록 활성이 거의 나타나지 않았다.

또한, 30 g의 커피박에 4 종류의 미생물을 발효하여 추출한 조다당에서도 200 μg/mL의 농도에서 가장 높은 활성을 나타내었고, 200 μg/mL를 초과하는 농도에서는 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 커피박 발효물의 다당체가 NK cell의 활성화 및 Th 1 type의 면역반응 유도를 통한 cytotoxic T lymphocyte(CTL)의 활성화와 같은 세포매개성 면역에 있어 활성을 나타내기 때문으로 예측되었다.

특히 lL-12는 암세포에 치사작용을 하는 NK cell 활성화에 직접 관여하여 항암활성 유도에 필수적인 사이토카인으로 인정되고 있으므로, 15 g의 커피박 발효물과 30 g의 커피박 발효물 모두 200 μg/mL의 농도에서 특히 암세포에 유용하게 작용할 것으로 예상되었다(도 8).

TNF-α의 경우, 15 g의 커피박에 4 종류의 미생물을 발효하여 추출한 조다당에서는 농도 의존적으로 증가하였으며, 대조군(커피박 비발효군) 대비 I. 오블리쿠스 및 C. 밀리타리스가 가장 높은 활성을 나타내었다.

반면, 30 g의 커피박에 4 종류의 미생물을 발효하여 추출한 조다당에서는 15 g의 커피박에 4 종류의 미생물을 발효하여 추출한 조다당보다 대조군(커피박 비발효군)의 TNF-α의 활성능이 높아졌다는 것을 확인 할 수 있었으며, I. 오블리쿠스 시료만이 대조군(커피박 비발효군) 대비 높은 활성을 나타내었고, 특히 40 μg/mL의 이상에서 급격히 활성이 증가하였음을 알 수 있었다(도 9).

Claims

커피박을 준비하는 단계;
상기 커피박을 채유하여, 커피 오일이 제거된 채유박을 제조하는 단계; 및
상기 채유박에 균을 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 면역 증진용 조성물의 제조 방법으로,
상기 면역 증진용 조성물은 ABTS 라디칼 소거 활성 및 DPPH 라디칼 소거 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 면역 증진용 조성물의 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 커피박은 커피 원두로부터 커피액을 추출하고 남은 잔사인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 채유 단계는 커피박으로부터 커피 오일을 제거하여 수행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 채유박은 채유에 의하여 커피 오일이 제거된 커피박인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 균은 이노노투스 균, 모나스커스균 또는 코디셉스균인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 접종은, 상기 채유박에 물 및 당을 첨가하고 균을 접종하여 수행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 면역 증진용 조성물은 식품 조성물 또는 사료 조성물인 것을 특징으로 하는 제조 방법.