JPWO2020004568A1 - エクオール産生促進剤およびそれを含むエクオール産生促進用食品または飲料組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトの腸内におけるエクオールの産生を促進するための新たな手段、またはそれと関連する月経前症候群を改善したり、肌の不調または加齢に伴う肌の状態の変化を改善したりするための新たな手段を提供する。本発明の係るエクオール産生促進剤は、酵母マンナンを有効成分として含む。本発明の月経前症候群改善剤および肌の状態改善剤は、当該エクオール産生促進剤（酵母マンナン）を含む。本発明のエクオール産生促進用、月経前症候群改善用または肌の状態改善用の食品組成物および飲料組成物は、それぞれ前記エクオール産生促進剤、月経前症候群改善剤または肌の状態改善剤を含む。

Description

本発明は、腸内でのエクオールの産生を促進するための剤、およびそれを有効成分として含有する食品または飲料組成物に関する。また、本発明は、酵母の細胞壁から抽出される酵母マンナンの用途に関する。

エクオールは、大豆イソフラボンの一種、ダイゼインの代謝産物であり、大豆イソフラボン自体よりも高い女性ホルモン様活性（すなわち、エストロゲン活性）を示す生理活性物質である。エクオールについてはこれまで、更年期症状の軽減、肌の状態の改善、月経前症候群（ＰＭＳ：premenstrual syndrome）による不快症状の軽減などの効果が報告されている（例えば非特許文献１）。

ヒトはダイゼイン等のエクオール前駆体をエクオールに変換する酵素を持っていないが、ヒトの腸内細菌（例えば、バクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus）、ストレプトコッカス・インターメディアス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）など）がそのような酵素を持っており、腸内でエクオールを産生している。

ヒトの体内のエクオールの濃度を高めるためには、エクオールを直接的に経口摂取することが考えられるが、エクオールは一般的な食品には含まれない化合物であり、そのような食経験は乏しく（したがってエクオールを含有するサプリメント等の形態にする必要がある）、また経口摂取したエクオールを蓄積することもできない。一方で、腸内細菌によるエクオール産生を促進するための材料（組成物）として、例えば特許文献１〜３に開示されているようなものが知られている。具体的には、特許文献１は、アルドン酸又はその誘導体を有効成分とすることを特徴とするエクオール産生促進組成物を開示している。特許文献２は、ダイフラクトース アンハイドライドとイソフラボンを含有することを特徴とする血中エクオール濃度上昇剤を開示している。特許文献３は、ダイゼイン、ダイジン、マロニルダイジン、アセチルダイジン及びサクシニルダイジンからなる群より選択されるダイゼイン系イソフラボンを単体又は大豆胚軸抽出物もしくはその精製物として含有し、かつ、無脂乳固形分を含有することを特徴とするエクオール非産生者の血中エクオール産生促進用組成物（ただし、食品である組成物と、ダイゼインを資化してエクオールを産生する能力を有する微生物又はホルムオノネチンを含有する組成物とを除く。）を開示している。

しかしながら、酵母から抽出されたα−マンナン又はα−マンナン―タンパク質複合体（本明細書において「酵母マンナン」と総称する。）がエクオールの産生促進に寄与することについては、上記の文献等には開示されておらず、示唆する記載もない。

国際公開第２００７／１４８６３１号 特開２００６−１４３６２３号公報（特許第４７２３８４９号公報） 国際公開第２００８／１４６８３５号（特許第５６１７６１３号公報）

Kenneth D. R. Setchelland Carlo Clerici, Equol:History, Chemistry, and Formation, The Journal of Nutrition, pp.1355S-1362S,2010 (doi: 10.3945/jn.109.119776)

本発明は、ヒトの腸内におけるエクオールの産生を促進するための新たな手段、またはそれと関連する月経前症候群を改善したり、肌の不調または加齢に伴う肌の状態の変化を改善したりするための新たな手段を提供することを課題とする。別の側面からは、本発明は、酵母マンナンの新たな用途を提供することを課題とする。

本発明者らは、酵母マンナンを摂取することにより、ヒトの腸内でのエクオール産生量を増加させ、さらに月経前症候群を改善したり、肌の不調または加齢に伴う肌の状態の変化を改善したりすることができることを見出した。酵母マンナンは水溶性であり、その水溶液は粘性が非常に低いため、飲料または食品（以下、「飲食品」ともいう。）に配合して利用するのに適した材料である。

すなわち本発明は、下記の事項を包含する。
［項１］
酵母マンナンを有効成分として含む、エクオール産生促進剤。
［項２］
項１に記載のエクオール産生促進剤を含む、エクオール産生促進用食品組成物または飲料組成物。
［項３］
項１に記載のエクオール産生促進剤を含む月経前症候群改善剤。
［項４］
項３に記載の月経前症候群改善剤を含む、月経前症候群改善用食品組成物または飲料組成物。
［項５］
項１に記載のエクオール産生促進剤を含む肌の状態改善剤。
［項６］
項５に記載の肌の状態改善剤を含む、肌の状態改善用食品組成物または飲料組成物。
［項７］
エクオールの産生を促進するために使用される酵母マンナン。
［項８］
エクオール産生促進用食品組成物または飲料組成物の製造のための酵母マンナンの使用。
［項９］
月経前症候群を改善するために使用される酵母マンナン。
［項１０］
月経前症候群改善用食品組成物または飲料組成物の製造のための酵母マンナンの使用。
［項１１］
肌の状態を改善するために使用される酵母マンナン。
［項１２］
肌の状態改善用食品組成物または飲料組成物の製造のための酵母マンナンの使用。

上記「エクオール産生促進剤」及び「エクオール産生促進用食品組成物または飲料組成物」は、例えば、「エクオールの産生を促進するために（有効成分（剤）として）使用される酵母マンナン」、「エクオール産生促進のための（有効成分（剤）としての）酵母マンナンの使用（用途）」、「エクオール産生促進用食品組成物または飲料組成物の製造のための（有効成分（剤）としての）酵母マンナンの使用」、「（食品組成物または飲料組成物に含まれている）酵母マンナンの有効量を摂取させるもしくは摂取する（腸内に導入させるまたは導入する）ことを含む、エクオールの産生促進方法」などに転換することも可能であり、本明細書に記載した「エクオール産生促進剤」及び「エクオール産生促進用食品組成物または飲料組成物」に関する事項を同様に適用することができる。上記「月経前症候群改善剤」及び「月経前症候群改善用食品組成物または飲料組成物」についても、例えば、「月経前症候群を改善するために（有効成分（剤）として）使用される酵母マンナン」、「月経前症候群改善のための（有効成分（剤）としての）酵母マンナンの使用（用途）」、「月経前症候群改善用食品組成物または飲料組成物の製造のための（有効成分（剤）としての）酵母マンナンの使用」、「（食品組成物または飲料組成物に含まれている）酵母マンナンの有効量を摂取させるもしくは摂取する（腸内に導入させるまたは導入する）ことを含む、月経前症候群の改善方法」などに転換することが可能であり、本明細書に記載した「月経前症候群改善剤」及び「月経前症候群改善用食品組成物または飲料組成物」に関する事項を同様に適用することができる。上記「肌の状態改善剤」及び「肌の状態改善用食品組成物または飲料組成物」についても、例えば、「肌の状態を改善するために（有効成分（剤）として）使用される酵母マンナン」、「肌の状態改善のための（有効成分（剤）としての）酵母マンナンの使用（用途）」、「肌の状態用食品組成物または飲料組成物の製造のための（有効成分（剤）としての）酵母マンナンの使用」、「（食品組成物または飲料組成物に含まれている）酵母マンナンの有効量を摂取させるもしくは摂取する（腸内に導入させるまたは導入する）ことを含む、肌の状態の改善方法」などに転換することが可能であり、本明細書に記載した「肌の状態改善剤」及び「肌の状態改善用食品組成物または飲料組成物」に関する事項を同様に適用することができる。

