KR20150056395A - 장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 sck a08 균주 및 이의 용도 - Google Patents

장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 sck a08 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 장류에서 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주(KCCM 11450P), 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제의 제조 방법, 상기 균주를 포함하는 식품 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법에 관한 것으로, 본 발명의 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 식품산업에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주 및 이의 용도{Bacillus licheniformis SCK A08 strain having antimicrobial activity against pathogenic microorganism of soy sauce and degrading activity of biogenic amine and uses thereof}
본 발명은 장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스(Bacillus l icheniformis) SCK A08 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장류에서 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주(KCCM 11450P), 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제의 제조 방법, 상기 균주를 포함하는 식품 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법에 관한 것이다.
한국의 장류 식품인 청국장, 된장 및 간장은 우리 조상으로부터 수백년 동안 섭취해 온 음식으로서 특별한 부작용이 없는 식품이며, 항산화 효과, 혈전용해 효과, 혈압강하 효과 등을 유발하는 각종 유익한 생리활성 물질들이 포함된 것으로 알려져 있다.
장류는 한국인의 식탁에 필수적인 부식으로서 식품으로 안전성 확보는 무엇보다도 중요한 과제이다. 장류의 발효과정에서 식품 안전을 좌우하는 3가지 주요 인자는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 같은 유해 미생물, 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus ) 등이 생산하는 아플라톡신(aflatoxin) 및 발효 미생물에 의해 생산되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)이 있다.
전통 방식에 의해 제조하는 장류는 필연적으로 자연 환경에 노출되는 상태로 발효가 이루어지기 때문에 발효나 숙성과정 동안 토양이나 대기의 유해 미생물들에 의해 독소들이 생성될 가능성이 높다. 장의 발효에 관여하는 주된 미생물 중의 하나는 바실러스(Bacillus) 속이다. 세균으로서 바실러스 서브그룹(Bacillus subgroup) 1에 속하는 바실러스 마이코이드(B. mycoides ), 바실러스 튜린지엔시스(B. thuringiensis), 바실러스 안트라시스(B. anthracis) 또는 바실러스 세레우스(B. cereus)는 유해균으로 알려져 있다. 특히 바실러스 세레우스는 HBL(haemolysin BL), NHE(non-hemolytic enterotoxin) 또는 cytK(cytotoxin K)와 같은 설사나 장염을 일으키는 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 식품에 오염된 바실러스 세레우스 균이 증식하여 생산한 독소(cereulide) 및 구토를 일으키는 펩티드 형태의 안트락스(anthrax)와 유사한 호흡 질환을 유발하는 세트락스(certhrax)를 생산한다.
바이오제닉 아민(biogenic amine)은 아미노산의 탈탄산 작용, 아미노기 전이작용 등의 화학적 작용에 의해 주로 생성되는 질소화합물로서, 단백질 함유 식품 내에서 미생물 또는 생화학적 활성에 의해 발생된다. 바이오제닉 아민은 미생물의 아미노산 디카복실라제(amino acid decarboxylase) 작용에 의해 형성되며 세균에서는 아크로모나스(Acromonas), 바실러스(Bacillus), 시트로박터(Citrobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 에스케리키아(Escherichia), 크렙시엘라(Klebsiela), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 프로테우스(Proteus) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속 등이 아미노산 디카복실라제를 가지는 것으로 알려져 있다(Taylor et al ., 1983 Mar. Fish. Rev. 45, 35-39). 대표적인 바이오제닉 아민으로는 퓨트레신(putrescine), 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine) 및 세로토닌(serotonin) 등이 있다. 바이오제닉 아민은 체내에서 신경전달 물질로 직·간접적으로 작용하고 혈압조절 및 혈류 등의 심혈관계 질환에도 영향을 미치므로, 바이오제닉 아민 함유 식품의 섭취로 여러가지 약리적인 현상이 나타날 수 있다. 이들 중 인체의 분해 한도를 넘어서는 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심 및 설사 등의 증상을 유발한다. 또한, 바이오제닉 아민에 의해 혈관 수축 및 심박 활동이 증가되어 혈압 상승을 유발하고, 동공과 눈꺼풀 조직을 확장시켜 눈물의 분비를 촉진하고, 타액의 과다분비, 호흡 증가 및 혈당 상승을 가져오며 편두통을 유발하기도 하는 것으로 보고되었다.
단백질 함량이 높은 콩, 프로테아제(proteases) 활성이 높은 바실러스(Bacillus) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 의한 발효, 미혐기적 환경 및 적당한 발효 온도를 고려할 때 장류는 바이오제닉 아민을 생산하기 적당한 환경이라고 할 수 있다.
앞으로 전통 장류의 지향점은 전통적인 장류의 맛과 풍미는 유지하되 발효 미생물 제어를 통한 식품 위생상의 안전성을 동시에 확보할 수 있어야 한다. 이를 위해 발효 동안 유해 균주들의 증식을 억제하며, 바이오제닉 아민을 생산하지 않고 동시에 분해도 가능한 발효 균주의 선발은 필수적이다.
한편, 한국등록특허 제0537782호에는 '바실러스 리케니포미스를 포함하는 진균 방제용 미생물제제 및 이를 이용한 생물학적 방제법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0506721호에는 '바실러스 리케니포미스 N1 및 이를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 미생물 제제'가 개시되어 있으나, 본 발명의 장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 전통 장류에서 유해 미생물에 대해 강한 항균 활성을 지니고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서 바이오제닉 아민의 높은 분해 활성을 가지는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 분리하였다. 상기 균주를 장류에 처리한 경우 유해 미생물의 증식이 억제되고, 바이오제닉 아민이 효과적으로 분해되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 장류에서 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주(KCCM 11450P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 배양하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 포함하는 식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다.
본 발명에서는 전통 장류에서 분리한 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주가 장류의 발효 과정 동안 발생하는 유해 미생물의 증식을 억제하고, 바이오제닉 아민을 효과적으로 분해하는 것을 확인하였다. 본 발명의 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 식품산업에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 SCK A08 균주 및 다른 연관 균주들의 관계를 보여주는 16S rRNA 유전자 서열 비교 분석을 통해 구축한 계통수를 나타낸다.
도 2은 SCK A08 균주가 독소 특성을 가지는 유전자를 보유하였는지 확인하기 위하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 그림이다. M: 사이즈 마커, 1: NheA 유전자, 2: NheB 유전자, 3: NheC 유전자, 4: HblA 유전자, 5: HblC 유전자, 6: HblD 유전자, 7: CesA 유전자, 8: CesB 유전자, 9: CytK 유전자, 10: ctx 유전자.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장류에서 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주(KCCM 11450P)를 제공한다.
상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주(KCCM 11450P)는 전통 장류에서 분리하였으며, 독소 유전자가 없고, 유해 미생물에 길항 능력을 가지며 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 균주이다. 상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2013년 09월 11일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCCM 11450P).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 퓨트레신(putrescine) 또는 카다베린(cadaverine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 균주는 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 미생물의 아미노산 디카복실라제 작용에 의해 아미노산으로부터 형성되며, 인체의 분해 한도를 넘어서는 바이오제닉 아민을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등의 증상을 유발한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 미생물 제제에서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물 제제는 장류로부터 분리된 유해 미생물에 대해 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성을 가지는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에 의한 미생물 제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 배양하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 바실러스 리케니포미스 균주를 배양하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 식품에 포함할 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 균주는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
상기 식품은 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 종균으로 이용한 발효식품일 수 있고 더욱 상세하게는 장류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 장류는 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다.