なお、本明細書において、エクオール産生促進剤、月経前症候群改善剤および肌の状態改善剤を「本発明の剤」と総称したり、それぞれを「本発明の各剤」と称したりすることがある。また、食品組成物および飲料組成物を「飲食品組成物」と総称することがある。

酵母マンナンを有効成分として含有する本発明のエクオール産生促進剤を利用することにより、腸内でのエクオールの産生を促進する作用に優れ、かつ摂取しやすい、エクオール産生促進用の飲食品組成物を製造することが可能となる。また、エクオールの産生を促進することにより、月経前症候群の各種症状を改善したり、肌の不調または加齢に伴う肌の状態の変化を改善したりすることができるため、本発明のエクオール産生促進剤およびそれを含む飲食品組成物は、月経前症候群改善剤およびそれを含む飲食品組成物ならびに肌の状態改善剤およびそれを含む飲食品組成物に応用することも可能である。特許文献１および３に記載されているように、腸内でのエクオールの産生量（すなわち、ダイゼインからエクオールへの代謝量）には個人差があるが、本発明のエクオール産生促進剤等は幅広い人々に対して、摂取前よりもエクオールの産生量を増加させ、月経前症候群を改善したり、肌の状態を改善したりする作用をもたらすことができる。

［エクオール産生促進剤、月経前症候群改善剤および肌の状態改善剤］
本発明のエクオール産生促進剤は酵母マンナンを含有するものであり、腸内でのエクオールの産生を促進する作用のための有効成分として、酵母マンナンのみを含む（すなわち、酵母マンナンからなる）ものであってもよいし、酵母マンナンに加えて同じくエクオール産生促進作用を有する他の有効成分を含むものであってもよい。

本発明の月経前症候群改善剤は、上記のような本発明のエクオール産生促進剤（そのエクオール産生促進のための有効成分としての酵母マンナン）を含有するものであり、月経前症候群の各種症状（例えば後記実施例に記載した質問１及び２の計１７項目の少なくとも１つ）を改善するための有効成分として、酵母マンナンのみを含む（すなわち、酵母マンナンからなる）ものであってもよいし、酵母マンナンに加えて同じく月経前症候群改善作用を有する他の有効成分を含むものであってもよい。月経前症候群（ＰＭＳ：premenstrual syndrome）は、月経前の黄体期に当たる時期から始まる身体および精神症状であり、女性の８０％で症状があるともいわれている。ＰＭＳの症状の中でも精神症状がより重く、日常生活にも支障がある状態は月経前不快気分障害（ＰＭＤＤ：Premenstrual Dysphoric Disorder）と呼ばれ、アメリカ精神医学会の精神疾患の診断基準の手引きである「ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ」（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders）に診断基準案がある。

本発明の肌の状態改善剤は、上記のような本発明のエクオール産生促進剤（そのエクオール産生促進のための有効成分としての酵母マンナン）を含有するものであり、肌の状態を改善するための有効成分として、酵母マンナンのみを含む（すなわち、酵母マンナンからなる）ものであってもよいし、酵母マンナンに加えて同じく肌の状態改善作用を有する他の有効成分を含むものであってもよい。ここで、肌の状態の改善には、肌の状態の不調を改善すること、及び、加齢に伴う肌の状態の変化を改善すること等が含まれる。肌の状態の不調としては、例えば、ニキビ、吹き出物、乾燥、べたつき、ざらつき、赤み、かゆみ、その他の肌荒れの諸症状等が挙げられる。加齢に伴う肌の状態の変化とは、その年齢としては不調ではないが以前とは異なる肌の状態を呈するようになることをいい、例えば、肌の水分量の減少、皮膚の弾力性の低下、きめの乱れ、色ムラ、たるみ、しみ、シワまたは毛穴の目立ち等が挙げられる。

本発明の典型的な実施形態において、エクオール産生促進剤の有効成分としての酵母マンナンを摂取することにより、エクオールの産生を促進するとともに、月経前症候群の症状を改善することと、肌の状態の変化を改善することの、いずれか一方または両方を達成することができる。したがって、本発明の一つの実施形態において、エクオール産生促進剤、月経前症候群改善剤および肌の状態改善剤は、同一の剤によって具現化することができる。

エクオール産生促進作用は、上記のような月経前症候群改善作用および肌の状態改善作用以外の作用効果とも関連する。そのような作用効果としては、例えば、更年期障害の改善、骨密度の増加（骨粗鬆症の予防および／または治療）、乳癌または前立腺癌の予防および／または治療、血糖上昇の抑制、血中コレステロールの上昇抑制、血中中性脂肪の上昇抑制、体脂肪および内臓脂肪面積の低下、ならびに、動脈硬化の改善など、エクオールの血中濃度を高めることによって奏される作用効果が挙げられる。したがって、本発明のエクオール産生促進剤は、上記のような他の用途（又は作用効果）のために利用することも可能である。

（１）酵母マンナン
本発明において、酵母マンナンは、酵母由来の「α−マンナン」及び酵母由来の「α−マンナン―タンパク質複合体」の、少なくとも１種を含む物質を指す。α−マンナン及びα−マンナン―タンパク質複合体は、いずれも酵母の細胞壁を構成する主要な成分である。

上述の「α−マンナン」は、Ｄ−マンノースがα１，６−結合、α１，２−結合、又はα１，３−結合により重合した多糖類であり、その主鎖には、マンノピラノースが１又は２以上、α１，２−結合又はα１，３−結合した側鎖が結合していてもよい。このα―マンナンは水溶性である。

一方、上述の「α−マンナン―タンパク質複合体」は、酵母の細胞壁に局在するタンパク質に、Ｎ−グリコシド結合又はＯ−グリコシド結合により、１又は２以上のα−マンナン鎖が結合した水溶性の糖タンパク質である。この糖タンパク質で結合している「α−マンナン鎖」は、上記「α−マンナン」と同様に、Ｄ−マンノースがα１，６−結合、α１，２−結合、又はα１，３−結合により重合した多糖鎖であり、その主鎖には、マンノピラノースが１又は２以上、α１，２−結合又はα１，３−結合した側鎖が結合していてもよい。なお、「α−マンナン―タンパク質複合体」のタンパク質には、アミノ酸残基２以上のペプチドを含むものとする。

酵母マンナンは、酵母に由来している限り、どのように回収されたものであってもよい。例えば、酵母の細胞壁を酵素又は化学的処理等により損傷させて分離回収（抽出）した酵母マンナンであってもよく、酵母から培地中に放出されたものを回収した酵母マンナンであってもよい。

酵母マンナンは、商品としても容易に入手することもできる。具体的には、マンナン ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍ７５０４（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社）等が挙げられる。また、酵母マンナンは、以下に記載するような公知のいずれかの方法を用いて、酵母から調製することができる。

（２）酵母マンナンの調製方法
酵母マンナンの調製方法としては、公知のいずれかの方法を用いることができる。例えば、酵母からその細胞壁を調製する工程として、ビール、清酒、及び、パン等の製造に用いられた酵母から酵母エキスを抽出し、残滓である酵母の細胞壁から酵母マンナンを調製する工程により、酵母マンナンを得ることができる。酵母マンナンの原料とする酵母の細胞壁としては、例えば「酵母細胞壁」の商品名でアサヒグループ食品株式会社から販売されている酵母の細胞壁や、その他の同様の商品を用いてもよい。

酵母の細胞壁から酵母マンナンを調製する工程としては、例えば、酵母の細胞壁から酵母マンナン粗抽出物を得る工程（本明細書において「粗抽出工程」と呼ぶ。）を含み、必要に応じて当該工程の後にさらに、酵母マンナン粗抽出物を精製し、酵母マンナン精製物を得る工程（本明細書において「精製工程」と呼ぶ。）を含む工程が挙げられる。粗抽出工程の前に、酵母からその細胞壁を調製する工程を行う場合もあるが、予め製造された酵母の細胞壁を原料として用いる場合はそのような工程は不要となる。粗抽出工程においては、例えば、熱水（希アルカリを含む）抽出法（例えば、特公昭６４−３４７９号公報、及び、特開昭５８−１０９４２３号公報参照。）、自己消化法（例えば、特公昭５８−５７１５３号公報参照。）、細胞壁溶解酵素による酵素消化方法（例えば、特公昭５９−４０１２６号公報参照。）等の方法を用いることができる。精製工程においては、例えば、塩酸等によるタンパク質の除去処理、アルコール沈殿処理、プロテアーゼ処理、及び、クロマトグラフィーによる処理等を行うことができる。

本明細書では、酵母マンナン粗抽出物と酵母マンナン精製物とを総称して「酵母マンナン調製物」と呼ぶ。上述したような市販されている酵母マンナンも酵母マンナン調製物に該当する。酵母マンナン調製物中には、酵母由来のα−マンナンおよび／または酵母由来のα−マンナン−タンパク質複合体の他、酵母の細胞壁中に存在していたり、酵母マンナンの調製のための処理により生じたりした、様々な夾雑物（例えば、グルカン、タンパク質、マンノース等）も含まれていてもよい。酵母マンナン調製物中の酵母マンナンの含有量は、酵母マンナンとして酵母マンナン調製物を用いたときに本発明の作用効果が奏される含有量の後述する酵母α−マンナンを有する酵母マンナンである限り、特に限定されるものではない。粗抽出工程でどのような方法を用いるか、および精製工程を行うかどうか、精製工程を行う場合はどのような処理を用いるかなどは、所望の含有量の酵母α−マンナンを有する酵母マンナン調製物が得られるよう、適宜選択すればよい。当業者であれば、一般的な方法および条件に従って、本発明の作用効果を奏する上で支障のない含有量の酵母α−マンナンを有する酵母マンナンを調製することができる。言い換えれば、一般的な方法および条件に従って当業者によって調製された酵母マンナンは、本発明の作用効果を奏する上で支障のない含有量の酵母α−マンナンを有している。

上述の酵母マンナンの調製方法における原料として用いられる酵母は、上述のα−マンナン、及び、上述のα−マンナン―タンパク質複合体を細胞壁の構成成分とする酵母であれば特に限定されるものではない。このような酵母は、例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces）属菌、シゾサッカロマイセス（Shizosaccharomyces）属菌、ピキア（Pichia）属菌、キャンディダ（Candida）属菌、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属菌、ウィリオプシス（Williopsis）属菌、デバリオマイセス（Debaryomyces）属菌、ガラクトマイセス（Galactomyces）属菌、トルラスポラ（Torulaspora）属菌、ロドトルラ（Rhodotorula）属菌、ヤロウィア（Yarrowia）属菌、ジゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属菌等の酵母であってもよく、サッカロマイセス属菌が好ましい。当業者であれば、一般的な方法および条件に従って、本発明の作用効果を奏する酵母マンナンを調製するための原料として用いる上で支障のない酵母を培養することができる。言い換えれば、一般的な方法および条件に従って当業者によって培養された酵母は、本発明の作用効果を奏する酵母マンナンを調製する上で支障のない原料として用いることができる。

また、上述の酵母マンナンの原料として用いられる酵母は、可食性の酵母であることが好ましく、パン酵母又はビール酵母として使用されている酵母であることがより好ましい。具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、サッカロマイセス・パラドキサス（Saccharomyces paradoxus）、サッカロマイセス・ミカタエ（Saccharomyces mikatae）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Saccharomyces kudriavzevii）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・リポリティカ（Candida lypolitica）、及び、キャンディダ・サケ（Candida sake）等が挙げられる。上述の酵母マンナンの原料として用いられる酵母は、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・パストリアヌス、及び、サッカロマイセス・バヤヌスであることが好ましい。

（３）酵母α−マンナンの含有率の算出方法
上記の調製方法により得られる酵母マンナン調製物には、酵母由来のα−マンナン−タンパク質複合体（つまりα−マンナン鎖と結合した状態のタンパク質部分）も含まれていてもよい。ここで、本明細書において、酵母由来のα−マンナンと、酵母由来のα−マンナン−タンパク質複合体のうちのα−マンナン鎖部分とをあわせて「酵母α−マンナン」と総称することとする。酵母マンナン中の酵母α−マンナンの含有率は、酵母マンナンの調製方法によって多少変動するが概ね一定の範囲内にあり、通常は３０〜９５％である。酵母α−マンナンの含有率は、酵母マンナンとして酵母マンナン調製物を用いたときに本発明の作用効果が奏される限り特に限定されるものではない。当業者であれば、一般的な方法および条件に従って、本発明の作用効果を奏する上で支障のない酵母α−マンナンの含有率を有する酵母マンナンを調製することができる。言い換えれば、一般的な方法および条件に従って当業者によって調製された酵母マンナンは、本発明の作用効果を奏する上で支障のない、酵母α−マンナンの含有率を有している。