상기 장류 유해 미생물 제어는 본 발명의 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주를 장류에 처리함으로써, 유해 미새물의 성장을 지연시키거나 저해시키는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 균주 선발 및 배양
전통 방법에 따라 제조한 50종의 메주, 된장 및 청국장을 구입 후 0.1g을 취해 0.3mM 인산 완충액(pH 7.2)으로 희석하였다. 영양한천 배지(nutrient agar, NA) 및 바실러스 세레우스 선택 배지(chromogenic polymyxin B-methoprim agar, CPMA) 표면에 희석된 균액을 각각 200㎕씩 도포하고 37℃에서 18시간 배양한 후, NA에서 자란 집락수에 비해 CPMA에서 자란 집락수의 비율이 낮았던 장류들을 선발하였다. NA에서 배양한 상기 선발 장류의 집락들을 이쑤시개로 찍어 미리 만들어둔 NA 및 CPMA 배지의 같은 위치에 각각 접종하고, 37℃에서 18시간 후에 CPMA에 자라지 않은 균들만을 수집하였다. 상기 1차 선발한 균들을 대상으로 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 균주를 선발하기 위해 바이오제닉 아민 생성 검출배지를 제조하여 보라색을 띄는 균주만을 수집하였다. 바이오제닉 아민을 분해하는 균주를 선발하기 위해 균주가 이용 가능한 탄소와 질소원으로 0.5%의 히스타민과 티라민을 함유하는 최소배지에서 증식력이 좋은 균주만을 선별하였다.
2. 바이오제닉 아민( Biogenic amine ) 분석
선발 균주들의 바이오제닉 아민 분해 능력을 정량적으로 분석하기 위하여 HPLC를 수행하였다. 증기 멸균한 삶은 콩가루 0.3g에 각각 16mg의 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 퓨트레신(putrescine) 및 카다베린(cadaverine)을 녹인 0.8㎖ NB 배지를 첨가하고, 선발한 균주의 배양액 0.2 ㎖을 접종하였다. 대조군에는 바이오제닉 아민이 없는 NB에 균주만 접종한 대조군과 균만 첨가하지 않은 대조군을 사용하였다. 47℃에서 배양한 후 준비된 시료를 10,000×g에서 10분간 원심분리하여 얻은 0.1㎖ 상층액, 80㎕ 아세톤 용해 1% 댄실염화물(dansyl chloride), 50㎕ 포화 Na2CO3 및 50㎕ 내부 표준 용액(1,7-diaminoheptane)을 섞어 45℃에서 1시간 동안 유도체화 시켰다. 유도체화한 시료용액에 10% 프롤린(proline) 50㎕를 첨가하여 여분의 댄실염화물을 제거한 뒤, 0.5㎖ 에테르(ether)를 넣고, 3분 후 상층액만 분리하여 건조시킨 후, 0.1㎖ 아세토니트릴(acetonitrile)에 용해시켰다. HPLC 분석으로 역상 컬럼은 C18(Capcell pak, 4.6 mm×250mm, 5㎛)을 사용하였다. 이동상은 증류수에 녹인 0.1% 포름산(formic acid, A) 및 아세토니트릴에 녹인 0.1% 포름산(B)을 사용하였고, 농도 경사는 0∼10분, A:B=45:55; 11∼15분, A:B=35:65; 16∼25분, A:B=20:80; 26∼30분, A:B=10:90, 30분, 유속은 1㎖/분으로 하고 10㎕ 시료를 주입하였다.
3. 균주의 동정
선발균의 생화학적 동정을 위해 균을 새로운 NA 배지에 접종하고 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 형성된 집락은 NA 배양액에 희석 후 46종 건조 배지 및 생화학 반응물로 구성된 BCL ID 카드(bioMerieux Vitek Inc., USA)에 주입하였고, 15분 간격으로 결과들이 VITEK Compact 소프트웨어(bioMerieux Vitek)에 통합적으로 저장 분석된 뒤 14시간 후 동정이 완료되었다. 16S rRNA 유전자의 염기서열에 의한 균 동정을 위해 일반적인 프라이머로서 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 서열번호 2) 및 1,492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'; 서열번호 3)을 이용하여 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭하였다. 그 후 동정에 중요한 가변 염기 영역을 포함하는 1,490bp 부위(서열번호 1)를 BigDye Terminator v3.1 Cycle 시퀀싱 키트(Applied Biosystems Inc., USA)를 사용하여 해독하였다. 상기 염기서열은 NCBI 데이터베이스로부터 BLASTN 프로그램 및 RDP(Ribosomal Database Project)의 서열매치(Seqmatch) 프로그램(version 3)을 사용하여 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 얻은 후, 염기서열들 간의 상호 비교를 위해 CLUSTALW 프로그램을 사용하였다. 계통수 분석은 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업을 통해 갭(gap)이 최소화되도록 보정한 후, Kimura's two-parameter 방법 및 maximum parsimony 방법을 사용하여 작성하였다. 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위해 부트스트랩(bootstrap) 분석을 1,000회 실행하였으며 계통 분석과 부트스트랩 분석은 PAUP(version 4.0b)을 사용하였다.