酵母マンナン調製物中の酵母α−マンナンの含有率は、次の方法により算出する。まず、酵母マンナン調製物の検体（Ａ）中のマンノース、および、酵母マンナン調製物を加水分解した検体（Ｂ）中のマンノースを各々定量する。ここで、検体（Ｂ）は、検体（Ａ）を硫酸で処理することにより、検体（Ａ）中の全ての糖鎖を単糖に加水分解した後、中和された検体である。各検体中のマンノースは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：high performance liquid chromatography）により定量することができ、一般財団法人 日本食品分析センターで実施されている方法で定量してもよい。続いて、検体（Ｂ）のマンノース量から検体（Ａ）のマンノース量を差し引いた値に対して、酵母α−マンナンの加水分解により結合した水の量を減じるため、０．９を乗じることにより酵母マンナン調製物中の酵母α−マンナンの含有量を算出する。最後に、検体（Ａ）の重量に対する、酵母α−マンナンの含有量の割合を算出することにより、酵母マンナン調製物中の酵母α−マンナンの割合、すなわち酵母α−マンナンの含有率を算出することができる。本発明の各剤は、酵母α−マンナンの純度が１００％である酵母マンナン調製物を用いる必要はなく、純度が上記のような一般的な範囲にある酵母マンナン調製物を用いてもよい。

本発明のエクオール産生促進剤、月経前症候群改善剤および肌の状態改善剤の各剤の形態は特に限定されるものではなく、粉末状であってもよいし、水または他の溶媒を用いた溶液状（分散液状）であってもよい。本発明の各剤は典型的には、各剤の作用に対応した用途の飲食品組成物に配合して使用されるので、そのような飲食品組成物の製造に適した剤型とすることが好ましい。

本発明の各剤による作用効果、すなわちエクオール産生促進作用、月経前症候群改善作用、肌の状態改善作用はそれぞれ、公知の手法を用いて、または公知の手法に準じて、評価することができる。エクオール産生促進作用は、例えば、イムノクロマト法により被験者の尿中のエクオール濃度を測定し、または、ＨＰＬＣ（High Performance Liquid Chromatography）等により被験者の尿中もしくは血中のエクオール濃度を測定し、その濃度がエクオール産生促進剤（その有効成分である酵母マンナン）を摂取することによって高くなるかどうかを通じて評価することができる。月経前症候群改善作用は、例えば、被験者に対して月経前症候群の症状の軽重に関する質問をし、その回答に対応するスコアが月経前症候群改善剤（その有効成分である酵母マンナン）を摂取することによって改善されるかどうかを通じて評価することができる。肌の状態改善作用は、例えば、被験者に対して肌の不調の軽重または加齢に伴う肌の状態の変化の程度に関する質問をすることにより、あるいは肌の状態（例えば、皮膚水分量、皮膚水分蒸散量、皮膚弾力性、皮脂量、シミ、シワ、きめ、色ムラ、毛穴、茶色のシミ、赤み、ポルフィリン量、皮疹数、コラーゲン量等）に関する指標値を測定することにより、その質問に対する回答に対応するスコアまたはその測定値が肌の状態改善剤（その有効成分である酵母マンナン）を摂取することによって改善されるかどうかを通じて評価することができる。いずれの作用効果についても、適切に群（プラセボ等の対照群を含む。）や条件を設定した上で試験を行い、統計学的な処理を行う（有意差があるかどうかを検定する）ことによって、合理的な評価とすることができる。

［飲食品組成物］
本発明のエクオール産生促進用飲食品組成物（食品組成物および飲料組成物）は、本発明のエクオール産生促進剤と、食品組成物および飲料組成物それぞれの形態に適合したその他の成分とを含有する。本発明の月経前症候群改善用飲食品組成物および肌の状態改善用飲食品組成物も同様に、本発明の月経前症候群改善剤および肌の状態改善剤と、食品組成物および飲料組成物それぞれの形態に適合したその他の成分とを含有する。言い換えれば、本発明のエクオール産生促進用飲食品組成物、月経前症候群改善用飲食品組成物および肌の状態改善用飲食品組成物は、それぞれ、エクオールの産生促進、月経前症候群の各種症状の改善および肌の状態の改善という作用効果を賦与するための成分（添加物質）として、本発明のエクオール産生促進剤、月経前症候群改善剤および肌の状態改善剤が添加されている、飲食品組成物である。

なお、エクオール産生促進剤（ならびにそれを含有する月経前症候群改善剤および肌の状態改善剤）の有効成分である酵母マンナンを、細胞壁を有する酵母の形態で含有するが、組成物として製造されていない天然の素材またはその加工品、例えば酵母が残存している発酵食品や醸造酒自体は、本発明の飲食品組成物には該当しない。

飲食品組成物の形態は特に限定されるものではなく、本発明の各剤を配合することのできる、公知の各種の飲食品と同様の形態とすることができる。例えば、錠剤、カプセル剤、散剤（顆粒剤）、その他の剤型のサプリメント（栄養補助食品）；清涼飲料（炭酸飲料、ノンアルコール飲料、ジュース、コーヒー飲料、茶系飲料、ミネラルウォーター、スポーツ飲料など）、乳飲料、豆乳飲料、発酵乳、乳酸菌飲料、ココア、アルコール飲料（ビール、発泡酒、その他の醸造酒、リキュール、日本酒、甘酒、ワイン、焼酎など）、インスタント粉末から調製される飲料、その他の飲料；パン、シリアル、菓子類（ビスケット、クッキー、チョコレートなど）、加工品（かつおぶし、塩辛、くさやなど）、漬物（ぬか漬け、キムチ、ピクルス）、発酵食品（納豆、チーズ、ヨーグルトなど）、調味料（醤油、味噌、酢など）、その他の食品が挙げられる。

飲食品組成物中の本発明の各剤の含有量、またはその有効成分としての酵母マンナンの含有量は、本発明の各剤による作用効果、すなわちエクオール産生促進作用、月経前症候群改善作用または肌の状態改善作用が奏される酵母α−マンナンの含有量を有する限り特に限定されるものではない。また、飲食品組成物中の酵母α−マンナンの含有量は、本発明の各剤による作用効果、すなわちエクオール産生促進作用、月経前症候群改善作用または肌の状態改善作用が奏される限り特に限定されるものではない。酵母マンナン及び酵母α−マンナンの含有量は、飲食品組成物の形態や製造方法などを考慮して、また必要に応じて一食または一日あたりの有効成分量などを考慮して、適宜設定することができる。本発明の各剤として、酵母マンナン調製物を用いる場合は、その酵母マンナン調製物の重量と、その酵母マンナン調製物中に含まれる酵母α−マンナンの割合（酵母α−マンナンの含有率）とによって、有効成分としての酵母マンナンの含有量が本発明の各剤による作用効果を奏する範囲となるよう調節することができる。

本発明の飲食品組成物の、本発明の各剤以外の原料または成分は、従来の飲食品組成物と同様とすることができる。

本発明の飲食品組成物は、エクオールの前駆体となる大豆イソフラボン（ダイゼイン、またはその配糖体ないし類縁体であるダイジン、マロニルダイジン、アセチルダイジン、サクシニルダイジン等）は必須成分としなくてよいが、所望により大豆イソフラボンの精製物または大豆イソフラボンを含有する物質（例えば豆乳等、大豆由来の飲食品）を成分に含めてもよい。