4. 바실러스 리케니포미스 ( Bacillus licheniformis ) SCK A08 균주 특성 분석
최종선발된 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주의 독소 유전자 보유 여부를 확인하기 위하여 PCR 분석을 통하여 확인하였다. 바실러스 세레우스의 설사 독소 유전자(nheABC , hblACD 및 cytK), 구토 독소 세레울라이드(cereulide) 합성 효소 유전자(cesA 및 cesB)를 갖는지 확인하기 위하여 PCR을 실시하였다. 상기 독소 검출용 프라이머 서열은 표 1에 나타내었으며, PCR 조건은 94℃에서 2분간 초기 변성 후, 94℃에서 1분간 변성, 56℃에서 1분간 결합 및 72℃에서 1분간 증폭 과정을 30회 반복하고 72℃에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다.
본 발명에 사용한 PCR 프라이머
Primer pair Sequence
(5' -> 3')		 Target sequence
(GenBank accession no) 		Size (bp)
nheAF
nheAR		 ATATGCGCAAAATGTAATTGCTCCA(서열번호 4)
TGCCTTCTTCAACATTTGTTTGAATTT(서열번호 5)		 Non-hemolytic enterotoxin, nheA (AY835995) 935
nheBF
nheBR		 ACTTATGGCAGTATTTGCAGCAGGA(서열번호 6)
TGCAACGCTGTAATTGCAGTATCAA(서열번호 7)		 Non-hemolytic enterotoxin,
nheB (AY835995)		 972
nheCF
nheCR		 GACCAGCAGGATTCCCAGATGTAAT(서열번호 8)
CCACGCCTTCATGTAATTTTTCTGT(서열번호 9)		 Non-hemolytic enterotoxin, nheC (AY835995) 930
hblAF
hblAR		 ACCAGTAGCGACTTTTGCAAGTGAA(서열번호 10)
TTTTGAGCTGCATTCTCAATATGCC(서열번호 11)		 Hemolytic enterotoxin, hblA (AY822584) 909
hblCF
hblCR		 ATCAATACTCTCGCAACACCAATCG(서열번호 12)
ATGTGCTCGTTGCTCTGCTGTTAAT(서열번호 13)		 Hemolytic enterotoxin, hblC (AY822584) 957
hblDF
hblDR		 GACTGAAGACAGCATTGGCTCAAAC(서열번호 14)
CGATGTCTTTCGAAATGAATTCTGC(서열번호 15)		 Hemolytic enterotoxin, hblD (AY822584) 1,059
cytKF
cytKR		 CCGCTGTTTTTGCTAGTAGTGCTGT(서열번호 16)
ACGTCTTTTACGTTGTTTCCAACCC(서열번호 17)		 Cytotoxin K, cytK (DQ019311) 901
cesAF
cesAR		 GTTGGCGTGTTATGTGATCG(서열번호 18)
GGTGAAACAGCTTCTCCTGC(서열번호 19)		 Cereulide synthetase A, cesA (AB248763) 662
cesBF
cesBR		 AAAGAATGTTTCACCGAAGACGGTT(서열번호 20)
ACACACTTCTTTTCCGATTCCACCT(서열번호 21)		 Cereulide synthetase B, cesB (AB248763) 1,161
ctxF
ctxR		 TGCTAAAGGAGGGAAGGAACCGT(서열번호 22)
AGCCCCATGTACCCCTTCTGGA(서열번호 23)		 Certrax, ctx (AAEK01000004) 1,000