サプリメントの形態をとる本発明の飲食品組成物は、本発明の各剤に加えて、一般的または公知のサプリメントが含有する各種の成分、例えば賦形剤、甘味料、着色料、香料およびその他の成分から選ばれる少なくとも１種を含有することができる。サプリメント中の本発明の各剤の含有量は特に限定されるものではなく、一般的なサプリメントと同様に適宜設定することができるが、例えば、サプリメント中の酵母マンナン調製物の含有量が、サプリメントの全質量に対して、５％以上または１０％以上、７５％以下となる量とすることができる。

なお、サプリメントは、酵母マンナン調製物１００％、すなわち本発明のエクオール産生促進剤、月経前症候群改善剤または肌の状態改善剤１００％の形態としてもよい。このような実施形態における「サプリメント」は、本発明の各剤しか含有しない、つまり本発明の各剤のみからなる物質であるため「飲食品組成物」には該当しないが、「本発明のエクオール産生促進剤、月経前症候群改善剤または肌の状態改善剤」の実施形態の一つであって、飲食品組成物に配合されるのではなく、そのまま摂取されるという使用が想定されているもの、とみなすことができる。

飲料組成物の形態をとる本発明の飲食品組成物は、本発明の各剤に加えて、一般的または公知の飲料が含有する各種の成分、例えば水（又は炭酸水）、コーヒー抽出物、茶葉抽出物、果汁、その他の植物原料抽出物、乳、豆乳、発酵乳、甘味料、酸味料、着色料および香料から選ばれる少なくとも１種を含有することができる。飲料組成物中の本発明の各剤の含有量は特に限定されるものではなく、一般的な飲料組成物と同様に、必要に応じて濁りなどを考慮しながら、適宜設定することができるが、例えば、飲料組成物中の酵母マンナンの含有量が、飲料組成物の全質量に対して、０．０４％以上または０．１％以上、７．５％以下または４％以下となる量とすることができる。

このような本発明の飲食品組成物は、成分として本発明の各剤を加える工程をさらに含むこと以外は、従来の飲食品組成物と同様の方法により製造することができる。

飲食品組成物は、保健機能食品（すなわち、栄養機能食品、特定保健用食品および機能性表示食品）として、また治療食（すなわち、治療の目的を果たすもの、又は、医師が食事箋を出し、それに従い栄養士等が作成した献立に基づいて調理されたもの。）、食事療法食、又は、介護食等として、製造することもできる。

飲食品組成物の一食分または一日あたりの摂取目安量は、本発明の各剤の作用効果が奏されることを期待する対象の年齢、体重、性別や、摂取前の指標値などに応じて、また非臨床的または臨床的な試験結果等に基づいて、適宜設定することができる。飲食品組成物の摂取期間も適宜設定することができ、長期間に亘って繰り返し、また日常的に、摂取することが好ましい。本発明の一つの側面において、本発明の飲食品組成物は、その飲食品組成物に含まれる有効成分としての酵母マンナンの摂取量（以下、「酵母マンナンの有効量」ともいう。）が、好ましくは０．１ｇ／日以上、より好ましくは０．２ｇ／日以上、さらに好ましくは０．３ｇ／日以上であり、好ましくは４ｇ／日以下、より好ましくは２．５ｇ／日以下、さらに好ましくは１．５ｇ／日以下となるよう摂取されるものである。

本発明の飲食品組成物の用途、すなわち本発明の飲食品組成物がエクオール産生促進用、月経前症候群改善用または肌の状態改善用であることは、直接的にまたは間接的に表示することができる。直接的な表示の例は、製品自体、パッケージ、容器、ラベル、タグ等の有体物への記載であり、間接的な表示の例は、ウェブサイト、店頭、展示会、看板、掲示板、新聞、雑誌、テレビ、ラジオ、郵送物、電子メール等の場所または手段による、広告・宣伝活動である。本発明の飲食品組成物を機能性表示食品として製造する場合は、例えば「本品には酵母マンナンが含まれます。酵母マンナンには、肌の潤いを守るのを助ける機能があることが報告されており、肌が乾燥しがちな方に適しています。」などのように、機能性成分として含まれる酵母マンナンの作用効果（肌の保湿作用）に基づく機能性を表示することができる。

［本発明の他の側面］
本発明は一つの側面において、酵母マンナンの有効量を摂取させるもしくは摂取する、換言すれば腸内に導入させるまたは腸内に導入することを含む、ヒトおよびヒト以外の哺乳類（例えばマウス等の実験動物、またはペット等）におけるエクオールの産生を促進する方法を提供する。本発明は一つの側面において、酵母マンナンの有効量（またはそれを含有するエクオール産生促進剤）を摂取させることを含む、ヒトおよびヒト以外の哺乳類（例えばマウス等の実験動物、またはペット等）の肌を改善する方法を提供する。本発明は一つの側面において、酵母マンナンの有効量（またはそれを含有するエクオール産生促進剤）を摂取させることを含む、ヒト（特に女性）の月経前症候群を改善する方法を提供する。

これらの「エクオール産生促進方法」、「肌の状態改善方法」および「月経前症候群改善方法」の発明は、前述した本発明の各剤（エクオール産生促進剤、肌の状態改善剤および月経前症候群改善剤）および／または本発明の各飲食品組成物（エクオール産生促進用、肌の状態改善用および月経前症候群改善用それぞれの食品組成物および飲料組成物）の発明から当業者であれば転換可能であり、本明細書に記載したそれらの各剤および／または各飲食品組成物に関する事項を同様に適用することができる。

［酵母マンナン調製物Ｘの準備］
（酵母マンナン調製物Ｘ：サッカロマイセス・パストリアヌス由来）
市販の酵母の細胞壁（商品名「酵母細胞壁」、アサヒグループ食品株式会社）１０ｋｇを蒸留水に懸濁し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１１．０に調製した後、９０℃で１２時間煮沸した。遠心分離により上清を回収し、塩酸を添加してｐＨ５．５に調製した。凍結乾燥操作により２ｋｇの酵母マンナン調製物Ｘを得た。

（酵母α−マンナンの含有率）
一般財団法人 日本食品分析センターに委託し、上記で得られた酵母マンナン調製物Ｘの検体（Ａ）中のマンノース、および、上記で得られた酵母マンナン調製物Ｘを加水分解した検体（Ｂ）中のマンノースを各々定量した。その結果、検体（Ａ）のマンノースの含有量は検出限界値であり、検体（Ｂ）のマンノースの含有量は６９ｇ／検体１００ｇであった。これらを基に上述の算出方法により、得られた酵母マンナン調製物Ｘ中の酵母α−マンナンの含有率を算出したところ、６２％であった。

一般財団法人 日本食品分析センターにおける、検体（Ａ）および検体（Ｂ）中のマンノースの定量方法の具体的な手順は次の通りである。検体（Ａ）および検体（Ｂ）それぞれ０．６ｇを採取し、濃度７２％の硫酸に添加し、室温で１時間撹拌した。検体溶液の硫酸の濃度を４％に希釈した後、オートクレーブ（１２１℃）中で１時間を加熱した。検体溶液を室温に冷却後、中和して、水で２００ｍＬに定量した。定量後の検体溶液を濾紙で濾過し、濾液を水で５０倍に希釈し、希釈液をさらにメンブランフィルターで濾過した。この濾液を下記の操作条件による高速液体クロマトグラフ法で分析し、濾液中のマンノースの濃度を測定して、検体（Ａ）および検体（Ｂ）中のマンノースを定量した。
機種：ＬＣ−２０ＡＤ（株式会社島津製作所）
検出器：蛍光分光光度計ＲＦ−２０Ａｘｓ（株式会社島津製作所）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＵＧＡＲ ＡＸＩ，φ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ（東ソー株式会社）
カラム温度：６０℃
移動相：０．５ｍｏｌ／Ｌ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．７）
流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：２０μＬ
蛍光励起波長：３２０ｎｍ
蛍光測定波長：４３０ｎｍ
ポストカラム：反応液；１ｗ／ｖ％ Ｌ−アルギニン溶液
反応液流量；０．７ｍＬ／ｍｉｎ
反応温度；１５０℃

［実施例１〜４、比較例１及び２］
２０〜４０代の男女３３名を３群に分け、酵母マンナン調製物Ｘ１ｇまたは２ｇを含有する麦茶飲料、またはプラセボ（マルトデキストリン１ｇ）を含有する麦茶飲料（以下、各々「試験飲料」ともいう。）を、各群に対して１日１本ずつ４週間摂取させ、摂取前後で、［Ａ］尿中エクオール濃度の測定および［Ｂ］肌の不調スコアの記録を行った（実施例１及び２、比較例１）。また、２０〜４０代の女性１８名を３群に分け、上記［Ａ］及び［Ｂ］と同様に、酵母マンナン調製物Ｘ１ｇまたは２ｇを含有する麦茶飲料、またはプラセボ（マルトデキストリン１ｇ）を含有する麦茶飲料を、１日１本ずつ４週間摂取させ、摂取前後で、［Ｃ］月経前不定愁訴スコアを記録した（実施例３及び４、比較例２）。

なお、エクオール産生能が関係する上記の事項の評価にあたっては、被験者全員がエクオールの前駆体となる大豆イソフラボンを十分量摂取している必要がある。そのため、酵母マンナン調製物の摂取前、および摂取後のどちらの採尿に際しても、採尿前３日間はエクオールの前駆体となる大豆イソフラボンを摂取する目的で、イソフラボンを９４ｍｇ含有する成分無調製豆乳飲料２００ｍｌを１日１本、各被験者に摂取させた。被験者の尿は採取後直ちに凍結保存した。

［Ａ］エクオール産生促進作用の評価
エクオール産生促進作用は、酵母マンナン調製物Ｘの摂取前後の各被験者の尿中エクール濃度をWilcoxon符号順位検定により評価した。尿中エクオール濃度は、室温下で解凍した尿を使用して、イムノクロマト法により測定した。尿中エクオール濃度の測定結果及びWilcoxon符号順位検定結果を表１に示す。酵母マンナン調製物Ｘ２ｇ摂取群では、試験飲料の摂取後に尿中エクオール濃度が有意に増加した。また、酵母マンナン調製物Ｘ１ｇ摂取群では、試験飲料の摂取後に尿中エクオール濃度が増加する傾向を示した。一方、プラセボ摂取群では、試験飲料の摂取前後で尿中エクオール濃度に有意な変化は認められなかった。

［Ｂ］肌の状態改善作用の評価
肌の状態改善作用は、以下の質問に対する、４件法による回答のスコア（なかった＝スコア１、弱くあった＝スコア２、中程度にあった＝スコア３、強くあった＝スコア４）をWilcoxon符号順位検定により評価した。
質問：最近1か月の様子を思い出し、肌の不調はありましたか。

肌の不調に関するスコアとWilcoxon符号順位検定結果を表２に示す。酵母マンナン調製物Ｘ１ｇおよび２ｇ摂取群で、試験飲料摂取後に肌の不調スコアが有意に改善した。一方、プラセボ摂取群では、試験飲料摂取前後で肌の不調スコアに有意な変化は認められなかった。

［Ｃ］月経前症候群改善作用の評価
月経前症候群改善作用は、下記の全１７項目の質問に対する、４件法による回答のスコア（なかった＝スコア１、弱くあった＝スコア２、中程度にあった＝スコア３、強くあった＝スコア４）をWilcoxon符号順位検定により評価した。これらの質問は、精神的症状、身体的症状、及び、社会的機能の低下（以下、「月経前不定愁訴」ともいう。）に関する質問であり、アメリカ精神医学会の精神疾患の診断基準の手引きであるＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲの月経前不快気分障害（ＰＭＤＤ）診断基準案（American Psychiatric: Association :Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition Text Revision: DSM-IV-TR. Washington DC: American Psychiatric Association, 2000）の日本語訳（高橋三郎, 大野裕, 染谷俊幸（訳）: DMS-IV-TR精神疾患の診断・統計マニュアル新訂版. 東京: 医学書院, 2003）に基づき作成された質問紙（宮岡佳子、秋元世志枝、上田嘉代子、加茂登志子: PMDD評価尺度の開発と妥当性および信頼性の検討 (The reliability and validity of the newly developed PMDD scale): 日本女性心身医学会雑誌 (JJp Soc Psychosom ObsLet Gynecol) Vol.14, No. 2, pp.194-201. 平成21年10月））に準じて作成された。
質問１：下記のような症状が月経の始まる１、２週間前から始まり、しかもその症状は月経が始まると２、３日で消失するということが、最近の月経周期にありましたか？
（１）抑うつ気分になる。または絶望的な気分になる。
（２）不安になる。または緊張する。
（３）涙もろくなる。または突然悲しくなる。
（４）怒りっぽくなる。またはイライラする。または人にあたる。
（５）興味がなくなる（仕事、学校、趣味など）。
（６）集中力が低下する。
（７）疲れやすくなる。または気力がなくなる。
（８）食欲が増す。または特定の食べ物（例：甘いものなど）が欲しくなる。
（９）いつもより眠りすぎる。眠気が強い。
（１０）いつもより眠れなくなる。
（１１）自分をコントロールできない感じになる。
（１２）下記の身体症状のどれかが現れる。乳房の痛みや張り、腹部の張る感じ、腹痛、頭痛、関節痛、筋肉痛、身体がむくんだ感じ、体重増加、便秘。
質問２：上記に挙げた症状が１つでもあった人（弱くあった〜強くあった）に伺います。
その症状が出現している間、下記の日常活動に支障がでたかお答えください。
（１３）仕事の能率に支障がでた（職場または学校）。
（１４）家事に支障がでた。
（１５）職場の人との関係に支障が出た（関係に支障がでる例：つきあいを避ける、人にあたる、けんかをするなど）。
（１６）家族との関係に支障がでた。
（１７）友人・知人との関係に支障がでた。