또한, 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주의 항균 활성을 확인하기 위하여, 표준 균주인 바실러스 세레우스(B. cereus) KACC 10004(ATCC 27348), KACC 11240(ATCC 14579), KACC 13064 및 KACC 13066, 그리고 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KACC 1621, KACC 1916, KACC 1927 및 KACC 3881을 NB 배지에 접종하여 37℃에서 18시간 진탕배양 후 200㎕를 각 CPMA 표면에 골고루 도말하고 배지 중앙에 6mm 페이퍼 디스크(paper disc, 3M)를 올려놓았다. 본 실험실에서 분리한 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주를 NB배지에서 37℃, 48시간 진탕배양 후 원심분리한 상층액을 페이퍼 디스크 중앙에 20㎕를 분주하고 37℃에서 18시간 배양 뒤 투명환 크기(지름)를 측정하였다. 이들 균주 증식에 대한 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주의 길항력은 각 균의 최적 온도에서 배양한 뒤 6 mm 페이퍼 디스크 주변의 투명환 직경으로 비교하였다.
최종선발된 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주의 효소 활성을 측정하기 위하여, 단백질분해효소활성(Protease activity)는 스킴 밀크 함유 배지(스킴 밀크 0.5%, 펩톤 0.5%, 글루코스 0.1%, 한천 1.5%)를 제조하여 사용하였고, 페이퍼 디스크 분석 방법을 활용하였다. 활성화시킨 균주 배양액 20㎕를 디스크에 분주하고 37℃에서 21시간 배양 후 지름(cm)을 측정하였다.
본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 이용하여 제작된 청국장의 일반 성분 분석으로, 수분함량은 적외선 수분측정기(FD-720, kett, Japan)를 사용하여 0.1% 이하의 유의차를 항량으로 측정하였다. 적정산도의 측정은 자동적정장치(Excellence Titrator T50M, Switzerland)을 이용하여 분석하였다. 적정산도는 시료 5g에 증류수 45㎖를 넣고 진탕한 후 0.1N NaOH를 가하여 pH 8.4가 될 때까지 적정하고, 이때의 소비된 0.1N NaOH ㎖수로 표시하였다. pH는 위 적정 산도와 동일하게 처리된 샘플을 이용하여 자동적정장치로 측정되었다. 염도는 시료 10g에 증류수 90㎖을 가하여 혼합한 후 디지털 염도계(Model TM-30D, Takemura Electric Works, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.
아미노태 질소 함량은 포르몰(Formol) 적정법에 준하여 자동적정장치(Excellence Titrator T50M, Switzerland)로 분석하였다. 2g을 취하여 증류수 50㎖를 가하고 1시간 동안 진탕한 후 0.1 N NaOH 용액으로 적정하여 pH 8.4로 조정하였다. 여기에 20㎖의 중성 포름알데하이드(pH 8.4)를 가하고 0.1N NaOH 용액으로 다시 pH 8.4가 되도록 중화 적정하였다. 별도로 증류수에 대한 바탕시험을 실시하여 아미노태 질소 함량을 구하였다.
실시예 1. SCK A08 균주의 선발 및 동정
순창군과 전국에서 수집한 50종의 전통장류인 메주, 된장 및 청국장으로부터 바이오제닉 아민을 생성하지 않고 분해하는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주가 최종 선발되었다. 분리된 SCK A08 균주를 NA 배지에서 배양 후 집락형태를 관찰한 결과, 백색의 집락 주위로 반투명의 광택 환을 형성하였다. 또한 선발 균주 SCK A08 균주를 1,500× 배율의 광학 현미경하에서 관찰했을 때 움직임이 매우 활발했고 그람 염색에서 양성을 나타내었다. Vitek BCL 카드를 이용하여 46 종류의 생화학적 검사 결과를 Vitek 2 Compact 소프트웨어를 이용하여 분석한 결과, 98%의 확률로 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 종으로 분류되었다(표 2).
본 발명의 SCK A08 균주의 생화학적 특성
Test Reaction Test Reaction
β-Xylosidase - Phenylalanine arylamidase +
L-Lysine arylamidase - L-Proline arylamidase -
L-Aspartate arylamidase - β-Galactosidase +
D-Mannose + L-Pyrrolydonyl arylamidase +
D-Melezitose - a-Galactosidase -
N-Acetyl-D-glucosamine (+) Alanine arylamidase -
Palatinose + Tyrosine arylamidase +
L-Rhammose - β-N-Acetyl-glucosaminidase -
β-Glucosidase + Ala-Phe-Pro arylamidase -
β-Mannosidase - Cyclodextrin +
Phosphorylcholine esterase - D-Galactose -
Pyruvate - Glycogen -
a-Glucosidase + Myoinositol +
D-Tagatose + Methyl-a-D-glucopyranose +
D-Trehalose + Ellman +
InuLin - Methyl-D-xylosidase -
D-Glucose + a-Mannosidase -
D-Ribose - Maltotriose +
Putrescine assimilation - Glycine arylamidase +
Growth in 6.5% NaCl + D-Mannitol +
Kanamycin resistance - EscuLin hydrolase +
Oleandomycin resistance - Tetrazolium red (+)
Leucine arylamidase + Polymyxin B resistance +
RDP(Ribosomal Database Project)에 등록된 모든 바실러스 속 표준 균주들만을 사용하여 계통도를 분석한 결과, SCK A08 균주는 ATCC 14580 균주와 가장 가까운 근연 관계로 16S rDNA 유전자 서열 상동성은 100%(1,399bp/1,400bp)를 보였다(도 1). 따라서 생화학 분석과 계통학적 분류를 고려하여 SCK A08 균주를 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로 동정하였다.
실시예 2. 본 발명의 바실러스 리케니포미스 ( Bacillus licheniformis ) SCK A08 균주 특성 검정
본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주의 독소 특성을 가지는 관련 유전자의 보유 여부를 확인하기 위하여, 바실러스 세레우스의 독소 관련 유전자인 Nhe, Hbl, CytK, cereulide, certhrax를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 바실러스 리케니포미스 SCK A08는 이들 유전자의 어느 것도 함유하고 있지 않았다(도 2).
바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주의 바이오제닉 아민 분해능을 알아보기 위하여 삶은 콩 g당 각 53mg의 히스타민, 티라민, 퓨트레신 및 카다베린을 첨가한 배지에서 2일간 배양 후 이들 아민을 HPLC를 통한 정량 분석을 수행한 결과, 각각 80%, 57%, 69%와 73%가 분해된 것을 확인할 수 있었다.
바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주가 전통장류에서 주로 발생되는 식중독미생물인 바실러스 세레우스와 스타필로코커스 아우레우스에 대한 항균 효과를 갖는지 시험 분석한 결과는 표 3과 같다. 증식 억제에 차이는 있었으나 SCK A08 균주는 시험에 사용한 바실러스 세레우스 4종과 스타필로코커스 아우레우스 4종 모두에서 이들의 증식을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. 전통 장류에 존재하는 유해미생물 억제능을 가진 바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주의 사용은 HACCP 시스템의 도입이 어려운 전통장류 업체에서 유해균들의 오염 문제를 해결할 수 있는 효과적 대안이 될 수 있을 것이다.