月経前不定愁訴に関する全１７項目のスコアを各被験者毎に合計したＰＭＤＤサマリスコアとWilcoxon符号順位検定結果を表３に示す。酵母マンナン調製物Ｘ１ｇおよび２ｇ摂取群で、試験飲料摂取後にスコアが有意に改善した。

また、全１７項目の個別のスコアのうち（４）、（８）、（９）および（１２）についてのスコアとWilcoxon符号順位検定結果をそれぞれ表４、表５、表６および表７に示す。項目（１２）（身体症状、表７）に関しては、酵母マンナン調製物Ｘ２ｇ摂取群で、試験飲料摂取後にスコアが有意に改善した。項目（４）（イライラ、表４）、項目（８）（食欲、表５）および項目（９）（眠気、表６）の３項目に関しては、それぞれ酵母マンナン調製物Ｘ１ｇ摂取群で、試験飲料摂取後にスコアの改善傾向が見られた。

［酵母マンナン調製物Ａ、Ｂ及びＣの準備］
（酵母マンナン調製物Ａ：サッカロマイセス・パストリアヌス由来）
市販の酵母の細胞壁（商品名「酵母細胞壁」、アサヒグループ食品株式会社）１０ｋｇを蒸留水に懸濁し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１１．０に調製した後、９０℃で１２時間煮沸した。遠心分離により上清を回収し、塩酸を添加してｐＨ５．５に調製した。凍結乾燥操作により２ｋｇの酵母マンナン調製物Ａを得た。得られた酵母マンナン調製物Ａの酵母α−マンナンの含有率を上述の算出方法により算出したところ、酵母α−マンナン含有率は５０．５％であった。

（酵母マンナン調製物Ｂ：サッカロマイセス・セレビシエ由来）
市販の試薬（商品名「マンナン ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍ７５０４（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社）を酵母マンナン調製物Ｂとした。酵母マンナン調製物Ｂの酵母α−マンナンの含有率を上述の算出方法により算出したところ、酵母α−マンナン含有率は、７８．８％であった。

（酵母マンナン調製物Ｃ：キャンディダ・ユーティリス由来）
キャンディダ・ユーティリス（ＩＦＯ０６２６）を８．０ＬのＹＰＤ培地に植菌し、０．５０Ｌずつ２．０Ｌ容の三角フラスコに分注して、２５℃、１２０ｒｐｍで２４時間振とう培養した。培養液を集菌して蒸留水に懸濁し、１００℃で１０分間加熱後に遠心分離により上清を取り除いて細胞壁画分を調製した。得られた細胞壁画分を蒸留水に懸濁し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１１．０に調製した後、９０℃で１２時間煮沸した。遠心分離により上清を回収し、塩酸を添加してｐＨ５．５に調製した。凍結乾燥操作により３．７ｇの酵母マンナン調製物Ｃを得た。使用したＹＰＤ培地の組成は以下であり、ｐＨは調製しなかった。
酵母エキス： １０ｇ
ペプトン ： １０ｇ
グルコース： ２０ｇ
蒸留水 ： １Ｌ

［実施例５、比較例３］
肌の乾燥を自覚する３０〜４０代の女性２５名を２群に分け、酵母マンナン調製物Ａを１２３０ｍｇ含有する錠剤、または麦芽糖を１２３０ｍｇ含有する対照錠剤（以下、各々「試験食」及び「対照食」ともいう。）を、各群に対して１日１回８週間摂取させた。試験食及び対照食の摂取前後で、［Ｄ］経皮水分蒸散量の測定及び［Ｅ］尿中エクオール濃度からのエクオール変換効率を算出した（実施例５、比較例３）。なお、１日に摂取する試験食中の酵母α―マンナン量は０．６２ｇに相当する。

［Ｄ］経皮水分蒸散量の測定
経皮水分蒸散量は、体内から無自覚のうちに角層を通じて揮散する水分量であり、肌の保湿レベルを表す指標として広く用いられている。経皮水分蒸散量は、温度が２０〜２２℃、湿度が５０±５％に管理された恒温恒湿室で被験者を３０分間安静にさせた後、側臥位で、Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ ＴＭ３００ＭＰ（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ（ＣＫ）社）を使用して前腕内側を測定した。試験食及び対照食の肌保湿効果は、試験食摂取群（実施例５）と対照食摂取群（比較例３）について、試験食及び対照食の摂取８週後の経皮水分蒸散量、試験食及び対照食の摂取前の経皮水分蒸散量及び両者の経皮水分蒸散量の変化量を各々ｔ検定により評価した。各群の水分蒸散量およびその変化量と検定結果を表８に示す。

試験食及び対照食の摂取前では、両群の経皮水分蒸散量に統計的な有意差は見られなかったが、試験食及び対照食の摂取８週後では、試験食摂取群は、対照食摂取群に対して統計的に有意に低値を示した。また、試験食及び対照食の摂取前後の経皮水分蒸散量の変化量は、試験食摂取群で、対照食摂取群に対して統計的に有意に低値を示した。

［Ｅ］尿中エクオール濃度からのエクオール変換効率の算出
尿中のダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオール濃度を後述の酵素ＨＰＬＣ（High Performance Liquid Chromatography）法で測定し、以下の算出式を用いてエクオール変換効率を算出した。
エクオール変換効率（％）＝｛エクオール／（ダイゼイン＋ジヒドロダイゼイン＋エクオール）｝＊１００

なお、エクオール変換効率を評価するに当たり、被験者全員がエクオールの前駆体となる大豆イソフラボンを十分量摂取している必要があるため、試験食及び対照食の摂取前及び摂取後のどちらの採尿に際しても、採尿前３日間はエクオールの前駆体となる大豆イソフラボンを摂取する目的で、大豆イソフラボンを２５ｍｇ含有する錠剤を１日１回摂取させ、尿は採取後直ちに凍結保存した。

（酵素ＨＰＬＣ法）
Redruello, B. et al.の酵素ＨＰＬＣ法（Redruello, B. et al., A novel UHPLC method for the rapid and simultaneous determination of daidzein, genistein and equol in human urine, Journal of Chromatography B (2015), Volume 1005 (15 November 2015),pages 1-8）に基づいて、尿中のダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオールを定量した。

室温下で解凍した尿５００μｌに、０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を５００μｌとβ−グルクロニダーゼ／アリルスルファターゼ（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社）を４μｌ添加した。３７℃で３時間反応させ、反応終了後、内部標準物質として４−ヒドロキシベンゾフェノンを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、酢酸エチル３ｍｌで２回抽出した。減圧乾固後、ＤＭＳＯ／メタノール１：１溶液 ５００μｌに溶解して、適宜希釈してＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣは次の条件で行なった。
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
検出：紫外吸光光度計（測定波長２８０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
移動相： Ａ液：水＋５ｍＭギ酸アンモニウム
Ｂ液：メタノール＋５ｍＭギ酸アンモニウム
流量：０．４ ｍＬ／分
サンプル注入量：１μｌ