본 발명의 SCK A08 균주의 항균 활성
Test strain Antimicrobial Activity
( halo size , cm ) 		Culture condition
Bacillus cereus KACC 10004(ATCC 27348) 1.2 NA, 37℃
Bacillus cereus KACC 11240(ATCC 14579) 1.72 NA, 37℃
Bacillus cereus KACC 13064 1.28 NA, 37℃
Bacillus cereus KACC 13066 1.65 NA, 37℃
Staphylococcus aureus KACC 1621 1.43 NA, 37℃
Staphylococcus aureus KCTC 1916 1.28 NA, 37℃
Staphylococcus aureus KCTC 1927 1.41 NA, 37℃
Staphylococcus aureus KCTC 3881 1.16 NA, 37℃
바실러스 리케니포미스 SCK A08 균주를 메주발효와 청국장 발효에 종균으로 이용가능성을 확인하기 위해 페이퍼 디스크 분석 방법을 이용하여 단백질가수분해효소의 활성을 측정한 결과, 확산거리가 2.64cm로서 자체 보유중인 선별된 균주들의 활성평균인 1.0~2.5cm에 비하여 활성이 높게 나타났다.
실시예 3. 본 발명의 바실러스 리케니포미스 ( Bacillus licheniformis ) SCK A08 균주를 이용한 청국장 제조 및 이의 특성
본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주의 종균으로서 이용가능성이 있는지 확인하고자 청국장 제조시에 히스타민, 티라민, 퓨트레신 및 카다베린을 각각 2.0%를 넣은 실험구와 넣지 않은 대조구에 대하여 잔여 히스타민, 티라민, 퓨트레신 및 카다베린 함량을 HPLC를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 히스타민, 티라민, 퓨트레신 및 카다베린의 분해율은 각각 67.41%, 76.59%, 57.32%와 50.69%를 나타냈다. 이는 콩을 멸균처리한 후 클린벤치에서 종균을 접종하여 오염이 되지 않도록 배양하였기 때문에 종균인 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주가 히스타민, 티라민, 퓨트레신 및 카다베린을 분해한 것으로 판단되었다.
본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 이용하여 제조한 청국장의 수분함량을 적외선수분측정기를 이용하여 측정한 결과, 56.67%를 나타내었다. 이 결과는 순창 고추장단지 내 청국장의 평균 수분함량인 57±3.1과 유사하였다. 적정산도는 0.55㎖, pH는 7.8로, 순창 고추장단지 내 청국장의 평균 pH인 7.0±0.8 범위에 속하였다. 염도의 경우 시중 판매되는 청국장은 최종 조미를 한 후 유통되기 때문에 평균 4.2±1.8%를 나타내는데, 이번 연구에서는 조미과정이 없기 때문에 0%를 나타났다.
전통 청국장의 경우, 최소 72시간 이상 발효하였을 때 아미노태 질소 함량은 230mg%를 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 제조한 청국장의 아미노태 질소 함량은 48시간 배양 후 103.85mg%를 나타내었다.
외관, 향, 맛, 전체적 기호도를 관능평가로 살펴본 결과, 청국장의 향은 약한 편에 속했으며 색택은 적절하다고 판단되었다. 발효미생물센터 연구원 10명을 대상으로 9점 척도법으로 기호도 조사를 실시한 결과를 보면 외관 6.4, 향 7.7과 맛 6.0이었고, 전체적 기호도도 6.8로 좋은 평가를 받았다(표 4).
본 발명의 균주로 제조한 청국장의 관능평가
Mean value
Apearence 6.4 std err : 0.4
min : 4
max : 8
Flavour 7.7 std err : 0.26
min : 6
max : 9
Taste 6.0 std err : 0.45
min : 3
max : 8
Overall preference 6.8 std err : 3.6
min : 5
max : 8
바이오제닉 아민은 주로 단백질이 풍부한 전통장류 중 된장과 간장에서 높게 발생하고 있다. 현재까지 국내외 식중독 사고를 보면 바이오제닉 아민 중 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 퓨트레신(putrescine)에 의한 보고가 있다. 전통장류의 바이오제닉 아민에 대한 위생적인 문제를 해결하기 위해 전통장류 제조에 적합한 발효미생물 중에서 바이오제닉 아민 비생성 및 분해하는 미생물을 선발하여 종균으로 적용한다면 바이오제닉 아민에 대한 문제를 해결할 수 있을 것이다. 이러한 문제의 해결을 위해 본 연구에서는 우수한 발효능력과 함께 유해균에 대해 강한 길항 능력을 지니며, 바이오제닉 아민을 생산하지 않지만 높은 분해능력을 보이는 균주를 선발하여 장류제조 종균으로의 이용가능성을 실증하였다. 결론적으로 선발된 장류발효균주를 종균으로 이용하여 메주제조 및 청국장 제조 등에 이용한다면 바이오제닉 아민과 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 안전한 수준으로 낮출 수 있을 것으로 사료되었고, 전통장류의 HACCP 적용을 위한 HAZARD를 관리하는 우수한 수단으로 이용될 수 있을 것이다. 또한 향후에는 단일 균종만 종균으로 사용할 경우 전통장류의 우수한 풍미를 재현하는데 한계가 있기 때문에 종균들을 적절하게 조합한 혼합발효를 통해 제조한다면 풍미가 좋을 뿐만 아니라, 위생문제를 해결한 우수한 장류를 생산할 수 있을 것으로 판단되었다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11450P 20130911
<110> Sunchang Research Center for Fermentation Microbes(SRCM) <120> Bacillus licheniformis SCK A08 strain having antimicrobial activity against pathogenic microorganism of soy sauce and degrading activity of biogenic amine and uses thereof <130> PN13342 <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1490 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 1 gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcggac cgacgggagc 60 ttgctccctt aggtcagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac 120 tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggatgctt gattgaaccg catggttcaa 180 tcataaaagg tggcttttag ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg 240 gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac 300 actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa 360 tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaaac 420 tctgttgtta gggaagaaca agtaccgttc gaatagggcg gtaccttgac ggtacctaac 480 cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg 540 tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc 600 ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg 660 gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg 720 actctctggt ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat 780 accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagagggttt ccgcccttta 840 gtgctgcagc aaacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc 900 aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 960 gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaacccta gagatagggc ttccccttcg 1020 ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080 agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag 1140 gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1200 tgacctgggc tacacacgtg ctacaatggg cagaacaaag ggcagcgaag ccgcgaggct 1260 aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa 1320 gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380 acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaacctttt 1440 ggagccagcc gccgaaggtg ggacagatga ttggggtgaa gctaaaaagg 1490 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atatgcgcaa aatgtaattg ctcca 25 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgccttcttc aacatttgtt tgaattt 27 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acttatggca gtatttgcag cagga 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgcaacgctg taattgcagt atcaa 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaccagcagg attcccagat gtaat 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccacgccttc atgtaatttt tctgt 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 accagtagcg acttttgcaa gtgaa 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ttttgagctg cattctcaat atgcc 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 atcaatactc tcgcaacacc aatcg 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 atgtgctcgt tgctctgctg ttaat 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gactgaagac agcattggct caaac 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cgatgtcttt cgaaatgaat tctgc 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ccgctgtttt tgctagtagt gctgt 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 acgtctttta cgttgtttcc aaccc 25 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gttggcgtgt tatgtgatcg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ggtgaaacag cttctcctgc 20 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 aaagaatgtt tcaccgaaga cggtt 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 acacacttct tttccgattc cacct 25 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tgctaaagga gggaaggaac cgt 23 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 agccccatgt accccttctg ga 22

Claims (4)

  1. 장류에서 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주(KCCM 11450P).
  2. 제1항의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제.
  3. 제1항의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주를 포함하는 식품.
  4. 제1항의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK A08 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법.
KR1020130139359A 2013-11-15 2013-11-15 장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 sck a08 균주 및 이의 용도 KR20150056395A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20170130341A (ko) * 2017-11-20 2017-11-28 대한민국(농촌진흥청장) 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주 및 이의 용도
KR20220082395A (ko) * 2020-12-10 2022-06-17 재단법인 발효미생물산업진흥원 바실러스 서브틸리스 srcm102047 균주를 이용한 멸치 젓갈의 제조방법

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