標準品として、ダイゼイン（Carbosynth社製）、ジヒドロダイゼイン（Cayman Chemical社製）、エクオール（Tocris Bioscience社製）、４−ヒドロキシベンゾフェノン（東京化成工業株式会社）を使用した。

上述の方法により算出した、試験食及び対照食の摂取後のエクオール変換効率は、試験食摂取群で、対照食摂取群に対して統計的に有意に高値を示した。

［実施例６、実施例７、比較例４及び比較例５］
ＩＣＲマウスの新鮮排泄便を３０倍容のＧＡＭ培地に懸濁して１００μｍ孔径のフィルター（FALCON社製）で濾過した。濾過液３ｍｌを７ｍｌのＧＡＭ培地に植菌し、嫌気チャンバー内で３７℃、２４時間培養した。培養後、半量の８０％グリセロール溶液と混合して、マウス糞便懸濁液として−８０℃で凍結保存した。

酵母α−マンナンの終濃度が１．０％となるように、酵母マンナン調製物ＡをＧＡＭ糖分解用培地に添加した。酵母マンナン調製物Ａを添加した培地にマウス糞便懸濁液を接種し、３７℃で２４時間嫌気培養して活性化させた。活性化した培養液を遠心分離して培養上清を除去した。ＧＡＭ糖分解用培地にダイゼイン（Carbosynth社製）を終濃度１００μＭとなるように加えた。ダイゼインを加えた培地に、上清を除去した培養液を再懸濁した。その際に、酵母α−マンナンの終濃度が１．０％または０．５％となるように酵母マンナン調製物Ａ（実施例６ａ及び６ｂ）または酵母マンナン調製物Ｂ（実施例７ａ及び７ｂ）を添加した。各々、３７℃で４８時間嫌気培養し、培養後のエクオール濃度を上述した酵素ＨＰＬＣ法で測定した。酵母マンナン調製物を加えない無添加区（比較例４）、及び、酵母マンナン調製物の代わりにα−マンナンの構成単糖であるマンノース（商品名「Ｄ（＋）−マンノース」、富士フイルム和光純薬株式会社）を１．０％添加するマンノース添加区（比較例５）を設定して、測定した各エクオール濃度と比較した。

ＨＰＬＣは次の条件で行った。
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
検出：紫外吸光光度計（測定波長２８０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
移動相： Ａ液： 水＋５ｍＭギ酸アンモニウム
Ｂ液： メタノール＋５ｍＭギ酸アンモニウム
流量：０．４ｍＬ／分
サンプル注入量：１μｌ

実施例６ａ及び６ｂ、実施例７ａ及び７ｂ、比較例４並びに比較例５の結果を表９に示す。

培養後のエクオール濃度は、酵母マンナン調製物ＡとＢいずれの場合も酵母マンナン調製物Ａ又はＢ添加区で、無添加区と比較して高い値を示した（実施例６ａ及び６ｂ、実施例７ａ及び７ｂ、並びに比較例４）。また、酵母α−マンナン１．０％添加区では、０．５％添加区より、培養後のエクオール濃度が高い値を示し、効果の濃度応答性が確認された。一方、１．０％マンノース添加区では、無添加区と比較して培養後のエクオール濃度が高い値を示さなかった（比較例４及び５）。

［実施例８、実施例９、比較例６及び比較例７］
ＩＣＲマウスの新鮮排泄便を３０倍容のＧＡＭ培地に懸濁して１００μｍ孔径のフィルター（FALCON社製）で濾過した。濾過液 ３ｍｌを７ｍｌのＧＡＭ培地に植菌し、嫌気チャンバー内で３７℃、２４時間培養した。培養後、半量の８０％グリセロール溶液と混合して、マウス糞便懸濁液として−８０℃で凍結保存した。

酵母α−マンナンの終濃度が１．０％となるように酵母マンナン調製物ＡをＧＡＭ糖分解用培地に添加した。酵母マンナン調製物Ａを添加した培地にマウス糞便懸濁液を接種し、３７℃で２４時間嫌気培養して活性化させた。活性化した培養液を遠心分離して上清を除去した。ＧＡＭ糖分解用培地にダイゼイン（Carbosynth社製）を終濃度１００μＭとなるように加えた。ダイゼインを加えた培地に上清を除去した培養液を再懸濁した。その際に、酵母α−マンナンの終濃度が１．０％となるように酵母マンナン調製物ＡまたはＣを添加した（実施例８及び９）。３７℃で４８時間嫌気培養し、培養後のエクオール濃度を上述した酵素ＨＰＬＣ法で測定した。測定した各エクオール濃度を、酵母マンナン調製物を加えない無添加区（比較例６）及び酵母マンナン調製物の代わりにα−マンナンの構成単糖であるマンノース（商品名「Ｄ（＋）−マンノース」、富士フイルム和光純薬株式会社）を１．０％添加するマンノース添加区（比較例７）と比較した。

ＨＰＬＣは次の条件で行った。
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
検出：紫外吸光光度計（測定波長２８０ｎｍ）
カラム温度：４０℃
移動相： Ａ液：水＋５ｍＭギ酸アンモニウム
Ｂ液：メタノール＋５ｍＭギ酸アンモニウム
流量：０．４ ｍＬ／分
サンプル注入量：１μｌ

実施例８、実施例９、比較例６及び比較例７の結果を表１０に示す。

その結果、培養後のエクオール濃度は、酵母マンナン調製物Ａ及びＣいずれの場合も、酵母マンナン調製物添加区Ａ及びＣで、無添加区と比較して高い値を示した（実施例８及び９、並びに比較例６）。一方、１．０％マンノース添加区では、無添加区と比較して培養後のエクオール濃度が高い値を示さなかった（比較例６及び７）。

Claims (12)

1. 酵母マンナンを有効成分として含む、エクオール産生促進剤。
2. 請求項１に記載のエクオール産生促進剤を含む、エクオール産生促進用食品組成物または飲料組成物。
3. 請求項１に記載のエクオール産生促進剤を含む月経前症候群改善剤。
4. 請求項３に記載の月経前症候群改善剤を含む、月経前症候群改善用食品組成物または飲料組成物。
5. 請求項１に記載のエクオール産生促進剤を含む肌の状態改善剤。
6. 請求項５に記載の肌の状態改善剤を含む、肌の状態改善用食品組成物または飲料組成物。
7. エクオールの産生を促進するために使用される酵母マンナン。
8. エクオール産生促進用食品組成物または飲料組成物の製造のための酵母マンナンの使用。
9. 月経前症候群を改善するために使用される酵母マンナン。
10. 月経前症候群改善用食品組成物または飲料組成物の製造のための酵母マンナンの使用。
11. 肌の状態を改善するために使用される酵母マンナン。
12. 肌の状態改善用食品組成物または飲料組成物の製造のための酵母マンナンの使用。